Eine digitale mikrofluidische Elektroporationsplattform für CRISPR-Genom-Editierung mit geringem Input und mRNA-Transfektion in Suspensions-T-Zellen und 3D-Zellmodellen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die miniaturisierte CRISPR–Cas9-Genom-Editierung des TCRα/β-Rezeptors in primären menschlichen T-Zellen mittels 'DMF-Ection', einer digitalen Mikrofluidik-(DMF)-Elektroporationsplattform. Die Methode ermöglicht parallele, niedrige Eingabe-Genbearbeitung mit hoher Lebensfähigkeit und ist zudem anpassungsfähig für die mRNA-Abgabe in mehrzellige 3D-Sphäroide.

Abstract

Die digitale Mikrofluidik-(DMF)-Elektroporation ermöglicht eine präzise, geringvolumige genetische Manipulation von Säugetierzellen, wobei der zelluläre Input bis zu 100-fach minimiert und die Lebensfähigkeit erhalten bleibt. Diese Studie präsentiert einen hochdurchsatzbasierten DMF-basierten Transfektions-Workflow für CRISPR-vermittelte Knockout des TRAC-Lokus in primären menschlichen Suspensions-T-Zellen und für die mRNA-Transfektion dreidimensionaler HEK293T Sphäroide. Mit räumlich abgelagerten CRISPR-Leit-RNAs und der On-Cartridge-Ribonukleoprotein-(RNP)-Assemblierung wurde eine effiziente TRAC-Störung sowohl in CD4⁺- als auch CD8⁺-T-Zellpopulationen mit nur 10.000 Zellen pro Bedingung erreicht, wobei die Post-Editing-Viabilitäten über 85 % betrugen. Biophysikalische Charakterisierung mittels strömungsinduzierter und Taylor-Dispersionsanalysen zeigte, dass Polymeradditive Cas9–sgRNA-Komplexe unter Elektroporationspufferbedingungen stabilisieren und reproduzierbare Bearbeitung bei Submikrolitervolumen unterstützen. Der Arbeitsablauf wurde weiter für 3D-Anwendungen angepasst, indem EGFP-mRNA in intakte HEK293T Sphäroide eingetragen wurde, was zu einer robusten und räumlich gleichmäßigen Fluoreszenz führte, ohne das Wachstum oder die Morphologie der Sphäroiden zu beeinträchtigen. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die DMF-Elektroporation eine effiziente Genombearbeitung und mRNA-Lieferung sowohl über Suspensions-Immunzellen als auch über mehrzellige Sphäroide ermöglicht. Diese Plattform bietet eine skalierbare und niedrige Eingabelösung für Anwendungen in der CAR-T-Zelltherapie, funktioneller Genomik und fortschrittlichen 3D-Zellmodellen.

Introduction

Gen-Editierung in primären menschlichen Zellen wird sowohl für die therapeutische Entwicklung als auch für die Grundlagenforschung zunehmend zentral, einschließlich Anwendungen in der Immuntechnik, der Modellierung seltener Krankheiten und der funktionellen Genomik¹. Obwohl die Elektroporation eine hocheffiziente Genomeditierung ermöglicht, benötigen konventionelle Cuvette-basierte Systeme typischerweise bis zu Millionen von Zellen pro Bedingung, was deren Nutzung für patientenabgeleitete Proben und seltene Immunpopulationen einschränkt². Darüber hinaus sind diese Systeme aufgrund von Einschränkungen bei Durchsatz, Automatisierung und Reagenzienverbrauch^schlecht für großflächige Screenings geeignet.

Die mikrofluidische Elektroporation hat sich als vielversprechender Ansatz für die Genombearbeitung mit geringem Input^{erwiesen 4}. Die meisten bestehenden Plattformen basieren jedoch auf kontinuierlichen Strömungsarchitekturen, die komplexe Flüssigkeitshandhabung, begrenzte Flexibilität beim Reagenzienmischen und relativ hohe Anforderungen pro Bedingung erfordern. Im Gegensatz dazu ermöglicht die digitale Mikrofluidik (DMF) die aktive Manipulation diskreter Nanoliter-Tröpfchen auf einem planaren Elektrodenarray, was eine präzise Steuerung der Reaktionszusammensetzung, des Timings und der räumlichen Lokalisierung ermöglicht. Dieses Plug-and-Play-Tropfenformat eignet sich hervorragend für Workflows mit geringem Volumen und hoher Durchsatzleistung, bei der die Erhaltung von Primärzellen und Reagenzien unerlässlich ist⁵.

Jüngste Arbeiten haben die Machbarkeit einer DMF-basierten intrazellulären Abgabe unter Verwendung von Tri-Tropfen-Elektroporationsarchitekturen gezeigt, die lokale, stromarme elektrische Felder erzeugen, um eine effiziente RNP- und mRNA-Abgabe zu gewährleisten und gleichzeitig thermische und elektrochemische Belastung ^6,7,8 zu minimieren. Auf dieser Grundlage aufbauend wurde eine DMF-Elektroporationsplattform der nächsten Generation entwickelt, genannt 'DMF-Ection', mit 48 unabhängig adressierbaren Reaktionsstellen, vollständiger Automatisierungskompatibilität und skalierbarer Patronenfertigung⁽Abbildung 1). Die DMF-Kartusche besteht aus einer unteren PCB-Platte und einer Kunststoffoberplatte, die durch eine Dichtung getrennt sind und über Ausrichtungsschnappsen in einer einzigen korrekten Ausrichtung zusammengesetzt sind (Abbildung 1A). Das 48-Plex-Layout ist in acht identische Familien organisiert (Abbildung 1A–H), von denen jede sechs unabhängig adressierbare Elektroporationsstellen enthält und bis zu 48 parallele Bearbeitungsbedingungen pro Cartridge unterstützt (Abbildung 1B). Führungs-RNA-Bibliotheken werden vor der Montage der Kartusche mit einem Akustikspender auf die Substratoberfläche aufgebracht. Die Positionsgenauigkeit der Ablagerung wurde an allen 48 Standorten bestätigt, wobei sich die Abwurfpositionen innerhalb einer submillimeterlangen Abweichung vom Elektrodenmittelpunkt (Abbildung 1C) gruppierten (Abbildung 1C), was eine zuverlässige RNP-Montage auf der Kartusche unterstützte. Nach dem Laden werden Zellen und Flüssigkeitselektrodentropfen auf der Kartusche aktiviert, um die Tri-Tropfen-Elektroporationsgeometrie zu bilden (Abbildung 1D). Nach der Elektroporation werden die Zellen in Kulturplatten zur Rückgewinnung und nachgeschalteten Analyse entladen, einschließlich Durchflusszytometrie, Sequenzierung und Mikroskopie (Abbildung 1E). Dieses System ermöglicht eine hocheffiziente Genom-Editierung mit bis zu 100-fach weniger Zellen als Standard-Cuvette-basierte Methoden und erweitert den Zugang zur Genomtechnik in Anwendungen mit geringem Input und hoher Durchsatz erheblich.

Diese Studie bewertet die Leistung der Plattform, indem sie mehrere biomolekulare Ladungen liefert, darunter mRNA- und CRISPR–Cas9-Ribonukleoproteinkomplexe (RNP), wodurch eine effiziente Transfektion und Gendisruption erreicht werden. Neben primären T-Zellen bietet DMF-Ection einen verallgemeinerbaren Rahmen zur Abgabe von Nukleinsäuren in komplexe mehrzellige Strukturen. Dreidimensionale (3D) Sphäroide und Organoid-Typ-Modelle stellen aufgrund ihrer Architektur und Fragilität erhebliche Barrieren für das Eindringen von Reagenzien dar, und konventionelle Elektroporationsmethoden stören oft die Morphologie oder erzeugen heterogene Abgabe. Um zu beurteilen, ob die gleichen miniaturisierten Elektroporationsprinzipien wie bei der T-Zell-Bearbeitung auch auf strukturierte Gewebe angewendet werden, wurde der DMF-Workflow auf 3D-HEK293T Sphäroiden angewandt. Diese Experimente zeigten, dass DMF-basierte Elektrobenetzung intakte Sphäroide innerhalb von Tri-Tropfen-Geometrien sanft positionieren und eine einheitliche mRNA-Abgabe unterstützen kann, während Struktur und Wachstum erhalten bleiben. Obwohl diese Ergebnisse außerhalb des hier beschriebenen primären T-Zell-Protokolls liegen, verdeutlichen sie die breitere Anwendbarkeit programmierbarer DMF-Elektroporation für aufkommende 3D-zelluläre Systeme, die für die Wirkstoffforschung und Krankheitsmodellierung relevant sind.

Protocol

Die primären menschlichen T-Zellen, die in diesem Protokoll verwendet werden, wurden von kommerziellen Lieferanten unter der Zustimmung des informierten Spenders und in Übereinstimmung mit den geltenden institutionellen, ethischen und regulatorischen Richtlinien bezogen. Der gesamte Umgang mit menschlichen biologischen Materialien erfolgte gemäß institutionellen Biosicherheitsprotokollen. Forscher, die dieses Protokoll umsetzen, sind dafür verantwortlich, sicherzustellen, dass ihre Verwendung primärer menschlicher Zellen den Anforderungen des lokalen institutionellen Überprüfungsausschusses (IRB) oder des Ethikausschusses, den anwendbaren Biosicherheitsvorschriften und allen relevanten nationalen oder regionalen Gesetzen zur Verwendung menschlichen biologischen Materials entspricht. Mit dem in dieser Studie verwendeten Zellmaterial waren keine patientenidentifizierbaren Informationen verknüpft.

1. Präparation und Aktivierung primärer menschlicher T-Zellen

1. Taue kryokonservierte primäre menschliche CD3⁺-T-Zellen schnell in einem 37 °C Wasserbad. Die Zellen werden in vorgewärmtes basales T-Zellmedium übertragen und 10 Minuten lang bei 180 × g zentrifugiert. Verwerfen Sie das Supernatant und lassen Sie das Pellet in frischem Medium wieder aufhängen.
2. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und -lebensfähigkeit mit einem automatisierten Zellzähler.
3. Resuspendieren Sie die Zellen bei 1 × 10^{6 Zellen} /mL in einem T-Zell-Kulturmedium, ergänzt mit einem löslichen tetramerischen Antikörper CD3/CD28 T-Zell-Aktivatorstimulus (gemäß Herstelleranweisung) und 200 IU/mL IL-2. Zellen 72 Stunden lang bei 37 °C inkubieren, 5 % CO₂.
   HINWEIS: Halten Sie die Zelldichte während der Aktivierung zwischen 0,5–2 × 10⁶ Zellen/mL. Aktivierung in U-unteren 96-Well-Platten führen Sie durch, um den Kontakt zwischen Zelle und Aktivator sowie die Aktivierungseffizienz zu optimieren.

2. Vorbereitung von Leit-RNA-Punkten auf dem DMF-Substrat (akustisches Dispenser-Spotting)

1. Replizierte lyophilisierte sgRNA in nukleasefreiem Wasser auf eine Lagerkonzentration von 100 μM. In einem separaten Röhrchen bereiten Sie einen 100 mg/mL Vorrat Poly-L-Glutaminsäure (PGA, Natriumsalz, MW 15.000–50.000 Da) in nukleasefreiem Wasser vor. Kombinieren Sie sgRNA- und PGA-Bestand mit einem Volumenverhältnis von 5:4 (sgRNA: PGA), was eine endgültige sgRNA-Konzentration von 55,6 pmol/μL und eine endgültige PGA-Konzentration von 44,4 mg/mL in nukleasefreiem Wasser ergibt. Vortex kurzzeitig und Zentrifugieren bei 1.000 × g für 30 Sekunden, Aliquot in Einmalmengen und ungenutzte Aliquots bei −80 °C bis zu 6 Monate lagern.
   HINWEIS: Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.
2. Fügen Sie die Guide-PGA-Mischung auf eine akustische Quellplatte mit niedrigem Dead-Volume in Brunnen hinzu, die dem gewünschten Reaktionsstellenlayout entsprechen.
3. Übertragen Sie 40 nL (entspricht 2,2 pmol sgRNA) der Guide-PGA-Mischung in jede Ziel-Spotting-Region des DMF-Substrats mit einem kalibrierten Akustikspender.
   HINWEIS: Bei 55,6 pmol/μL liefert 40 nL 2,2 pmol sgRNA pro Stelle (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Getrocknete Führungen werden beim Tropfenzusammenführen auf der Kartusche wieder zusammengesetzt; Eine vollständige Wiederherstellung wird durch eine konstante Bearbeitungseffizienz über alle Seiten hinweg bestätigt.
4. In einem biologischen Sicherheitsschrank lassen Sie die gefleckten Tröpfchen vollständig bei Zimmertemperatur an der Luft trocknen, bis keine sichtbare Flüssigkeit mehr übrig bleibt (ca. 5 Minuten).
   HINWEIS: Verwenden Sie keinen erzwungenen Luftstrom oder Hitze, da dies die Führungs-RNA lösen oder abbauen kann.
5. Setze die DMF-Kartusche zusammen.
   1. In einem biologischen Sicherheitsschrank richtet man die obere Platte über dem gepunkteten Substrat aus, indem man die asymmetrischen Kunststoff-Snap-Merkmale von der oberen Platte mit den Kerben an der unteren Platte abgleicht. Üben Sie gleichmäßigen, gleichmäßigen Druck entlang der kurzen Kanten aus, bis ein deutlicher mechanischer Schnapp spürbar ist, um das vollständige Eingreifen der Verriegelungsfunktionen zu bestätigen.
      HINWEIS: Die Patrone ist mit einer einzigen korrekten Ausrichtung konstruiert; Falsche Montage führt nicht zu dem Snap. Halten Sie die Substrate jederzeit an den Rändern, um Verunreinigungen oder Schäden an funktionalen Oberflächen zu vermeiden und zu vermeiden, dass die Substrate gegeneinander rutschen, da dies die Oberflächenbeschichtungen zerkratzen könnte.
   2. Checkpoint: Bestätigen Sie die korrekte Montage durch den mechanischen Druckknopf.
      HINWEIS: Es gibt keinen elektrischen Vorlaufindikator für die Beschichtungsintegrität; etwaige funktionale Ausfälle, die durch eine fehlerhafte Montage entstehen, werden automatisch erkannt und im nachträglichen Qualitätskontrollbericht gemeldet.
      Pausepunkt: Bewahren unbenutzte montierte Kartuschen in einer versiegelten Verpackung mit Trockenmittel (Siliziumgelpäckchen) bei Raumtemperatur bis zu 48 Stunden auf.

3. Zellvorbereitung

1. Bereiten Sie vor jeder Anwendung 1 ml Complete Transfction Buffer frisch vor, indem Sie einen DMF-kompatiblen Elektroporationspuffer mit dem bereitgestellten biokompatiblen nicht-ionischen Tensid im Verhältnis 20:1 (v/v) kombinieren (Elektroporationspuffer: Tensid), was eine Endkonzentration von 0,05 % (v/v) ergibt. Sanft verrühren und auf Eis legen.
   HINWEIS: Der hier verwendete DMF-kompatible Transffektionspuffer ist ein isotoner Puffer mit niedriger Leitfähigkeit (Leitfähigkeit: 3,5 mS/cm, Osmolalität: 305 mOsm/L). Forscher, die alternative Puffer verwenden, sollten die Kompatibilität mit der DMF-Aktivierung und der Zellviabilität überprüfen. Das biokompatible nicht-ionische Tensid dient dazu, Tröpfchenstiftungen zu reduzieren; wird das bereitgestellte Tensid nicht verwendet, ein geeigneter Ersatz.
2. Waschen Sie aktivierte T-Zellen einmal mit Transfektionspuffer (ohne Tensid). Zentrifugiere mit 180 × g für 5 Minuten, aspiriere das Supernatant und suspendiere das Zellpellet in einem vollständigen Transfektionspuffer (mit Tensid) bei 1,0 × 10^{7 Zellen} /mL in einem Gesamtvolumen von 100 μL pro Kartusche. Bleib auf Eis.
3. Unmittelbar vor dem Laden auf die Kartusche wird Cas9-Nuklease direkt zu den 100 μL T-Zell-Suspension gegeben und durch sanftes Pipettern gemischt; Bleib auf Eis.
   HINWEIS: Für primäre T-Zellen wird Cas9 mit 42 pmol pro 100 μL Patronenvolumen (0,42 pmol/μL) geladen. Jede Elektroporationsstelle verarbeitet etwa 1 μL Zellsuspension und liefert 0,42 pmol Cas9 pro Edit. Optimieren Sie diese Dosierung, wenn Sie sich an andere Immunzelltypen anpassen (siehe Tabelle 1).

Komponente	Endgültige Konzentration pro Bearbeitung
Cas9	0,42 pmol in ~1 μL Tropfen
sgRNA	2,1 pmol (aus 40 nL Spot)
PGA	44,4 mg/mL Fond in Spotting-Mischung
Tensid	0,05 % (v/v)
Zelleingabe	~10.000 Zellen

Tabelle 1: Zusammenfassende Tabelle der Endkonzentrationen in jedem Transfektionstropfen.

4. Transfektion auf der DMF-Eckionsplattform

1. Mit einer Mehrkanal-Pipette wird 10 μL des T-Zellen/Cas9-Gemisch in jeden der 8 Zellen-Ladeports und 10 μL vollständigen Transfektionspuffer in die 16 Flüssigkeitselektroden-Ladeports (wie in Abbildung 1 dargestellt) gegeben.
2. Stellen Sie die Spannung auf 500 V, die Pulsdauer auf 3 ms und die Anzahl der Impulse auf 2 ein. Initiieren Sie die Elektroporationssequenz gemäß den Plattformanweisungen.
   1. Checkpoint: Überprüfen Sie den QC-Bericht nach dem Durchlauf unmittelbar. Sporadische Versagen (<10 % der Standorte) erfordern keine Intervention. Wenn die Fehler systematisch sind, ersetzen Sie die Kartusche durch die mitgelieferte Qualitätskontrolle, führen Sie die System-Gesundheitsprüfung durch (~2 Min) und wenden Sie sich an den technischen Support, falls die Probleme bestehen.

5. Entlastung und Wiederherstellung bearbeiteter T-Zellen

1. Mit einem Flüssigkeitsbehandler werden elektroporierte Zellen von jeder Reaktionsstelle in eine 96-Well-U-Bodenplatte mit 150 μL vorgewärmtem basalem T-Zellmedium mit 200 IU/mL IL-2 übertragen.
2. Inkubieren Sie die Zellen 72 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂, um den Proteinwechsel und Veränderungen der Oberflächenrezeptorexpression zu ermöglichen.

6. Flowzytometrieanalyse des TRAC-Knockouts

1. Transfert der Zellen auf eine sterile 96-Well-konische Bodenplatte, um den Zellverlust zwischen den Washes zu reduzieren. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Flow Cytometry Buffer (1× PBS, 2 % FBS, 2 mM EDTA) durch Zentrifugation bei 400 × g für 5 Minuten und Entfernen des Überlagerungsmittels durch vorsichtiges Invertieren der konischen Bodenplatte. Die Zellen bleiben in der Platte pelletiert.
2. Bereiten Sie eine Oberflächenfärbungs-Mastermischung mit Anti-CD4-, Anti-CD8- und Anti-TCRα/β-Antikörpern in einem Flow Cytometry Buffer in herstellerempfohlenen Konzentrationen vor. Fügen Sie pro Brunnen 25 μL des Master-Gemisch hinzu und inkubieren Sie 20 Minuten bei 4 °C, geschützt vor Licht. Waschen Sie zweimal mit 1× PBS (ohne FBS) durch Zentrifugation bei 400 × g für 5 Minuten. Cellen in 100 μL 1× PBS mit einem Viabilitätsfarbstoff bei 1:1.000 (v/v) neu suspendieren und 10 Minuten bei lichtgeschützter Raumtemperatur inkubieren.
   HINWEIS: Kegelförmige Bodenplatten sind effektiv beim Pelletieren von Zellen; Überprüfen Sie, ob die Zellen in allen Schritten gut aufgehängt sind.
3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Flowzytometriepuffer und suspendieren Sie sie in 150–200 μL pro Probe zur Aufnahme.
4. Konfigurieren Sie das Zytometer mit geeigneten Laserleitungen und Filtersätzen für die verwendeten Fluorochrome (z. B. 488 nm Anregung für Wirksamkeitsfarbstoff; 405 nm oder 488 nm für Oberflächenmarker, je nach Anwendung). Stellen Sie die Spannungen mit Single-Stain-Kompensationskontrollen und einer unverfärbten Probe ein. Sammeln Sie mindestens 5.000 Live-Singlet-Events pro Probe. Gatet sequentiell auf: Streu-Singlets → lebenden Zellen (Viability-Farbstoff-negativ) → CD4⁺ oder CD8⁺ → TCRα/β-Expression.
   HINWEIS: Unter Standardbedingungen können die insgesamt erfassten Live-Ereignisse zwischen 5.000 und über 10.000 pro Probe liegen, nachdem die Zellen beim Waschen und Färben verloren haben, vorausgesetzt, die Zellen hatten Zeit zur Vermehrung.
5. Bestimmung der TRAC-Genstörung durch Messung der Häufigkeit von TCRα/β-negativen Zellen in den CD4⁺- und CD8⁺-Populationen. Berichte die Knockout-Effizienz als Prozentsatz der TCRα/β-negativen Zellen relativ zum Live-Singlet-Gate für jede Teilmenge.

Results

Erwartete Ergebnisse
Die Elektroporation von 10.000 aktivierten T-Zellen pro Bedingung führt typischerweise zu >85 % TRAC-Knockout-Effizienz mit >95 % Lebensfähigkeit 72 Stunden nach der Transfektion. Die Durchflusszytometrie zeigt einen deutlichen Verlust der TCRα/β-Färbung im TRAC-Zielzustand im Vergleich zu nicht-zielenden sgRNA-Kontrollen (NTC) und Kontrollen, die keinem elektrischen Feld ausgesetzt sind. Sofern nicht anders angegeben, steht n für unabhängige DMF-Lektionsläufe, die an verschiedenen Tagen durchgeführt werden. Technische Replikate aus demselben Cartridge-Lauf wurden vor der statistischen Analyse gemittelt und tragen nicht unabhängig zu n bei. Alle hier berichteten T-Zell-Experimente wurden mit kryokonservierten Zellen durchgeführt, die von einem einzelnen gesunden Spender stammten. Die Spender-zu-Spender-Variabilität mit derselben Plattform wird weiter^{charakterisiert 9}.

Verbesserte Stabilität des Cas9–sgRNA-Ribonukleoproteins unter Elektroporationsbedingungen aufgrund anionischer Polymerzusätze
Eine zentrale Designanforderung der digitalen Mikrofluidik ist eine hochgradig hydrophobe Oberfläche, die es den Tröpfchen ermöglicht, während des Elektrobenetzens frei zu gleiten. Obwohl diese Eigenschaft für Tröpfchenbewegung und präzise Aktivierung unerlässlich ist, stellt sie Herausforderungen für die Beladung der Reagenzen dar. Für Arrayed-Screening-Anwendungen ist es entscheidend, dass benutzerdefinierte Nutzlastbibliotheken direkt auf die Cartridge-Oberfläche abgelagert werden können. Dies ermöglicht es, dass Reagenzien-Layouts das Bibliotheksdesign des Benutzers widerspiegeln und sicherstellt, dass der digitale mikrofluidische Workflow nahtlos arrayed Experimente ohne zusätzlichen Transfer oder manuelle Eingriffe durchführen kann. Das Nano-Dispensieren mit einem akustischen Dispenser eignet sich für diese Aufgabe hervorragend, da es Nanolitervolumina mit hoher Positionsgenauigkeit über große Arrays auf verschiedene Oberflächen liefern kann. Wenn Tröpfchen jedoch auf eine hydrophobe Kartuschenoberfläche treffen, prallen sie oft ab, perlen sich oder breiten sich nicht gleichmäßig aus, was zu einer inkonsistenten Ablagerung und Rückgewinnung führt. Diese Variabilität zeigt sich am deutlichsten bei intermediären Tröpfchenvolumina von 40 nL bis 120 nL (Abbildung 2A, n = 3 pro Bedingung, *** p-Wert < 0,01), wo angenommen wird, dass die kinetische Energie des Tröpfchens hoch genug ist, um einen Rückprall zu verursachen, die Oberflächenadhäsion jedoch nicht ausreicht, um die Flüssigkeit zu verankern. Daher kann die direkte Ablagerung auf der Kartusche bei höheren Nutzlastdosierungen ohne weitere Modifikationen unzuverlässig sein. Um diesen Effekt zu mildern, wurden Reagenzien mit dem biosicheren Polymer Poly-L-Glutaminsäure (PGA) ergänzt. PGA ist ein biologisch abbaubares, negativ geladenes Polypeptid, das weit verbreitet als Stabilisator in pharmazeutischen Formulierungen verwendet wird und eine ausgezeichnete Kompatibilität für Lebendzell-Workflows aufweist. Es wird angenommen, dass das geladene Rückgrat den Kontaktwinkel des Tropfens verringert und eine gleichmäßigere Ausbreitung fördert, wodurch der Rückstoß reduziert und die Oberflächenhaftung verbessert wird. Mit vorhandenem PGA skalierten die abgesetzten Fluoresceinvolumen linear mit der Absorption, und die Varianz wurde zwischen den Patronen deutlich reduziert. Statistische Analysen bestätigten, dass PGA die Reproduzierbarkeit bei 40, 90 und 120 nL Spotting-Volumina signifikant verbesserte (***p < 0,001, ****p < 0,0001), während sehr kleine Tröpfchen (10–20 nL) kaum Unterschiede zeigten, da der Rebound bei niedrigen kinetischen Energien weniger ausgeprägt ist.

Anschließend wurde die Zugabe von Polymerzusätzen, die im DMF-Workflow verwendet werden, hinsichtlich ihres Einflusses auf das Verhalten von Cas9–sgRNA-Ribonukleoproteinen (RNP) unter den für die Elektroporation verwendeten Pufferbedingungen mit geringem Volumen bewertet. Zu diesem Zweck wurde eine Flow-Induced Dispersion Analysis (FIDA)-Technologie eingesetzt. FIDA wurde ausgewählt, da es eine genaue Lösungsphasenmessung des hydrodynamischen Radius und der Bindungsaffinität liefert und so die Protein-Nukleinsäure-Interaktionen unter denselben Pufferbedingungen wie in experimentellen Umgebungen quantifizieren können. FIDA zeigte, dass freie sgRNA einen hydrodynamischen Radius (Rh) von 3,45 ± 0,26 nm aufweist, was mit einer kleinen, einsträngigen RNA-Spezies übereinstimmt. Die Titration mit Cas9 erzeugte einen stabilen RNP-Komplex mit einer Rh von 15,32 ± 0,46 nm und einer subnanomolaren Bindungsaffinität (KD = 0,70 ± 0,14 nM) (Abbildung 2).

Um die Wirkung der Polymerstabilisierung zu bewerten, wurde vor der RNP-Bildung Poly-L-Glutaminsäure (PGA) zur Guide-RNA hinzugefügt. Das Vorhandensein von PGA verringerte die scheinbare Affinität zwischen Cas9 und sgRNA (K_D = 67,7 ± 9,5 nM) und verringerte die Komplexgröße auf etwa 10 nm (Abbildung 2A, rechtes Panel). Obwohl die reduzierte Affinität auf weniger eng assoziierte Komplexe hindeutet, zeigte das kleinere und gleichmäßigere R_h darauf hin, dass PGA die Bildung übergroßer RNP-Assemblies verhindert (Abbildung 2B).

Anschließend wurde die RNP-Stabilität unter Elektroporationsbedingungen mittels Taylor-Dispersionsanalyse bewertet (Abbildung 2C). Ohne Polymer erzeugten Cas9–sgRNA-Mischungen breite, schlecht angepasste Taylorgramme, die auf Aggregation hinweisen (Abbildung 2B). Im Gegensatz dazu ergab die Zugabe von 0,0025 mg/mL PGA wohldefinierte, monodisperse Dispersionsprofile (R² = 0,999) mit R_h ~ 9,6 nm. Diese Ergebnisse zeigen, dass PGA Aggregation verhindert und die RNP-Gleichmäßigkeit verbessert, wodurch reproduzierbare Elektroporation im Nanolitermaßstab unterstützt wird. Diese Stabilisierung liefert eine mechanistische Begründung für die hohen Bearbeitungseffizienzen, die in nachgelagerten T-Zell-Experimenten beobachtet wurden.

Dosisabhängige Bearbeitungseffizienz in primären T-Zellen.

Obwohl FIDA-Experimente zeigten, dass PGA die Effizienz der RNP-Assemblierung verringert, wurde angenommen, dass die Ergebnisse der funktionellen Editierung weniger beeinflusst sind, da Elektroporation typischerweise mit überschüssiger Guide-RNA im Vergleich zu Cas9 durchgeführt wird. Daher wurde das PGA–RNP-Eingangsvolumen hinsichtlich der Auswirkungen auf die Knockout-Effizienz in primären menschlichen T-Zellen am TRAC-Lokus bewertet (Abbildung 2D). Über vier Patronen hinweg war die Bearbeitungseffizienz konstant hoch (>75–80 %) bei RNP-Eingängen von 40 nL (2,1 pmol), 20 nL (1,05 pmol) und 10 nL (0,53 pmol), mit minimaler Variabilität zwischen CD4^+- und CD8⁺ -Untermengen. Selbst bei 5 nL (0,26 pmol) blieb die Bearbeitung robust, obwohl eine moderate Reduktion im Vergleich zu höheren Dosen beobachtet wurde. Bei der niedrigsten getesteten Dosis (2,5 nL, 0,13 pmol) nahm die Bearbeitungseffizienz deutlich ab und erreichte ein Plateau von etwa ~60 % TRAC KO. Die Kontrollen bestätigten die Spezifität der Bearbeitung: Keine Elektroporationsbohrungen (0V) und Off-Cartridge-Steuerungen (OCC) zeigten nur Hintergrund-Knockout. Die erhöhte TCR-negative Frequenz, die in der Off-Cartridge-Control (OCC) CD8⁺-Population beobachtet wurde, spiegelt wahrscheinlich eine donorspezifische Baseline-TCR-Absenkung nach der Aktivierung wider, unabhängig von Elektroporation oder Genbearbeitung, da diese Zellen der Kartusche nicht ausgesetzt waren. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass DMF-Ection eine effiziente, CRISPR-vermittelte Bearbeitung bei nanolitergroßen RNP-Eingaben ermöglicht. Wichtig ist, dass die Bearbeitung zwischen CD4^+- und CD8^+- T-Zellen vergleichbar war, was die Anwendbarkeit der Plattform über T-Zell-Teilmengen hinweg unterstreicht und nahelegt, dass die RNP-Nutzung um mehr als eine Größenordnung reduziert werden kann, ohne die Knockout-Effizienz zu beeinträchtigen.

Effiziente Genstörung in primären CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen mittels miniaturisierter DMF-Ektion
Um die Leistung des DMF-Ection-Workflows tiefer zu validieren, wurde der CRISPR–Cas9-vermittelte Knockout des TRAC-Locus in primären menschlichen CD4⁺- und CD8⁺-T-Zellen mit nur 10.000 aktivierten Zellen pro Erkrankung untersucht. Drei experimentelle Gruppen wurden eingeschlossen: die TRAC-Targeting-Guide-Bedingung (TRAC KO), eine Non-Targeting-Kontrolle (NTC) zur Berücksichtigung unspezifischer Effekte der RNP-Abgabe und eine Off-Cartridge-Kontrolle (OCC) zur Etablierung der Ausgangs-TCRα/β-Expression in unbehandelten, unmanipulierten Zellen. Eine Standard-Gating-Strategie wurde angewandt, um lebende Singlets zu identifizieren, gefolgt von CD4⁺- und CD8⁺-Teilmengen sowie TCRα/β-Expression (Abbildung 3A). Eine hocheffiziente Genstörung des TRAC-Locus wurde in beiden T-Zell-Subsets über 40 unabhängige Elektroporationsläufe hinweg erreicht. In CD4⁺-T-Zellen erreichte die TRAC-Knockout-Effizienz 88,4 ± 4,9 %, verglichen mit 3,2 ± 4,7 % bei NTC und 9,8 ± 5,1 % bei OCC-Bedingungen. Ein vergleichbares Ergebnis wurde in CD8⁺ T-Zellen beobachtet, wobei TRAC KO 89,8 ± 4,2 % gegenüber 4,2 ± 7,4 % (NTC) und 20,2 ± 4,9 % (OCC) erreichte (Abbildung 3B, links). Wichtig ist, dass die Elektroporation unter den Bedingungen keine wesentliche Zytotoxizität verursachte. Die Lebensfähigkeit überstieg in allen Gruppen 96 %, ohne signifikanten Unterschied zwischen TRAC KO (97,1 ± 1 %), NTC (96,8 ± 1 %) und OCC (97 ± 1 %) (Abbildung 3B, rechts). Zusammen zeigen diese Daten, dass die DMF-Elektroporation robuste, hocheffiziente TRAC-Störungen ermöglicht und gleichzeitig die zelluläre Lebensfähigkeit über mehrere unabhängige Strecken erhält. Primäre menschliche T-Zellen wurden aus kommerziellen Quellen mit informierter Zustimmung des Spenders und gemäß institutionellen und anbieterlichen ethischen Richtlinien gewonnen.

Umgang mit HEK293T Sphäroiden mit digitaler Mikrofluidik
Anschließend wurde der digitale mikrofluidische Elektroporations-Workflow für Anwendungen mit mehrzelligen dreidimensionalen Strukturen bewertet. Hohle HEK293T Sphäroide wurden gebildet, indem etwa 100 Zellen pro Bohrloch in Mikroplatten mit niedriger Haftung eingesat und 24 Stunden lang kultiviert wurden, um die Sphäroidbildung zu ermöglichen (Abbildung 4A). Geformte Sphäroide wurden anschließend gesammelt, wieder aufgehängt und zur Elektroporation auf die digitale Mikrofluidik-Kartusche geladen. Nach der Behandlung wurden die Sphäroide in eine 96-Well-Platte zur nachgelagerten Bildgebung und Wachstumsanalyse ausgelagert.

Um eine durchschnittliche Rückgewinnung von einem Sphäroid pro Bohrloch nach der Elektroporation zu erreichen, wurde absichtlich eine übermäßige Anzahl von Kugeln auf die Patrone geladen, um Materialverluste während der Handhabung und des Transfers auszugleichen. Ungefähr 192 Sphäroide wurden in 100 μL Elektroporationspuffer wieder aufgehängt und auf die Patrone geladen. Jede Reaktionsfamilie erhielt ~9,3 μL der Suspension, was ~18 Sphäroiden entspricht, wobei einzelne Tröpfchen ~1 μL enthielten (1–2 Sphäroide pro Tropfen). Da etwa die Hälfte der Sphäroide während des Patronenbetriebs im Ladeport blieb, führte diese Ladestrategie zu durchschnittlich ~1 Sphäroid pro Tri-Tropfen-Elektroporationsstelle.

Die Analyse der Sphäroidrückgewinnung zeigte, dass 0–1 Sphäroide typischerweise pro Bohrloch nach der Elektroporation entlastet wurden, was etwa 4–6 Sphäroiden pro Reaktionsfamilie entspricht (Abbildung 4B im linken Panel). Diese Rückgewinnung ist niedriger als das theoretische Maximum und spiegelt Verluste wider, die während des Waschens, der Aspiration des Überlagerungsstoffs und dem Zurückbleiben der Sphäroide im Ladeport auftreten. Diese Verluste werden auf den kleinen Sphäroiddurchmesser (~100 μm) und die inhärente Schwierigkeit zurückgeführt, die gleichmäßige Verteilung nicht-einzelliger Strukturen innerhalb der Suspension aufrechtzuerhalten. Infolgedessen bleiben einige Sphäroide ungleichmäßig verteilt oder gelangen nicht in den Tri-Tropfen-Bereich. Das Laden einer übermäßigen Anzahl von Sphäroiden stellte sicher, dass an den meisten Elektroporationsstellen mindestens ein Sphäroid vorhanden war, was eine konsistente nachgelagerte Analyse ermöglichte, wie durch die mikroskopische Bildgebung des DAPI-gefärbten Sphäroids in der Mikrofluidik-Kartusche gezeigt wurde (Abbildung 4B, rechter Panel). Eine weitere Prozessoptimierung kann die Anzahl der für eine äquivalente Wiederherstellung erforderlichen Sphäroiden verringern. Trotz dieser Handhabungsverluste ermöglichte der Arbeitsablauf eine sanfte Positionierung intakter Sphäroide innerhalb der Tri-Tropfen-Elektroporationsgeometrie.

EGFP-mRNA-Lieferung und Lebensfähigkeit in HEK293T Sphäroiden
Eine effiziente Abgabe von EGFP-mRNA in HEK293T Sphäroide wurde nach der Elektroporation (50 ng GFP-mRNA pro Sphäroid) beobachtet. Die 24 Stunden nach der Elektroporation durchgeführte Fluoreszenzmikroskopie zeigte eine robuste und räumlich gleichmäßige GFP-Expression in den elektroporierten Sphäroiden, während unter 0-V- oder Off-Cartridge-Kontrollbedingungen keine nachweisbare Fluoreszenz beobachtet wurde (Abbildung 4C, linkes Panel). Eine quantitative Analyse der normalisierten mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) pro sphäroidem Bereich bestätigte eine erfolgreiche Transfektion unter beiden getesteten Elektroporationsparametersätzen (Abbildung 4C, mittleres Panel). Konkret zeigten Sphäroide, die bei 500 V, 2 ms und 2 Pulsen elektroporiert wurden, einen MFI von 6,96 × ^10-5 ± 3,50 × ^10-5, während solche, die bei 375 V, 6 ms und 1 Puls elektroporiert wurden, einen MFI von 5,05 × ^10-5 ± 3,29 × ^10-5 aufwiesen. Unter Kontrollbedingungen wurde keine messbare Fluoreszenz festgestellt (0 ± 0). Beide Elektroporationsbedingungen führten zu einer signifikant höheren Fluoreszenz im Vergleich zu Kontrollen (p < 0,05), ohne statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Pulsparametern. Um zu beurteilen, ob die Elektroporation das Sphäroidwachstum oder die strukturelle Integrität negativ beeinflusst, wurden die Sphäroiddurchmesser täglich über 5 Tage nach der Behandlung gemessen. Elektroporierte Sphäroide zeigten Wachstumskinetiken, die mit unbehandelten Kontrollen vergleichbar ist, was darauf hindeutet, dass die mRNA-Transfektion die Sphäroidlebensfähigkeit oder Proliferationskapazität nicht beeinträchtigte (Abbildung 4C, rechtes Panel). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die digitale mikrofluidische Elektroporation eine effiziente mRNA-Abgabe in intakte mehrzellige Sphäroide ermöglicht, während strukturelle Integrität und Wachstum erhalten bleiben, was die Machbarkeit unterstützt, diese Plattform auf dreidimensionale zelluläre Modelle auszuweiten.

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert. Die statistische Signifikanz wurde mittels Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Korrektur für Mehrfachvergleiche bestimmt, mit einer Signifikanzschwelle von p < 0,05. N Werte repräsentieren unabhängige biologische Replikate (separate Spender oder unabhängige Kartuschenläufe), wie in der Abbildung angegeben.

Abbildung 1. Architektur und Arbeitsablauf der DMF-Elektroporationsplattform. (A) Foto der DMF-Patrone. (B) Annotierter Schaltplan des zusammengesetzten 48-Plex-Kassettenlayouts (mittleres Bild), das die (A–H)-Organisation von acht identischen Familien zeigt, von denen jede sechs unabhängig adressierbare Elektroporationsstellen enthält, mit beschrifteten Flüssigkeitselektroden-Lade-, Zell-Lade-, Anode-, Kathoden- und Nanopunkt-Regionen (linkes Inset-Bild). Wichtige Merkmale, darunter Ladeanschlüsse, Entladeanschlüsse und Montageschnapps, sind gekennzeichnet. Die Patrone wird zusammengesetzt, indem die beiden Platten in einer einzigen korrekten Ausrichtung eingesteckt werden, bis ein deutlicher mechanischer Eingriff spürbar ist. Rechtes Bild: Flüssigkeitsbehandler-Dispense-Karte, die farbcodierte Positionen für Ladeports (rot), Entladeports (pink) und Zielortung (blau) zeigt. (C) Links: Bild, das die Positionsgenauigkeit der akustischen Dosierung an allen 48 Stellen (n = 48) zeigt, wobei die Abwurfpositionen relativ zum Elektrodenmittelpunkt (mm) dargestellt werden. Die enge Clusterung bestätigt die Ablagerungsgenauigkeit bei Submillimetern. Rechts: repräsentative Bilder, die einen korrekt zentrierten Punkt vor der Rehydrierung durch den Zelltropfen (oben) und während der Rehydratation zeigen, wo der Tropfen hin und her bewegt wird, wo der Führer zum Wiederschweben ist (unten, roter Pfeil). (D) Draufsichtsbild diskreter Elektroporationsregionen, das die schrittweise Bewegung der Tröpfchen von (i) der Rehydratation der Nutzlast durch Hin- und Herschieben des Tropfens über die abgelagerte Leit-RNA, (ii) Bewegung zur Elektroporationsstelle zwischen Anode und Kathode zeigt, wo der Zelltropfen mit den beiden flankierenden flüssigen Elektrodentropfen überbrückt und gepulst wird, und (iii) der vollständige Tri-Drop, der sich vor der Bergung durch den Flüssigkeitsbehandler zu seinem Entladeport bewegt. (E) End-to-End-Workflow-Schaltplan. Führungs-RNA wird mit einem akustischen Spender auf das Patronensubstrat aufgebracht. Zellen und Nutzlast werden vorbereitet und mit einem automatisierten Flüssigkeitsbehandler auf die Kartusche geladen. Die Elektroporation erfolgt auf der DMF-Plattform. Die Zellen werden in eine 96-Well-Platte entladen und zur Bergung in einen Inkubator überführt. Die nachgelagerte Analyse erfolgt mittels Durchflusszytometrie, Mikroskopie, Next-Generation-Sequenzierung oder anderen geeigneten Auswertungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2. Auswirkungen der Polymer-Supplementierung auf Ablagerung und RNP-Assemblierung. (A) Die Polymersupplementierung verbessert die Genauigkeit der akustischen Abscheidung. Fluoresceinabsorption nach Ablagerung und Rekonstitution über vier unabhängige Kartuschen, mit oder ohne Poly-L-Glutaminsäure. Die Varianz wurde bei Zwischenmengen (40–120 nL) in Anwesenheit von PGA reduziert. 
(B) Einfluss von PGA auf die Cas9–sgRNA-Assemblierung. FIDA-Affinitätsbindungskurven messen den hydrodynamischen Radius (Rh) im Fehlen (linkes Panel) oder in Anwesenheit (rechtes Panel) von PGA. Freie sgRNA zeigte eine Rh von 3,45 ± 0,26 nm, während die Cas9-Titration eine RNP-Komplexgröße von 15,32 ± 0,46 nm ergab (Kd = 0,70 ± 0,14 nM). Die Zugabe von PGA verringerte die Komplexgröße und schwächte die Bindungsaffinität auf konzentrationsabhängige Weise. Mit der Zugabe von 0,005 mg/mL PGA zeigte freie sgRNA eine Rh von 4,31 ± 0,07 nm, während die Cas9-Titration eine RNP-Komplexgröße von 10,21 ± 0,38 nm (K ergab)_d = 67,7 ± 9,5 nM). Die Experimente wurden in einem elektroporations-Puffer mit niedriger Leitfähigkeit und 0,05 % pluronischem F-68 durchgeführt. Die Fluoreszenz wurde bei 480 nm mit dem integrierten LED-Modul nachgewiesen. Für alle Experimente wurde eine dauerhaft beschichtete Kapillare (Ø 75 μm, L = 100 cm) verwendet. Um die Wirkung polyanionischer Polymere auf die RNP-Montage zu testen, wurde PGA zu Testgemischen bei Konzentrationen von 0,0025 mg/mL und 0,005 mg/mL hinzugefügt. Diese Bedingungen wurden ausgewählt, um den Bereich zu modellieren, der in digitalen Mikrofluidik-Elektrowetting- und Elektroporationspuffern verwendet wird. Für die direkte Bindungsanalyse wurde 10 nM FAM-markierte sgRNA, die auf das TRAC-Locus zielt, als fluoreszierender Indikator verwendet. Steigende Konzentrationen von Cas9-Nuklease (bis zu 500 nM) wurden in einem CapMix-Test gegen den Indikator getitriert, um Dispersionsprofile für die Komplexbildung zu erstellen. Alle Experimente wurden bei 25 °C durchgeführt, wobei jeder Datenpunkt 40 nL Indikator und ~12 μL Analyt (Cas9) verbrauchte. Die Experimente wurden mit folgender Reihenfolge durchgeführt: (1) Spülen mit 0,1 % Phosphorsäure bei 3.500 mbar für 30 Sekunden; (2) Spülung mit Prüfpuffer bei 3.500 mbar für 30 Sekunden; (3) die Kapillare mit Analyt bei 3.500 mbar für 20 Sekunden zu füllen; (4) Einspritzung des Anzeigers bei 50 mbar für 10 Sekunden; (5) Mobilisierung und Messung mit Analyten bei 400 mbar für 180 Sekunden. Hydrodynamische Radien wurden berechnet, indem die extrahierte Spitzenbreite bei der Hälfte der maximalen Spitzenhochhöhe und Dissoziationskonstanten (K_D) wurden durch nichtlineare Regressionsanpassung an ein 1:1-Bindungsmodell bestimmt. (C) Einfluss von PGA auf die Stabilität des RNP. Taylor-Dispersionsprofile von Cas9–sgRNA-Komplexen mit und ohne PGA, durchgeführt mit 500 nM Cas9-Nuklease und 50 nM FAM-markierten sgRNA. Ohne PGA wurde kein stabiler Komplex beobachtet, was sich an der zunehmenden Bildung großer Aggregate sowie einem abnehmenden Signal des Komplexes im Laufe der Zeit (links) zeigt. Die Zugabe von 0,0025 mg/mL PGA ergab ein wohldefiniertes, monodisperses Taylorgramm mit minimaler Aggregation von R_h ~ 9,6 nm (R² = 0,999, richtig). Die komplexe Stabilität wurde unter Standard-Elektroporationsbedingungen (500 nM Cas9 + 50 nM sgRNA) mit oder ohne 0,0025 mg/mL PGA bewertet. Die Proben wurden vorgemischt und bei 4 °C im Einlassprobenbehälter gehalten, während die Injektionen in 10-minütigen Abständen über mehrere Stunden durchgeführt wurden. Die Experimente wurden mit folgender Reihenfolge durchgeführt: (1) Spülen mit 0,1 % Phosphorsäure bei 3.500 mbar für 30 Sekunden; (2) Spülung mit Prüfpuffer bei 3.500 mbar für 30 Sekunden; (3) die Kapillare mit Analyt (Assay-Puffer) bei 3.500 mbar für 20 Sekunden füllen; (4) Einspritzung des Anzeigers bei 50 mbar für 10 Sekunden; (5) Mobilisierung und Messung mit Analyten bei 400 mbar für 180 Sekunden. Eine instabile Komplexbildung zeigte sich durch die Bildung großer Aggregate (Spitzen im Taylorgramm) und abnehmendes Signal. Stabile Komplexe wurden durch gut angepasste, monodisperse Taylorgramme identifiziert (R² > 0,99), und R_h Werte wurden aus angepassten Profilen extrahiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3. TCR-Alpha/Beta-Knockout-Effizienz und Lebensfähigkeit in primären menschlichen T-Zellen. (A) Repräsentative Durchflusszytometrie-Gating-Strategie für lebende Singlets, CD4⁺- und CD8⁺-T-Zell-Subsets sowie TCRα/β-Expression in kontrollierten (nicht-zielgerichteten sgRNA) und experimentellen (TRAC sgRNA) Bedingungen. Die Zellen wurden sequentiell an FSC/SSC, Singlets, Viability und CD4⁺- oder CD8⁺-Populationen vor der Bewertung der TCRα/β Oberflächenexpression gegatt. (B) Links: TCRα/β Knockout-Effizienz in CD4⁺- und CD8⁺-T-Zell-Subsets unter drei Bedingungen: TRAC KO, Non-Targeting Control (NTC) und Off-Cartridge Control (OCC). CD4⁺: TRAC KO = 88,4 ± 4,9 % (n = 40), NTC = 3,2 ± 4,7 % (n = 24), OCC = 9,8 ± 5,1 % (n = 18). CD8⁺: TRAC KO = 89,8 ± 4,2 % (n = 40), NTC = 4,2 ± 7,4 % (n = 24), OCC = 20,2 ± 4,9 % (n = 18). Rechts: Post-Elektroporations-Viabilität unter allen Bedingungen, mit Singlets abgeschlossen. Viabilität: TRAC KO = 97,1 ± 1 % (n = 40), NTC = 96,8 ± 1 % (n = 24), OCC = 97 ± 1 % (n = 18). Einzelne Datenpunkte werden mit Mittelwert und SD dargestellt. n steht für unabhängige Elektroporationsläufe über mehrere Patronen und Tage hinweg. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4. Effiziente mRNA-Abgabe in HEK293T Sphäroide mittels DMF-Ection. (A) Workflow-Diagramm, das den Prozess der Bildung von Sphäroiden und der Durchführung sphäroider Transfektion beschreibt. Hundert HEK293T Zellen werden pro Brunnen in eine spezialisierte sphäroide Mikroplatte geladen und 24 Stunden lang kultiviert, um Sphäroide mit einem Durchmesser von 100 μm zu bilden. Sphäroide (192) werden entladen und in 100 μL Transfektionspuffer wieder suspendiert. Diese Federung wird mit entsprechender Nutzlast mit 9,3 μL pro Familie auf die geführte DMF-Ection-Kartusche geladen. Sobald die Elektroporation erfolgt, werden die Proben in eine 96-Bohrloch-Platte zur nachgelagerten Analyse entladen. (B) Links: Anzahl der Sphäroiden, die pro Familie auf DMF-Ection-Patronen entladen wurden, im Vergleich zu hand-pipettierten Off-Cartridge-Steuerungen. Mitte: Fluoreszierendes Bild des Tri-Drop, bei dem ein größeres rotes Quadrat den Tri-Drop umreißt und das rote Oval die Sphäroide umkreist. Rechts: Fluoreszierendes Bild, das den Ladeport mit geladenen Sphäroiden (blaue Kreise) zeigt. (C) Linkes Panel: Hellfeldaufnahmen intakter HEK293T Sphäroide vor der Elektroporation und Fluoreszenzbilder der Sphäroide 24 Stunden nach EGFP mRNA-Elektroporation, verglichen mit 0 V und Off-Cartridge-Kontrollen. (D) Oberes Panel: Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzintensität, normiert auf den sphäroiden Bereich für zwei Elektroporationsbedingungen (500 V, 2 ms, 2 Impulse; 375 V, 6 ms, 1 Impuls). Kein signifikanter Unterschied zwischen elektroporierten Bedingungen, aber alle elektroporierten Bedingungen unterscheiden sich signifikant von 0 V und Off-Cartridge-Steuerungen (500 V 2 ms 2 Puls: 6,955 × ^10-5 ± 3,502 × ^10-5, 375 V 6 ms 1 Impuls: 5,045 × ^10-5 ± 3,294 × ^10-5, 0 V: 0 ± 0, Off-Cartridge-Steuerung: 0 ± 0 (*p < 0,05). Die Bilder wurden mit dem FIJI-Bildverarbeitungspaket¹⁰ verarbeitet. (500 V, 2 ms, 2 Impulse: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 Impuls: n = 4; Off-Cartridge-Steuerung: n = 3; 0 V Steuerung: n = 3). (D) Unteres Panel: Sphäroiddurchmesser nach der Elektroporation über 5 Tage unter allen Bedingungen. Der Durchmesser wurde mit FIJI anhand von Phasenkontraktbildern gemessen, die mit 20-facher Vergrößerung und einem umgekehrten Mikroskop aufgenommen wurden. (500 V, 2 ms, 2 Impulse: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 Impuls: n = 4; Ausgeschaltete Patronensteuerung: n = 3; 0 V Steuerung: n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt einen miniaturisierten digitalen mikrofluidischen Elektroporations-Workflow, der eine effiziente intrazelluläre Abgabe in primäre menschliche T-Zellen mit nanolitergroßen Tröpfchen ermöglicht. Ein zentraler Vorteil dieser Methode ist die Möglichkeit, die CRISPR–Cas9-Genom-Editierung mit nur 10.000 Zellen pro Reaktion durchzuführen, was den Materialbedarf im Vergleich zur herkömmlichen Elektroporation deutlich reduziert. Die tropfenbasierte Architektur unterstützt Automatisierung und gewährleistet reproduzierbare Reagenzhandhabung und Reaktionsmontage an mehreren parallelen Standorten.

In früheren Studien zeigte ein direktes Benchmarking der DMF-Ektionsplattform mit einem weit verbreiteten System, dass konventionelle Nukleofektion weniger als 2 % GFP-positive T-Zellen bei 10.000 Zellen pro Bearbeitung produzierte, während die DMF-Ektionsplattform unter denselben niedrigen Eingabebedingungen eine Transfektionseffizienz von >90 % erreichte. Für einen arrayierten Bildschirm mit 192 Bedingungen benötigte die DMF-Plattform 25-fach weniger Zellen und etwa 50-mal weniger Cas9 pro Bedingung als herkömmliche^{Methoden 9}. Diese Vergleiche heben die materiellen Vorteile der miniaturisierten DMF-Elektroporation für Anwendungen mit niedrigem Eingang und Screening hervor

Kritische Schritte und Fehlerbehebung
Mehrere Schritte sind entscheidend für den Erfolg. Eine genaue Kalibrierung des akustischen Flüssigkeitsbehandlers gewährleistet eine präzise Abscheidung der Führungs-RNA auf das Kartuschensubstrat, was für eine konsistente RNP-Montage unerlässlich ist. Wenn das Spotting inkonsistent ist oder Tröpfchen nicht am Substrat haften, überprüfen Sie, ob PGA in der Guide-RNA-Mischung in der richtigen Konzentration (5 mg/mL final) enthalten ist und dass der akustische Spender für die spezifische Quellplattengeometrie kalibriert ist. Inkonsistente Flecken bei mittleren Mengen (40–120 nL) werden am häufigsten durch den Tropfenrückfall auf der hydrophoben Oberfläche verursacht; Eine leichte Erhöhung der PGA-Konzentration oder eine Verringerung der Dosierhöhe kann dieses Problem lösen.

Die korrekte Zellkonzentration vor dem Laden aufrechtzuerhalten ist wichtig, da Abweichungen in der Dichte die Tröpfchenbildung beeinträchtigen und die Bearbeitungseffizienz verringern können. Wenn die Bearbeitungseffizienz unter 75 % fällt, überprüfen Sie zunächst, ob die T-Zell-Aktivierung ausreichend war (bestätigen Sie die Hochregulation von CD25 und CD69 mittels Durchflusszytometrie vor der Elektroporation) und bestätigen, dass Cas9 und sgRNA unmittelbar vor dem Laden und nicht im Voraus kombiniert wurden.

Polymeradditive spielen eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung von Cas9–sgRNA-Komplexen unter Elektroporationspufferbedingungen¹¹. Obwohl PGA die nominale Bindungsaffinität reduziert, verbessert seine stabilisierende Wirkung die Reproduzierbarkeit und verhindert die Aggregation bei Nanolitervolumen. Dies stellt einen abstellbaren Parameter für Forscher dar, die den Arbeitsablauf an andere Protein-RNA-Komplexe anpassen.

Fehlerbehebung
Gescheiterte Tröpfchenbrücke
Überprüfen Sie nach jedem Experiment den instrumentellen Qualitätskontrollbericht nach dem Durchlauf. Das Fehlen eines detektierten Stroms deutet auf ein fehlgeschlagenes Brückenbildung hin, entweder aufgrund unzureichender Tröpfchen oder durch das Versäumen einer Fusion, und wird vom System automatisch markiert. Betroffene Standorte können nicht innerhalb derselben Strecke geborgen werden. Wenn die Ausfälle sporadisch sind (<10 %), ist keine Aktion erforderlich; Verteilt die Replikate auf mehrere Patronen, um den Einfluss zu minimieren. Wenn die Ausfälle systematisch sind, führen Sie die Qualitätskontrolle und den System-Gesundheitscheck durch und kontaktieren Sie den technischen Support, falls die Probleme bestehen.

Inkonsistente sgRNA-Fleckung
Nach der Abgabe wird visuell bestätigt, dass alle erwarteten Tröpfchen vorhanden sind, innerhalb der Elektrodengrenzen zentriert und frei von Satellitentropfen. PGA in die Guide-RNA-Mischung einbauen, um Polydispersion zu verhindern. Bei fehlenden Tröpfchen überprüfen Sie den Spender-Run-Bericht und geben Sie bei Bedarf erneut ab. Bei schlechter Meniskusbildung halten Sie mindestens 5 μL pro Bohrloch, drehen Sie die Platte kurz und tippen Sie sanft auf eine ebene Oberfläche. Arbeiten Sie auf Eis und versiegeln Sie Platten, wenn sie nicht verwendet werden, um Verdunstung zu verhindern.

Verringerte Bearbeitungseffizienz
Wenn eine verminderte Bearbeitungseffizienz festgestellt wird, wird in folgender Reihenfolge untersucht: (1) Abgabebedingungen mit EGFP mRNA validieren, bevor mit RNP fortgesetzt wird; (2) Bestätigen, ob der gemessene QC-Strom mit den erwarteten Werten übereinstimmt; (3) Zelldichte, Leit-RNA und Cas9-Konzentration titrieren; (4) Überprüfen Sie die hohe Zellviabilität unmittelbar vor dem Laden; (5) Überprüfung der Reagenzintegrität und der Lagerbedingungen; (6) Bestätigen, dass die Auslesemethode für die Zelldichte und das Ziel von Interesse geeignet ist.

Anpassung der Plattform an alternative Zelltypen und -modelle
Für andere primäre Immunzelltypen, wie NK-Zellen oder regulatorische T-Zellen, müssen Elektroporationsparameter optimiert werden. Die Zellgröße ist ein wichtiger Faktor für die elektrische Feldschwelle, die für die Membranpermeabilisierung erforderlich ist: Kleinere Zellen benötigen höhere Feldstärken, während größere Zellen bei niedrigeren Spannungen permeabilisiert sind – ein gut dokumentierter Zusammenhang in der Elektroporationsbiophysik. Als Ausgangspunkt für Zelltypen, die kleiner als aktivierte CD3⁺ T-Zellen sind, sollte die Spannung (500–550 V) beibehalten oder leicht erhöht werden, während die Pulszeit kurz bleibt (2–3 ms), um übermäßige thermische Belastung zu vermeiden. Bei größeren Zellen sollte die Spannung auf 350–400 V reduziert und die Pulsdauer ohne mehr als 10 ms moduliert werden. Darüber hinaus ist Mikrooptimierung auf Spenderebene gängige Praxis in der Elektroporation, und Parameter, die in gesunden Spenderzellen validiert werden, lassen sich möglicherweise nicht direkt auf kranke oder patientenbezogene Materialien übertragen. Zellen von Spendern mit hämatologischen Malignitäten, chronischer Infektion oder Immunschwäche zeigen häufig veränderte biophysikalische Eigenschaften, und die Bearbeitungseffizienz sowie -viabilität sollten für jeden neuen Spender neu bewertet werden, insbesondere bei der Arbeit mit nicht-gesunden oder klinischen Proben. Die Lebensfähigkeit der Zellen sollte 24 und 72 Stunden nach der Elektroporation bewertet und die Parameter Iterativ angepasst werden. Die Cas9-Dosierung muss möglicherweise ebenfalls um 1,5–2 × im Vergleich zum T-Zell-Protokoll erhöht werden, wenn die RNP-Abgabeeffizienz sinkt.

Bei größeren oder dichteren 3D-Modellen wie Organoiden mit einem Durchmesser von mehr als 200 μm kann die Dichtung in der Kartusche modifiziert werden müssen, um größere Strukturgröße und Diffusionsbarrieren zu berücksichtigen. Nutzer, die solche Anwendungen versuchen, sollten erwägen, äußere Zellschichten vorab zu dissoziieren, um die Reagenzpenetration zu verbessern, oder mehrere Pulsbedingungen nacheinander anzuwenden. Kontaktieren Sie den korrespondierenden Autor für eine Anleitung zur Anpassung der Tröpfchengeometrie und Pulsparameter für Strukturen jenseits des hier validierten 100 μm Sphäroiddurchmessers.

Translationale Relevanz
Das translationale Potenzial dieses Workflows geht über einfaches Knockout hinaus. Die Plattform wurde auf homologieorientierte Reparatur-Knock-in eines 4-kb GFP-Konstrukts und eines funktionalen Anti-HER2-CAR am TRAC-Locus in primären T-Zellen sowie auf einen 45-Ziel-arrayierten CRISPR-Screen, der neuartige Regulatoren der CD4⁺ T-Zell-Erschöpfung⁹ identifiziert, angewendet. Diese Anwendungen zeigen einen Weg von der Protokoll-Optimierung bis zur funktionalen Entdeckung in klinisch relevanten Primärzellmodellen. Dennoch bleiben wichtige Einschränkungen bestehen: Funktionelle Ergebnisse wie Allel-Störungsraten durch Sequenzierung, Zytokinsekretion und in vivo-Engraftment wurden im aktuellen Protokoll nicht bewertet und stellen notwendige nächste Schritte für die therapeutische Translation dar. Zusätzlich unterstützt die Plattform zwar 48 parallele Reaktionen pro Kartusche, aber für größere Bildschirme ist eine Parallelisierung mit mehreren Kartuschen erforderlich.

Einschränkungen
Wie bei jeder miniaturisierten Plattform sollten bestimmte praktische Einschränkungen anerkannt werden. Die Downstream-Phänotypisierung muss an den kleinen Reaktionsmaßstab angepasst werden; Die Erwerbung der Durchflusszytometrie kann zusätzliche Konzentrationsschritte oder das Poolen von Replikatbrunnen erfordern, um ausreichende Ereigniszählungen zu erreichen. Die Elektroporationseinstellungen der Plattform erfordern möglicherweise auch eine Optimierung für Zelltypen mit hoher Empfindlichkeit gegenüber elektrischen Feldern, und Nutzer sollten veröffentlichte Parameter als Ausgangspunkte und nicht als universell festgelegte Werte betrachten. Schließlich wurde für den hier vorgestellten sphäroiden Workflow keine formale Viability-Färbung zu verlängerten Post-Elektroporationszeitpunkten durchgeführt; Die durchmesserbasierte Wachstumsverfolgung wurde als Ersatzmaß für die strukturelle Integrität verwendet und stellt eine wichtige Richtung für die zukünftige Charakterisierung dar.

Insgesamt bietet DMF-Ection, eine nicht-virale Transfektionsmethode, einen leistungsstarken und flexiblen Ansatz für Genom-Editierung und mRNA-Abgabe in niedrigen Input- und Hochdurchsatz-Umgebungen. Seine Kompatibilität mit primären T-Zellen, strukturierten 3D-Modellen und automatisierter Flüssigkeitshandhabung erweitert die Möglichkeiten in der Zelltherapietechnik, Multi-Condition-CRISPR-Screening und miniaturisierter funktioneller Genomik.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentation
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Spheroid-Protokoll
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Spheroid-Protokoll
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentation
DMEM Media	Gibco	10564011	Media-Zusatz-Spheroid-Kultur
DMF kompatibler Puffer	DropGenie		Transfektion
DropGenie Transfektionssystem	DropGenie		Instrumentation
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow-Puffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluoreszenzmikroskop	ThermoFisher		Instrumentation
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media-Zusatz-Spheroid-Kultur
Fida 1 instrument und Fida Neo 480 nm Detektor	Fida Biosystems ApS		Instrumentation
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Zellen	ATCC		Spheroid-Protokoll
Human IL-2 Rekombinantes Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T-Zell-Medien-Zusatz
Human Primary Pan CD3+ T Zellen	All Cells		Peripheres Blut, kryokonserviert, pan CD3+ Helfende T-Zellen, negativ selektiert
Immunocult CD3/CD28 Aktivator	StemCell Technologies	10970	T-Zell-Aktivierungsmedium
Immunocult Expansion Medium	StemCell Technologies	10981	T-Zell-Aktivierungsmedium
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentation
INTEGRA ASSIST PLUS Pipettierroboter	Integra	4505, 4-Positions-Portrait-Deck (PN 4521),	Instrumentation
nicht zielgerichtete synthetische Leit-RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Rekombinantes Antikörper	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140122	Media-Zusatz-Spheroid-Kultur
Poly-L-Glutaminsäure (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Verwenden Sie bei 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuklease	IDT	10017687
Spheroid-Mikroplatte	Corning	3830	Spheroid-Protokoll
Surfactant F	DropGenie		Transfektion- bei 1:20 in DMF kompatiblem Puffer verwenden, um vollständiges Transfektionspufferung zu machen
TRAC synthetische Leit-RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot	Gibco	25-300-062	Spheroid-Protokoll