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Methodenartikel

Eine zweifarbige Faserphotometriemethode zur Aufzeichnung der Aktivität von Astrozytenneuronen über mehrere Gehirnregionen während des Lern- und Gedächtnisverhaltens

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DOI:

10.3791/70582

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28. April 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Guangxi Key Laboratory of Special Biomedicine/Advanced Institute for Brain and Intelligence, School of Medicine, Guangxi University, 2Brain Research Center and State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Third Military Medical University, 3Department of Neurology, Gansu Provincial Central Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Beschreibung einer Methode zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Kalziumsignalen von Neuronen und Astrozyten über mehrere gedächtnisbezogene Hirnregionen hinweg und demonstriert deren Anwendung während eines Lern- und Gedächtnisverhaltensparadigmas.

Zusammenfassung

Lernen und Gedächtnis hängen entscheidend von der Koordination zwischen Neuronen und Astrozyten über verteilte Hirnregionen ab. Astrozyten modulieren die synaptische Übertragung und neuronale Erregbarkeit und tragen so zur Codierung und Konsolidierung von Informationen in gedächtnisbezogenen Schaltkreisen bei. Die intra- und interregionalen Korrelationen zwischen Astrozyten und Neuronen sind entscheidend für das Verständnis von Gedächtnis- und kognitiven Störungen. Die gleichzeitige Überwachung der astrozytischen und neuronalen Aktivität in mehreren Regionen während des Gedächtnisverhaltens bleibt jedoch technisch herausfordernd. Hier wird eine Methode vorgestellt, die die gleichzeitige Aufzeichnung dieser Kalziumsignale von Astrozyten und Neuronen in mehreren gedächtnisbezogenen Bereichen ermöglicht. Diese Strategie kombiniert zelltypspezifische, zweifarbige genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs), ein mehrkanaliges Faserphotometriesystem und synchronisiertes Verhaltenstracking, um eine Echtzeitüberwachung der neuronalen und astrozytischen Aktivität im medialen präfrontalen Kortex (mPFC), der hippocampalen CA1-Region und im medialen entorhinalen Cortex (MEC) zu erreichen. Repräsentative Ergebnisse zeigen koordinierte Kalziumdynamiken zwischen Regionen und Zelltypen während der Objekterkennungsaufgabe. Diese Methode bietet einen reproduzierbaren und effizienten experimentellen Rahmen zur Untersuchung der Astrozyten-Neuron-Interaktionen, die Lern- und Gedächtnisprozessen zugrunde liegen.

Einleitung

Lernen und Gedächtnis sind grundlegende kognitive Prozesse, die das Erwerben, Speichern und Abrufen von Informationen beinhalten, die entscheidend für die Entwicklung adaptiver Verhaltensweisen sind. Diese Prozesse bilden die Grundlage für eine Vielzahl komplexer Funktionen wie räumliche Navigation, Objekterkennung, kontextuelle Assoziation und Entscheidungsfindung. Darüber hinaus weisen kognitive Dysfunktionsstörungen, darunter Alzheimer, altersbedingte kognitive Erkrankungen und traumatische Hirnverletzungen, Auffälligkeiten in der Gedächtnisbildungauf. Daher erfordert ein umfassendes Verständnis der neuronalen Grundlage von Lernen und Gedächtnis die Aufklärung des dynamischen Zusammenspiels zwischen verschiedenen Zelltypen. Dieses Zusammenspiel findet innerhalb und über diese Regionen während der Codierung und Abrufung von Informationen statt.

Traditionell wurde angenommen, dass die Gedächtnisbildung überwiegend durch neuronale Aktivität bestimmt ist. Umfangreiche Forschungen haben jedoch gezeigt, dass Astrozyten die Kodierung, Konsolidierung und Abruf von Informationen signifikant regulieren. Sie erreichen dies durch die Modulation der synaptischen Übertragung, die Regulierung der neuronalen Erregung, die Freisetzung von Gliotransmittern und die Bereitstellung von metabolischer Unterstützung 4,5,6,7,8. Astrozyten interagieren dynamisch mit Neuronen, und die bidirektionale Kommunikation wird zusammen als "Astrozyten-Neuron-Netzwerk" bezeichnet. Daher ist das Verständnis der koordinierten Wechselwirkungen zwischen Astrozyten und Neuronen entscheidend, um die zellulären und Netzwerkmechanismen von Lernen und Gedächtnis zu verstehen.

Lernen und Gedächtnis hängen von der dynamischen Integration von Informationen über mehrere Gehirnregionen hinweg ab. Die Interaktionen zwischen Astrozyten und Neuronen sind nicht auf lokale Mikroschaltkreise beschränkt, sondern erstrecken sich über verteilte Hirnregionen, die mit dem Gedächtnis verbunden sind, einschließlich des medialen präfrontalen Cortex (mPFC), der hippocampalen CA1-Region und des medialen entorhinalen Cortex (MEC). Das mPFC wurde mit der Gedächtniskonsolidierung und der Regulierung des Langzeitgedächtnisses in Verbindung gebracht; CA1 ist zentral für die Kodierung und Reaktivierung des episodischen Gedächtnisses; und MEC dient als Drehkreuz für räumliche und multimodale Informationsintegration und liefert wesentliche Eingaben für den hippocampal-kortikalen Schaltkreis 12,13,14,15,16. Sich sammelnde Belege deuten darauf hin, dass Astrozyten in diesen Regionen an koordinierten interregionalen Dynamiken mit Neuronen teilnehmen und eine Schlüsselrolle beim Informationsfluss und Zustandsübergängen während des Lernens und des Gedächtnisses spielen17,18.

Obwohl die Anerkennung der synergistischen Funktion von Astrozyten und Neuronen in der Gedächtnisverarbeitung zugenommen hat, bleibt eine erhebliche technische Herausforderung darin, die Kalziumaktivität sowohl in Astrozyten als auch in Neuronen über mehrere gedächtnisassoziierte Gehirnregionen während des Verhaltens frei bewegender Tiere gleichzeitig zu überwachen. Die Zwei-Photonen-Bildgebung bietet eine hochauflösende räumliche Auflösung, ist jedoch durch Tiefen- und Kopffixation19,20 eingeschränkt; Die Mehrkanal-Elektrophysiologie ermöglicht Aufzeichnungen mit hoher Zeitauflösung, weist jedoch keine Zelltyp-Spezifität auf und kann astrozytische Kalziumsignale nicht unterscheiden. Daher wurde eine Methode entwickelt, die die gleichzeitige Aufzeichnung astrozytischer und neuronaler Kalziumsignale über mehrere gedächtnisbezogene Hirnregionen in frei bewegenden Mäusen ermöglicht. Genetisch kodierte Kalziumindikatoren (GECIs) berichten über intrazelluläreCa-2+-Dynamiken durchCa-2+-abhängige Konformationsänderungen in CaM/M13, die die Fluoreszenz genetisch kodierter Fluorophore modulieren. Zweifarbige GECI-Ansätze nutzen spektral separable Indikatoren wie grüne und rote Kalziumsensoren sowie zelltypspezifische Promotoren, um die gleichzeitige Aufzeichnung astrozytischer und neuronalerCa-2+-Aktivität innerhalb desselben Hirnbereichs zu ermöglichen. Durch die Kombination zelltypspezifischer zweifarbiger GECIs (GCaMP6f und jRGECO1a) und eines mehrkanaligen Faserphotometriesystems wurde eine Echtzeitüberwachung der Kalziumaktivität in Neuronen und Astrozyten in mPFC, CA1 und MEC erreicht. Darüber hinaus wurden unter Berücksichtigung der neuartigen Objekterkennungsaufgabe (NOR) koordinierte Kalziumdynamiken zwischen Gehirnregionen und Zelltypen bei Lernaufgaben nachgewiesen. Diese Methode ist ein reproduzierbares, zuverlässiges und skalierbares Protokoll zur Untersuchung der Astrozyten-Neuron-Ensembleaktivität in Gehirnregionen während des Lernens und des Gedächtnisses.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee der Third Military Medical University genehmigt (Animal Ethics Approval Nr.: AMUWEC20230126) und gemäß dem Leitfaden der Third Military Medical University für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt, um die ethische Behandlung von Tieren sicherzustellen. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Um die Sicherheit des Experimentators zu gewährleisten, wurden alle experimentellen Verfahren mit lebenden Tieren und viralen Vektoren unter Schutzkleidung, sterilen Handschuhen und einer Maske durchgeführt. Alle Instrumente wurden vor der Nutzung gründlich sterilisiert, und die Versuchsflächen wurden vor und nach jedem Experiment mit 70 % Ethanol gereinigt. Die übrigen Materialien wurden gemäß den institutionellen Abfallentsorgungsvorschriften entsorgt. Alle Reagenzien und Ausrüstung wurden so behandelt, dass direkter Kontakt mit Haut oder Augen vermieden wird.

1. Tiervorbereitung und Umgang mit Viralen

  1. Vier Monate alte C57BL/6 Mäuse (beide Geschlechter) in einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser.
  2. Tau-Aliquoten von AAV5-GfaABC1D-GCaMP6f oder AAV9-hSyn-jRGECO1a unmittelbar vor der Nutzung bei 0–4 °C auf Eis.
  3. Schließen Sie eine gezogene Glas-Mikropipette (Spitzendurchmesser 15–25 μm) an eine Spritze an und montieren Sie sie auf eine Mikroinjektionspumpe.
  4. Stellen Sie die Maus auf eine sterile chirurgische Plattform und desinfizieren Sie alle Instrumente mit 70 % Ethanol.

2. Stereotaktische virale Injektion

HINWEIS: In dieser Studie wurde eine zweistufige Virusinjektionsstrategie verwendet. Unter den aktuellen experimentellen Bedingungen kann diese Strategie zuverlässig und stabil umgesetzt werden, und das resultierende Expressionsmuster entspricht dem erwarteten zelltypspezifischen Promotorprofil.

  1. Erste Operation: AAV5-GfaABC1D-GCaMP6f (Titer: 7 × 1012 vg/mL) Injektion für Astrozyten
    1. Führen Sie eine Anästhesie mit 3 % Isofluran in einer Kammer ein und halten Sie dann die Anästhesie mit 0,8–1,2 % Isofluran über einen Nasenkegel (nach institutionell genehmigten Protokollen).
    2. Halten Sie die Körpertemperatur bei 37–38 °C mit einem Heizkissen und tragen Sie eine Augensalbe auf, um eine Hornhauttrocknung zu verhindern.
    3. Entferne die Kopfhaare und desinfiziere die Haut gründlich. Mache einen Mittellinienschnitt, um die Schädeloberfläche freizulegen.
    4. Setzen Sie den Kopf in das stereotaxische Instrument, stellen Sie die Bregma- und Lambda-Nähte auf dieselbe horizontale Ebene ein und stellen Sie den Rahmen weiter ein, um sicherzustellen, dass die Punkte 2 mm seitlich zum Bregma auf beiden Seiten waagerecht sind.
    5. Identifizieren Sie stereotaxische Koordinaten mit einem Maus-Gehirnatlas, wobei Bregma als Bezugspunkt dient.
      mPFC: AP +1,8 mm, ML +0,3 mm, DV −3,0 mm
      CA1: AP −2,1 mm, ML +1,6 mm, DV −1,2 mm
      MEC: AP −4,5 mm, ML −2,9 mm, DV −2,0 mm
    6. Bohren Sie über jeder Stelle eine 0,6 mm (Durchmesser) kreisige Kraniotomie, halten Sie die Dura Mater feucht und intakt nach dem Öffnen des Schädels.
    7. Fülle das GCaMP6f-Virus mit 5 nL/s in die Spritze und setze die Spritze in den stereotaxischen Arm.
    8. Senken Sie die Pipette langsam, injizieren Sie 150 nL bei 0,6 nL/s, halten Sie sie 8 Minuten und ziehen Sie dann mit 0,1 mm/s ab. Wiederholen Sie dieses Verfahren für alle Regionen.
    9. Versiegeln Sie den Schnitt mit Gewebeklebstoff und lassen Sie 2 Wochen für die virale Expression ein.
  2. Sekundärchirurgie: AAV9-hSyn-jRGECO1a (Titer: 1 × 1013 vg/mL) Injektion für Neuronen.
    HINWEIS: Die Operation wurde 14 Tage nach der ersten Virusinjektion durchgeführt.
    1. Anästhesie wie oben beschrieben indlösen und aufrechterhalten (Schritt 2.1.1).
    2. Halten Sie die Körpertemperatur und schützen Sie die Augen.
    3. Öffnen Sie die Kopfhaut entlang der Mittellinie wieder und richten Sie den Schädel aus.
      HINWEIS: Der Schädel wurde nivelliert, indem Bregma und Lambda in derselben horizontalen Ebene ausgerichtet wurden.
    4. Klares Gewebematerial an denselben Stellen wie die Kraniotomiefenster der ersten Operation, wodurch die Dura Mater intakt freigelegt wird.
    5. Koordinaten mit Bregma als Referenzpunkt anpassen, Injektionen streng auf denselben Koordinaten und Tiefen wie zuvor beschrieben durchführen.
    6. Fülle den jRGECO1a-Virus mit 5 nL/s und setze die Spritze ein.
    7. 150 nL bei 0,6 nL/s injizieren, 8 Minuten halten und langsam abziehen. Wiederholen Sie dieses Verfahren für alle Regionen und planen Sie 3 Wochen für die virale Expression ein.

3. Implantation der Multi-Site-Faserphotometrie-Sonde

HINWEIS: Führen Sie unmittelbar nach der jRGECO1a-Injektion durch.

  1. Installieren Sie die Glasfaserferrule in einem stereotaxischen Halter.
  2. Positioniere die Faser (1,25-mm-Ferrule, 200-μm-Kern, NA 0,39) 100–150 μm über der viralen Injektionstiefe:
    mPFC: AP +1,8 mm, ML +0,3 mm, DV −2,9 mm
    CA1: AP −2,1 mm, ML +1,6 mm, DV −1,1 mm
    MEC: AP −4,5 mm, ML −2,9 mm, DV −1,9 mm
  3. Versiegeln Sie die Kraniotomie mit Gewebeklebstoff und sichern Sie die Ferrule mit Zahnkleber.

4. Mehrkanal-Faserphotometrie-Aufzeichnung

HINWEIS: Um eine stabile und vollständige Expression der beiden Kalziumindikatoren sicherzustellen, wurde drei Wochen nach der zweiten Virusinjektion eine mehrkanalige faseroptische Photometrie zur Aufzeichnung durchgeführt.

  1. Gewöhnen Sie die Mäuse einmal täglich für drei Tage an das Fasersystem und die Arena.
    1. Nach 3 Wochen viraler Expression wird die Maus kurzzeitig mit 3 % Isofluran betäubt.
    2. Verbinden Sie ein Ende der gebündelten Glasfaser mit dem Faserphotometrie-Aufnahmesystem.
    3. Stellen Sie das Anregungslicht auf zwei Wellenlängen ein: 470 nm und 560 nm.
    4. Stellen Sie die Aufnahmefrequenz auf 30 Hz ein.
    5. Verbinden Sie die drei Zweige am anderen Ende der Bündelfaser mit drei Gehirnregionen: Kanal 1 zu mPFC, Kanal 2 zu CA1, Kanal 3 zu MEC.
    6. Platziere die Mäuse in einem offenen Bereich mit einer Seitenlänge von 50 cm und ermögliche freie Erkundung.
    7. Nach 10 Minuten trennen Sie die Glasfaser und bringen Sie die Mäuse zurück in ihre Hauskäfige.
  2. Faserphotometrie-Aufzeichnung während der Novel Object Recognition Task
    HINWEIS: Reinigen Sie die Plattform und die Objekte vor jedem Versuch mit 75 % Ethanol.
    1. Platziere zwei identische Objekte in diagonal gegenüberliegenden Quadranten.
    2. Verbinden Sie das Glasfaserbündel in einem leicht betäubten Zustand.
    3. Lassen Sie die Mäuse 10 Minuten lang Objekte erkunden und bringen Sie sie dann zurück in Hauskäfige, ohne die Faser zu entfernen.
    4. Führen Sie während des neuartigen Objekterkennungstests bei Mäusen eine Faserphotometrie-Aufzeichnung durch.
      HINWEIS: Den Versuch wird ausgeschlossen, wenn Bewegungsartefakte für stabile Aufzeichnungsdaten zu groß sind.
      1. Stimulationslaser anpassen:
        470 nm für GCaMP6f (Astrozyten)
        560 nm für jRGECO1a (Neuronen)
      2. Kalksignale bei 30 Hz aufzeichnen, synchronisiert mit Videotracking bei 30 Hz. Positionieren Sie eine Laserdiode im Videobild (außerhalb des Gesichtsfeldes der Maus) beim Beginn der Aufnahme, um als temporalen Marker zu dienen.
      3. Zehn Minuten nach der Lernphase ersetzen Sie ein Objekt durch ein neues Objekt und legen Sie die Maus zurück, um während der Aufnahme 10 Minuten zu erkunden.
      4. Trennen Sie die Faser mit einer Keramikferrule und bringen Sie die Mäuse zurück in die Heimkäfige.

5. Datenverarbeitung und -analyse

HINWEIS: Klassifizieren Sie einen Ca2⁺-Transient in Glasfaserphotometrieaufnahmen nur dann als echtes Signal, wenn seine Amplitude das Dreifache der Standardabweichung des Rauschbandes21, 22, 23 übersteigt. Novel Object Recognition Test (NORT) Protokoll24:D feinen Objektinteraktionen als Ereignisse, bei denen Mäuse physischen Kontakt mit dem Gegenstand aufnehmen, entweder indem sie ihn anstupsen oder mit der Nase schnüffeln. Für die Signalquantifizierung definieren Sie die Basislinie als das mittlere Signal während des -2 bis -1 s Fensters (relativ zum Wechselwirkungsbeginn bei t=0). Stellen Sie das Peri-Event-Analysefenster so ein, dass es von 2 Sekunden vor bis 4 Sekunden nach Beginn jeder Objektinteraktion erstreckt wird, entsprechend festgelegten Protokollen.

  1. Fluoreszenzspuren in Analysesoftware importieren.
    HINWEIS: Die Fluoreszenzsignalverarbeitung wurde mit proprietärer Analysesoftware durchgeführt, die den Standard-Faserphotometrie-Workflows folgte. Die Software selbst ist nicht Open Source und kann nicht geteilt werden. Allgemeine methodologische Überlegungen zur Signalverarbeitung der Glasfaserphotometrie finden Sie in den aktuellen Methodologieberichten25.
  2. Führen Sie eine Baseline-Korrektur durch und richten Sie die Kalziumsignale mit synchronisiertem Video auf den Beginn der NOR-Aufgabe aus.
  3. Konvertiere ΔF/F in Z-Werte für interregionale und zweifarbige Vergleiche9:
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
    HINWEIS:
    (ΔF/F)Mittelwert: Mittelwert von ΔF/F.
    (ΔF/F)STD: Standardabweichung von ΔF/F.
    FRaw: rohe Fluoreszenzintensität.
    FAusgangswert: Ausgangs-Fluoreszenzintensität (Mittelwert über den vordefinierten Ausgangszeitraum).
  4. Quantifizieren Sie Metriken wie die Fläche unter der Kurve (AUC) für Astrozyten- und neuronale Kalziumantworten während der Erforschung neuer vs. vertrauter Objekte.

6. Histologische Verifikation nach der Erfassung

  1. Betäuben Sie die Maus mit einer Überdosis Pentobarbital, bis der vollständige Reflexverlust bestätigt ist.
  2. Führen Sie eine transkardiale Perfusion mit normaler Kochsalzlösung durch, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd (PFA).
  3. Sezieren Sie das Gehirn sorgfältig und fixieren Sie es anschließend mit 4 % PFA bei 4 °C für 12–24 Stunden.
  4. Das Gehirn wird auf 30 % Saccharose in PBS bei 4 °C übertragen, bis das Gewebe zur Kryoprotektion absinkt.
  5. Man bettet das Gehirn in eine optimale Schnitttemperatur ein, friert es ein und schneidet koronale Schnitte (40 μm Dicke) mit einem Kryostat.
  6. Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung durch, um die Virusexpression und die Faserplatzierung zu überprüfen.

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Ergebnisse

Basierend auf dem oben beschriebenen Protokoll wurde eine zweifarbige Multi-Site-Glasfaseraufzeichnung durchgeführt, die auf die mPFC, CA1 und MEC der 4 Monate alten C57-Mäuse abzielte. In der vorliegenden Studie haben wir eine zweistufige virale Injektionsstrategie implementiert, um die beiden Indikatoren sequentiell einzuführen. Unter unseren experimentellen Bedingungen kann diese Strategie zuverlässig und stabil implementiert werden, und das resultierende Expressionsmuster entspricht ...

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Diskussion

In dieser Studie wurde eine Methode entwickelt, um die gleichzeitige Erfassung der astrozytischen und neuronalen Kalziumaktivität in mehreren gedächtnisrelevanten Gehirnarealen von Mäusen während des Lernens und des gedächtnisbezogenen Verhaltens zu erfassen. Im Gegensatz zuEinzelregionen-Bildgebung 28 oder elektrophysiologischen Techniken erfasst die synchrone Mehrregion-Aufzeichnung koordinierte Dynamiken über verteilte Speichernetzwerke hinweg und erweist sich ...

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Offenlegungen

Von den Autoren werden keine finanziellen oder anderweitigen Interessenkonflikte angegeben.

Danksagungen

Frau Jia Lou wird für technische Unterstützung gewürdigt, und Sai Te Xin Si (KI-Tool) wird für Sprachbearbeitungshilfe anerkannt. Diese Arbeit erhielt Unterstützung von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas (Zuschuss Nr. 82371485, 82588301, 32400932) und der Naturwissenschaftlichen Stiftung Chongqing, China (Zuschuss Nr. CSTB2024NSCQ-JQX0024, 2024NSCQ-MSX1104).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
75 RN 5uL SYR W/O NEEDLEHamilton7634-01Schließt sich an Mikropipette für virale Injektion an
AAV5-GfaABC1D-GCaMP6fAddgene52925Astrozyten-spezifische GCaMP6f Expression
AAV9-hSyn-NES-jRGECO1aAddgene100854Neuronen-spezifischer rot-verschobener Calciumindikator
Bepanthen Augen- und NasensalbeBepanthenMA0008Verhindert das Austrocknen der Hornhaut
Gebundene optische Fasern mit KeramikhüllenInperBFO-1x3-W1.25Verbindet implantierte Fasern mit dem Photometriesystem
KameraMind VisionMV-SUA502C-TVerhaltensvideos synchronisiert mit Calciumsignalen
ZahnzementNISSINSuper-Bond C&BWird verwendet, um Ferrules am Schädel zu befestigen
Ferrule-HalterInperSCH-1.25Hält die Keramikferrule während der Implantation sicher
Isofluran-Verdampfer & AnästhesiesystemRWD Life ScienceR510-29Für Anästhesieinduktion und -erhaltung
Mehrkanaliges Faser-PhotometriesystemRWD Life ScienceR821Für zweifarbige Aufzeichnung
OFRS-SoftwareRWD Life ScienceAnalysiert aufgezeichnete Calciumsignale
Optische FasernRWD Life ScienceR-FOC-BL200C-39NImplantiert in die Zielregion des Gehirns
Stereotaktisches InstrumentRWD Life Science68801Verwendet für präzise virale Injektion und Faserimplantation
SpritzenpumpeKD Scientific788130Liefert Virus mit kontrollierten Raten
Gewebskleber3M Animal Care Products1469SB VetbondZur Wundverschluss

Referenzen

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