Zusammenstellung und Nutzung eines pflanzlichen gnotobiotischen Wachstumssystems für Studien zur Interaktion von Pflanzen und Mikroben in Getreiden

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Zusammenstellung und Anwendung eines neuen gnotobiotischen Pflanzenwachstumssystems, das für Getreide entwickelt und in Weizen und Mais validiert ist. Dieses pflanzen-gnotobiotische System ermöglicht kontrollierte Pflanzen-Mikroben-Experimente, indem es sterile Wachstumsbedingungen, Bewässerungsmanagement und Kompatibilität mit verschiedenen bodenbasierten Substraten bietet.

Zusammenfassung

Die Entwicklung mikrobieller landwirtschaftlicher Verbesserungsmittel, die konsequent im Feld arbeiten, erfordert ein Verständnis der molekularen Mechanismen von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen. Die Untersuchung dieser zugrunde liegenden Wechselwirkungsmechanismen erfordert die Fähigkeit, Pflanzen unter umweltkontrollierten und gnotobiotischen Bedingungen wachsen zu lassen (d. h. alle Mikroorganismen, die mit der Pflanze interagieren, sind bekannt, sei es keimfreie, definierte mikrobielle Gemeinschaften oder natürliche Gemeinschaften). Die derzeit verfügbaren gnotobiotischen Pflanzensysteme sind nicht geeignet, um große landwirtschaftlich relevante Pflanzen wie Getreide zu untersuchen. Zudem fehlt den meisten dieser Systeme die Fähigkeit, die Bewässerung zu steuern. Hier stellen wir GNOVA vor, ein neues gnotobiotisches System, das entwickelt wurde, um Getreidepflanzen mit der Fähigkeit zur Bewässerung zu ermöglichen. Dieses neue System ist eine barrierefreie Plattform, die aus einer 3D-gedruckten Basis und kommerziell verfügbaren Materialien besteht. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Zusammenstellung des Systems und der Experimenteinrichtung. Darüber hinaus präsentieren wir einen Leistungsvergleich von GNOVA mit einem gnotobiotischen Beutelsystem. GNOVA verlängerte das Pflanzenwachstum von zwei Wochen im Beutelsystem auf 17 Wochen für Weizen und 4 Wochen für Mais. Die Keimrate beider Kulturen stieg innerhalb der GNOVA ebenfalls von 66 % auf 100 % für Weizen und von 75 % auf 100 % für Mais. Weizen, der in der GNOVA angebaut wurde, entwickelte Fräsen, die in Pflanzen gleichen Alters im Sacksystem fehlten. Das frische Gewicht des Mais, das in der GNOVA angebaut wurde, war 594 % höher als im Beutelsystem. Außerdem waren die Triebgröße und die Wurzellänge des Mais im GNOVA-System jeweils 89 % bzw. 57 % größer als in den Säcken. Das GNOVA-System erweitert den Werkzeugkasten, den Wissenschaftlern zur Erforschung von Pflanzen-Mikrobiota-Interaktionen über das Setzlingsstadium in Getreide hinaus zur Verfügung steht, indem es mehr Wachstumsraum und Bewässerungsmanagement bietet.

Einleitung

Bakterienbasierte landwirtschaftliche Behandlungen haben in den letzten Jahrzehnten großes Interesse erregt, da sie die Produktivität der Pflanzen durch Steigerung des Pflanzenwachstums und die Widerstandsfähigkeit gegenüber Umweltstress steigern können. Gleichzeitig sind die molekularen Wirkmechanismen dieser Biostimulanzien weiterhin schlecht verstanden, was zu ihren inkonsistenten Ergebnissen in Böden, Standorten und ^{Umweltbedingungen} beiträgt. Die Verbesserung der Wirksamkeit bestehender mikrobenbasierter Behandlungen und die Entwicklung neuer Technologien erfordert ein tieferes Verständnis der molekularen Mechanismen der Pflanze-Mikroben-Interaktion ^3,4. Die Analyse dieser Mechanismen bleibt jedoch aufgrund der Komplexität natürlicher mikrobieller Gemeinschaften ^5,6 eine Herausforderung. Um die mikrobiellen Effektoren und Wechselwirkungen zu identifizieren, die Pflanzenvorteile antreiben, können wir die Komplexität natürlicher Systeme reduzieren, indem wir synthetische mikrobielle Gemeinschaften (SynComs) in Wachstumssystemen einsetzen, die die Kontrolle der Umweltbedingungen und der mikrobiellen Gemeinschaft ermöglichen. Gnotobiologie, die Untersuchung von Wirten, die mit definierten mikrobiellen Gemeinschaften⁷ assoziiert sind, ermöglicht es Forschern, keimfreie Wirte mit solchen zu vergleichen, die mit bekannten mikrobiellen Gemeinschaften kolonisiert sind, um die mikrobielle Funktion mit Pflanzenphänotyp⁸ zu verknüpfen.

Frühe gnotobiotische Systeme wurden aus Glasreagenzgläsern^{9, 10, 11, 12} und Gläsern¹³ gebaut. Seitdem haben wir eine rasche Ausbreitung neuer Systeme beobachtet, die entwickelt wurden, um Pflanzen gnotobiotisch zu untersuchen. Die heute am häufigsten verwendeten Systeme sind die Verwendung von Petrischalen¹⁴, Reagenzgläsern ^15,16, Glasgläsern¹⁷, Magenta-Boxen¹⁸, versiegelten^{Beuteln 19}, Hydroponik²⁰, FlowPot und GnotoPot²¹, Mikrofluidiksystemen²² sowie EcoFABs²³. Trotz dieses Fortschritts sind die meisten Systeme entweder für Bildgebung²² oder Exsudatsammlung^17,20 optimiert oder für kleine Modellarten 14,18,21 konzipiert. Viele sind geschlossene Systeme, die die Bewässerungskontrolle und die Experimentdauer einschränken. Diese Einschränkungen stellen Herausforderungen für die Untersuchung größerer landwirtschaftlicher Kulturen wie Getreide dar, die zusätzlichen Platz, Luftzirkulation und Wassermanagement benötigen.

In Anerkennung eines Systems, das größere Pflanzen und längere Studien aufnehmen kann, wurde kürzlich EcoFAB 3.0 entwickelt, um den gnotobiotischen Anbau auf größere Pflanzen²⁴ auszuweiten. Der EcoFAB 3.0 bietet ein größeres Volumen an Wurzeln und Kopfraum, was das Wachstum von Sorghum bicolor bis zu 4 Wochen unterstützt und die Exsudatsammlung sowie^{die Wurzelbildgebung rund um 24} Wochen ermöglicht. Obwohl dieses neue System ein vielversprechendes Beispiel für die Erweiterung gnotobiotischer Systeme auf landwirtschaftliche Pflanzen ist, besteht weiterhin Bedarf an einer zugänglichen und vielseitigen Plattform, die sich problemlos in Laboren einsetzen lässt und mit einer Vielzahl experimenteller Arbeitsabläufe kompatibel ist. Aus diesem Grund entwickelten wir GNOVA (GNotobiotic system for Versatile Plant Applications), ein System, das darauf ausgelegt ist, Getreidekulturen unter gnotobiotischen Bedingungen unterzubringen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für den Zusammenbau und Betrieb von GNOVA bereit und demonstrieren deren Leistung im Vergleich zu einem gnotobiotischen Beutelsystem, das routinemäßig in unserem Labor verwendet wird. Mit der Entwicklung dieses neuen Systems haben wir die Fähigkeit verbessert, Weizen und Mais unter sterilen Bedingungen anzubauen, indem wir einen größeren Wachstumsraum und eine integrierte Bewässerung im Vergleich zu früheren geschlossenen Systemen bieten. Die Leistung von GNOVA ist vergleichbar mit der des EcoFAB 3.0 und erweitert damit das Repertoire an Werkzeugen zur Zerlegung von Pflanzen-Mikrobiom-Interaktionen in nicht-modellbasierten Getreidepflanzen. Darüber hinaus wird die Vielseitigkeit und Anpassungsfähigkeit pflanzlicher Gnotobiotika durch das einfache Design von GNOVA, die Verwendung kommerziell verfügbarer Materialien und verfügbare 3D-Objektdateien verstärkt, die es Forschern ermöglichen, Materialien und Designs anzupassen, um ihre Forschungs- und Budgetbedürfnisse anzupassen.

Protokoll

HINWEIS: 3D-Druckdateien für die Basis sind in den Zusatzmaterialien zu finden und öffentlich in Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc) verfügbar. Für Geschwindigkeit und Kosteneffizienz empfehlen wir, in großen Mengen bei lokalen kommerziellen 3D-Druckdienstleistern zu drucken.

1. Zusammenstellung des gnotobiotischen Systems

1. Starte die Montage des Potis (einmal durchführen vor wiederholtem experimenteller Gebrauch).
   1. Schließen Sie den Topfboden, indem Sie den Edelstahl-Drahtgitterkreis über ein Ende des Polycarbonatrohrs legen und den Kreis mit der Schlauchklemme sichern (Abbildung 1A).
   2. Bohren Sie Bewässerungsöffnungen, indem Sie eine 1/4 Zoll (6,35 mm) große Bewässerungsöffnung schaffen, die 1,5 cm von der oberen Kante des offenen Endes des Polycarbonatrohrs entfernt ist. Bohren Sie zwei 1/8 Zoll (3,18 mm) Schlitze 3 cm von der ersten Öffnung entfernt, wobei ein Schlitz 1 cm vom Rand und der andere 2 cm vom oberen Schlitz entfernt ist.
      HINWEIS: Falls erforderlich, können zusätzliche Rohrleitungen um die obere Kante des Topfes nach denselben Schritten hinzugefügt werden.
   3. Installieren Sie das Bewässerungsrohr, indem Sie ein kurzes Stück Siliziumrohr durch die 1/4-Zoll-Öffnung führen.
   4. Sichern Sie den Schlauch, indem Sie den Kabelbinder durch die beiden 1/8-Zoll-Schlitze führen (Abbildung 1B). Führen Sie den männlichen Luer von Befestigung 1 in das Silikonrohr ein, das außerhalb des Potis herausragt (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Der Schlauchbarb von Anschluss 1 sollte freiliegen.
   5. Bereiten Sie Spritzenfässer vor, indem Sie ein leeres Spritzenrohr mit Glaswolle füllen und das Ende mit einem kleinen Stück Alufolie schließen (Abbildung 1C).
   6. Befestigen Sie ein kurzes Stück Siliziumrohr am Ende des Schluerverschlusses am Spritzenlauf (Abbildung 1C).
   7. Bereiten Sie zwei identische Spritzenrohre vor. Befestigen Sie einen der vorbereiteten Spritzenrohre am freiliegenden Schlauchbarb von Anschluss 1 am Rohr, das aus dem Behälter herausragt (Abbildung 1D).
   8. Pause: Zusammengebaute Töpfe können für spätere experimentelle Nutzung gelagert werden.

Abbildung 1: Pot-Baugruppe. A) Boden des Topfes mit Drahtgitter und Schlauchklemme geschlossen. (B) Bewässerungsschacht am oberen Rand des Topfes. (C) Bewässerungsleitung endet mit freiliegendem Schlauchbarb von Fitting 1 mit vorbereitetem Spritzenlauf. (D) Zusammengebauter Topf mit geschlossener Bewässerungsleitung Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Topfvorbereitung für das Experiment (vor jedem neuen Experiment durchführen)
   1. Klebe den Boden des Topfes mit zwei vorgefertigten Rundkreisen aus Glasfaserrohr aus (Abbildung 2A).
   2. Bereiten Sie das Bodensubstrat vor, indem Sie zwei Teile Ton mit einem Teil Sand mischen. Gib 840 ml Substrat in den Topf.
   3. Decken Sie die Potis mit einer Kunststoffkappe ab und sichern Sie sie mit Klebeband (Abbildung 2B).
   4. Autoklavengefüllte Töpfe im Trockenzyklus bei 121 °C für 30 Minuten. Lassen Sie sie über Nacht mit Plastikdeckeln auf den Töpfen abkühlen. Reautoklav im Trockenzyklus bei 121 °C für 30 Minuten. Ganz abkühlen lassen. Halte die Töpfe mit dem Plastikdeckel abgedeckt.
      HINWEIS: Andere Bodensubstrate können verwendet werden, aber die benötigte Menge pro Topf sollte im Voraus optimiert werden. GNOVA wurde außerdem mit 800 ml 100 % Ton und 1 L 100 % Sand getestet. Andere Bodensubstrate benötigen möglicherweise mehr Autoklavenzyklen oder andere Einstellungen für eine vollständige Sterilisation.
      VORSICHT: Beim Entfernen der Töpfe aus dem Autoklaven ist Vorsicht geboten, da das Material heiß wird und die Schlauchklammern sich lockern könnten. Stellen Sie sicher, dass die Schlauchklemmen nach dem Abkühlen fest sitzen, bevor Sie die Potis aufheben.
   5. Setze abgekühlte Potis in die 3D-gedruckte Basis ein. Stellen Sie den mit Erde gefüllten Topf in den 3D-gedruckten Sockel. Halte den Topf an der Basis fest, nicht an den Öffnungssäulen, da diese der empfindlichste Teil sind.
   6. Führen Sie das Bewässerungsrohr durch eine der unteren Öffnungen der 3D-gedruckten Basis (Abbildung 2C).
      HINWEIS: Autoklavieren Sie die 3D-gedruckte Stützbasis nicht, da dies das Teil schmelzen könnte. Experimente, die Temperaturen über 60 °C erfordern, benötigen möglicherweise einen alternativen hitzebeständigen Glühfaden (siehe Materialtabelle).
   7. Halten Sie die Töpfe nach dem Autoklavieren bei Zimmertemperatur und entfernen Sie den Plastikdeckel oder die vorbereitete Spritze erst beim finalen Experimentaufbau.

Abbildung 2: Vorbereiteter Topf Illustration. (A) Boden des Topfes, ausgekleidet mit Fiberglas-Rohrfolie. (B) Oberseite des Topfes geschlossen mit Plastikdeckel. (C) Ein leerer Topf wurde in das endgültige 3D-gedruckte Basisdesign eingebaut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Glaszylindervorbereitung (Durchführung vor jedem neuen Experiment)
   1. Decken Sie ein Ende des Glaszylinders mit einem vorgefertigten DW4-Filter ab und sichern Sie es mit dem Vinylband (Abbildung 3A).
   2. Drehen Sie den Glaszylinder so, dass er zum anderen offenen Ende zeigt, und befestigen Sie einen Baumwollring 14 cm vom Rand entfernt im Rohr. Sichern Sie den Baumwollring mit chirurgischem Klebeband (Abbildung 3B).
   3. Verschließen Sie das untere Ende des Zylinders mit einer Sterilisationsumwicklung mit zwei Gummibändern (Abbildung 3B).
   4. Autoklaviert die vorbereiteten Glaszylinder im Trockenzyklus bei 121 °C für 30 Minuten vor der Nutzung. Nach dem Autoklavieren werden die sterilen Glaszylinder bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis sie benötigt werden, ohne die Folie zu entfernen.

Abbildung 3: Glaszylinder-Baugruppe. (A) Oberes Ende des Glaszylinders mit DW4-Filtermedium und Vinylband verschlossen. (B) Unteres Ende des Glasflaschen, mit einem Baumwollring versehen und mit Sterilisationsfolie und Gummibändern verschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Vorbereitung des Bewässerungsfilters (Durchführung vor jedem Bewässerungsereignis, mit Ausnahme der Schritte 1.4.4–1.4.6, die nur einmal durchgeführt werden sollten)
   1. Stellen Sie den Filterhalter zusammen, indem Sie die PES-Filtermembran (Abbildung 4A.4) zwischen den Filterhalter (Abbildung 4A.5) und die Filterscheibe (Abbildung 4A.3) platzieren.
   2. Orientiere die glatte Seite der Filtermembran in Richtung des Ausflusses und achte darauf, dass sie zur Oberseite des Filterhalters zeigt (Abbildung 4A.1).
   3. Setzen Sie den O-Ring (Abbildung 4A.2) oben in den Filterhalter (Abbildung 4A.1). Befestigen Sie den Filterdeckel am Filterhalter. Nur handfestziehen.
   4. Verbinder anschließen. Stecke den männlichen Schläger von Anschluss 2 an den oberen Anschluss des Filterhalters.
   5. Befestigen Sie ein kurzes Stück Siliziumrohr am Ende des Schlauchstachels am Filter (Abbildung 4B). Setzen Sie den männlichen Luder eines Fitting 1 am Ende des anderen vorbereiteten Spritzenlaufs aus Schritt 1.1.6 (Abbildung 4B) ein.
   6. Verbinde den Filter mit dem Schlauchbarb-Anschluss am vorbereiteten Spritzenrohr.
   7. Autoklaven die zusammengebauten Filter im Trockenzyklus bei 121 °C für 30 Minuten. Ziehe die Filter fest, sobald sie abgekühlt sind und vor der Benutzung.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, alle benötigten Filter vorzubereiten und sie in einer geschlossenen Polypropylenbox zu autoklavieren. Nach dem Autoklavieren können die Bewässerungsfilter bei Raumtemperatur steril gehalten werden, solange die vorbereitete Spritze nicht entfernt wird.

Abbildung 4: Filterhalter-Baugruppe. (A) Zerlegter Filterhalterteil: 1. Filterhalter-Oberseite, 2. O-Ring, 3. Filterdisk, 4. Filtermembran und 5. Filterhalter. (B) Zusammengebauter Filterhalter mit entsprechendem vorbereitetem Spritzenrohr. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Aufbau des Experiments

1. Bereiten Sie Lösungen und Materialien mindestens einen Tag vor der Einrichtung des Experiments vor und sterilisieren Sie sie.
   1. Bereiten Sie 0,5x Murashige und Skoog Pflanzenwachstumsmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Autoklavenmedium im flüssigen Zyklus bei 121 °C für 30 Minuten.
   2. Autoklaven des zerlegten Flaschendeckelspenders im Trockenzyklus bei 121 °C für 30 Minuten. Autoklaven: 1 Liter deionisiertes Wasser im Flüssigkreislauf bei 121 °C für 30 Minuten.
   3. Autoklavenglas-Petrischale, 500 ml Becher, Teesiebe und Pinzette im Trockenzyklus bei 121 °C für 30 Minuten am Tag im Voraus.
      HINWEIS: Sofern nicht anders angegeben, sollten die folgenden Schritte in einer laminaren Flusshaube unter Verwendung der aseptischen Technik durchgeführt werden.
2. Samen an der Oberfläche sterilisieren.
   HINWEIS: Das Sterilisationsprotokoll für Oberflächensamen hängt von der verwendeten Pflanzenart ab. Das gnotobiotische System wurde sowohl mit Weizen als auch mit Mais unter Verwendung folgender Saatgutsterilisationsprotokolle getestet.
   VORSICHT: Tragen Sie beim Umgang mit Bleichmittel und Natriumhypochlorit einen Kittel, Handschuhe und Schutzbrillen, da diese Chemikalien reizend oder korrosiv für Haut und Augen sein können. Ethanol ist brennbar; Verwenden Sie keine nahe offene Flamme.
   1. Sterilisation von Weizensamen²⁵
      1. Füllen Sie zwei Becher mit 150 ml 95 % V/V-Ethanol, einen Becher mit 150 ml unverdünntem Haushaltsbleichmittel und zwei Becher mit 150 ml Wasser.
      2. Geben Sie Weizensamen in das Teesieb. Rühren Sie das Teesieb vorsichtig mit Samen in einem der Becher mit 95 % V/V-Ethanol für eine Minute.
      3. Samen in ein neues Teesieb umleiten. Teesiebe mit Samen in Bleichmittel 10 Minuten lang vorsichtig bewegen.
      4. Samen in ein neues Teesieb umleiten. Rühre die Teesiebe vorsichtig mit Samen im anderen Becher mit 95 % V/V-Ethanol.
      5. Bewegt Teesieb mit Samen vorsichtig in sterilem, deionisiertem Wasser 30 Sekunden lang. Bewegt die Teesiebe vorsichtig mit Samen im anderen Becher mit sterilem deionisiertem Wasser für 2 Minuten. Setze sterile Samen in eine leere, sterile Petrischale.
   2. Maissamensterilisation²⁶
      1. Legen Sie Maissamen in ein 50-mL konisches Rohr. Fülle das konische Rohr mit 70% V/V-Ethanol. Wenden Sie das konische Rohr vorsichtig 3 Minuten lang um.
      2. Dekantieren Sie 70 % Ethanol und füllen Sie das konische Rohr mit Samen mit 2 % V/V Natriumhypochlorit. Wenden Sie das konische Rohr vorsichtig 3 Minuten lang um.
      3. Dekantieren Sie 2 % Natriumhypochlorit und spülen Sie die Samen mit sterilem deionisiertem Wasser. Wasser überfüllen und die Samen viermal mit Wasser abspülen. Legen Sie Maissamen in eine sterile Petrischale.
3. Fügen Sie das mikrobielle Inokulum dem Medium hinzu, wenn es angebracht ist.
   HINWEIS: Während der Optimierung und Sterilitätstests des gnotobiotischen Systems wurde kein mikrobielles Inokulum angewendet.
4. Bauen Sie die Flaschenverschlussspender zusammen und befestigen Sie sie an den Medienflaschen.
   HINWEIS: Da es sich um ein offenes System handelt, empfehlen wir, einen Behälter zu haben, um das Durchflussmedium zu sammeln. Wir haben festgestellt, dass die Verwendung eines Backblechs gut funktioniert und eine einfache Bewegung ermöglicht, aber es erfordert häufiges Entleeren.
5. Nimm den Plastikdeckel vom Topf und gib 378 ml Medium in den Topf.
   HINWEIS: Dies entspricht etwa 70 % wassergefülltem Porenraum (WFPS), der bei Verwendung anderer Bodensubstrate angepasst werden sollte. Verwenden Sie 360 ml für Ton und 358 ml für Sand.
   1. Säe den sterilisierten Samen mit einer sterilen Pinzette auf die entsprechende Tiefe.
   2. Weizen in einer Tiefe von 1/2 Zoll und Mais in einer Tiefe von 2,5 cm aussäen. Alternativ kann sterile vorgekeimte Setzlinge in die GNOVA ausgesät werden. Verwenden Sie vorgekeimte Samen für Maiswachstumstests.
   3. Setze den Kunststoffdeckel oben auf dem Topf auf.

3. Endmontage und experimenteller Betrieb

1. Bringen Sie den Topf und den Glaszylinder in eine Wachstumskammer. Halte den Glaszylinder mit dem Boden nach unten nahe am Topf.
2. Entferne schnell den Kunststoffdeckel vom Topf und die Sterilisationsfolie vom Glaszylinder. Senken Sie den Glaszylinder auf die Spitze und setzen Sie ihn auf die Kante des 3D-gedruckten Sockels.
   HINWEIS: Eine Flamme (z. B. ein tragbarer Bunsenbrenner) kann während der Endmontage des Wachstumssystems neben dem Topf platziert werden, um das Kontaminationsrisiko weiter zu verringern.
   VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass sich bei der Arbeit mit offener Flamme keine anderen brennbaren Materialien in der Nähe befinden. Achten Sie auf die Position der Flamme relativ zu Ihrem Körper, um Verbrennungen zu vermeiden.
3. Pflanzen zwischen 4 und 17 Wochen wachsen lassen, abhängig von der Pflanzenart, unter artspezifischen Wachstumsbedingungen.
4. Weizen werden bei Tag-/Nachttemperaturen von 22 °C/16 °C und Mais bei 27 °C/23 °C angebaut. Die Photoperiode beider Pflanzen beträgt 12 Stunden nur unter Leuchtstoffröhren.

4. Bewässerung

1. Befestigen Sie ein langes Silikonrohr am Flaschendeckelspender.
2. Halten Sie die Sterilität während des Gießens mit einer tragbaren Flamme aufrecht. Wenn eine tragbare Flamme keine Option ist, führen Sie eine Bewässerung mit Bleichmittel durch, um die Sterilität zu erhalten.
3. Bewässerung mit einer tragbaren Flamme.
   VORSICHT: Arbeiten Sie vorsichtig um offene Flammen, um Körperverletzungen und Schäden an der Einrichtung zu vermeiden.
   1. Platziere die Flamme in der Nähe der Bewässerungsleitung. Entfernen Sie das Spritzenrohr von der Bewässerungsleitung und dem Filterhalter. Halten Sie alle Rohrenden innerhalb der Flammenzone.
   2. Befestigen Sie den Filterhalter an der Bewässerungsleitung. Verbinden Sie die beiden Spritzenrohre miteinander. Verbinde das andere lange Silikonrohrteil am Flaschenoberspender mit dem unteren Anschluss des Filterhalters.
   3. Dosieren Sie 150 ml 0,5-faches Murashige und Skoog-Medium. Trennen Sie die beiden Spritzenrohre.
   4. Lösen Sie das Silikonrohr vom Filterhalter ab und ersetzen Sie es durch ein Spritzenrohr.
4. Bewässerung mit 10 % Bleichmittel
   HINWEIS: Wir empfehlen, diese Bewässerungsstrategie in großen Experimenten (n > 50) anzuwenden, um den Durchsatz beim Bewässern zu erhöhen.
   VORSICHT: Tragen Sie beim Umgang mit Bleichmittel einen Laborkittel, Handschuhe und Schutzbrille.
   1. Gib eine 10%ige V/V-Bleichlösung in zwei kleine Plastikbecher und stelle sie in der Nähe der Bewässerungsleitung. Entfernen Sie das Spritzenrohr von der Bewässerungsleitung und dem Filterhalter.
   2. Alle Schlauchenden in die 10%ige Bleichlösung tauchen, bis sie benötigt werden. Schüttle die überschüssige Bleichlösung ab. Befestigen Sie den Filterhalter an der Bewässerungsleitung des Topfs.
   3. Verbinden Sie das andere lange Silikonrohrstück des Flaschentop-Dispensers mit dem unteren Anschluss des Filterhalters.
   4. Dosieren Sie 150 ml 0,5-faches Murashige und Skoog-Medium. Lösen Sie das Siliziumrohr vom Filterhalter.
      HINWEIS: Das Bewässerungsvolumen beträgt 120 mL für Sand und 360 mL für Ton.
   5. Ersetze den Filter in der Bewässerungsleitung nach dem Abschütteln des überschüssigen Bleichmittels durch ein Spritzenfass.
      HINWEIS: Wenn sich das Bewässerungsvolumen ändert, berücksichtigen Sie etwa 20 ml Medien, um die Bewässerungsleitung zu primieren.
5. Bewässern Sie die Töpfe einmal pro Woche. Passen Sie das Bewässerungsvolumen und die Häufigkeit je nach Ziel des Experiments und dem verwendeten Bodensubstrat an. Wenn 100 % Sand verwendet wird, erhöhen Sie die Bewässerungsfrequenz auf zweimal pro Woche.

5. Ernte

HINWEIS: Dieses Ernteprotokoll wurde während der Tests und Optimierung des gnotobiotischen Systems befolgt. Das Ernteprotokoll sollte angepasst werden, um spezifische Forschungsziele und das Volumen der verarbeiteten Proben zu berücksichtigen.

1. Bereiten Sie alle Lösungen und Materialien mindestens einen Tag vor der Ernte vor und sterilisieren Sie sie.
   1. Autoklaven 4 Liter deionisiertes Wasser und 500 ml 0,145 M NaCl, in einem Flüssigkeitszyklus bei 121 °C für 30 Minuten am Voraus.
   2. Autoklaveschere und -pinzette im Trockenzyklus bei 121 °C für 30 Minuten am Voraus.
      HINWEIS: Sofern nicht anders angegeben, sollten die folgenden Schritte in einer laminaren Flusshaube unter Verwendung der aseptischen Technik durchgeführt werden. Wenn für die Probenentnahme keine Sterilität erforderlich ist, können alle diese Schritte außerhalb einer laminaren Flusshaube durchgeführt werden.
2. Übertragen Sie die gnotobiotischen Systeme aus der Wachstumskammer ins Labor und setzen Sie sie nahe an die laminare Flusshaube.
3. Entferne den Glaszylinder aus dem Topf und setze ihn schnell in die laminare Flow-Haube. Nimm den Topf aus der 3D-gedruckten Basis.
4. Halte die Pflanze an der Basis und kippe das Bodensubstrat in einen Behälter. Schütteln Sie vorsichtig große Erdklumpen von den Wurzeln ab.
   HINWEIS: Bodensubstratproben können gemäß dem spezifischen Forschungsziel in diesem Ernteabschnitt entnommen und verarbeitet werden. Das hier kurz beschriebene Protokoll wurde zur Überprüfung der Sterilität von Böden verwendet.
5. Bodenentnahme für Bakterienzählung²⁷ mit Einzelplatten-Serialverdünnung²⁸.
   1. Füllen Sie die Bohrungen einer 96-Bohrloch-Platte mit 270 μL von 0,145 m NaCl. Lassen Sie die erste Reihe frei. Gib 1 g Bodensubstrat in ein 15 ml konisches Rohr mit 9 ml 0,145 M NaCl.
   2. Vortex mit maximaler Geschwindigkeit für 5 Minuten. Übertragen Sie 30 μL der Probe in einen leeren Brunnen der 96-Bohrloch-Platte.
   3. Bereiten Sie sieben serielle Verdünnungen jeder Probe vor, indem Sie 30 μL jeder Probe in den darunterliegenden Brunnen mit 270 μL NaCl-Lösung pipettieren.
   4. Gut mischen, indem du zwischen jedem Transfer auf und ab pipettierst.
   5. Bereite eine einzelne Platte mit serieller Verdünnung jeder Probe vor, indem 10 μL jeder seriellen Verdünnung auf eine einzelne R2A-Platte aufgetragen wird.
   6. Kippe die Platten, um die Tropfen zu verteilen. Teller bei Zimmertemperatur inkubieren.
   7. Zählen Sie koloniebildende Einheiten (CFU) und berechnen Sie CFU/g Boden.
6. Trennen Sie die Triebe von den Wurzeln mit einer sterilen Schere. Rekord für frisches Schussgewicht.
7. Reinigen Sie die Wurzeln, indem Sie sie vorsichtig in einem Becher mit deionisiertem Wasser schütteln. Tupfen Sie die Wurzeln trocken und nehmen Sie frisches Gewicht auf.
   HINWEIS: Ober- und Unterirdisches Material kann an diesem Punkt gesammelt und gemäß der für die relevanten nachgelagerten Analyse am besten geeigneten Methodik verarbeitet werden.

Ergebnisse

Wir entwickelten GNOVA, ein neues pflanzliches gnotobiotisches System, das die sterile und kontrollierte Umgebung ermöglicht, die notwendig ist, um Pflanze-Mikroben-Interaktionen zu untersuchen. Dieses neue System bietet 62 cm (24,4 Zoll) vertikalen Triebraum und einen 1,3-Liter-Topf, der mit mehreren Bodensubstraten kompatibel ist. Das vollständig zusammengebaute System ist etwa 92,4 cm (3 Fuß) hoch und 11,6 cm (4,57 Zoll) breit (Abbildung 5A–C). Im Vergleich zu anderen Systemen hat er die höchste vertikale Kapazität für Triebwachstum und die zweitgrößte Wurzelkammer (Ergänzungstabelle 1). GNOVA benötigt nur 0,0135 m^² Oberfläche in der Wachstumskammer, wodurch dieses System kompakt und wendig ist. Dieses System kann in Reach-In-Wachstumskammern mit einer vertikalen Freiheit von 1,22 m eingesetzt werden. Alle Komponenten dieses Systems, mit Ausnahme der 3D-gedruckten Basis, sind autoklavierbar und kompatibel mit Autoklaven mit Abmessungen von 24 Zoll × 24 Zoll × 36 Zoll (Breite × Länge × Höhe; 61 cm × 61 cm × 91 cm). Dies vereinfacht das experimentelle Setup, indem die manuelle Sterilisation einzelner Teile umgangen wird. Außerdem sind die meisten Komponenten dieses Systems wiederverwendbar, sodass die Kosten pro Experiment nach den anfänglichen Einrichtungskosten von 54 USD pro Einheit bei etwa 6 USD liegen (Ergänzungstabelle 2). Die Umweltbedingungen innerhalb der GNOVA wurden durch die Verfolgung der Temperatur und relativen Luftfeuchtigkeit des Systems mit einer eine Woche alten Maispflanze über drei Tage hinweg bestimmt. Die Temperatur innerhalb der GNOVA lag im Durchschnitt bei +1,3 °C höher als in der Wachstumskammer (ergänzende Abbildung 1). Die Temperaturunterschiede innerhalb des Systems und der Kammer waren während des Lichtzyklus (durchschnittlich +2,5 °C) größer als während des Dunkelzyklus (durchschnittlich +0,4 °C). Die relative Luftfeuchtigkeit innerhalb der GNOVA lag im Durchschnitt bei 63 %, im Gegensatz zu 34 % in der Wachstumskammer.

Abbildung 5: Darstellungen des GNOVA-Systems. (A) 3D-Modell des endgültigen Designs der Stützbasis (B) Querschnitt des 3D-Modells der Stützbasis (C) Querschnitt des 3D-Modells der vollständig montierten GNOVA Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Um die Sterilität im System zu gewährleisten, führten wir einen vierwöchigen Versuch mit nicht bewässerten und bewässerten Systemen ohne Pflanzen durch. Die Verunreinigung am Glaszylinder wurde durch Probenahmen oberhalb und unterhalb des Baumwollrings mittels direkter Abstrichbeschichtung bestimmt. Oberhalb des Baumwollrings wurde sowohl für nicht bewässerte (n=4) als auch für bewässerte Proben (n=6) kein nachweisbares mikrobielles Wachstum über drei Kolonien (d. h. eine einzelne Kolonie pro Drittel der beprobten Oberfläche) beobachtet. Unterhalb des Baumwollrings wurde Wachstum in einer nicht bewässerten Replikation beobachtet, während in bewässerten Systemen kein Wachstum festgestellt wurde (ergänzende Abbildung 2B). Dies deutet auf ein geringes Kontaminationspotenzial durch den Glaszylinder hin, da mikrobielles Wachstum nur in begrenzten Replikationen unterhalb des Baumwollrings vorhanden war, der nicht mit der Pflanze in Kontakt steht. Die Bodenkontamination wurde durch das Erkennen serieller Verdünnungen auf R2A-Platten bewertet (ergänzende Abbildung 2C). Kein signifikantes mikrobielles Wachstum wurde in beiden Zuständen nachgewiesen, abgesehen von einer einzelnen bewässerten Replikat mit einer nicht scorablen, koloniebildenden Einheitszahl durch serielle Verdünnungen (d. h. < 30 Kolonien). Zusätzlich zu den Sterilitätstests führten wir einen Leistungsvergleich von Weizen und Mais durch, die in GNOVA angebaut wurden, mit unserem standardmäßigen gnotobiotischen Wachstumsprotokoll von zwei Wochen im Beutelsystem¹⁹. Um die Auswirkungen von geringer Größe und fehlender Bewässerung auf die Pflanzenleistung zu verstehen, haben wir die Wachstumsperioden im Beutel so verlängert, dass sie mit denen innerhalb der GNOVA übereinstimmen. Obwohl der anfängliche Bodenwassergehalt, der bei der Einrichtung beider Systeme verwendet wurde, übereinstimmte, erhielt GNOVA wöchentliche Fertigation, während die Säcke dies nicht taten. Für alle Vergleiche verwenden wir das Beutelsystem als Referenz, da dies die anfängliche gnotobiotische Einrichtung unseres Labors war. Sowohl Weizen als auch Mais erreichten innerhalb der GNOVA 100 % Keimung, während im Beutelsystem Weizen nur 67 % (n = 3) und Mais 75 % (n = 8) erreichte (Abbildung 6).

Abbildung 6: Keimung von Weizen (n = 3) und Mais (n = 8) innerhalb der GNOVA (lila) und des Beutelsystems (grün). Das Keimungsergebnis jeder Replikation wird durch Punkte auf der y-Achse entweder als Keine Keimung oder Keimung für jedes gnotobiotische System dargestellt. Balken geben die Keimrate (%) jeder Pflanzenart innerhalb verschiedener Systeme an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ein Wachstumstest für Weizen und Mais wurde ebenfalls durchgeführt, um die maximal lebensfähige Wachstumsperiode und die Pflanzenleistung innerhalb der GNOVA zu bestimmen. Obwohl unser Standard-Beutelprotokoll nur zwei Wochen Wachstum vorsieht, haben wir die Wachstumsphase innerhalb der Beutel über zwei Wochen hinaus verlängert, um einen besseren Vergleich zwischen den beiden Systemen zu ermöglichen. Nach zwei Wochen hatte der in der GNOVA (n=3) angebaute Weizen bereits Zadocks Wachstumsstufe (GS) 13 erreicht (Abbildung 7A), während er im Beutel bei GS11 blieb. In Woche fünf hatten die Anlagen GS21 innerhalb der GNOVA-Systeme erreicht, wie das Aussehen der Fräsen (Abbildung 7B) zeigt. Im Gegensatz dazu fehlten Fräsen in den Sacksystemen, und die Anlagen blieben in GS13. Diese Wachstumshemmung und das Fehlen phänologischer Veränderungen im Beutelsystem führten zur Einstellung der Pflanzen in diesem System in Woche sechs. Weizenpflanzen wuchsen weitere fünf Wochen innerhalb der GNOVA, wo eine Zunahme von Blattanzahl und Biomasse beobachtet wurde (Abbildung 7C). Obwohl die Weizenbiomasse nach 12 Wochen Wachstum innerhalb der GNOVA visuell zunahm, begannen die Pflanzen auch, mehr chlorotische Blätter zu zeigen, und das Glaszylindervolumen wurde durch Pflanzenbiomasse gefüllt (Abbildung 7D). Weizen wurde danach weitere zwei Wochen angebaut (Abbildung 7E, F). Es gab jedoch keinen sichtbaren Anstieg der Biomasse, sodass der Wachstumstest nach 17 Wochen des Wachstums beendet wurde. Das Maiswachstum wurde außerdem innerhalb der GNOVA für vier Wochen bewertet und mit Mais, der in Säcken angebaut wurde, verglichen (Abbildung 8A,B). In diesem Experiment wurden Maissamen vor der Aussaat in der GNOVA oder im Beutelsystem sterilisiert und vorgekeimt. Das frische Trieb- und Wurzelgewicht von Mais unterschied sich signifikant zwischen den beiden Systemen (Zwei-Proben-T-Test, p-Wert < 0,05, Ergänzungstabelle 3). Mais, der in GNOVA angebaut wurde, hatte frische Triebe und Wurzeln, die im Durchschnitt 11,2 g bzw. 5,7 g wogen (Abbildung 8C, D). Im Gegensatz dazu hatten die im Beutel angebauten Maistriebe und Wurzeln frische Gewichte von 1,29 g bzw. 1,15 g. Insgesamt stieg die frische Biomasse des in der GNOVA angebauten Maises im Vergleich zum im Beutelsystem angebauten Mais um 593 %. Außerdem waren die Trieb- und Wurzellänge innerhalb der GNOVA um 89 % bzw. 57 % signifikant größer als in den Beuteln (Abbildung 8E, F).

Abbildung 7: Wachstum des Weizens im GNOVA-Prototyp. (A) Weizen in zwei Wochen in Zadocks Wachstumsphase (GS) 13. (B) Vergleich von Weizen nach fünf Wochen Wachstum in einem Sack und GNOVA. Fräsen befinden sich in der GNOVA (GS21) und fehlen im Beutel (GS13). (C) Erhöhung der Weizenbiomasse nach 10 Wochen Wachstum. (D) Zunahme der Weizenbiomasse nach 13 Wochen Wachstum mit dem Auftreten chlorotischer Blätter. (E) Weitere Erhöhung der Weizenbiomasse nach 15 Wachstumswochen. F) Weizenbiomasse nimmt den größten Teil des verfügbaren Wachstumsvolumens nach 17 Wochen ein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8: Wachstum von Mais innerhalb des GNOVA (lila) Prototyps im Vergleich zum Säcksystem (grün). Balken zeigen Durchschnittswerte ± Standardfehler (n=4) (A) Mais an, der vier Wochen lang in GNOVA und im Beutelsystem angebaut wurde. (B) Größenvergleich der geernteten Pflanzen in GNOVA und Beutelsystem. (C) Frisches Schussgewicht (Mean±SE). (D) Frisches Wurzelgewicht (Mittel±SE). (E) Schusslänge (Mean±SE). F) Wurzellänge (Mittel±SE). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Zeitliche Dynamik der relativen Luftfeuchtigkeit und Temperatur, gemessen innerhalb von GNOVA (lila) und der Wachstumskammer (orange). Die Daten wurden in fünfminütigen Abständen über drei Tage aufgezeichnet. Daten innerhalb der GNOVA wurden mit einer sieben Wochen alten Maispflanze erfasst. Bereiche, die hellblau schattiert sind, entsprechen den Nachtperioden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Mikrobielles Wachstum resultiert aus Sterilitätstests der GNOVA ohne Bewässerung der Pflanzen (Control) und mit Bewässerung (Irrigated). (A) Glaszylinderproben über dem Baumwollring. (B) Glaszylinderproben unter dem Baumwollring. (C) Einplatten-Serienverdünnung von Bodenproben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Funktionsvergleich von GNOVA mit anderen bestehenden gnotobiotischen Pflanzen (EcoFAB, magentafarbene Boxen, Beutel, FlowPot und GnotoPot sowie EcoFAB 3.0). Systeme werden anhand wichtiger Parameter verglichen, die für das experimentelle Design relevant sind, wie z. B. Pflanzenhöhe, Wurzelvolumenkapazität und Bewässerungskontrolle. Die Informationen wurden aus veröffentlichter Literatur und verfügbaren Systembeschreibungen zusammengestellt; Wo Daten nicht explizit angegeben wurden, werden Schätzungen angegeben. † Beste Näherung, wenn sie in der Literatur nicht angegeben ist; ‡ Das System muss nicht auseinandergebaut oder zur laminaren Strömungshaube verlegt werden, um die Aufgabe zu erfüllen; * Möglich mit Modifikationen am System; Kostenkategorien sind definiert als: niedrig (< 30 USD pro Einheit), mittel (30–100 USD pro Einheit), hoch (> 100 USD pro Einheit) Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Materialliste (BOM) und geschätzte Kosten für den Zusammenbau und Betrieb einer einzelnen GNOVA-Einheit. Materialien werden als wiederverwendbare oder Einwegkomponenten kategorisiert, mit entsprechenden Einheitskosten, benötigten Mengen pro System und Gesamtkosten pro System. Wiederverwendbare Komponenten tragen zu den anfänglichen Aufbaukosten bei, und Einwegmaterialien stellen verbrauchbare Kosten pro Experiment dar. * berechnet aus ausgehandelten Massenpreisen für kosteneffiziente Tarife; ** Die benötigte Menge variiert je nach Experimente, verwendetem Bodensubstrat und Forschungsziel. Wert für ein vierwöchiges Experiment mit einem wöchentlichen Bewässerungsplan unter Verwendung der Ton- und Sandmischung; † Ungefähre Kosten der pro System benötigten Materialmenge; ‡ Enthält keinen Preis für Nährstofflösung oder Bodensubstrat, da dies je nach experimentellem Ziel variiert.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Die resultierenden p-Werte des zweiprobigen t-Tests für Maiswachstum maßen Variablen, die innerhalb der GNOVA und des Beutelsystems gezüchtet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Das hier vorgestellte Pflanzengnotobiotiksystem, GNOVA, bietet ein zugängliches und vielseitiges Werkzeug zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Pflanze und Mikroben in Getreidepflanzen. Zu den wichtigsten Merkmalen gehören eine erhöhte Wachstumskapazität und eine eingebaute Bewässerung, die das Wachstum von Getreide über das Setzlingsstadium hinaus unter sterilen Bedingungen verlängert. Die Leistung dieses Systems ist vergleichbar mit der des EcoFAB 3.0 und bietet ein zugängliches alternatives pflanzliches gnotobiotisches System. Das System besteht aus kommerziell erhältlichen Komponenten, die aus Kostengründen, Einfachheit und Kompatibilität mit mittelgroßen Autoklaven ausgewählt wurden, was die Einführung in Laboren erleichtert. Montage und Betrieb sind unkompliziert und erfordern keine spezielle Ausrüstung, wodurch Hürden bei der Umsetzung reduziert werden. GNOVA kann aufgrund ihrer Kompatibilität mit einer Vielzahl von Bodensubstraten, Saatgutsterilisationsprotokollen, mikrobiellen Impfstoffen (keimfrei, SynCom oder natürliche Gemeinschaft) und vielfältigen nachgelagerten Analysen an unterschiedliche Forschungsziele angepasst werden.

Minimale Kontamination ist in pflanzlichen gnotobiotischen Experimenten unerlässlich, um sicherzustellen, dass die beobachteten Effekte auf interessierende Mikroben und nicht auf Schadstoffe zurückzuführen sind. Der einfache Betrieb von GNOVA verringert das Kontaminationsrisiko. Strikte Einhaltung der aseptischen Technik und die folgenden wichtigen Empfehlungen stellen sicher, dass die Sterilität aufrechterhalten bleibt. Während des Experiments empfehlen wir die Desinfektion der laminaren Flusshaube zwischen mikrobiellen Impfstoffen, um Kreuzkontaminationen der Behandlungen zu minimieren. Die Reihenfolge, in der die Behandlungen angewendet werden, kann ebenfalls die Kreuzkontamination verringern. Die Anwendung keimfreier Behandlungen vor allen lebenden mikrobiellen Behandlungen ist ideal. Fremde Mikroben können ebenfalls durch Samen eingeführt werden. Oberflächen-Saatgutsterilisationsprotokolle sollten daher für jede Pflanzenart oder Saatgutquelle optimiert werden, um Sterilität und Keimung^{auszubalancieren 26}. Sterilisationsprotokolle für Nicht-Modellgetreide wie Sorghum²⁴, Gerste²⁹, Switchgrass und Hafer²³ können problemlos in GNOVA implementiert werden. Wenn die Sterilisation die Keimung negativ beeinflusst, können stattdessen vorgekeimte Samen verwendet werden. Bewässerung stellt eine Hauptquelle der Kontamination in gnotobiotischen Systemen dar. Der kritischste Punkt während dieses Prozesses ist das Anbringen der Filter an den Bewässerungsleitungen. Die Rohrenden der Bewässerungsleitungen und Filter müssen durch diesen Prozess steril bleiben. Die Flammensterilisation erfordert Geschicklichkeit und kann besonders in großen Experimenten arbeitsintensiv sein (n >50). Daher wird die alternative Bleichmittelmethode für große Experimente oder bei Flammensterilisation nicht praktikabel empfohlen. Die Pflege zusätzlicher steriler Filter sowie das Vorhandensein von Bleichmittel oder Ethanol während des Bewässerns werden ebenfalls empfohlen, falls die Materialien beim Umgang mit dem System kontaminiert werden. Darüber hinaus wird die Einbeziehung von Kontaminationskontrolleinheiten (d. h. keine Pflanze, keine Mikrobenbehandlung und Bewässerung) dringend empfohlen, um die Sterilität zu überwachen und Schadstoffe zu identifizieren.

Um das Risiko einer Bewässerungskontamination zu überwinden, waren die frühesten gnotobiotischen Pflanzensysteme vollständig geschlossen und verfügten über keine Bewässerungsfähigkeit, was die Dauer der Experimente begrenzte. Mais wurde gnotobiotisch in^{Beuteln 19,30} angebaut, Glasröhrchen und Petrischächern¹⁵ in zwei bis vier Wochen. Um Wasser und Nährstoffe während des Pflanzenwachstums aufzufüllen, ermöglichten alternative Systeme wie das EcoFAB²³, FlowPot und GnotoPot²¹ die Bewässerung durch teilweise Demontage in laminaren Flusshauben. Dies schränkte ihre Größe und Kompatibilität mit größeren Pflanzen ein. Da Bewässerungsleitungen außerhalb der GNOVA leicht zugänglich sind, ist eine Demontage nicht erforderlich, und das System ist nicht auf die Größen der laminaren Flusshaube beschränkt. Dies ermöglicht nicht nur eine kontinuierliche Versorgung mit Nährstoffen und Wasser, sondern vergrößert auch den verfügbaren Wachstumsraum. Verringerter Triebraum kann die photosynthetische Kapazität verringern und zur Wachstumsstörung^beitragen, während die Einschränkung des Wurzelvolumens zu einer Wurzelbindung führen und die Wasser- sowie Nährstoffaufnahme^{verringern kann 31}. Die Kombination aus geringem Wachstumsraum und fehlender Bewässerung im Sacksystem könnte die verringerte Biomasse und das Fehlen phenologischer Entwicklung von Mais und Weizen im Vergleich zum GNOVA-System erklären. Dieses neue System ermöglichte das gnotobiotische Wachstum von Mais über eine Dauer, die mit der von Sorghum in EcoFAB 3.0²⁴ vergleichbar ist. Außerdem übersteigt er das gnotobiotische Wachstum von Weizen für vier Wochen in einem hydroponischen System (20) in einem repräsentativeren Bodensystem. Neben physikalischen Einschränkungen sind gnotobiotische Systeme oft auf eingeschränkten Luftstrom angewiesen, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. Begrenzter Luftstrom kann zu erhöhter Temperatur und Luftfeuchtigkeit sowie zu niedrigeren Gaswechselraten führen, was die Pflanzenphysiologie^{beeinträchtigen} könnte. Ein verbessertes Wachstum wurde in Systemen mit verbessertem Luftstrom berichtet, wie magentafarbenen Boxen mit HEPA-Filtern³³, die ähnlich wie der DW4-Filter in GNOVA funktionieren. Ebenso zeigte EcoFAB 3.0 erhöhte Temperatur und relative Luftfeuchtigkeit, galt aber weiterhin als robuste Grundlage für das gnotobiotische Wachstum von Sorghum²⁴. Dies legt nahe, dass zwar physische und ökologische Einschränkungen in gnotobiotischen Systemen bestehen, die hier vorgestellten Fortschritte im Systemdesign jedoch dennoch verbesserte Bedingungen bieten, die das gnotobiotische Wachstum von Getreide effektiver unterstützen.

Die einfache Modifikation ist ein weiteres zentrales Merkmal von GNOVA. Die Modularität des Designs ermöglicht es den Nutzern, einzelne Teile anzupassen, um besser zu ihren Forschungsbedürfnissen und ihrem Budget zu passen. Dieses System ist mit jedem Bodensubstrat, einschließlich natürlicher Böden, kompatibel. Anpassungen des Aufbauvolumens, der Konzentration der Nährstofflösung sowie des Bewässerungsvolumens und der Bewässerungshäufigkeit sollten auf den physikalisch-chemischen Eigenschaften des Bodens basieren, da sie direkt die Verfügbarkeit und Verteilung von Nährstoffen und Wasser beeinflussen³⁴. Dürre kann durch Überwachung des gesamten GNOVA-Systems und die gravimetrische Bestimmung des Bodenwassergehalts³⁵ ausgelöst werden. Wurzelexsudaten können destruktiv gesammelt werden, indem geerntete Pflanzen in ultrareinem Wasser³⁶ inkubiert werden oder durch Spülung des Systems zur Gewinnung nicht-steriler Laugwasser³⁷. Falls sterile Exsudate benötigt werden, können der Potis und die 3D-gedruckte Unterstützungsbasis von GNOVA modifiziert werden, um eine integrierte Exsudat-Sammelfunktion zu integrieren, ähnlich wie im Design von EcoFAB 3.0²⁴. Wissenschaftler, die Prioritätseffekte³⁸ auf die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft verstehen möchten, können zusätzliche Bewässerungsleitungen um den Topf installieren. Dies ermöglicht die anschließende Anwendung mikrobieller Impfstoffe bei gleichbleibender Sterilität der Hauptbewässerungsleitung. Die Umweltbedingungen könnten überwacht werden, indem desinfizierte drahtlose Temperatur- und Relativfeuchtigkeitssensoren in GNOVA platziert werden. Alternativ würde der Austausch des Glaszylinders durch eine Polycarbonatkammer und das Bohren von Probeprobenkanälen²⁴ die Messung der Umgebung und die Gasprobenentnahme ermöglichen. Dies könnte die Quantifizierung von Gasen und flüchtigen Verbindungen wie_CO2,_O2 und Ethylen ermöglichen, mit dem Potenzial, die Anlagenleistung³³ zu beeinflussen. Auch der Luftstrom zum System kann durch das Entfernen des Baumwollrings im Glaszylinder erhöht werden. Allerdings könnten diese Änderungen das Kontaminationsrisiko erhöhen und sind innerhalb der GNOVA noch nicht validiert oder optimiert.

Trotz der Vorteile und Vielseitigkeit von GNOVA sollten einige Einschränkungen berücksichtigt werden. Es sollte beachtet werden, dass dieses System am besten für den Einsatz in kontrollierten Wachstumskammern geeignet ist, da unkontrollierte Bedingungen im Gewächshaus oder auf dem Feld seine Leistung beeinflussen können. Obwohl Weizen 17 Wochen lang im System wachsen konnte, wurden etwa 12 Wochen nach Wachstum Anzeichen von Stress beobachtet. Daher sollte Weizen nicht länger als 12 Wochen angebaut werden. Außerdem wurde die Aufrechterhaltung der Sterilität nur durch vier wöchentliche Bewässerungsphasen über einen vierwöchigen Wachstumszeitraum bestätigt; Längere Experimente bergen ein erhöhtes Kontaminationsrisiko. Obwohl die GNOVA die Wurzelvolumenkapazität erhöht hat, ist Wurzelrestriktion weiterhin möglich, und eine zeitliche Bewertung der Wurzelmorphologie kann helfen, optimale Wachstumsdauern zu bestimmen, die die Wurzelbindung minimieren. Zusätzlich können einige Modifikationen am System, wie der Austausch des Glaszylinders durch einen Polycarbonatzylinder, die Einrichtungskosten auf über 100 USD pro Einheit erhöhen. Derzeit erlaubt die GNOVA nur die endpunktdestruktive Probenahme, was den Arbeits- und Replikationsbedarf für zeitliche Studien zu mikrobiellen Dynamiken, Exudationsmustern oder Sterilitätsüberwachung erhöht. Schließlich ist die Aufrechterhaltung der Sterilität während Aufbau, Bewässerung und Ernte zeitaufwendig, und selbst vereinfachte Systeme wie GNOVA erfordern einen gezielten Aufwand, was die Gesamtbetriebskosten erhöht. Insgesamt sollten diese Einschränkungen bei der Einführung dieses Systems berücksichtigt werden. Darüber hinaus müssen Umweltbeschränkungen durch gnotobiotisches Wachstum bei der Planung von Experimenten und der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden, da sie die Pflanzenphysiologie und damit das zugehörige Mikrobiom beeinflussen können.

GNOVA bietet eine vielseitige gnotobiotische Plattform, die mit Getreidekulturen kompatibel ist. Das System ermöglicht die Rückgewinnung nahezu intakter Wurzelsysteme, die für Wurzelarchitektur-Analysetools wie RhizoVision Explorer³⁹ und ARIA⁴⁰ geeignet sind, wodurch die Charakterisierung der Wurzelmorphologie als Reaktion auf verschiedene mikrobielle Inokulanten und Umweltbedingungen ermöglicht wird. In Kombination mit SynComs- und Multi-Omics-Analysen erleichtert GNOVA die Identifikation mechanistischer Verbindungen zwischen mikrobiellen Effektoren und Pflanzenreaktionen. Größere SynComs (>100 Mitglieder) in Kombination mit metagenomischer 41,42,43-Analyse können verwendet werden, um Ko-Vorkommensmuster zu untersuchen und Mikroben von ökologischer Relevanz unter verschiedenen Bedingungen zu identifizieren ^5,44. Im Gegensatz dazu ermöglichen kleinere SynComs (<50 Stämme) in Kombination mit metatranskriptomischer^45,46, metaproteomischer 19,47,48 und metabolomischer 49,50,51 eine detaillierte Charakterisierung der funktionellen Antwort bei Pflanzen und Mikroben⁴⁴. Zusammen positionieren diese Fähigkeiten GNOVA als wertvolles Werkzeug zur Identifizierung wichtiger mikrobieller Eigenschaften, die die Entwicklung neuer Bioinokulanten beschleunigen können, die die Nachhaltigkeit landwirtschaftlicher Systeme verbessern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Powerconnect Akku-Bohrmaschine & 100-teiliges Set	Black+Decker	BDC120VA100	1/4" und 1/8" Bohrerbits erforderlich.
Vinylband, gelb, 1" breit x 36 Yards	3M	471	Verbrauchsmaterial
Sterling Gummibänder Größe #32  (2 Gummibänder pro System)	Amazon	B001I1QO00	Verbrauchsmaterial.
Weizensamen			In diesem Experiment verwendete Sorte: Catawba
Glasfaser-Rohrisolationsband, 3" breit x 1/2" dick  (2 vorgeschnittene Kreise pro System)	Lowe's	28930	Schneiden Sie in 2 7/8" (7,3 cm) Durchmesserkreise. Verbrauchsmaterial. Für die Produktion großer Mengen an Kreisen rollen Sie das Isolationsband aus und verwenden Sie die offene Kante des Topfes, um den Kreis zu schneiden, indem Sie den Topf auf das Isolationsband legen und Druck und Drehung ausüben.
DW4-Filtermedium, vorgeschnitten auf 15" x 75 Yards  (1 geschnittener Kreis pro System)	Class Biological Clean, Ltd	NA	Schneiden Sie in 6,3" (16,02 cm) Durchmesserkreise. CBC hat andere vorgeschnittene oder Standardrollengrößen, die stattdessen gekauft werden können, falls gewünscht.  Verbrauchsmaterial. Schneiden Sie eine Vorlage des Kreises aus Karton und verwenden Sie sie, um Kreise über den Bereich des DW4-Mediums zu zeichnen und mit einer Schere zu schneiden.
Silikonschlauch, Versilon SPX-50 Hochfest, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" Wandstärke	Saint-Gobain	ABX00007	Schneiden Sie in zwei lange Stücke (16" // 40,64 cm) und drei kurze Stücke (2,5" // 6,35 cm)
Natriumhypochlorit 5% verfügbares Chlor in wässriger Lösung	VWR	JT9416-1	Auf 2% v/v verdünnen und für Maissterilisationsprotokoll verwenden
Murashige & Skoog-Medium, Mikro- und Makroelemente. 25 L	Research Products International	M10200-25.0	Auf 0,5x Stärke verdünnt
Ethanol, 100%, Deacon Labs	Fisher Scientific	04-355-451	Auf 95% v/v verdünnt
Spritze 3 mL, Luer-Lock unsteril  (2 pro System)	Fisher Scientific	14-817-117	Kolben wegwerfen und nur den Zylinder behalten, mit Glaswolle füllen und mit Folie verschließen.
Glasbecher, 250 mL	VWR	470191-150	Fünf werden für die Weizensamensterilisation benötigt
Maissamen			Genotyp, das in diesem Experiment verwendet wurde: Mexico 21–22 B73XMo17
Aluminiumbackblech 18" x 26"	Amazon	B01FIK54LQ	Stellen Sie sicher, dass es den Abmessungen Ihrer Durchflusshaube entspricht
Natriumchlorid	Fisher Scientific	BP358-1	0,145 M Lösung vorbereiten.
3D-gedruckte Basis, Polymilchsäure (PLA) Filament verwendet (1 pro System)	Protolabs	NA	Druck- und bearbeitbare Dateien finden Sie in den ergänzenden Materialien. Dateien sind unter Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc verfügbar. AUTOKLAVERY NICHT DURCHFÜHREN, wenn PLA als Filament zur Herstellung der Basis verwendet wurde. PLA schmilzt über 150 °C und kann sich über 60 °C verformen. Es wird empfohlen, die Integrität der 3D-gedruckten PLA-Basis zu testen, wenn sie bei Temperaturen über 40 °C verwendet werden soll. Für höhere Wärmebeständigkeit können stattdessen Materialien wie PETG (Polyethylenterephthalatglykol) oder PC (Polycarbonat) verwendet werden; dies erhöht die Kosten des Teils und ist möglicherweise immer noch nicht autoklavierbar. Das 3D-Drucken der Basisprototypen wurde in einem persönlichen Drucker mit Bauräumen von 256 × 256 × 256 mm (Länge × Breite × Höhe) durchgeführt. Aus Gründen der Geschwindigkeit und Kosteneffizienz empfehlen wir den Druck in großen Mengen bei lokalen kommerziellen 3D-Druckdienstleistern.
Männliche Luer zu Schlauchbarb-Verbindung 1/8" ID, tierische Derivat-frei Polypropylen  (2 pro System)	Cole-Parmer	EW-50114-69	Im Protokoll als Fitting 1 bezeichnet
Männliche Slip Luer zu Schlauchbarb-Verbindung 1/8" ID, tierisches Derivat-freies Polypropylen  (1 pro System)	Cole-Parmer	EW-50114-63	Im Protokoll als Fitting 2 bezeichnet
201 Edelstahl-Schneckengetriebe-Schlauchklemmen, 1 1/2" -3 1/2" Klemmdurchmesser (1 pro System)	Grainger	5CZF2	Im Protokoll als Schlauchklemmen bezeichnet
Airstream Gen 3 Laminar Flow Cabinet mit einfachem Schalter, Abmessungen 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 "	ESCO Lifesciences	2120707	Im Protokoll als laminarer Durchflusshauben bezeichnet. Jede laminare Durchflusshaube mit ähnlichen Abmessungen funktioniert. Bei kleineren Durchflusshauben können möglicherweise Modifikationen erforderlich sein.
Spielsand, Quikrete Premium. 50 lb	The Home Depot	1001709466	Im Protokoll als Sand bezeichnet
304 Edelstahlgewebtes Drahtgeflecht, 120 Maschen (1 pro System)	Amazon	B09KRS5F7T	Im Artikel als Edelstahldrahtgeflecht bezeichnet. Schneiden Sie in 4,7" (11,9 cm) Durchmesserkreise. Für hohe Durchsatzleistung oder Kreisproduktion schneiden Sie eine Vorlage des Kreises aus Karton und verwenden Sie sie, um Kreise über den Bereich des gewebten Drahtgeflechts zu zeichnen und mit einer Schere zu schneiden.
Ton (Montmorillonit), OIL-DRI Loose Sorbent, 50 lb Gewicht, nicht duftend	Grainger	44Z111	Im Protokoll als Ton bezeichnet. Verbrauchsmaterial.
Klare Hurrikankerzenschattenuhren ohne Boden 4" OD x 30" Länge (1 pro System)	WCG International	HST0430	Im Protokoll als Glaszylinder bezeichnet
Klare Kunststoffkappe, 3" (7,6 cm) Durchmesser  (1 pro System)	ClearTec Packaging	PCC3.000	Im Protokoll als Kunststoffkappe bezeichnet
Klares Polycarbonat-Rohr, 3" OD x 2 7/8" ID x 1/16' Wandstärke x 12" Länge