Kombination von Kollagenase-Injektionen mit körperlich ausgelöster mechanischer Überlastung: Ein Mausmodell, das Überlastung simuliert, Belastungsverletzung, Kniearthrose

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Einrichtung eines Mausmodells der stressbedingten Kniearthrose durch die Kombination intraartikulärer Kollagenase-Injektionen mit durch Belastung induzierter Überanstrengung und bietet so eine minimalinvasive Plattform zur Untersuchung degenerativer Pathogenese.

Zusammenfassung

Kniearthrose (KOA) ist eine multifaktorielle degenerative Gelenkerkrankung, die durch das komplexe Zusammenspiel von biologischem Gewebeabbau und anhaltender mechanischer Überlastung ausgelöst wird. konventionelle chirurgische Tiermodelle führen häufig zu einer posttraumatischen Zerstörung des posttraumatischen Gelenks, die die allmähliche und kumulative Pathogenese des menschlichen degenerativen KOA nicht genau replizieren kann. Um diese translationale Lücke zu überbrücken, etabliert die vorliegende Studie ein neuartiges und reproduzierbares Mausmodell, das überlastbedingte stressinduzierte KOA simuliert, indem es den Abbau des milden enzymatischen Knorpels mit anhaltender mechanischer Belastung synergiert. Konkret wurden standardisierte intraartikuläre Injektionen von Typ-II-Kollagenase über einen Zeitraum von vier Wochen mit täglicher mechanischer Überanstrengung über ein streng kalibriertes Rotatoren-Ermüdungsapparat kombiniert. Die Wirksamkeit dieser Dual-Faktor-Intervention wurde durch umfassende verhaltensbezogene, histologische und molekulare Analysen validiert. Die automatisierte Ganganalyse zeigte schwere Lokomotoritätsdefizite in der kombinierten Gruppe. Diese zeichneten sich durch deutliche Verkürzungen der Schrittlänge, der Schrittbreite und der Pfotenfläche der Spitzenhaltung aus. Histomorphologische Untersuchungen mit Safran-O-Fast-Grünfärbung bestätigten diese funktionellen Defizite, zeigten fortschreitende Knorpelstrukturschäden, Oberflächendefekte und signifikant erhöhte Osteoarthritis Research Society International (OARSI)-Werte, die die pathologischen Merkmale des frühen bis mittleren Stadiums menschlicher KOA treu widerspiegeln. Darüber hinaus zeigten immunhistochemische Untersuchungen eine deutliche Hochregulation des mechanosensitiven Kanals Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) und gleichzeitige Reduktion des entscheidenden Matrixproteins Kollagen Typ II Alpha 1 (COL2A1) in Gelenkchondrozyten. Durch die Integration lokaler Gelenkinstabilität mit kontrolliertem mechanischem Stress vermeidet diese minimalinvasive Strategie das akute Trauma, das mit chirurgischen Modellen verbunden ist. Dieses Protokoll etabliert eine klinisch relevante experimentelle Plattform zur Verfolgung dynamischer molekularer Mechanismen, zur Bewertung chronischer Schmerzphänotypen und zur Erprobung langfristiger therapeutischer Interventionen bei Arthrose im Frühstadium.

Einleitung

Arthrose (OA) ist eine multifaktorielle degenerative Erkrankung, die durch Schmerzen, Schwellungen, Steifheit und eingeschränkte Funktion gekennzeichnet ist und durch Faktoren wie Fettleibigkeit, mechanische Überlastung und Trauma¹ verursacht wird. Kniearthrose (KOA) ist sehr verbreitet und mit dem Alter immer häufiger, jedoch sind klinische Studien aufgrund unterschiedlicher klinischer Erscheinungsformen oft begrenzt. Daher erfordert die Entwicklung wirksamer Behandlungen geeignete Tiermodelle². Angesichts der intrinsischen Heterogenität von OA existiert kein allgemein akzeptiertes "Goldstandard"-Modell, das von Forschern verlangt, spezifische Modelle zu identifizieren, die mit ihrer wissenschaftlichen Forschung übereinstimmen.

KOA wird in der modernen Medizin derzeit als eine Erkrankung charakterisiert, die das Zusammenspiel mechanischer und biologischer Faktoren im Gelenkknorpel und im perichondralen Gewebe umfasst. Die Folge dieses komplexen Zusammenspiels ist vor allem der fortschreitende Verfall des Gelenkknorpels und seiner umgebenden Matrix³. Mechanischer Stress dient als entscheidendes Transduktionssignal, das verschiedene physiologische und pathologische Prozesse in Gelenkzellen und Geweben^{steuert 4}. Die Erhaltung des Gelenkknorpels in einem gesunden Zustand erforderte eine angemessene mechanische Belastung im physiologischen Bereich. Umgekehrt führt eine übermäßige Überlastung oft zur Degeneration des Knorpels und zum anschließenden Beginn von KOA⁵. Spontane Modelle werden durch erhebliche Zeit- und Wirtschaftsinvestitionen^{behindert 6}, während chirurgisch induzierte Modelle einen destruktiven Ansatz verwenden, der hauptsächlich mittlere bis späte KOA repräsentiert und von der natürlichen degenerativen Progression^{abweicht 7,8}. Umgekehrt zielen chemisch induzierte Modelle auf die Kollagenmatrix ab, können jedoch die umfassenden Veränderungen der degenerativen Arthrose des Menschen erfassen, wenn sie ohne mechanische Belastung⁹ verwendet werden. Die Kombination enzymatischer Abbau mit mechanischer Überanstrengung schließt diese Lücken, indem die allmähliche Pathogenese der Überlastungsbelastung getreuer nachgebildet wird. Ziel dieser Studie ist es, ein neuartiges Mausmodell von KOA zu etablieren und zu validieren, indem intraartikuläre Typ-II-Kollagenase-Injektionen mit Überanstrengung unter Verwendung eines rotierenden Radermüdungsapparats kombiniert werden.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den vom Animal Care and Use Committee der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine genehmigten Protokollen durchgeführt. Die Experimente wurden unter einer Projektlizenz (NR.: PZSHUTCM201016022) durchgeführt, die vom Experimental Animal Center der Shanghai University Of Traditional Chinese Medicine Ethics erteilt wurde, gemäß dem National Research Council (US) Committee for the Update of Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Protokoll zur Herstellung von Tiermodellen

1. Zufällig werden 32 10 Wochen alte C57BL/6 Mäuse zufällig in vier Gruppen verteilt: Kontrolle, Kollagenase, übermäßige Betätigung und Kollagenase + übermäßige Bewegung.
   1. Gewöhnen Sie alle Mäuse eine Woche lang unter den üblichen Fütterungs- und Unterbringungsbedingungen, bevor Sie mit den Modellierungsverfahren beginnen.
2. Die Tiermodelle werden über einen Zeitraum von 4 Wochen gemäß den zugewiesenen Versuchsgruppen induziert.
   1. Verabreichen Sie Typ-II-Kollagenase mittels intraartikulärer Injektion an die Mäuse der Kollagenase-Gruppe.
   2. Lassen Sie die Mäuse in der Trainingsgruppe mit einem Drehradgerät trainieren.
   3. Wenden Sie sowohl die intraartikuläre Kollagenase-Injektion als auch das rotierende Rad-Übungstraining auf die Mäuse in der Gruppe Kollagenase + übermäßiges Training an.
   4. Halten Sie in allen relevanten Trainingsgruppen die exakt gleiche Trainingsfrequenz und -dauer bei.

2. Typ-II-Kollagenase-Intraartikulationsprotokoll

1. Anästhesie
   1. Anästhesie wird mit Isofluran eingeleitet, das über eine kalibrierte Gasanästhesiemaschine verabreicht wird. Führen Sie eine schnelle Induktion bei einer Konzentration von 2–3 % Isofluran durch.
   2. Die Anästhesie sollte bei 1,5–2 % Isofluran bleiben. Stellen Sie den ordnungsgemäßen Betrieb des Anästhetikum-Säuberungssystems sicher, um berufliche Exposition zu vermeiden.
   3. Überwachen Sie während des gesamten Eingriffs kontinuierlich die Atemfrequenz und Reflexe der Maus.
2. Hautvorbereitung
   1. Tragen Sie Haarentfernungscreme auf den Bereich rund um das linke Kniegelenk auf. Entfernen Sie die Haare komplett mit einem Schaber.
   2. Reinigen Sie die freiliegende Haut gründlich. Halten Sie während der gesamten Vorbereitung aseptische Bedingungen aufrecht.
3. Typ-II-Kollagenase-Präparation
   1. Gleiche das Typ-II-Kollagenasepulver 30 Minuten lang in einem sterilen Biosicherheitsschrank auf Raumtemperatur aus. Verwenden Sie steriles, phosphatgepuffertes Kochsalzlösungsmittel (PBS, pH 7,2–7,4) als exklusives Lösungsmittel und Puffer für den Lösungsprozess.
   2. Wiegen Sie die erforderliche Masse des Kollagenasepulvers präzise mit einer analytischen Waage. Fügen Sie das sterile PBS langsam dem Pulver hinzu, um eine endgültige Arbeitskonzentration von 0,04 U/μL zu erreichen.
   3. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, indem Sie die Mischung auf und ab pipetten, bis sie klar und frei von sichtbaren Partikeln ist. Vermeiden Sie während dieses Schrittes heftiges Vortexen, um den Verlust der enzymatischen Aktivität zu verhindern.
   4. Zentrifugieren Sie die hergestellte 0,04 U/μL-Lösung bei 1.000 U/min für 5 Minuten bei 4 °C. Dies entfernt ungelöste Mikropartikel und verhindert eine Nadelverstopfung während der nachfolgenden Injektion.
   5. Saugen Sie das Supernatant in sterile Schläuche ein und lagern Sie es in einem 4 °C-Eisbad für sofortige Gebrauch. Bereiten Sie die Lösung für jede Sitzung frisch vor, um maximale enzymatische Aktivität zu gewährleisten.
4. Intraartikuläre Injektion
   1. Greifen Sie die Rückenhaut der Maus mit Daumen und Zeigefinger der nicht-dominanten Hand. Sichern Sie beide unteren Gliedmaßen mit Ring- und kleinen Fingern, um die Kniegelenke natürlich zu strecken und den Injektionsbereich vollständig freizulegen.
   2. Halten Sie eine 10-μL-Mikrospritze, die mit einer 30-G-Nadel ausgestattet ist. Führen Sie die Nadel parallel zur Hautoberfläche in die oberflächliche Hautschicht für etwa 0,2 cm am Eintrittspunkt ein.
   3. Stellen Sie die Nadelrichtung langsam in eine senkrechte Richtung zur Haut an, wenn der Gewebewiderstand abnimmt.
   4. Die Nadel wird etwa 0,3–0,5 cm weiter vorgeschoben, bis ein Widerstandsverlust auf das Eindringen in die Gelenkhöhle hinweist. Ziehen Sie den Spritzenstempel langsam heraus, um das Fehlen von Blutreflux zu bestätigen.
   5. Injizieren Sie 5 μL der Typ-II-Kollagenase-Lösung (Konzentration: 0,04 U/μL) mit konstanter^{Geschwindigkeit 10} in die Gelenkhöhle.
   6. Halten Sie die Nadelposition unmittelbar nach der Injektion bei. Drücken Sie vorsichtig die Haut um die Injektionsstelle 10–15 Sekunden lang.
   7. Zieh die Nadel langsam ab. Drücken Sie den Eintrittspunkt leicht mit einer sterilen Mullbinde 30 Sekunden lang, um ein Medikamentenauslaufen zu verhindern.
   8. Setzen Sie die Maus in einen warmen und trockenen Käfig zu Hause. Lassen Sie das Tier sich auf natürliche Weise von der Anästhesie erholen, was typischerweise 5–10 Minuten dauert.
   9. Setzen Sie nach vollständiger Genesung der Maus wieder auf die üblichen Unterbringungs- und Futterbedingungen.
   10. Führen Sie diese intraartikulären Injektionen zweimal pro Woche mit einem Abstand von 3–4 Tagen zwischen den Injektionen durch, ausschließlich während der 4-wöchigen Modellierungsphase (nach der anfänglichen einwöchigen Akklimatisierung).
   11. Entsorgen Sie alle scharfen Gegenstände sofort in zugelassenen Biohazard-Behältern.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass geschultes Personal alle Injektionen durchführt, um Gelenkverletzungen und experimentelle Variabilität zu minimieren.

3. Rotierendes Rad-induziertes Überanstrengungsprotokoll

1. Ausrüstungsvorbereitung und Sicherheitsprüfung
   1. Stellen Sie die Rotations-Ermüdungsvorrichtung auf 12 U/min (entspricht etwa 0,063 m/s) und die Dauer auf 2 Stunden pro Sitzung ein.
   2. Schalte das elektrische Stimulationsmodul ein. Bestätigen Sie, dass der Stromausgang im voreingestellten sicheren Bereich von 0,1–0,3 mA liegt. Erhöhen Sie die Stromintensität nicht manuell.
      VORSICHT: Verwenden Sie das elektrische Stimulationsmodul ausschließlich, um die Mäuse zurück zum Rad zu führen, nicht als Strafreiz. Überprüfen Sie die Verkabelung des Geräts auf Schäden und stellen Sie sicher, dass die Elektroden vor dem Betrieb gut kontaktiert werden, um Kurzschlüsse und elektrische Schlagverletzungen zu vermeiden.
2. Akklimatisierungstraining
   1. Stellen Sie sicher, dass die rotierenden Radkammern des Ermüdungsgeräts sauber, trocken und frei von Schmutz sind. Deaktiviere die Elektroden der elektrischen Stimulation am Radeingang, um möglichen stimulationsbedingten Stress zu eliminieren.
   2. Behandle jede Maus vorsichtig an der Schwanzbasis oder schöpfe sie mit sterilem Weichgewebe ab. Stellen Sie Mäuse einzeln in den zentralen Bereich der Lauffläche des rotierenden Rads.
   3. Positioniere die Maus in einer natürlichen vierbeinigen Standposition auf der waagerechten Lauffläche. Orientiere den Körper parallel zur zentralen Rotationsachse des Rades, mit den Vorderpfoten nach vorne und den Hinterpfoten leicht nach hinten.
   4. Verwenden Sie eine temporäre, nicht einschränkende weiche Barriere, um zu verhindern, dass die Maus in den ersten 2 Minuten in die schmale Elektrodenzone eindringt. Entfernen Sie die Barriere nach dieser Zeit, damit die Maus die gesamte Kammer frei erkunden kann.
   5. Lassen Sie die Mäuse in den ersten 3 Tagen täglich 10 Minuten im stationären Gerät. Starten Sie während dieser Zeit keine Drehung des Rad und starten Sie keine elektrische Stimulation.
   6. Überwachen Sie die Maus auf Anzeichen starker Belastung wie anhaltendes Einfrieren oder übermäßiges Aufahen. Positioniere die Maus vorsichtig in den mittleren Radbereich, wenn sie ein ungewöhnliches Verhalten zeigt, um eine natürliche Haltung wiederherzustellen.
   7. Starte das Rad am vierten Tag mit einer Geschwindigkeit von 5 U/min für eine Dauer von 30 Minuten. Dieser Schritt gewöhnt die Mäuse an den Bewegungsrhythmus des Geräts ohne den Einsatz elektrischer Hinweise.
   8. Führen Sie die Mäuse manuell zurück zur Mitte des Rades, falls sie während der rhythmischen Anpassungsphase fallen oder anhalten. Stellen Sie sicher, dass die elektrische Stimulation während der gesamten 4-tägigen Akklimatisierungsphase deaktiviert bleibt.
      VORSICHT: Vermeiden Sie die Anwendung elektrischer Stimulation während der Akklimatisierungsphase, um angstbedingte Stressreaktionen zu vermeiden und zukünftige Trainingsbefolgung sicherzustellen.
3. Formale Übungsausführung
   1. Führen Sie die formale Schulung zu einer festen Zeit jeden Tag durch (z. B. 9:00–11:00 Uhr). Tragen Sie isolierte Handschuhe, um die Mäuse in das rotatorenartige Ermüdungsapparat zu legen.
   2. Schließen Sie die Tür des Geräts. Starten Sie die voreingestellten Parameter von 12 U/min (~0,063 m/s) für eine maximale Dauer von 2 Stunden pro Sitzung (siehe Abbildung 1).
      VORSICHT: Überwachen Sie die Mäuse während des Trainings kontinuierlich. Pausieren Sie das Training für 5 Minuten, wenn eine Maus kontinuierlich fällt (mehr als 3 Mal innerhalb einer Minute), um schwere Erschöpfung und stressbedingte Verletzungen zu vermeiden.
4. Bestimmung und Stimulation des Ermüdungsendpunkts
   1. Überwachen Sie die Mäuse kontinuierlich, um ihren Müdigkeitszustand zu bewerten. Beende die Trainingseinheit frühzeitig, ohne die volle 2-Stunden-Dauer zu erzwingen, wenn eine Maus mindestens zwei der vier spezifischen Ermüdungskriterien erfüllt, um Überstress zu vermeiden.
   2. Definiere Kriterium 1 als die Unfähigkeit, länger als 5 Sekunden auf dem Laufrad zu bleiben, bevor man fällt. Definieren Sie Kriterium 2 als eine signifikant erhöhte Fallfrequenz von 3 oder mehr Zeiten innerhalb eines Zeitraums von 1 Minute.
   3. Definiere Kriterium 3 als das Fehlen einer freiwilligen Absicht, zum Rad zurückzukehren, bei dem die Maus trotz elektrischer Stimulation unbeweglich bleibt oder sich nur kurz bewegt.
   4. Definiere Kriterium 4 als das Auftreten abnormer Lokomotorik. Achten Sie auf offensichtliche Anzeichen wie schleifende Gliedmaßen oder einen schwankenden Gang.
   5. Lassen Sie das Gerät automatisch eine leichte elektrische Stimulation auslösen, wenn eine Maus zum Spinnereingang fällt. Stellen Sie sicher, dass die elektrische Stimulation sofort aufhört, sobald die Maus zum Rad¹¹ zurückkehrt.
      VORSICHT: Beenden Sie das Training sofort, wenn die Maus abnormale Beschwerden wie Krampfanfälle oder Atemnot zeigt. Entfernen Sie die Maus aus dem Gerät und bieten Sie bei Bedarf eine symptomatische Behandlung durch.
5. Post-Training Verarbeitung und Häufigkeit
   1. Schalten Sie nach dem Training die Stromversorgung des Geräts ab. Trage isolierte Handschuhe, um die Mäuse zu entfernen und sie in ihre Häuschge zurückzubringen.
   2. Stellen Sie den Mäusen ausreichend Trinkwasser zur Verfügung. Beobachten Sie die Tiere auf abnormale Aktivitäten, geistigen Zustände oder Gliedmaßenprobleme (z. B. Klaudikatation oder Muskelzittern).
   3. Erfassen Sie alle Auffälligkeiten und sorgen Sie für rechtzeitige Behandlung.
   4. Halten Sie diese Trainingsfrequenz von einmal täglich, 2 Stunden pro Einheit, über 4 aufeinanderfolgende Wochen hinweg. Halten Sie die Trainingsparameter und die Sicherheitsüberwachung während des gesamten Zeitraums konsistent.
      HINWEIS: Überprüfen Sie vor jeder täglichen Trainingseinheit, ob das Ermüdungsgerät und das elektrische Stimulationsmodul ordnungsgemäß funktionieren, um eine konstante Stimulationsintensität zu gewährleisten.

4. Ganganalyse

1. Systemübersicht
   1. Führen Sie die Gangartaufnahme und -analyse mit einem automatisierten Gangbildgebungssystem durch.
   2. Führen Sie alle Gangverfahren an 32 10 Wochen alten C57BL/6-Mäusen nach der 4-wöchigen Modellierungsphase durch.
   3. Positionieren Sie die Hochgeschwindigkeitskamera unter dem transparenten Laufbandgürtel, um während der Fortbewegung ventrale Bilder aufzunehmen.
2. Akklimatisierung und Aufbau
   1. Gewöhnen Sie alle Mäuse vor der formellen Datenerhebung an das Laufband, um Stress zu minimieren.
   2. Stellen Sie die Laufbandgeschwindigkeit auf 20 cm/s ein, um dem physiologischen Gehtempo der Mäuse gerecht zu werden.
   3. Protokolliere drei unabhängige, gültige Studien pro Maus mit einem 2-minütigen Ruheintervall zwischen den Studien.
3. Trial-Aufnahme und Stride-Auswahl
   1. Erlauben Sie der Maus, während jeder Prüfung für eine 60-sekündige Aufnahmephase kontinuierlich zu laufen.
   2. Führen Sie einen Ersatztest durch, wenn eine Aufnahme aufgrund von "Einfrieren", Springen oder Drehen ungültig ist.
   3. Beginnen Sie erst mit der Datenerhebung, nachdem die Maus eine stabile, konstante Fortbewegung für mindestens 10 Sekunden erreicht hat.
   4. Wählen Sie aus jedem 60-sekündigen Versuch mindestens 4 aufeinanderfolgende vollständige Schritte zur Analyse aus.
   5. Stellen Sie sicher, dass zwei unabhängige, geblendete Beobachter die Schrittauswahl durchführen, um subjektive Voreingenommenheit zu eliminieren.
   6. Stelle sicher, dass die Maus eine natürliche vierbeinige Haltung einnimmt, ohne zu überspringen oder plötzliche Geschwindigkeitsschwankungen zu haben.
   7. Überprüfen Sie, ob der Schritt sowohl eine Phase der Laststellung als auch eine Vorwärtsbewegungsphase enthält.
   8. Achten Sie auf klare Bilder vom Pfotengürtelkontakt, ohne Verlust, Unschärfe oder Kontamination zu verfolgen.
4. Bildverarbeitung und Parameterextraktion
   1. Nutzen Sie die integrierten Algorithmen der Systemsoftware, um aufgenommene Bilder zu digitalisieren und Kontaktpunkte zwischen Pfotenriemen zu erkennen.
   2. Berechnen Sie das Schwung/Stand-Verhältnis als Verhältnis von Dauer der Schwungphase zur Dauer der Standphase.
   3. Messen Sie die Schrittlänge (cm) als die lineare Distanz, die während eines einzelnen vollen Schrittes zurückgelegt wird.
   4. Messen Sie die Schrittbreite (cm) als horizontalen Abstand zwischen den mittleren Rändern der kontralateralen Hinterpfoten in der Spitzenstellung.
   5. Bestimmen Sie die Pfotenfläche in der Spitzenstellung (cm²), die die gesamte Kontaktfläche bei maximaler Gewichtstrage darstellt.
   6. Berechnen Sie die Pfotenflächenvariabilität (cm²) als den Variationskoeffizienten der Kontaktfläche über aufeinanderfolgende Schritte.
   7. Berechnen Sie den Durchschnittswert der 3 gültigen Versuche für jede einzelne Maus und exportieren Sie die finalen Datensätze.
      HINWEIS: Studien mit unregelmäßigem Stopp-, Sprung- oder Drehverhalten werden aus der Analyse ausgeschlossen.

5. Histologie

1. Gewebesammlung und -fixierung
   1. Eliminieren Sie alle Mäuse human durch eine zervikale Verrenkung nach der 4-wöchigen Einleitungsphase. Sezieren Sie das linke Kniegelenk sorgfältig und entfernen Sie das umliegende überschüssige Weichgewebe.
   2. Tauchen Sie das Exemplar sofort in vorgekühltes 4%-Paraformaldehyd-(PFA)-Fixativ (w/v) ein. Stellen Sie sicher, dass das Fixationsvolumen 10–15 mal so groß ist wie das Probenvolumen, um das Gewebe vollständig zu versenken.
   3. Fixiere das Gewebe bei Raumtemperatur für 48 Stunden. Bewegen Sie den Fixationsbehälter alle 8 Stunden sanft, um eine ausreichende Fixationsdurchdringung zu gewährleisten.
2. Gewebeentkalkung
   1. Spülen Sie das fixierte Exemplar 10 Minuten lang mit langsam fließendem Wasser. Wiederholen Sie diesen Spülvorgang dreimal, um das restliche PFA zu entfernen.
   2. Übertragen Sie die Probe in eine 0,5 mol/L Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Entkalkungslösung (pH 7,2–7,4). Halten Sie das Entkalkungslösungsvolumen bei 20-fachem Probenvolumen und lagern Sie es bei 4 °C.
   3. Entkalken Sie das Gewebe für 14–21 Tage. Ersetze die alte Flüssigkeit alle 3 Tage durch eine frische EDTA-Entkalkungslösung.
   4. Testen Sie den Entkalkungsendepunkt, indem Sie das subchondrale Knochen vorsichtig mit einer sterilen Nadel durchbohren. Beenden Sie den Entkalkungsprozess, wenn die Nadel reibungslos und widerstandsfrei eindringt.
   5. Waschen Sie die vollständig entkalkte Probe 2 Stunden lang unter fließendem Wasser, um die restlichen EDTA zu entfernen. Waschen Sie die Probe anschließend dreimal für jeweils 5 Minuten mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
3. Einbettung und Sektionierung
   1. Dehydrieren Sie das entkalkte Exemplar sequentiell mit einer graduierten Ethanolserie (70 %, 80 % und 90 % für jeweils 2 Stunden; 95 % für 1 Stunden; absolutes Ethanol zweimal für jeweils 1 Stunde).
   2. Reinigen Sie das dehydrierte Gewebe zweimal für jeweils 10 Minuten mit Xylol. Eingebetten Sie das freigesprochene Gewebe in Paraffin.
   3. Schneiden Sie das mit Paraffin eingebettete Gewebe mit einem Mikrotom in 5 μm dicke, sagittale durchgehende Schnitte. Montieren Sie die Abschnitte auf poly-L-lysin-beschichtete Glasscheiben und backen Sie sie 2 Stunden lang in einer Trocknungsplatte bei 60 °C.
4. Histomorphologische Bewertung
   1. Färben Sie die Schnitte mit Saranin O-fast grün, um die Histomorphologie des Gelenkknorpels zu bewerten.
   2. Bewertung der Knorpeldegeneration mit dem Bewertungssystem der Osteoarthritis Research Society International (OARSI) unter doppelblinden Bedingungen¹².
5. Immunhistochemie (IHC) Kern-Arbeitsablauf
   1. Deparaffinisieren Sie die Abschnitte in Xylol zweimal für jeweils 10 Minuten. Rehydrieren Sie die Abschnitte sequentiell durch eine graduierte Ethanolserie zu deionisiertem Wasser.
   2. Tauchen Sie die Schnitte in einen 0,01 mol/L Citratpuffer (pH 6,0) zur mikrowelleninduzierten Wärme-Epitop-Rückgewinnung. Erhitze den Puffer auf hoher Leistung bis zum Kochen und lasse dann 15 Minuten sanft bei mittlerer Leistung köcheln.
   3. Kühlen Sie die Stücke natürlich auf Zimmertemperatur ab. Waschen Sie die Folien dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten
   4. Inkubieren Sie die Schnitte in einer 3%igen Wasserstoffperoxid-(H2O2)-Methanollösung für 20 Minuten bei Raumtemperatur, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Wasche die Folien dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten.
   5. Tragen Sie eine 5%ige Ziegenserum-Blocklösung auf die Abschnitte auf. Inkubieren Sie 60 Minuten bei Zimmertemperatur, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.
   6. Entsorge die Blocklösung ohne Waschen. Anwendung der spezifischen primären Antikörper-Arbeitslösung (Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) bei 1:100, Caspase-3 bei 1:200 oder Kollagen Typ II Alpha 1 (COL2A1) bei 1:150 Verdünnung).
   7. Inkubieren Sie die Schnitte mit dem primären Antikörper über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 4 °C für 12–16 Stunden.
   8. Am nächsten Tag auf 30 Minuten Raumtemperatur ausgleichen, dann dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten waschen. Wenden Sie einen Meerrettichperoxidase-(HRP)-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper auf (1:500-Verdünnung).
   9. Inkubieren Sie die Abschnitte mit dem sekundären Antikörper 60 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wasche die Folien dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten.
   10. Trage eine 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Chromogenlösung auf und inkubiere 3–5 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Stoppen Sie die Reaktion sofort mit deionisiertem Wasser, wenn unter mikroskopischer Beobachtung ein klares braunes Signal erscheint.
   11. Gegenfärbe die Schnitte 5 Minuten lang mit einer Hämatoxylinlösung. Spüle sie 10 Minuten unter fließendem Wasser, damit der Fleck blau wird.
   12. Unterscheide die Abschnitte mit einer 1%igen Säurealkohollösung für 30 Sekunden. Spüle die Folien 5 Minuten unter fließendem Wasser.
   13. Dehydrieren Sie die Schnitte schnell durch eine graduierte Ethanolserie und reinigen Sie das Gewebe zweimal mit Xylol für jeweils 10 Minuten.
   14. Montiere die Objektträger mit neutralem Balsam und bedecke sie mit optischen Harz-Deckblättern. Lassen Sie die montierten Objektträger bei Zimmertemperatur trocknen.
6. IHC-Steuerung und Bildanalyse
   1. Stellen Sie eine negative Kontrolle her, indem Sie während des Färbungsverfahrens den primären Antikörper durch PBS ersetzen. Fügen Sie einen bekannten positiven Knorpelgewebeschnitt als positive Kontrolle ein, um die Wirksamkeit von Antikörpern zu überprüfen.
   2. Nehmen Sie die Färbungsbilder mit einem ganzen Dia-Scanner mit 40× und 100× Vergrößerung auf.
      HINWEIS: Führen Sie alle histologischen Bewertungen unabhängig voneinander durch mindestens zwei blinde Beobachter durch, um subjektive Verzerrungen zu verringern.

6. Statistische Analyse

1. Datenverarbeitung und Gesamttests
   1. Führen Sie alle Datenerhebungen und -analysen unter blinden Bedingungen durch, um experimentelle Verzerrungen zu minimieren.
   2. Analysieren Sie die kontinuierlichen Variablen der vier experimentellen Gruppen mithilfe einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), um die Gesamtunterschiede zu testen.
   3. Wenden Sie den Kruskal-Wallis-H-Test auf alle Variablen an, die die notwendigen parametrischen Annahmen nicht erfüllen.
2. Post-hoc-Tests und Signifikanzschwellen
   1. Führen Sie nachträgliche paarweise Vergleiche mit dem Tukey-Test durch, um spezifische Gruppenunterschiede zu identifizieren, wenn die anfängliche ANOVA die statistische Signifikans anzeigt.
   2. Verlassen Sie sich ausschließlich auf den Tukey-Test, um die familienspezifische Fehlerquote zu kontrollieren. Kombinieren Sie dies nicht mit zusätzlichen Multiple-Comparison Correction-Methoden.
   3. Definiere statistische Signifikanz einheitlich als p < 0,05

Ergebnisse

Ganganalyse
Gangzyklus-Parameter: Das Schwung/Stand-Verhältnis – definiert als das Verhältnis der Dauer der nicht belastenden Schwungphase zur Phase der tragenden Haltung eines einzelnen Schrittes – wurde so bewertet, dass sie das Gleichgewicht zwischen Gewichtstrag und Antrieb widerspiegeln. Im Vergleich zur Kontrollgruppe (2,10 ± 0,06) zeigten Mäuse, die eine intraartikuläre Collagenase-Injektion erhielten (1,45 ± 0,05) oder übermäßige Bewegung unterzogen (1,68 ± 0,...

Diskussion

In dieser Studie entwickelten wir ein neuartiges Mausmodell von KOA, das die Auswirkungen übermäßiger Belastung auf das Gelenk nachahmt, indem intraartikuläre Injektion von Kollagenase mit radbasiertem, ermüdungsförderndem Trainingstraining kombiniert wird. Diese Ergebnisse bestätigen erneut die Vorstellung, dass KOA aus dem Zusammenspiel biologischer und mechanischer Faktoren entsteht. Das Verständnis und die Identifikation dieser Faktoren bieten Potenzial für die Entwicklung individuel...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
4% Paraformaldehydfixativ	Beyotime	P0099
Essigsäure	Sinopharm	631-61-8
DigiGait-Bildgebungssystem für Mäuse	RWD Life Science	MSI-DIG-MS
EDTA-Lösung	Procell	PB180320
Einbettung von Kassette	Leica	IP C
Ethanol	Sinopharm	64-17-5
Schnellgrüne Beize	Leyan	1085995
Haarentfernungscreme	Veet	G20161330
Hämatoxylin	Adamas	61753A
Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge	Hermle	Z366K
Inkubator	TAITEC	M-210FN
Inhalationsanästhesiemaschine	Waldläufer	RZ-Viking
Isoflurane	Webio	W100
Mikrotome	Ted Pella	10180-220
Mausrotatoren-Ermüdungsapparat	Beijing Zhishu Duobao Biologische Technologie	YLS-10B
Neutraler Balsam	Sinopharm	96949-21-2
Safranin O stain	Bioss	S0062
Halbautomatisches Gewebeeinbettungszentrum	Thermo Fisher	HistoStar
Schieber-Trocknungs-Heizplatte	Elektronenmikroskopiewissenschaften	XH-2002
Gewebe-Flotation-Wasserbad	BIOBASE	BT-I
Typ-II-Kollagenase	Sigma-Aldrich	C4-22-1G
Ganzer Dia-Scanner	Leica	Aperio VERSA
Xylen	Sinopharm	1330-20-7