Methodenartikel

Herstellung und chirurgische Anwendung von angereicherten, fotovernetzten Gelatine-Riboflavin-Hydrogelen zur Reparatur von Hornhautwunden bei Kaninchen

DOI:

10.3791/70579

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24. April 2026

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1Department of Cell Biology and Histology, School of Medicine and Nursing, University of the Basque Country UPV/EHU, 2BEGIKER Ophthalmology Research Group, IIS Biobizkaia, 3Department of Ophthalmology, University Hospital of Cruces

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein reproduzierbares Protokoll wird für die Herstellung, Anreicherung und Anwendung eines in situ blaulicht-kreuzvernetzbaren Gelatine-Ribollavin-Hydrogels zur Reparatur von hornhautstromaler Wunden bei Kaninchen vorgestellt, einschließlich prozeduraler Schritte für chirurgische Handhaben, partielle Tarsorrhaphie und postoperative Betreuung.

Zusammenfassung

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Dieser Artikel präsentiert ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Herstellung eines in situ vernetzbaren Gelatine-Hydrogels zur Reparatur von hornhautstromalen Wunden bei Kaninchen. Der Hydrogel-Vorläufer besteht aus Gelatine mit 5 % (w/v) und Riboflavinphosphat mit 0,01 % (w/v), das unter sterilen und lichtgeschützten Bedingungen hergestellt, steril gefiltert und vor der Anwendung erwärmt wird, um eine injizierbare Viskosität zu erreichen. Die optionale Einbindung von humanem Amnionmembranextrakt oder kaninchenautologem Serum wird detailliert beschrieben. Die Gelation auf Abruf wird auf der Augenoberfläche mit blauem Licht bei λ = 420–480 nm für insgesamt 2 Minuten ausgelöst. Die In-vivo-Methode umfasst eine reproduzierbare vordere stromale Keratektomie (Trephindurchmesser 6,5 mm; Tiefe ca. 187 μm), gefolgt von Hydrogelfüllung, leichter Aktivierung und einer partiellen lateralen Tarsorrhaphie zur Stabilisierung der Behandlung, zur Förderung der Wundheilung und zur Standardisierung der postoperativen Versorgung. Repräsentative in-vitro-Ergebnisse zeigen gelartiges viskoelastisches Verhalten mit Scherverdünnung und schneller Erholung sowie eine hohe optische Transmissivität (> 90 %) über 500 nm, was auf die Eignung für den Hornhautgebrauch hinweist. In vivo unterstützen hydrogelbasierte Behandlungen einen progressiven Epithelverschluss, eine gute Augentoleranz (niedrige Draize-Werte nach 3 und 7 Tagen) sowie einen zeitabhängigen Verlust sichtbaren Hydrogels, der mit biologischem Abbau und Gewebeersatz vereinbar ist. Kritische Schritte und Pausenpunkte werden hervorgehoben, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen, darunter Temperaturregelung während Auflösung und Filtration, Lichtschutz und Lampenpositionierung während der Vernetzung. Das Protokoll ermöglicht nahtfreie, präzise platzierte, lichtaktivierte Hydrogel-Stabilisierung, die mit der Zugabe mehrerer bioaktiver Nahrungsergänzungsmittel kompatibel ist. Es bietet eine praktische Grundlage für die präklinische Bewertung der nächsten Generation ophthalmischer Biomaterialien und erleichtert die Übertragung von photovernetzbaren Hydrogeltherapien zur Reparatur von Hornhautwunden.

Einleitung

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Die Hornhaut ist eine transparente, avaskuläre Struktur, die etwa zwei Drittel der Brechungskraft des Auges ausmacht, was ihre strukturelle und funktionelle Integrität für das Sehvermögen unerlässlich macht1. Aufgrund ihrer direkten Exposition gegenüber der Außenwelt ist die Hornhaut sehr anfällig für Traumata, Infektionen, chemische Schäden und postoperative Komplikationen 2,3. Das Versäumnis, die Epithelintegrität schnell und effektiv wiederherzustellen, kann zu anhaltenden Epitheldefekten (PEDs) und chronischen Hornhautgeschwüren führen, was letztlich zu Stromal....

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Protokoll

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Menschliche Plazenta wurden von Spendern mit informierter Zustimmung entnommen, gemäß der Erklärung von Helsinki und mit Zustimmung des Ethikausschusses des Universitätskrankenhauses von Cruces (Genehmigungsnummer CEIC E15/03). Alle Tierversuche wurden vom Ethikkomitee für Tierforschung der Universität des Baskenlandes (UPV/EHU) genehmigt (Genehmigungsnummer CEEA M20/2023/038) und entsprachen der ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung. Alle Verfahren wurden in der UPV/EHU-Tieranlage (SGIker) durchgeführt, wobei die sterile Technik während der gesamten Zeit (Klasse-II-Biosicherheitsschrank beim Umgang ....

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Ergebnisse

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Hydrogel-Synthese und -charakterisierung
Das Hydrogel wurde synthetisiert und in vitro evaluiert, um seine rheologischen und optischen Eigenschaften vor und nach der Photovernetzung zu bestimmen. Die Scherrheologie wurde verwendet, um die Viskoelastizität, den Fluss und das Flussverhalten zu charakterisieren. Frequenzsweeps zeigten, dass G′ über alle getesteten Frequenzen höher als G" blieb, was auf festenähnliches Verhalten hinweist (Abb.......

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Diskussion

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Das vorliegende Protokoll bietet einen reproduzierbaren Arbeitsablauf für die Vorbereitung, das Laden und die Anwendung eines photovernetzbaren Gelatine-Riboflavin-Hydrogels für die Heilung von Hornhautwunden. Mehrere In-vitro-Schritte sind entscheidend für die Erreichung einer einheitlichen Gelqualität und verdienen Betonung, da sie die häufigsten Variabilitätsquellen sind. Erstens sorgt das Halten der Vorläuferlösung bei 80 °C während des Rührens für eine vollständige Auflösun.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

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Diese Forschungsstudie wurde durch Zuschüsse des Gesundheitsministeriums der baskischen Regierung (2023111027 und IT524-22) unterstützt. C.R.-V. wurde durch ein Stipendium der Universität Baskenland, UPV/EHU, unterstützt. Die technische Unterstützung bei der Tierpflege sowie der von SGIker (UPV/EHU) bereitgestellte Analytische und Hochauflösende Mikroskopie-Service werden in großem Dank gewürdigt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Amphotericin BGibco (Thermo Fisher Scientific)15290018Endkonzentration: 1,25 μg/mL
Autologous serum, rabbit (AS)Prepared in-house-Zubereitet aus Vollblut; gefiltert durch 0,22 μm PES
Blue LED curing lampWoodpecker Medical Instrument CoLED.C modelWellenlänge: λ=420–480 nm; Abstand: 1–2 cm; Lichtleistung: 850-1000 mW/cm2
Buprenorphine (Buprecare)Ecuphar578950Dosis: 0,05 mg/kg, subkutane Injektion alle 12 h für 72 h
CameraPanasonicLUMIX TZ35Kamera mit Leica-Optik ausgestattet
Cimarec Digital Stirring HotplateThermo Fisher ScientificSP131320-33220-240 V, Max. Temperatur: 540 °C
Crescent microsurgical bladeBVI Medical373807-
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)Gibco (Thermo Fisher Scientific)11966025-
Eppendorf tubes (0.2 mL)Merck KGaA30124707Für HAMe-Vorbereitung kalt gehalten; Aliquotierung
Eppendorf tubes (5 mL)Merck KGaA30119606Für HAMe-Vorbereitung kalt gehalten; Aliquotierung
Fluorescein solution NovartisColorcusi Fluotest2% Fluorescein-Lösung, 5 µl Augentropfen
Gibco NeomycinMerck KGaAN1142Endkonzentration: 50 μg/mL
Gelatin powderSigma AldrichG1890Bei 80 °C aufgelöst; pH auf 7,0 eingestellt
Hyaluronic acid artificial tears (0.2%)Chem.-pharm. Fabrik GmbHHylo-Tear-
ImageJ image processing softwareNational Institute of Mental Health-Entwickelt von Wayne Rasband am Research Services Branch
Ketamine (Ketolar)Pfizer631028.1
LidocaineVet OneNDC 13985-222-04Topisch oder subkutane Injektion
Penicillin–StreptomycinGibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Endkonzentration: 50 μg/mL
PES syringe filters, 0.22 μm0.22μm (Millex)Merck KGaASLGP033RS-
Phosphate-buffered saline (PBS)Sigma AldrichP4417-100TAB-
Protease inhibitor cocktailSigma AldrichP8340Zugabe von 5 μL pro mg Gewebe
Povidone-iodine solutionMeda pharma7167204Präoperative Desinfektion
Riboflavin phosphate (RFP)Sigma AldrichR0630000Konzentrationen: 0,01% w/v (Endkonzentration); 0,02% w/v (Stammlösung)
SonicatorBandelein electronicSonoplus GM mini20-
Sonicator probeBandelein electronicMS 1.51,5 mm Durchmesser, 63 mm Länge.
Tarsorrhaphy sutures (non-absorbable)Alcon 80653080011–2 Nähte nach Bedarf
Tobramycin ophthalmic solution (3 mg/mL)NovartisTobrexDosierung: zweimal täglich bis zum Verschluss
Hessburg-Barron trephine, 6.5 mm diameterJedmed21-8265-
Vacutainer blood collection tubes with polymer gel separatorBD (Becton, Dickinson and Company)367704-
Xylazine solutionLaboratorios Calier SAXylagesicDosis: 5 mg/kg intramuskuläre Injektion

Referenzen

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  1. Meek, K., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Prog Retin Eye Res. 49, 1-16 (2015).
  2. Akowuah, P. K., Cruz, A. D. L., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An epithelial abrasion model for studying corneal wound healing. J Vis Exp. (178), e63112(2021).
  3. Mobaraki, M., et al.....

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Schlagwörter

Gelatine HydrogeleRiboflavin VernetzungBlaulicht VernetzungKaninchenhornhautHydrogel Herstellunganteriore stromale KeratektomieAmnionmembran Extraktinjizierbares Hydrogelophthalmologische Biomaterialien
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