Methodenartikel

Seneszenzdetektion mit reflektiertem Licht in der fettreichen stromalen Gefäßfraktion

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DOI:

10.3791/70588

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5. Juni 2026

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1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet, 2Nordiska Kliniken Stockholm

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet eine reflektierte-licht-konfokale Mikroskopie zur objektiven, einzelzelligen Detektion der seneszenzassoziierten Beta-Galactosidase (SA-β-gal) Aktivität in der stromalen Gefäßfraktion, die aus menschlichem Fettgewebe isoliert ist. Die Methode ist mit der Immunzytochemie kompatibel, beinhaltet pH-Kontrollen zur quantitativen Beurteilung und bietet zudem eine sensiblere und weniger subjektive Alternative zur herkömmlichen SA-β-gal-Färbung.

Zusammenfassung

Die zelluläre Seneszenz ist ein stressbedingter Zustand, der durch einen dauerhaften Zellzyklusstillstand und die Entwicklung eines charakteristischen sekretorischen Profils gekennzeichnet ist, das die Gewebefunktion beeinflusst und zu Alterung sowie Stoffwechselerkrankungen beiträgt. Die senezenzassoziierte β-Galactosidase (SA-β-gal) Aktivität wird häufig als Marker für seneszente Zellen verwendet; konventionelle SA-β-gal-Tests basieren jedoch oft auf subjektiver visueller Bewertung und liefern begrenzte quantitative Informationen. Diese Einschränkungen zeigen sich besonders in primären menschlichen Zellpopulationen wie der stromalen Gefäßfraktion (SVF), die aus Fettgewebe abgeleitet wird und eine heterogene Mischung aus Präadipozyten, Immunzellen und Endothelfellen enthält. Hier präsentieren wir einen optimierten reflektierten-licht-konfokalen Mikroskopieansatz für eine hochauflösende, quantitative Detektion der SA-β-gal-Aktivität in menschlichen SVF-Zellen. Dieses Protokoll ermöglicht eine objektive Einzelzellanalyse der SA-β-gal-Aktivität, ermöglicht eine simultane Immunzytochemie zur multiplexierten Detektion zusätzlicher Alters- oder Linienmarker und integriert pH-abgestimmte Kontrollgruppen. Durch die Kombination dieser Merkmale bietet diese Methode einen sensiblen, reproduzierbaren und quantitativen Ansatz zur Untersuchung der zellulären Seneszenz in heterogenen primären menschlichen Zellpopulationen. Sie bietet eine verbesserte Alternative zur herkömmlichen SA-β-Gal-Beizung.

Einleitung

Die zelluläre Seneszenz ist eine vielschichtige Reaktion, die durch viele Arten von Stress entstehen kann, darunter DNA-Schäden, Telomerverfall und Onkogenaktivierung. Sie führt zu einem stabilen Stillstand des Zellzyklus zusammen mit einer erhöhten Resistenz gegen Apoptose, die teilweise durch die Induktion anti-apoptotischer Proteine 1,2 angetrieben wird. Die Seneszenz wurde mit verbessertem Zellüberleben in Kontexten in Verbindung gebracht, in denen die Erhaltung der Gewebeintegrität unerlässlich ist, wie etwa bei Reparatur und Pflege 3,4. Über ihre Rolle in der Gewebehomöostase hinaus trägt die Alterung auch zur normalen Entwicklung bei, indem sie die embryonale Musterbildung 5,6 formt und als Barriere für die Tumorbildung fungiert, indem sie die Beseitigung beschädigter oder potenziell bösartiger Zellenfördert 7,8,9. Obwohl die Alterung vorteilhafte Funktionen erfüllen kann, haben mehrere Studien einen kontrastierenden Aspekt hervorgehoben, bei dem seneszente Zellen ein pro-inflammatorisches Sekretionsprofil annehmen, das den lokalen Stoffwechsel stören, das umliegende Gewebe schädigen und sogar das Tumorverlauf unterstützen kann(10,11,12,13).

Alterung wurde bei verschiedenen Zelltypen über mehrere Gewebe hinweg nachgewiesen und ist oft mit Alterung, Krankheit, Gewebestörungen oder Krebs verbunden. In der Leber wurde gezeigt, dass die Alterung hepatischer stellater Zellen den Tumorfortschritt fördert, indem sie die metabolische Homöostase durch sekretierte Faktoren14,15 verändert. Studien, die Hepatozyten16 oder Ganzleberbiopsien17 untersuchen, zeigen, dass die Alterung in diesen Zellen zu metabolischen Komorbiditäten wie metabolischer Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung und Steatohepatitis beitragen kann. Darüber hinaus hat die Beziehung zwischen Typ-2-Diabetes und Seneszenz in den letzten zehn Jahren erhebliche Aufmerksamkeit erregt, wobei Hinweise darauf hinweisen, dass die Seneszenz mit diabetesbedingten Komplikationen in Pankreas-β-Zellen, Hepatozyten16 und Adipozyten 18,19,20,21 in Verbindung gebracht wird. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der genauen Identifizierung von seneszenten Zellen in Stoffwechselgeweben, wo ihre Ansammlung und Heterogenität zum Krankheitsfortschritt und zur therapeutischen Zielerfassung22 beitragen.

Die mit der Seneszenz verbundenen Veränderungen in Signal- und Proteinexpression sind oft zell- und gewebespezifisch; Mehrere Merkmale sind jedoch im Großen und Ganzen charakteristisch für seneszente Zellen. Einer der am weitesten verbreiteten Marker ist die erhöhte enzymatische Aktivität von β-Galactosidase bei pH 6,0, die als seneszenzassoziiert β-Galactosidase (SA-β-gal)23 bezeichnet wird. β-Galactosidase ist eine lysosomale Hydrolase, die in allen Zellen vorkommt und normalerweise bei saurem pH-Wert (~4,5–5,0) aktiv ist, wo sie zum Abbau glykosylierter Substrate beiträgt. Das definierende Merkmal von SA-β-gal ist die Erhaltung der β-Galaktosidase-Aktivität unter suboptimalen pH-Bedingungen. Im klassischen Test werden die Zellen mit dem synthetischen Substrat 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal) bei pH 6,0 inkubiert, wobei die enzymatische Aktivität in den meisten Zellen reduziert, aber in seneszenten Zellen nachweisbar bleibt. Dies führt zur Bildung eines unlöslichen blauen Niederschlags, der mikroskopischvisualisiert werden kann 24.

Obwohl dieser Test weit verbreitet ist, basiert der Nachweis des X-Gal-Niederschlags traditionell auf der Hellfeldmikroskopie. Die Brightfield-Detektion basiert auf der visuellen Identifikation des blauen Niederschlags und weist daher eine begrenzte Empfindlichkeit für Signale auf niedriger Ebene und frühe Seneszenzzustände auf. Im Gegensatz dazu erfasst die reflektierte Lichtbildgebung die optische Dichte des X-Gal-Präzipitats und ermöglicht so eine quantitative Detektion über einen breiteren Dynamikbereich. In jüngerer Zeit wurden fluorogene Substrate entwickelt, um dieSensitivität 25 zu verbessern. Diese Ansätze messen jedoch typischerweise die β-Galactosidase-Aktivität unter Bedingungen, die die klassische pH-abhängige Definition von SA-β-gal nicht erhalten. Dadurch können sie die Signalintensität erhöhen, aber die Spezifität für die Seneszenz verringern. Im Gegensatz dazu ermöglicht die inhärente Opazität des X-Gal-Präzipitats dessen Detektion mittels konfokaler reflektierter Lichtbildgebung, was eine empfindlichere und quantitativere Anzeige liefert und gleichzeitig die ursprüngliche enzymatische Definition von SA-β-gal26 beibehält.

Im Laufe der Jahre wurden weitere Merkmale der Senezenz identifiziert, darunter eine erhöhte Expression der cyclinabhängigen Kinase-Inhibitoren P16 und P21 sowie der Transkriptionsfaktor P53, der den Zellzyklusstillstand und andere Senezenzprogramme reguliert 27,28,29,30,31,32,33. Diese Fortschritte haben zu einer robusteren Definition von Seneszenz geführt, bei der Zellen typischerweise anhand des kombinierten Vorhandenseins mehrerer Marker klassifiziert werden. In der Praxis werden diese Marker jedoch oft mit verschiedenen Modalitäten gemessen: Kernmarker wie P16 und P21 werden typischerweise mit fluoreszenzbasierten Techniken nachgewiesen, während die SA-β-gal-Aktivität traditionell mittels Hellfeldmikroskopie bewertet wurde. Diese Trennung hat die Fähigkeit eingeschränkt, mehrere Altersmerkmale innerhalb derselben Zelle zu bewerten. Die reflektierte Lichtbildgebung überwindet diese Einschränkung, indem sie eine direkte Integration der SA-β-gal-Detektion mit fluoreszenzbasierten Markern in einem einzigen Bildablauf ermöglicht, was eine robustere und biologisch sinnvollere Bewertung der Seneszenz in heterogenen Zellpopulationen ermöglicht.

Während Dedic und Kollegen mehrere Einschränkungen der traditionellen SA-β-gal-Bildgebung adressieren, darunter eine verbesserte Sensitivität, die Verwendung pH-abgestimmter Kontrollen zur objektiven Schwellenwertung und die Kompatibilität mit der Immunzytochemie, wurde ihre reflektierte-licht-konfokale Methode speziell für isolierte reife Adipozyten26 optimiert. Die Seneszenz im Fettgewebe ist jedoch nicht auf Adipozyten34,35 beschränkt, und weitere Einblicke können durch die Untersuchung der stromalen Gefäßfraktion (SVF) gewonnen werden. Die SVF umfasst Präadipozyten, Endothetel- und Fibroblastpopulationen sowie verschiedene Immunzellen, die alle eine Alterung durchlaufen und zur Fettremodellierung, Entzündung und veränderter metabolischer Signalübertragung beitragen können. Die Charakterisierung der Seneszenz innerhalb dieses heterogenen Kompartments ist daher wichtig, um zelltypspezifische Prozesse mit gewebebezogenen und systemischen Ergebnissen zu verknüpfen.

Hier erweitern wir die reflektierte Licht SA-β-gal Nachweis auf SVF-Zellen, wodurch die Anwendung auf mehrere Fettgewebezelltypen ermöglicht wird. Durch die Kombination dieses Ansatzes mit der Immunzytochemie ermöglicht die Methode eine integrierte Einzelzellanalyse der SA-β-gal-Aktivität zusammen mit Linien- und Funktionsmarkern in primären menschlichen Proben.

Protokoll

Alle Experimente wurden gemäß den Statuten der Helsinkier Erklärung durchgeführt. Die Studie wurde vom regionalen Ethikausschuss in Stockholm genehmigt, DNR 2012/50-31.

1. Zellvorbereitung

  1. Verwenden Sie stromale Gefäßfraktion (SVF)-Zellen, die durch Kollagenase-Verdauung aus menschlichem Fettgewebe isoliert werden.
    HINWEIS: Die Zellausbeute variiert je nach Biopsiegröße und Gewebezusammensetzung; jedoch werden typischerweise etwa 1,0 × 106 SVF-Zellen pro 10 g Fettgewebe gewonnen.

2. X-gal-Färbung und Präparatvorbereitungen

  1. Fixieren Sie Zellen in 1 ml 2%-Paraformaldehyd (PFA) in einem 1,5-mL Mikrozentrifugenrohr für 20 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf einer Kippe.
  2. Zentrifugiere bei 600 × g für 10 Minuten und entferne das Supernatant.
  3. Bereiten Sie die X-gal Färbelösung mit dem Alterungs-β-Galactosidase-Färbeset gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  4. Teile die Färbungslösung in 3 Röhrchen (jeweils 1 ml) und passe den pH-Wert auf 5, 6 und 8 mit 1 M HCl und 1 M NaOH ein. Missen Sie den pH-Wert mit einem kalibrierten pH-Messgerät.
  5. Gib X-Gal-Lösung zu 0,5 × 106 Zellen zur Konditionierung hinzu und inkubiere 24 Stunden bei 37 °C ohneCO2.
  6. Zentrifugiere bei 600 × g für 10 Minuten und entferne Supernatant.
  7. Waschen Sie die Zellen mit PBS (pH 7), zentrifugieren Sie bei 600 × g für 10 Minuten und entfernen Sie das Supernatant.
  8. Primäre Antikörperlösung (CD31 [1:200] oder IgG-Kontrolle [1:333]) in 5 % normalem Eselserum (NDS) bereiten. Cellen über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  9. Wasche die Zellen 3 Mal in PBST (0,1 %) für 10 Minuten bei RT auf einer Kippe.
  10. Sekundäre Antikörperlösung (Anti-Maus Alexa Fluor 555 [1:500]) und Weizenkeim-Agglutinin (WGA [1:200]) in 5 % NDS vorbereiten. Inkubiere 1 Stunde bei RT auf einem Rocker.
  11. Zentrifugiere bei 600 × g für 10 Minuten und entferne die sekundäre Antikörper-Färbungslösung.
  12. Wasche die Zellen 3 Mal mit PBST (0,1 %) für 10 Minuten auf einem Rocker bei RT.
  13. Zentrifugiere bei 600 × g für 10 Minuten und entferne das Supernatant.
  14. Cellen im Antifade-Mountant wieder aufhängen.
  15. Pipettieren Sie die Zellsuspension auf Mikroskopobjektträger.
  16. Lass das Montagemedium über Nacht bei RT aushärten, um die Zellen zu immobilisieren.
  17. Fügen Sie 100 μL 100% Glycerol hinzu, legen Sie einen Deckdeckel darauf und versiegeln Sie sie mit Nagellack.

3. Mikroskopie

HINWEIS: Bildzellen mit einem konfokalen Mikroskop, das zur Erkennung von reflektiertem Licht konfiguriert ist. Das reflektierte Lichtsignal sollte bei oder nahe der Anregungswellenlänge mit einem vom Hersteller bereitgestellten Strahlteiler oder einer dichroischen Spiegelkonfiguration aufgenommen werden. Verwenden Sie für alle Experimente ein 30× Objektiv mit Silikonöl (numerische Apertur 1,05).

  1. Wählen Sie die T90/R10-Strahlsplittereinstellung in der Mikroskopsoftware aus.
  2. Verwenden Sie 633 nm Anregung und sammeln Sie reflektiertes Licht zwischen 635–645 nm.
  3. Erfassen Sie das Hoechst-Signal mit 405 nm Anregung.
  4. WGA-Signal mit 488 nm Anregung empfangen.
  5. Erfassen Sie das CD31-Signal mit 555 nm Anregung.
  6. Stellen Sie die Z-Schrittgröße auf das Systemoptimum (0,74 μm) ein und definieren Sie einen Z-Stack basierend auf dem Membransignal, um das gesamte Zellvolumen zu erfassen.
  7. Nehmen Sie Bilder mit identischen Aufnahmeeinstellungen für alle Proben auf. Speichere Dateien im nativen Mikroskopformat (z. B. .oir) ohne Kompression.

4. Bildanalyse

HINWEIS: Analysieren Sie Bilder mit ImageJ und CellProfiler.

  1. Teile Kanäle in ImageJ, um Z-Stacks für jeden Kanal zu erzeugen (405, 488, 555, 633).
  2. Erzeugen Sie summierte Intensitätsprojektionen mit der Z-Projektfunktion und exportieren Sie sie als 16-Bit-TIFF-Dateien.
  3. Importiere Bilder in CellProfiler (Version 4.2.8) zur automatisierten Zellsegmentierung und Quantifizierung der reflektierten Lichtintensität pro Zelle (ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 2).
  4. Exportieren Sie Intensitätsmessungen in eine Tabelle zur nachgelagerten Analyse.

5. SA-β-Gal-Punktewertung

  1. Definieren Sie die Schwelle für SA-β-gal-Positivität als die mittlere reflektierte Lichtintensität des pH-8-Bedingungs plus drei Standardabweichungen.
  2. Zellen im pH-6-Zustand mit Intensitätswerten oberhalb dieses Schwellenwerts als SA-β-gal-positiv klassifizieren.

Ergebnisse

Die reflektierte Lichtfärbung von SA-β-gal bei menschlichen SVF-Zellen erzeugte klare und reproduzierbare Muster über die drei pH-kontrollierten Bedingungen. Die CD31-Färbung wurde eingebaut, um Endothelzellen innerhalb der SVF zu identifizieren, wodurch diese Zellen von anderen Populationen unterschieden werden können. Obwohl nur eine kleine Anzahl CD31-positiver Zellen vorhanden war, bestätigte der Marker das Vorhandensein von Endothelzellen und zeigte die Kompatibilität der Methode mit heterogenen Primärproben.

Die pH-5-Bedingung erzeugte in den meisten Zellen ein starkes Signal, was mit einer hohen endogenen Beta-Galaktosidase-Aktivität bei saurem pH-Wert übereinstimmt (Abbildung 1Aa–Ac). Bei pH 6, der Bedingung zur Beurteilung der SA-β-gal-Aktivität, war die Färbungsintensität im Vergleich zu pH 5 reduziert, und nur eine Teilmenge der Zellen zeigte ein Signal über dem Hintergrund (Abbildung 1Ba–BC). Diese Verschiebung sowohl der Signalintensität als auch der Frequenz entspricht der erwarteten pH-Abhängigkeit des Tests und ermöglicht die Identifikation von Zellen mit zurückgehaltener SA-β-Galaktosidase-Aktivität unter suboptimalen Bedingungen. Die pH-8-Bedingung erzeugte minimales reflektiertes Lichtsignal, wobei die meisten Zellen in der Nähe oder auf Hintergrundniveaus waren (Abbildung 1Ca–cc). Diese Bedingung wurde verwendet, um die Schwelle für SA-β-gal-Positivität zu definieren, die durch die rote gestrichelte Linie in Abbildung 1A c,Bc,Cc angezeigt wird.

Für die quantitative Analyse wurde die Schwelle für SA-β-gal-Aktivität als mittlere reflektierte Lichtintensität der pH-8-Bedingung plus drei Standardabweichungen definiert. Zellen im pH-6-Zustand mit Intensitätswerten, die diesen Schwellenwert überschreiten, wurden als SA-β-gal-positiv klassifiziert. Dieser Ansatz bietet eine objektive, datenbasierte Grenze, die Hintergrundsignale berücksichtigt und die Klassifikation von Falsch-positiven minimiert.

Um die Nachweisempfindlichkeit und Kompatibilität mit der Immunzytochemie zu bewerten, wurden reflektiertes Licht und Hellfeldbildgebung über alle pH-Bedingungen hinweg verglichen. Bei pH 5 (Abbildung 2Aa–Ad) zeigte reflektiertes Licht starken X-Gal-Niederschlag, während Brightfield nur die auffälligsten Ablagerungen entdeckte. Bei pH 6 (Abbildung 2Ba–Bd) identifizierte reflektiertes Licht SA-β-gal positive Zellen, die nicht zuverlässig durch Brightfield detektierbar waren, wenn das Signal schwach oder diffus erschien. Bei pH 8 (Abbildung 2Ca–Cd) detektierte reflektiertes Licht nur ein minimales Signal, was mit geringer enzymatischer Aktivität übereinstimmt, während Brightfield kein nachweisbares Niederschlag zeigte. Diese Beobachtungen zeigen, dass die reflektierte Lichtbildgebung den Nachweis von X-Gal-Niederschlag verbessert, insbesondere bei mittleren und niedrigen Aktivitätsniveaus.

Der reflektierte Licht-SA-β-Gal-Test wurde ebenfalls in einer 96-Well-Platte durchgeführt (ergänzende Abbildung 3). Diese Anordnung führte zu einem verstärkten Hintergrundsignal durch die Reflexion der Kunststoffoberfläche, was den Kontrast zwischen positiven und negativen Zellen reduzierte. Oberflächenunvollkommenheiten wie Kratzer erhöhten die Hintergrundreflexion weiter (ergänzende Abbildung 3, schwarze Pfeile). Daher war die quantitative Analyse weniger zuverlässig als die Bildgebung auf Glasabdeckungen. Wenn ein Plattenformat erforderlich ist, werden Glasbodenplatten zur optimalen Signalerkennung empfohlen.

Zusammen zeigen diese Ergebnisse eine klare Trennung zwischen der stark positiven pH-5-Bedingung, dem Zwischensignal bei pH 6 und dem minimalen Hintergrund bei pH 8. Dieses Muster entspricht dem erwarteten Verhalten des Tests und unterstützt die Verwendung von reflektierter Lichtbildgebung zur Erkennung der SA-β-gal-Aktivität in heterogenen Primärzellpopulationen.

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Abbildung 1: pH-abhängiges reflektiertes Licht SA-β-gal Detektion in SVF-Zellen.
WGA (AA, BA, CA) und reflektierte Lichtbildgebung (Ab, Bb, CB) erkennen X-gal-Niederschlag unter Bedingungen von pH 5, 6 und 8. Das Signal ist bei pH 5 am stärksten, bei pH 6 reduziert und bei pH 8 minimal. Die Quantifizierung der reflektierten Lichtintensität (Ac, Bc, Cc) zeigt die Verteilung der β-Galaktosidase-Aktivität unter jeder Bedingung. Jeder Punkt stellt eine einzelne Zelle dar, und die rote gestrichelte Linie zeigt den Schwellenwert an, der zur Klassifizierung von SA-β-gal-positiven Zellen verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Vergleich der reflektierten Licht- und Hellfeld-SA-β-gal-Detektion in SVF-Zellen. Zoomierte Bilder von X-gal-gefärbten SVF-Zellen bei pH 5, 6 und 8 zeigen WGA-Färbungen (Aa, Ba, Ca), CD31-Färbung (Ab, Bb, Cb) zur Identifizierung von Endothelzellen, reflektiertes Licht (Ac, Bc, Cc) zur Erkennung von X-gal-Niederschlag und entsprechende Brightfield-Bilder (Ad, Bd, Cd). Die reflektierte Lichtbildgebung erkennt X-Gal-Niederschlag unter verschiedenen Bedingungen, während Brightfield hauptsächlich höherintensive Ablagerungen zeigt und bei niedrigeren Signalpegeln nur begrenzte Detektion bietet. CD31-Färbungen werden sowohl bei pH-5- als auch bei pH-6-Bedingungen beobachtet, was die Identifikation von Endothelzellen ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Überblick über die CellProfiler-Pipeline. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Arbeitsablauf für die Segmentierung von Kernen und Zellen. Repräsentative Bilder von (A) Hoechst-gefärbten Kernen und (B) der entsprechenden Kernsegmentierung. (C) Zellsegmentierung basierend auf der Membranfärbung. (D) Überlagerung von Kernen und Zellgrenzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Reflektiertes Licht SA-β-Gal-Bildgebung in einer 96-Well-Platte mit Kunststoffboden. (A) WGA-Färbung und (B) reflektiertes Lichtbild von X-gal-gefärbten SVF-Zellen in einer Standardplatte mit 96 Bohrlöchern am Kunststoffboden. Im Vergleich zur Bildaufnahme auf Glas wird ein erhöhtes Hintergrundsignal beobachtet, was mit der Lichtreflexion an der Kunststoffoberfläche übereinstimmt, was den Kontrast bei der SA-β-Gal-Detektion verringert. Oberflächenkratzer (schwarze Pfeile) erhöhen das Hintergrundsignal weiter (B). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Senezenzassoziierte β-Galactosidase ist einer der am weitesten verbreiteten Marker zur Identifizierung von seneszenten Zellen; traditionelle Hellfeld-Detektionsmethoden sind jedoch durch geringe Empfindlichkeit und ein hohes Maß an Subjektivität begrenzt. Die reflektierte Lichtbildgebung von X-gal-gefärbten SVF-Zellen bietet einen empfindlicheren und reproduzierbareren Ansatz zur Messung der SA-β-gal-Aktivität auf Einzelzellebene, während sie mit der fluoreszierenden Antikörperfärbung kompatibel bleibt. Durch die Optimierung dieser Methode für SVF kann SA-β-gal-Aktivität zusammen mit zellspezifischen Markern wie CD31 nachgewiesen werden, wodurch die Analyse heterogener Primärzellpopulationen ohne Zellsortierung möglich ist.

Mehrere technische Parameter sind entscheidend für eine zuverlässige Implementierung. Eine genaue pH-Kalibrierung der X-gal-Färbungslösung ist unerlässlich, da kleine Abweichungen die enzymatische Aktivität verändern und die Signalerkennung beeinflussen können. Das pH-Messgerät sollte unmittelbar vor der Verwendung mit Standardpuffern (z. B. pH 4,0 und pH 7,0) kalibriert werden, und der pH-Wert der Färbelösung sollte nach der Vorbereitung überprüft werden. Zusätzlich muss die Z-Stack-Erfassung das gesamte Zellvolumen abdecken, da eine unvollständige Abdeckung zu einer Unterschätzung der reflektierten Lichtintensität führt. Bildgebende Parameter, einschließlich Laserleistung und Detektorverstärkung, sollten optimiert werden, um das Signal ohne Sättigung zu maximieren, und über Proben hinweg konsistent gehalten werden.

Im Vergleich zu alternativen Senezenz-Assays bietet die reflektierte Lichtbildgebung mehrere Vorteile. Die Brightfield SA-β-gal-Detektion basiert auf der visuellen Identifikation des Niederschlags, weist daher eine begrenzte Empfindlichkeit auf und ist nicht leicht mit multiplexierter Analyse kompatibel. Im Gegensatz dazu erkennt die reflektierte Lichtbildgebung die optische Dichte des X-gal-Präzipitats und erhält dabei die pH-abhängige enzymatische Definition von SA-β-gal. Dies ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis der SA-β-gal-Aktivität zusammen mit fluoreszenzbasierten Markern, sodass die Seneszenz anhand mehrerer Merkmale innerhalb einzelner Zellen bewertet werden kann.

Trotz dieser Vorteile hat die Methode Einschränkungen. Die reflektierte Lichtbildgebung erkennt die optische Dichte des X-Gal-Niederschlags, kann dieses Signal jedoch nicht eindeutig von anderen dichten intrazellulären Strukturen unterscheiden, weshalb pH-kontrollierte Bedingungen unerlässlich sind. Die pH-8-Bedingung liefert eine Grundlage für das reflektierte Hintergrundlicht und unterstützt die Unterscheidung zwischen spezifischen und unspezifischen Signalen. Der Ansatz erfordert außerdem ein konfokales Mikroskop mit geeigneten Reflektionslichterkennungsfähigkeiten, die möglicherweise nicht auf allen Systemen verfügbar sind. Darüber hinaus können Bildflächeneigenschaften die Signalqualität beeinflussen: Kunststoffbodenplatten erhöhen den Hintergrund durch Reflexionen und verringern den Kontrast, während Glasoberflächen eine zuverlässigere Erkennung ermöglichen.

Diese Methode baut auf der Arbeit von Dedic et al. auf, die die reflektierte Lichtbildgebung für den Nachweis von SA-β-gal in reifen Adipozyten etablierten, und erweitert den Ansatz auf ein breiteres Spektrum von Zelltypen26. Anwendung auf frisch isolierte SVF zeigt, dass die reflektierte Lichterkennung von X-gal-Niederschlag mit verschiedenen primären menschlichen Zellpopulationen kompatibel ist. Die Fähigkeit, SA-β-gal-Nachweis mit Linienmarkern wie CD31 zu kombinieren, ermöglicht die Analyse definierter Subpopulationen innerhalb heterogener Gewebe zusätzlich.

Obwohl bei primären menschlichen Proben Variabilität zwischen Spendern erwartet wird, ist das Ziel dieser Studie, die technische Umsetzung der Methode zu etablieren, anstatt die biologische Variabilität zu charakterisieren. Zukünftige Anwendungen in mehreren biologischen Proben oder experimentellen Bedingungen sollten geeignete statistische Analysen enthalten. Darüber hinaus wird die Validierung in etablierten Modellen der Senezenzinduktion und die Integration mit orthogonalen Senezenzmarkern die Interpretation der SA-β-gal-Aktivität in komplexen Zellpopulationen weiter verfeinern.

Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir danken Liv Eidsmo und Keira Melican für den Zugang zu menschlichen Gewebebiopsien sowie Lena Appelsved für die Unterstützung bei der Probenverarbeitung. Diese Studie wurde durch Fördermittel für KLS vom Schwedischen Forschungsrat (2022-01236), dem Strategischen Forschungsprogramm für Diabetes am Karolinska Institut (C5471162), der Novo Nordisk Stiftung (C5475033), dem Vallee Foundation Scholar Award (C5471234), dem Mark Foundation Aspire Grant (C5477023), der Schwedischen Krebsgesellschaft (22 2420), dem Strategischen Forschungsprogramm für Stammzellen und Regeneration am Karolinska Institut (C5472022) sowie der Knut und Alice Wallenberg Stiftung (2020.0118; 2023.0536) unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1.5 mL tubesBioSphere72.706.200Biosphere safeseal tube 1.5 mL, 250 ST
5 mL tubesEppendorf30119401Eppendorf tubes 5.0 mL microtube
96-well plateCorning4680Corning 96-well high content ccreening microplates with film bottom
CD31 primary antibodyAbcamAb9498Anti-CD31 antibody clone JC/70A
Konfokales Mikroskop mit reflektierten LichtfähigkeitenEvidentFV-4000
DeckgläserEprediaBB02400500A113MNZODeckgläser 24 mm x 50 mm, #1.5 Dicke (0,13-0,16 mm) 
DPBSGibco14190-136DPBS, ohne Kalzium, ohne Magnesium
FixierpufferSigma Aldrich1.00496.5000Formaldehydlösung 4%, gepuffert, pH 6,9 
HClSigma-Aldrich320331-500mLSalzsäure (37%)
InkubatorStuartS130HHybridisierungsofen/-schüttler
Mikroskopie-ObjektträgerAvantor VWR631-1560Einzel-Frost-Objektträger, farbige Enden
MontagemittelInvitrogenP36984ProLong Glass Antifade-Montagemittel, Anregung/Emission max 361/497 nm
Mouse IgG1 Isotyp-KontrolleR&D SystemsMAB002
NaOHSigma-AldrichS8045-500GNatriumhydroxid ≥ 98%
Normales EselserumJackson ImmunoResearch Labs017-000-121
pH-MeterMeterLabR21M002 PHM210 Standard-pH-Meter 
Pipettenspitzen (1000 µL)Biosphere70.1186.2101250µL gefilterte Pipettenspitzen
Pipettenspitzen (200 µL)Corning4823200µL gefilterte Pipettenspitzen
SABG-KitCell signaling9860SSeneszenz-beta-Galaktosidase-Färbesatz
Sekundärantikörper, Alexa Fluor 555InvitrogenA31570Donkey anti-Mouse IgG (H+L) hoch gekreuzt-adsorbiert Anregung/Emission max
553/568 nm
Tween-20Fisher Scientific10419000Rein, Fisher Chemical
WasserbadRowe ScientificSWB20DStandard-Wasserbad
WGAInvitrogenW11261Weizenkeim-Agglutinin (WGA) Alexa Fluor 488-Konjugat: Anregung/Emission max 495/519 nm

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