Mitteldurchsatz-Säulen-DNA-Extraktion mit 24-Well-Racks

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine kosteneffiziente Methode zur Beschleunigung der Plasmid-DNA-Extraktion. Durch die Verwendung von maßgeschneiderten 3D-gedruckten Racks, die mit Standardrotoren mit Schaufelplatten kompatibel sind, können Forscher bis zu 48 Rotationssäulen mit Kappen oder bis zu 116 Rotationssäulen ohne Kappen gleichzeitig verarbeiten, was die Handhabungszeit im Vergleich zu manuellen Mikrozentrifugenmethoden deutlich verkürzt.

Zusammenfassung

Die Extraktion der Siliziummembran-Spin-Säule ist der Standard für hochwertige DNA-Reinigung, ist jedoch arbeitsintensiv und schwer manuell über kleine Chargen hinaus skalierbar. Bestehende automatisierte Flüssigkeitshandhabungsroboter sind oft noch zu teuer für kleine und mittelgroße Labore. Dieses Papier präsentiert einen stromlinienförmigen, halbautomatisierten Ansatz mit maßgefertigten, 3D-gedruckten Racks, die standardmäßige Zentrifugationsplattenrotoren anschließen.

Das vorgeschlagene System ermöglicht die parallele Verarbeitung von bis zu 116 standardmäßigen kommerziellen Spin-Säulen. Das Rack-Design ermöglicht eine "verschachtelte" Konfiguration, die eine gleichzeitige Lysatklärung (über Filtrationssäulen) und DNA-Bindung (über Siliziumspalten) in einem einzigen Zentrifugationsschritt ermöglicht. Darüber hinaus beinhaltet das Design ein gemeinsames Abwasserreservoir, wodurch die Notwendigkeit entfällt, den Durchfluss aus einzelnen Schläuchen während der Waschschritte zu entsorgen.

Diese Methode erreicht DNA-Ausbeute und Reinheit, die mit Standardprotokollen vergleichbar sind, reduziert jedoch die gesamte Verarbeitungszeit um etwa 50–70 % bei Probenchargen größer als 24 (60–90 Minuten statt 120–180 Min). Die Gesamtzeit für Schritte wie Lysatfiltration, Waschen und Abfallentsorgung wird unabhängig von der Anzahl der verarbeiteten Proben um 5–10 Minuten verkürzt. Dieser Open-Source-Hardwareansatz überbrückt die Lücke zwischen manuellen Minipreps und teurer Automatisierung.

Einleitung

Die Isolierung von Nukleinsäuren mittels Siliziummatrizen wurde erstmals 1979 von Vogelstein und Gillespie aufgeklärt, die das grundlegende Prinzip der Adsorbierung von DNA-Fragmenten zu Glaspulver bei hohen Konzentrationen chaotroper Salze, insbesondere Natriumiodid¹, etablierten. Dieser Durchbruch bot eine sicherere und effizientere Alternative zu den toxischen Phenol-Chloroform-Extraktions- und aufwendigen Cäsiumchlorid-Gradienten-Ultrazentrifugationsmethoden, die die Zeit dominierten. Anschließend optimierten Boom und Co-Autoren diese Methodik erheblich, indem sie Guanidiniumthiocyanat (GuSCN) als primäres chaotropes^{Mittel 2} einführten. Diese Innovation war entscheidend, da GuSCN gleichzeitig als potentes Proteindenaturator zur Zelllyse wirkt und als starker Inhibitor von RNasen und DNasen wirkt und so die Nukleinsäureintegrität während der Anfangsphase der Extraktion bewahrt.

Seit ihrer Einführung wurde diese Festphasenextraktionstechnologie – weithin als "Boom-Methode" bezeichnet – umfassend verfeinert. Es wurde angepasst, um Nukleinsäuren aus zunehmend komplexeren biologischen Matrizen zu isolieren, die von bakterieller Plasmid³ und genomischer DNA⁴ bis hin zu eukaryotischer mitochondrialer⁵ und hochmolekulargewichtiger genomischer DNA reichen. Darüber hinaus wurde die Technologie für klinische und forensische Anwendungen skaliert, einschließlich der Isolierung zellfreier zirkulierender DNA aus Plasma⁶, der Gewinnung widerspenstiger Pflanzen-DNA und RNA reich an Polyphenolen⁷ sowie der Reinigung der viralen Nukleinsäuren⁸. Viele kommerzielle Bausätze mit Spin-Säulen sind ebenfalls erhältlich.

Der physikochemische Mechanismus, der diesem Prozess zugrunde liegt, beruht auf der Störung der Wasserstruktur durch chaotrope Ionen. Bei hoher Ionenstärke und niedrigem pH-Wert werden die Hydratationsschalen, die sowohl das Nukleinsäurephosphat-Rückgrat als auch die Siliziumoberfläche umgeben, entfernt (Dehydration). Dies erleichtert die Bildung von Kationenbrücken – typischerweise vermittelt durch Na⁺ oder chaotrope Kationen – zwischen den negativ geladenen Silanolgruppen auf der Siliziumoberfläche und den Phosphatgruppen der Nukleinsäure. Die Selektivität hinsichtlich des Nukleinsäuretyps (DNA vs. RNA) und der Fragmentlänge wird durch die präzise Modulation der Pufferchemie erreicht. Beispielsweise können spezifische Salzkonzentrationen und pH-Werte die Bindung langer genomischer Stränge gegenüber kurzen Oligonukleotiden begünstigen oder zwischen RNA und DNA unterscheiden. Zusätzlich verwenden moderne Iterationen dieser Technologie oft modifizierte Siliziumoberflächen, um die differenziellen Adsorptionsisothermen spezifischer Nukleinsäurespezies zu verbessern.

Der kanonische Arbeitsablauf für die Siliziumdioxid-basierte Nukleinsäurereinigung durchläuft vier verschiedene Phasen: (1) Lyse, bei der das biologische Ausgangsmaterial homogenisiert und zelluläre Strukturen zerfallen werden, oft unter Verwendung alkalischer Bedingungen oder Reinigungsmittel (SDS/Triton); (2) Klärung, bei der zelluläre Abfälle, ausgefällte Proteine und Polysaccharide entfernt werden, um eine Verstopfung der Säule zu verhindern; (3) Bindung, bei der der Supernatant mit chaotropen Salzen und Ethanol angepasst wird, um die Adsorption an die Siliziummembran zu fördern; und (4) Waschen, bei dem membrangebundene Nukleinsäuren mit alkoholbasierten Puffern abgespült werden, um Restsalze und Inhibitoren vor der Eluation in einen Puffer mit niedriger Ionenstärke zu entfernen.

Obwohl die Chemie dieses Prozesses robust ist, bleibt die mechanische Handhabung einzelner Spin-Säulen ein bedeutender Engpass für Mitteldurchsatz-Workflows (24–100 Proben), was eine Lücke zwischen manueller Verarbeitung und teuren automatisierten Flüssigkeitshandhabungssystemen schafft. Bestehende Ansätze zur Vereinfachung der manuellen säulenbasierten Nukleinsäureextraktion umfassen Vakuummanifolds und robotische Arbeitsstationen für die automatisierte Reinigung 9,10,11,12.

Vakuumkrümmer sind typischerweise entweder in einer Zugangskonfiguration mit 20–24 Luer-Steckdosen für Zentrifugalkolonnen erhältlich oder in einem Design, das für den Einsatz mit 96-Well-Platten vorgesehen ist. Vakuumkrümmer, die für 20–24 Proben konfiguriert sind, beschleunigen den Säulenwaschschritt während der DNA-Reinigung im Vergleich zur Zentrifugation, da sie das Entfernen der Säulen vom Rotor überflüssig machen. Obwohl diese Methode praktisch ist, kann eine Kreuzkontamination auftreten, da die Kolonnendrainagespitze die Luer-Öffnung des Vakuumkrümmers berührt. Wenn DNA aus einer Spalte in die Luer-Öffnung eindringt, kann sie bei der nachfolgenden Verwendung der Mannigfaltigkeit auf eine andere Probenspalte übertragen werden. Zur Vermeidung von Kontaminationen empfehlen Hersteller zusätzliche Zubehörteile^10,13; diese erschweren jedoch den Zusammenbau der Extraktionsanlage und werden oft weggelassen.

Vakuummanifolde, die für das 96-Well-Format entwickelt wurden, haben eine andere Bauweise und sind nicht für Mikrozentrifugensäulen, sondern für kompatible 96-Well-DNA-Extraktionsplatten vorgesehen, in denen Bohrungen eine Silikamembran enthalten. In diesem Fall wird die DNA-Extraktion mit vorverpackten 96-Well-Format-DNA-Isolationskits¹⁴ durchgeführt. Diese Kits bieten einen hohen Durchsatz, haben jedoch nur begrenzte Anwendbarkeit, da die Verarbeitung von weniger als 96 Samples oft unpraktisch ist.

Automatisierte robotische Arbeitsstationen zur Nukleinsäureextraktion sind zweifellos die bequemste Methode zur DNA-Reinigung, da sie nur minimale Bedienerbeteiligung erfordern, was den Forschern Zeit spart und stochastische Faktoren wie Kontamination minimiert. Leider fehlt es den meisten Bergungsstationen an Universalität und sie arbeiten ausschließlich mit dedizierten Bausätzen. Diese Arbeitsstationen werden hauptsächlich in diagnostischen Laboren verwendet, sind aber für die meisten kleinen bis mittelgroßen akademischen Labore nicht kosteneffizient.

Daher gibt es eine Lücke in der Laborpraxis bei mitteldurchsatzfähigen DNA-Extraktionsmethoden, die in der Lage sind, zwischen 12 und 96 Proben in weniger als 1 Stunde zu verarbeiten. Wir präsentieren ein 24-Well-Rack, das eine manuelle Isolierung von bis zu 48 Proben mit gekappten Spin-Säulen und bis zu 116 Proben mit unbedeckten Spin-Säulen ermöglicht. Als zusätzliche Ausrüstung werden eine Zentrifuge mit Schaukel-Scheifel-Rotor und eine Mikrozentrifuge mit festem Winkel verwendet. Das Verfahren zur Plasmid-DNA-Reinigung wird als Beispiel für die Verwendung von 24-Well-Racks dargestellt, da die Plasmid-DNA-Isolierung einen Klärungsschritt zur Entfernung von lysierten Zellresten beinhaltet, was die Automatisierung des Prozesses erschwert. Dennoch können diese Racks für nahezu jede Methode zur säulenbasierten Nukleinsäureextraktion verwendet werden.

Protokoll

1. Vorbereitung von 3D-gedruckter Ausrüstung

1. Drucken Sie das Rack mit einem 3D-Drucker mit verschmolzenem Filament und einer 0,4-mm-Düse. Verwende generisches PLA-, PETG- oder ABS-Filament mit 100 % Infill. Stelle die Schichthöhe auf 0,1 mm ein und aktiviere die Oberflächenglättung. Passen Sie die Druckeinstellungen an, um Wasserdichtheit und mechanische Stabilität zu gewährleisten.
   HINWEIS: STL-Dateien für Rack-Komponenten werden in Supplemental File 1 bereitgestellt. Befolgen Sie die angegebenen Druckparameter für das Basisreservoir. Testen Sie das Reservoir vor der Benutzung, indem Sie es mit 70 % Ethanol füllen und für längere Dauern (1, 2, 5, 10 und 30 Min) zentrifugieren, um das Fehlen von Lecks oder strukturellen Schäden zu bestätigen.
2. Klebe die Komponenten des Basisreservoirs zusammen, um eine versiegelte Einheit zu bilden.

2. Bakterienkultur und -lyse

1. Inokulieren Sie E. coli-Transformanten in 3–5 mL LB-Medium, das geeignete Antibiotika enthält. Über Nacht (12–16 H) bei 37 °C mit Schütteln inkubieren.
2. Zellen werden durch Zentrifugation bei 2.000 × g für 10 Minuten entnommen. Entsorge das Supernatant.
   HINWEIS: Zellpellets können vor der Verarbeitung bei −20 °C gelagert werden.
3. Fügen Sie dem Pellet 250 μL Aufhängungspuffer (Puffer P1 mit RNase A) hinzu. Vollständig durch Vortexen oder Pipettieren wieder suspendieren.
4. Fügen Sie 250 μL Lysepuffer hinzu (Puffer P2). Mischen Sie das Rohr vorsichtig 4–6 Mal um.
   HINWEIS: Vermeiden Sie intensives Vermischen, um Scheren der genomischen DNA zu verhindern.
5. Fügen Sie 350 μL Neutralisationspuffer hinzu (Puffer N3). Sofort gründlich durch Inversion mischen.
   HINWEIS: Ein weißer Niederschlag sollte sich bilden, was auf eine erfolgreiche Neutralisierung hinweist.

3. Montage der Filtereinheit

1. Setze DNA-Bindungssäulen in die Säulenhalterschicht des Racks.
2. Positionieren Sie die Säulendeckel in vorgesehene Schlitze, um sie während der Zentrifugation zu sichern.
3. Platziere Klärungs-/Filterspalten direkt über den Bindungsspalten in die Filterspalten-Schicht.
   HINWEIS: Wenn keine Filtersäulen verfügbar sind, zentrifugieren Sie das Lysat in Mikroröhren und übertragen Sie das Überstandsmittel in die Bindungssäulen.

4. Lysat-Clearance und DNA-Bindung

1. Übertragen Sie das neutralisierte Lysat aus Schritt 2.5 in die Filtersäulen.
2. Setzen Sie das zusammengesetzte Gepäckträger in einen Rotor mit Schwing-Bucket-Platte.
   VORSICHT: Sorgen Sie für ein richtiges Balancieren, indem Sie ein Gegengewichtgestell mit gleicher Masse und identischer Konfiguration verwenden.
3. Zentrifugiere bei 2.000 × g für 1 Minute bei Raumtemperatur.
4. Nimm das Gitter aus der Zentrifuge.
5. Entfernen und entsorgen Sie die Filtersäulenschicht.

5. Waschen

1. Entsorgen Sie den Durchfluss aus dem Reservoir in einen Abfallbehälter. Setze das Gestell mit den Bindespalten wieder zusammen.
2. Fügen Sie 500–700 μL Waschpuffer zu jeder Bindungssäule mit einer Mehrkanalpipette hinzu.
3. Zentrifugiere bei 2.000 × g für 1 Minute.
4. Entsorge den Durchfluss aus dem Reservoir.
5. Wiederholen Sie die Waschphase, indem Sie jeder Spalte Waschpuffer hinzufügen und 1 Minute bei 2.000 × g zentrifugieren.
   HINWEIS: Säulen können nach dem Waschen bei Raumtemperatur oder 4 °C gelagert werden.

6. Trocknung und Elution

1. Entferne die Bindungssäulen vom Gestell und übertrage sie in 2-mL-Sammelröhren.
2. Zentrifugiere bei >10.000 × g für 1 Minute, um die Membran zu trocknen.
3. Übertrage die Säulen, um 1,5-mL-Röhren zu reinigen.
4. Fügen Sie 50 μL Elutionspuffer oder Wasser direkt zur Membran hinzu. Inkubiere 1 Minute bei Zimmertemperatur.
5. Zentrifugiere bei >10.000 × g für 1 Minute, um DNA zu elutieren.

7. Optional: Ko-Niederschlag mit Titandioxid

1. Mische Lysepuffer mit Titandioxidpulver im Verhältnis 2:1 Volumen zu Masse.
2. Fügen Sie 250 μL der Titandioxidsuspension zum Lysat hinzu. Mischen Sie durch Inversion.
3. Fügen Sie 350 μL Neutralisationspuffer hinzu und mischen Sie gründlich.
4. Zentrifugiere bei 2.000 × g für 1 Minute.
5. Sammeln Sie das Supernatant, ohne den Niederschlag zu stören.
6. Übertragen Sie das Supernatant in die Bindungssäule.

Ergebnisse

Rack-Variationen
Wir haben vier Versionen von Racks entwickelt, die für eine breite Palette von Zentrifugenmodellen geeignet sind, sodass Ressourcen in verschiedenen Laborumgebungen genutzt und die Nutzerpräferenzen berücksichtigt werden. Alle Racks verfügen über ein 24-Brunnen-Format, verfügen aber je nach Version über zusätzliche Sitzplätze für Säulen. Detaillierte Abmessungen und Kompatibilität sind in Supplemental File 2 bereitgestellt. Ein hochauflösendes Bild des montierten Regals ist in der ergänzenden Abbildung S1 enthalten.

Die Basis-Rack-Version (Abbildung 1) ist die produktivste Konfiguration. Sie besteht aus vier Teilen und hat die Maße 88 × 130 × 77 mm. Sie ermöglicht die gleichzeitige Verwendung von bis zu 48 Spalten bei Spalten mit Kappen oder bis zu 116 Spalten bei Verwendung von Spalten ohne Kappen. Die Rack-Komponenten sind auf einfache Bedienung und darauf ausgelegt, unerwünschte Effekte während der Zentrifugation zu minimieren. Spin-Säulen werden in die Säulenschicht eingebaut, die Rillen zum Einsetzen von Kappen besitzt; Diese gleichen Rillen können auch Säulen ohne Kappen aufnehmen. Die Säulenschicht liegt auf dem Reservoir. Die Entwässerungsöffnung der Säulen befindet sich über dem Ausschnitt des Reservoirs, was hilft, das Spritzen zwischen benachbarten Säulen zu reduzieren. Die Flüssigkeit fließt durch eine Öffnung am unteren Rand des Aussparungs in das Reservoir. Die Reservoirkapazität beträgt etwa 100 mL und nimmt zwei Waschstufen mit hoher Säulenlast auf. Die Filtersäulenschicht kann bei Bedarf oberhalb der Säulenschicht platziert werden, wobei die Filtersäulen über und in Kontakt mit den Bindungssäulen positioniert sind. Die Kappe versiegelt die Schicht mit dem Filter oder den Bindungssäulen und begrenzt den Luftstrom während der Zentrifugenrotation. Die Basis-Rack-Version ist kompatibel mit A-2-DWP-Schaufelrotoren (z. B. Eppendorf 5804), Rotor 1770 (z. B. HETTICH Rotina 380) oder gleichwertigen Systemen.

Die Mini-Rack-Version (Abbildung 2) eignet sich für eine breite Palette von Zentrifugenschaufelrotoren. Sie besteht aus drei Teilen und hat die Mindestmaße 82,5 × 128 × 58 mm (mit der Filtersäulenschicht). Es erlaubt die Verwendung von bis zu 48 Spalten mit Kappen oder bis zu 90 Spalten ohne Kappen. Die Geometrie dieser Version ähnelt der des Basisracks, jedoch wurden die äußeren Reihen der Säulenpositionen entfernt und durch Rillen für Säulenkappen ersetzt. Die Reservoirkapazität variiert je nach gedruckter Version. Das kleinste Reservoir (20 ml) beherbergt einen Waschschritt für etwa 30 Säulen; größere Reservoirs ermöglichen einen höheren Durchsatz. Die Filtersäulenschicht hat abgerundete Kanten, um die Bewegung des Rotorschaufels in kleineren Zentrifugen zu ermöglichen. Die Mini-Rack-Version ist kompatibel mit UC-124 Schaufelrotoren (z. B. Accumax iFuge UC02) oder gleichwertigen Systemen. Ohne Filtersäulenschicht ist das Rack mit A-2-MTP-Schaufelrotoren (z. B. Eppendorf 5430) oder deren Äquivalenten kompatibel.

Die reservoirlose (unbedeckte) Version (Abbildung 3) ist für Nutzer mit begrenzter 3D-Druckerfahrung geeignet, da das Reservoir durch einen externen Behälter wie eine Pipettentippbox ersetzt wird. Diese Version besteht aus drei Teilen und misst 79 × 115 × 61,5 mm. Es erlaubt die Verwendung von bis zu 48 Spalten mit Kappen oder bis zu 78 Spalten ohne Kappen. Die Geometrie ähnelt der der vorherigen Versionen, fehlt jedoch ein integrierter Reservoir. Stattdessen wird ein geeigneter Behälter zur Abfallabfuhr verwendet. Die Säulen- und Filterschichten haben weniger Sitzpositionen, und die Filterschicht verfügt über konische Sitze, um Störungen bei der Rotorbewegung zu vermeiden. Der Boden ist so konzipiert, dass er in Standardbehälter passt, und kann mit Seitenabständen stabilisiert werden. Die Kompatibilität hängt vom gewählten Behälter ab, umfasst jedoch A-2-DWP-Schaufelrotoren (z. B. Eppendorf 5804), Rotor 1770 (z. B. HETTICH Rotina 380) und UC-124-Schaufelrotoren (z. B. Accumax iFuge UC02).

Die Cap Rack-Version (Abbildung 4) ist die einfachste Konfiguration und wird zusammen mit 5 mL oder 10 mL 24-Well-Deep-Well-Platten verwendet. Es besteht aus einer einzigen Komponente mit den Maßen 73 × 109 × 4 mm und ermöglicht den Einsatz von bis zu 48 Säulen. Diese Version ist mit jedem Zentrifugenrotor kompatibel, der das entsprechende Plattenformat unterstützt.

Ausbeute und Reinheit
Die DNA-Extraktion erfolgte an E. coli-Kulturen sowohl mit dem standardmäßigen manuellen Mikrozentrifugenprotokoll als auch mit der rackbasierten Methode. Die spektrophotometrische Analyse zeigte, dass die mit den Racks gewonnene DNA-Qualität vergleichbar war mit der mit der Standardmethode gewonnenen DNA. Typische A260/A280-Verhältnisse lagen für beide Anflüge zwischen 1,8 und 1,9. Die Gesamtplasmidausbeute (μg) zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen der herkömmlichen Methode und der Extraktion mit den Rackkonfigurationen (Abbildung 5); Rohdaten werden in Supplemental File 2 bereitgestellt. Auch die Plasmid-Konformation blieb erhalten, mit ähnlichen Verteilungen entspannter, linearisierter und supergewickelter Formen (Abbildung 6).

Kreuzkontaminationsanalyse
Um eine mögliche Kreuzkontamination zu bewerten, wurde ein Schachbrettexperiment durchgeführt. Die Säulen wurden abwechselnd mit einer hochkonzentrierten Ethidiumbromidlösung (die hochtiterhaltige DNA simuliert) und Wasser geladen. Nach der Zentrifugation bei 2.000 × g wurde die Farbstoffverteilung auf den Abfallbereich direkt unter den belasteten Säulen beschränkt, und es wurde kein sichtbares Signal in benachbarten Bohrlöchern oder auf benachbarten Säulenspitzen festgestellt (Abbildung 7). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das Rack-Design die Wahrscheinlichkeit von Spritzern und Quersäulenübertragungen unter den getesteten Bedingungen verringert.

Um die Kontamination weiter zu bewerten, wurde eine Echtzeit-PCR mit einem Amplicon als Kontaminationsmittel durchgeführt (siehe Supplemental File 2). Die Amplifikation wurde nur in Eluaten aus Säulen nachgewiesen, zu denen das Amplicon hinzugefügt worden war (Abbildung 8). Unter den getesteten Bedingungen wurde keine Kreuzkontamination festgestellt; die Leistung kann jedoch je nach Arbeitsablauf und Sample-Typ variieren.

Abbildung 1: Basisversion des Rack-Assembly-Schaltplans. Explodierte CAD-Ansicht zeigt die (A) Kappe, (B) Filter-Säulenschicht, (C) Spaltenhalter-Schicht und (D) Basisreservoir. Das Gestell besteht aus vier Teilen mit den Maßen 88 × 130 × 77 mm und ermöglicht die gleichzeitige Verwendung von bis zu 48 Spalten mit Kappen oder bis zu 116 Spalten ohne Kappen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Mini-Version des Rack-Montageschemas. Explodierte CAD-Ansicht, die die (A) Filter-Säulenschicht, (B) Spaltenhalter-Schicht und (C) Basisreservoir zeigt. Diese Version ähnelt geometrisch der Basisversion, jedoch wurden die beiden Seitenreihen der Säulensitze entfernt und durch Rillen für Säulenkappen ersetzt. Sie besteht aus drei Teilen, hat Mindestmaße von 82,5 × 128 × 58 mm (mit der Filtersäulenschicht) und erlaubt die Verwendung von bis zu 48 Spalten mit Kappen oder bis zu 90 Spalten ohne Kappen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Reservoirlose (unbedeckte) Version des Schaltplans der Rack-Montage. Explodierte CAD-Ansicht, die die (A) Filter-Säulenschicht, (B) Säulenhalter-Schicht, (C) Basis und (D) Pipettenspitzenbox zeigt. Diese Version ersetzt das integrierte Reservoir durch einen externen Behälter wie eine Pipettentippbox. Sie besteht aus drei Teilen, hat die Maße 79 × 115 × 61,5 mm und erlaubt die Verwendung von bis zu 48 Spalten mit Kappen oder bis zu 78 Spalten ohne Kappen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Cap-Version der 24-Well-Racks. Draufsicht (links) und untener Ansicht (rechts). Dies ist die einfachste Rack-Version, die zusammen mit 5-mL- oder 10-mL-24-Well-Deep-Well-Platten verwendet wird. Er besteht aus einem einzelnen Teil mit den Maßen 73 × 10⁻ × 4 mm und ermöglicht die Verwendung von bis zu 48 Spalten mit oder ohne Kappen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Vergleich von DNA-Ausbeute und Reinheit. Spektrophotometrische Analyse des Plasmid-Ertrags (μg/mL). Es wurde kein statistisch signifikanter Unterschied in der Gesamtplasmidausbeute zwischen der konventionellen Methode und der Extraktion mit den Rackkonfigurationen beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Vergleich der DNA-Qualität. DNA-Formen wurden durch Agarosegel-Elektrophorese visualisiert. Die entspannten, linearisierten und superaufgerollten DNA-Formen ähneln der Standard-manuellen Extraktion und der rackbasierten Extraktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Kreuzkontaminationsbewertung. Ansicht des Abfallreservoirs nach der Zentrifugation, die diskrete Abfallbecken ohne Überlappung zeigt. Die Säulen waren mit einer hochkonzentrierten Ethidiumbromidlösung (simuliert hoch-titer DNA) und Wasser beladen. Nach der Zentrifugation wurde kein Farbstoff in benachbarten "Wasser"-Brunnen oder an den Spitzen benachbarter Säulen beobachtet, was auf reduziertes Spritzen und Quersäulentransfer unter den getesteten Bedingungen hindeutet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8: Analyse der Kreuzkontamination mittels quantitativer PCR. Verstärkungskurven für Proben, die das Kontaminationsmittel enthalten, sind rot dargestellt, während Proben, die nur Wasser enthalten, grün dargestellt werden. Die Verstärkung wurde nur in Proben mit dem Kontaminationsmittel nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Datei 1: 3D-Modelldateien für Rack-Designs. Dieser Dateisatz enthält STL-Dateien für alle Rack-Konfigurationen, einschließlich der Basis-Rack-Version, der Mini-Rack-Version (mit mehreren Varianten der Reservoir-Höhen), der reservoirlosen Version und der Cap-Rack-Version. Einzelne Komponenten (z. B. Basisreservoir, Säulenhalterschicht, Filter-Säulenschicht und Kappe) werden für den 3D-Druck bereitgestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Unterstützende Daten und Methoden. Dieser Dateisatz enthält die Zentrifugenkompatibilitätstabelle, detailliertes Kreuzkontaminationstestverfahren, Datensätze für die Roh-DNA-Ausbeute und PCR-Instrumentenausgabedateien, die mit der Kontaminationsanalyse verbunden sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Basis-Rack-Version (vollständig montiert). Hochauflösendes Bild der vollständig zusammengebauten Grundrackkonfiguration, das die Gesamtstruktur und die Anordnung der Komponenten veranschaulicht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Dieses Protokoll adressiert die "Durchsatzlücke" in vielen molekularbiologischen Laboren. Obwohl 96-Well-Filterplatten schneller sind, können sie im Vergleich zu einzelnen^{Spin-Säulen geringere} Bindungskapazitäten oder geringere Endkonzentrationen aufweisen. Durch die Anpassung von Standard-Spin-Säulen an ein Platten-Rotor-Format kombiniert diese Methode die hohe Ausbeute der Säulen mit der Geschwindigkeit plattenbasierter Workflows.

Die Racks sind am vorteilhaftesten bei der Verarbeitung von mehr als 12 Proben. Die wichtigste Innovation des Protokolls ist die Verwendung von 24-Brunnen-Racks, die die säulenbasierte Nukleinsäureextraktion durch die Nutzung eines gemeinsamen Reservoirs zur Entsorgung von Supernatanten und Waschlösungen vereinfachen und beschleunigen. Bei Verwendung der Racks ist die für 14–116 Samples benötigte Zeit vergleichbar mit der für 2–12 Samples. Darüber hinaus wird der Aufwand des Bedieners reduziert, da wiederholte Schritte wie das Entfernen einzelner Rohre, das Übertragen von Säulen, das Entwerfen von Waschlösungen und das Öffnen von Kappen minimiert werden. Da die ursprünglichen Kit-Komponenten (Lösungen und Spin-Säulen) unverändert bleiben, wird eine vergleichbare DNA-Qualität erwartet und durch die präsentierten Ergebnisse gestützt.

3D-Druck der 24-Well-Racks ist mit Standardausrüstung möglich, erfordert jedoch möglicherweise Erfahrung für die Basis- und Mini-Versionen. Die Varianten ohne Reservoir und mit Deckengestell sind einfacher und können mit minimaler Druckerfahrung hergestellt werden. Ein wichtiger Aspekt bei der Modellierung der Fusionsabscheidung ist die Bildung von Mikrolücken zwischen den Schichten, die die Wasserdichtheit unter Zentrifugation beeinträchtigen können. Tests ergaben, dass 100 % Auffüllung, eine Wanddicke des Reservoirs von 7 mm und eine Schichthöhe von 0,1 mm ausreichende Wasserdichtheit gewährleisten. Das Erhitzen des Druckbetts und das Auftragen der Oberflächenglättung verbesserten die Dichtungsleistung zusätzlich. Im Gegensatz dazu waren Nachdruck-Versiegelungsmethoden mit Epoxidharzen oder organischen Lösungsmitteln nicht wirksam, da Verformung während der Zentrifugation zu Rissbildung und Leckagen führte. Unzureichende Wanddicke kann zudem zu strukturellem Versagen und Wasserdichtigkeitsverlust führen, was potenziell zu einem Zentrifugenungleichgewicht führen kann. Daher wird eine Vorabprüfung gedruckter Komponenten empfohlen.

Die vier Rack-Versionen sind für eine breite Palette von Zentrifugen mit Schaufelrotoren geeignet, sodass Nutzer die Konfiguration auswählen können, die am besten zu ihrer Ausrüstung und ihren Durchsatzanforderungen passt. Die Basis-Rack-Version bietet den höchsten Durchsatz, erfordert jedoch größere Zentrifugen und eine höhere Druckqualität. Die Mini-Version reduziert den Bedarf an Zentrifugengröße, senkt aber auch den Durchsatz. Die reservoirlose Version vereinfacht die Herstellung und ist mit gängig verfügbaren Behältern wie Pipettentippboxen kompatibel, wobei die Kompatibilität jedoch von der Geometrie des Behälters abhängt. Die Cap-Rack-Version ist die einfachste Konfiguration, kann aber nicht mit Filterspalten verwendet werden.

Filtersäulen, die keine Nukleinsäuren binden, sind möglicherweise weniger leicht verfügbar als Standard-Bindungssäulen⁹. In deren Abwesenheit können zusätzliche Klarstellungsschritte erforderlich sein, was die Gesamtbearbeitungszeit erhöht. Alternativ können Filterpipettenspitzen (1000 μL) oder das Titandioxidprotokoll verwendet werden.

Die Extraktionsracks fungieren als mechanisches Ergänzungsmittel zu den Standard-DNA-Extraktionsworkflows⁹ und verändern weder die Pufferzusammensetzung noch die Säulenchemie (außer bei der Titandioxidvariante). Dementsprechend wird kein wesentlicher Einfluss auf die DNA-Qualität erwartet, was mit der Agarosegel-Elektrophorese übereinstimmt und Vergleiche zeigt, die ähnliche Plasmidformen und -mengen im Vergleich zur Standardmethode zeigen.

Obwohl die Nutzung eines gemeinsamen Abfallreservoirs ein potenzielles Risiko einer Kreuzkontamination birgt, wurde dies unter den getesteten Bedingungen nicht beobachtet. Ein zentrales Designmerkmal ist die "Schornstein"-Geometrie der Säulenausläufe, die den Abstand zwischen Säulenspitzen und der Abwasseroberfläche beibehält. Um diese Trennung zu erhalten, sollte das Reservoir nicht überfüllt werden, und das Entleeren nach jedem vollständigen Durchfluss wird empfohlen.

Eine Einschränkung der Methode ist die maximale Geschwindigkeit von Schaukelrotoren (typischerweise 2.000 × g). Obwohl diese Geschwindigkeit für Bindungs- und Waschschritte ausreichend ist, ist sie für das vollständige Trocknen der Membran nicht ausreichend. Daher ist ein abschließender Hochgeschwindigkeits-Zentrifugationsschritt in einer Mikrozentrifuge mit festem Winkel erforderlich. Trotz dieses zusätzlichen Schrittes bleiben die Gesamtzeiteinsparungen bei Chargen über 24 Proben erheblich.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3D-Drucker-Filament	NIT, Russland	-	PETG oder PLA empfohlen
Puffer N3	Qiagen, Niederlande	19064
Puffer P1	Qiagen, Niederlande	19051
Puffer P2	Qiagen, Niederlande	19052
Creality Ender-3 S1 Pro	Creality, China
Elutionspuffer	Qiagen, Niederlande	19086
Eppendorf Zentrifuge 5702	Eppendorf, Deutschland	22626001	Festwinkelrotor
Eppendorf Zentrifuge 5804 R	Eppendorf, Deutschland	22625080	Schaufelteller-Rotor
Ethidiumbromid	Biolabmix, Russland	EtBr-10
Fritte von 1000 μL Filterpipettenspitze	GenFollower, China	E-FTB1000	Teil der Filter-Säulen
Miniprep ohne Filterbarriere Spin Column	JVLAB, China	-	Teil der Filter-Säulen
Phenolrot	Lenreactiv, Russland	200125
PrusaSlicer	Prusa Research, Tschechische Republik
QIAprep 2.0 Spin Miniprep Columns	Qiagen, Niederlande	27115
RNase A	Qiagen, Niederlande	19101
Waschpuffer	Qiagen, Niederlande	19065