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Einzelfaser-Isolationstest zur Beurteilung des oxidativen Myofaserverhaltens

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DOI:

10.3791/70637

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31. März 2026

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1Department of Health Promotion Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Juntendo University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung intakter einzelner Muskelfasern aus dem oxidativen Soleus und die Einrichtung hochgereinigter Myoblastkulturen, die aus diesen Fasern gewonnen wurden. Das optimierte Verfahren liefert zuverlässig etwa 300–500 intakte Myofasern pro Maus, was nachgelagerte molekulare und zelluläre Analysen ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Skelettmuskulatur besteht aus mehrnukleigen Myofasern, deren Integrität und Funktion für Bewegung und allgemeine Gesundheit unerlässlich sind. Bei neuromuskulären Erkrankungen können Muskelgruppen unterschiedlich über Krankheitstypen und Stadien hinweg betroffen sein, weshalb es wichtig ist, lebensfähige Einzelfasern aus repräsentativen Muskeln für mechanistische Studien zu isolieren. Ziel dieses Protokolls ist es, eine zuverlässige Methode bereitzustellen, um eine hohe Ausbeute intakter Einzelmyofasern aus dem Musculus soleus (SOL) zu isolieren, der aufgrund der Faserlänge und -fragilität schwer dissoziierbar ist. Durch die Optimierung der Kollagenasekonzentration und Verdauungszeit minimiert das Protokoll den Ballaststoffverlust und erhält die Lebensfähigkeit während der Dissoziation. Der optimierte Arbeitsablauf reduziert die Restgewebeanhaftung an isolierte Fasern deutlich, wodurch die Übertragung von Nichtfaserzellen begrenzt und die Kreuzzellkontamination minimiert wird. Diese Technik eignet sich sowohl für Einzelfaseranalysen als auch für Satellitenzellenisolation und anschließende Expansion unter Bedingungen mit minimaler Kontamination. Mit diesem optimierten Workflow erhalten wir routinemäßig ~300–500 intakte, von SOL abgeleitete einzelne Myofasern, die mit hoher Effizienz immunmarkiert werden können und zudem eine hochwertige Satellitenzellpopulation mit minimaler Fibroblastenkontamination liefern. Durch vergleichende Analysen mit dem Extensor Digitorum Longus (EDL)-Muskel unterstreichen wir den Wert eines maßgeschneiderten, muskelspezifischen Ansatzes zur Bewertung von Therapien in der neuromuskulären Erkrankungsforschung, der es ermöglicht, potenzielle pharmazeutische Interventionen innerhalb kleiner, abstimmbarer experimenteller Zeitfenster zu testen.

Einleitung

Skelettmuskulatur ist das am häufigsten vorhandene Gewebe im menschlichen Körper und macht etwa 40–50 % der gesamten Körpermasseaus. Skelettmuskulatur dient als Energiespeicher in Form von Glykogen. Während der Kälteeinwirkung liefert es Wärme durch Thermogenese und sorgt vor allem für die Fortbewegung. Die Skelettmuskulatur besteht aus mehrkernigen, postmitotischen Myofasern. Um die Muskelreifung und -reparatur aufrechtzuerhalten, werden neue Myokerne von der ansässigen Stammzelle unseres Skelettmuskels, der Satellitenzelle (SC), erzeugt. SCs befinden sich am Rand der postnatalen Skelettmuskelfasern 2,3,4. SCs werden durch den Transkriptionsfaktor Pax7 identifiziert, der sowohl im Ruhezustand als auch im aktivierten Zustand 3,5 exprimiert wird. Bei Verletzung oder hypertropher Stimulation aktivieren und hochregulieren SCs MyoD, treten in das myogene Programm ein, vermehren sich und verschmelzen schließlich mit bestehenden oder neu gebildeten Myofasern, um die Muskelfunktion 6,7,8 wiederherzustellen. SCs sind heterogen in ihrer Stammfähigkeit, embryologischer Herkunft (somitisch vs. nicht-somitisch), postnatalem Wachstumsstadium (jung vs. alt) und Muskelzusammensetzung (schnelle vs. langsame Fasern)9,10,11.

Je nach Körperregion wird die Skelettmuskulatur darauf zugeschnitten, die energetischen und funktionellen Anforderungen dieser Region zu erfüllen. Diese Heterogenität der Muskelfasern ist aufgrund ihrer Kontraktilität und oxidativen Kapazität möglich. Tatsächlich bestehen Muskelfasern aus langsam zuckenden oxidativen Fasern (genannt Typ I und IIa) und schnell kontrahierenden glykolytischen Fasern (bei Nagetieren IIb IIx genannt). Dieses wunderschöne, funktionale Mosaik aus Fasertypen ermöglicht es uns, uns im Alltag frei zu bewegen. Zum Beispiel befinden sich Haltungsmuskeln wie der Soleus (SOL) und die Erector spinae in einem Zustand chronischer, niedrigstufiger Aktivierung und enthalten daher einen hohen Anteil langsam oxidativer Typ-I- und Typ-IIa-Muskelfasern. Im Gegensatz dazu bestehen kurze, aber schnell wirkende Muskeln wie der Extensor digitorum longus (EDL) hauptsächlich aus glykolytischen Typ-IIx- und Typ-IIb-Fasern. Die Faserzusammensetzung ist jedoch nicht festgelegt; Vielmehr sind Muskelfasern dynamische Strukturen, die je nach funktionellen Anforderungen von schnell zu langsam wechseln können. Der Unterschied in der Kontraktilität des Fasertyps ist durch den Gehalt des Myosin-Proteins möglich. Dies ist das Hauptprotein im Skelettmuskel und besteht aus Isoformen der leichten und schweren Myosin-Ketten12,14.

Im Inneren eines Sarkomers (der kleinsten funktionellen Einheit des Muskels, die Kraft erzeugt) interagieren Myosinköpfe und Aktin zu einer Struktur, die als Kreuzbrücke bekannt ist. Durch die Hydrolyse von ATP wird Energie durch den Kreislauf der Myosin- und Aktin-Interaktionen15,16 freigesetzt. Die Myosin-Schwerkette (MyHC) ist der am besten geeignete Marker für die Identifikation des Fasertyps12,13. Je nach exprimierter Isoform von MyHC variiert die Geschwindigkeit der Muskelkontraktilität. Wie erwähnt, sind Typ-I-Fasern langsame oxidative Fasern, im Gegensatz zu Typ-II-Fasern. Typ-I-dominante Muskelgruppen enthalten eine höhere Menge oxidativer Enzyme, sind reicher an Mitochondrien und verfügen über ein dichtes Kapillarnetzwerk, um den Muskel zu perfundieren(17,18 (denken Sie an einen Marathonläufer). Typ-I-Fasern werden vom MYH7-Gen 13,19 codiert. Typ-II-Fasern sind schnell ermüdet, enthalten einen hohen Anteil an glykolytischen Enzymen und haben eine höhere maximale Verkürzungsgeschwindigkeit, was sie ideal für kurze Kraft- oder Bewegungsstöße macht (denken Sie an Kraftheber). Typ-II-Fasern für Typ-IIa, IIx und IIb (bei Nagetieren) werden von den Genen MYH2, MYH1 und MYH4 codiert, also20,21. Wenig überraschend verändert jede pathophysiologische Beleidigung, die die Muskelintegrität beeinträchtigt, die Zusammensetzung des Ballaststofftyps und führt zu schädlichen Auswirkungen auf die Muskelfunktion, was möglicherweise die Lebensqualität verringert. Tatsächlich beginnen viele Muskeldystrophien entweder in der Satellitenzelle (Satellitenzell-Opathien) oder in der Muskelfaser (motorisches Neuron- oder Muskelgewebe) und können eine Veränderung der Fasertypzusammensetzungverursachen 22,23,24,25. Zum Beispiel zeigen Rückenmarksverletzungen, Bettruhestudien und Raumfahrt (Mikrogravitation), dass langfristige Inaktivität dazu führen kann, dass die Haltungsmuskeln vom langsamen zu schnellen Faserphänotyp26, 27, 28, 29, 30 wechseln. Umgekehrt sind bei der Duchenne-Muskeldystrophie, sowohl bei menschlichen als auch bei Mausmodellen (MDX), schnelle glykolytische Fasern stärker und stärker betroffen als ihre langsameren Gegenstücke 31,32,33,34. Ähnlich wird bei der Facioscapulohumeralen Muskeldystrophie (FSHD) ein schneller zu langsamer Zuckungsübergang beobachtet, bei einem größeren Anteil an Typ-I-Fasern sowie geringere Kraftproduktion in Typ-II-Fasern 24,35,36.

Es bleibt unklar, warum bestimmte Muskelfasertypen bei verschiedenen Krankheiten selektiv betroffen oder verschont bleiben. Die Tatsache, dass diese Muster nicht zufällig sind, unterstreicht die Bedeutung, die zugrunde liegenden Mechanismen zu analysieren, für die sich die Einzelfaser-Isolation als mächtige und weit verbreitete Technik etabliert hat. Tatsächlich wurde dieses unverzichtbare Werkzeug seit seiner Einführung Mitte der 80er Jahre durch Bischoff37 kontinuierlich verfeinert und angepasst, was eine immer präzisere Untersuchung der Muskelbiologieermöglicht. Wichtig ist, dass die Einzelfaser-Isolation SCs so nah wie möglich an ihrer physiologischen Nische hält und so eine angemessene Kontrolle ihrer molekularen Aktivität ermöglicht. Obwohl Muskelgruppen wie die des Flexor digitorum brevis (FDB) und EDLrelativ leicht extrahiert werden können, bleibt der SOL-Musculus einer der schwierigsten Muskeln, um eine reiche Population intakter Fasern zu erhalten. Dies liegt an ihrer Steifigkeit, langen Faserlänge und der Anfälligkeit für Schäden. Um dies zu beheben, wurde in der vorliegenden Studie eine Technik optimiert, die robust eine hochwertige, lebensfähige Faserpopulation aus dem berüchtigt schwer zu isolierenden SOL-Muskel liefert. In Kombination mit der EDL-Faserisolierung ermöglicht dieser Ansatz die Kultur von Fasern und abgeleiteten Zellen (Satellitenzellen, Myoblasten und Myoröhren) aus unterschiedlichen Muskelgruppen. Entscheidend ist, dass diese Plattform eine systematische Untersuchung der molekularen Faktoren ermöglicht, die unterschiedlich zu verschiedenen Muskelpathologien beitragen können, und bietet eine wirkungsvolle Möglichkeit, pharmazeutische Interventionen so zu testen, dass muskeltypspezifische Reaktionen aufgedeckt und letztlich die Entwicklung wirksamer Behandlungen für Skelettmuskelerkrankungen unterstützt werden.

Protokoll

Alle Tiere wurden in der Tiereinrichtung der Tokyo Metropolitan University untergebracht (Genehmigungsnummern: A4-4, A5-9, A6-7, A7-018). Alle Tiere wurden unter spezifischen, pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten. Die in dieser Studie angewandten Tierhandhabung und experimentelle Verfahren folgten strikt den Richtlinien des Sicherheits- und Ethikausschusses der Tokyo Metropolitan University.

1. Herstellung von Reagenzen

  1. Tragen Sie während des gesamten Spiels Handschuhe. In einer 25-mL Zentrifugenröhre wird 0,5 % der Kollagenase-Typ-I-Lösung in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMAX mit 1 % Penicillin-Streptomycin-Amphotericin-B-Suspension (AB) hergestellt. Nachdem die Kollagennase gut gelöst ist (bei Bedarf leicht auf das Rohr klopfen), sterilisiere die Lösung durch einen 0,22 μm niedrig-proteinbindenden Filter.
    HINWEIS: 2,5 ml Kollagenase-Lösung reichen für zwei Soleus (eine Maus) aus.
  2. Bereiten Sie 10 ml 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor. Wärmeinaktivieren Sie bei 60 °C für 30 Minuten und filtern Sie die Lösung dann durch einen 0,22 μm niedrig-proteinbindenden Filter.
    HINWEIS: Das 5%ige BSA in PBS-Lösung kann bei 4 °C bis zu 10 Tage gelagert werden.

2. Dissektion der Soleusmuskeln

  1. Layout-Ausrüstung für Muskeldissektion (Abbildung 1A).
  2. Betäuben C57BL/6 Mäuse durch intraperitoneale Injektion einer dreifachen Anästhetikummischung (0,5 ml/g Körpergewicht) mit 1 mg/mL Medetomidinhydrochlorid, 5 mg/ml Midazolam und 5 mg/mL Butorphanol-Tartrat und euthanasieren die Mäuse anschließend durch zervikale Verrenkung.
  3. Mache aufeinanderfolgende Hautschnitte am Hintergliedmaß und ziehe die Haut ab. Entfernen Sie die Oberflächenfaszie.
  4. Trennen Sie die Sehne plantaris (PLA) von den Bündeln gastrocnemius (GAS) und soleus (SOL) Sehne. Entfernen Sie die PLA vorsichtig, indem Sie an ihrer Sehne ziehen (Abbildung 1B).
  5. Schneiden Sie die GAS- und SOL-Sehnenbündel durch und legen Sie die Muskeln frei. Setzen Sie einen Stift in die Lücke zwischen der proximalen Sehne von GAS und SOL (Abbildung 1C).
  6. Schieben Sie die Nadel vorsichtig zum distalen Ende, um den SOL- und GAS-Muskel zu trennen (Abbildung 1D).
  7. Schneiden Sie die Sehnenbündel von der GAS-Seite ab (Abbildung 1E).
  8. Lass die Verjährung auf das GAS ruhen. Stellen Sie die Position des SOL vorsichtig an, um die proximale Sehne freizulegen, und schneiden Sie sie mit einer Mikroschere ab (Abbildung 1F).
  9. Positioniere den SOL auf dem Dissektionstisch und entferne die verbleibende Sehne (Abbildung 1G).
    HINWEIS: Dieser Schritt ist optional; die verbleibende Sehne beeinflusst das Ergebnis nicht.

3. Verdauung der Soleusmuskeln

  1. Übertragen Sie den intakten Soleus in ein 25-mL-Zentrifugenrohr mit der hergestellten 0,5%igen Kollagensäurelösung. Inkubiere bei 37 °C für 130 Minuten.
    HINWEIS: Alle 15–20 Minuten kann man die Probe manuell bewegen, um die Fasern leicht zu trennen und die Kollagenaktivität zu unterstützen.

4. Isolierung einzelner Fasern unter einem Stereomikroskop

  1. Schneiden Sie zwei Pasteur-Pipetten, um eine mit breiter Bohrung und eine mit schmaler Öffnung zu erzeugen (Abbildung 2A). Unter Flammen sterilisieren und glätten Sie die Löcher, um Muskelschäden während der Trituration zu vermeiden.
  2. Um eine Ballaststoffhaftung während der Isolierung zu verhindern, beschichten Sie Pasteur-Pipetten und drei 50 mm Petrischalen mit 5 % BSA/PBS.
    HINWEIS: Während der gesamten Isolationsschritte wurde ein Stereomikroskop (Abbildung 2B) verwendet.
  3. Nach der Muskelverdauung entsorgen Sie die überschüssige Kollagenaselösung und übertragen Sie den Soleus in die erste Schale, die DMEM mit 1 % AB enthält (Abbildung 2C).
  4. Mit der breiten Pasteur-Pipette spülen Sie vorsichtig auf und ab, um die Fasern zu dissoziieren (Abbildung 2D).
  5. Mit der schmalbohrigen Pasteur-Pipette werden intakte Einzelfasern entlang der Muskelfaserlänge auf die zweite Schale übertragen. Nutzen Sie hier die Gelegenheit, um Ablagerungen und/oder geschrumpfte Fasern zu entfernen (Abbildung 2E, F).
  6. Übertragen Sie hochwertige (ganze/unversehrte) Einzelfasern auf eine dritte Schelle, um die Reinheit mit der schmalen Rohr-Pasteur-Pipette zu gewährleisten (Abbildung 2G,H).
  7. Sammeln Sie die Fasern in ein BSA-beschichtetes 25-mL-Zentrifugenrohr. Rühren Sie die Suspension vorsichtig um und lassen Sie sie dann 5 Minuten bei Zimmertemperatur stehen, damit die Fasern bis zum Boden des Rohrs ausfällen können.
  8. Mit der schmalrohrigen Pasteur-Pipette entsorgen Sie vorsichtig das Überlagerungsmittel und entfernen Sie alle verbleibenden Ablagerungen. Lassen Sie etwa 500 μL des DMEM mit 1 % AB-Lösung übrig. Dieser Niederschlag enthält eine hochgereinigte Population einzelner Muskelfasern (Abbildung 2G,H).
    HINWEIS: Diese Technik kann > 300 Einzelfasern ergeben, die dann für die Extraktion von Proteinen und mRNA sowie die anschließende Analyse verwendet werden können.

5. Etablierung hochgereinigter Myoblastkulturen aus Soleusfasern

  1. Verdünnen Sie die Matrigel Matrix auf 0,1 mg/mL und verwenden Sie es, um eine 100-mm-Kulturschale zu beschichten. Inkubieren Sie die Schale bei 37 °C für 30–60 Minuten, bis die Beschichtung gleichmäßig polymerisiert ist.
  2. Fügen Sie der Muskelfasersuspension ein gleiches Volumen Accutase hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend werden 10 ml Wachstumsmedium hinzugefügt (bestehend aus glukosefreiem DMEM, das 30 % fetales Rinderserum, 1 % GlutaMAX, 1 % Hühnerembryo-Extrakt, CEE, 1 % AB und 0,01 μg/mL basischer Fibroblastenwachstumsfaktor, bFGF) enthält).
    HINWEIS: Eine gleiche Menge Accutase in diesem Fall ist die 500 μL, wie in Abschnitt 4.8 beschrieben. Accutase erleichtert die sanfte Dissoziation der Muskelfasern und hilft, Satellitenzellen freizusetzen, was die anschließende Expansion der Myoblast-Kultur unterstützt.
  3. Übertragen Sie die 10 ml Accutase-behandelte Muskelfasersuspension in eine matrigelbeschichtete Schale. Etwa 4 einzelne Fasern/cm² werden einer 100 mm großen Kulturschale hinzugefügt. Stellen Sie sicher, dass die Fasern gleichmäßig über das Kulturgericht verteilt sind.
  4. Nach 3 Tagen im Kulturmedium können Myoblast-Kolonien beobachtet werden. Ersetze das Wachstumsmedium täglich, bis die Myoblasten die erforderliche Population erreichen. Normalerweise sind Myoblastkulturen ab Tag 6 für die experimentelle Phase ausreichend zusammenfließend (Abbildung 3A).
  5. Lösen Sie Myoblasten mit Trypsin von der ursprünglichen Kulturschale ab und inkubieren Sie die Probe bei 37 °C für 2 Minuten. Zählen Sie mit einem Hämozytometer die Zellen und Samen entsprechend der Bohrlochgröße und der für myogenen Fortschritt erforderlichen Zellkonfluenz.
    HINWEIS: Für eine 100-mm-Schüssel gib 1 ml Trypsin dazu.

Ergebnisse

Unsere Technik zeigt, dass isolierte Fasern des Soleus (SOL) und des Extensor digitorum longus (EDL) effizient immunmarkiert werden können gegen Pax7 (Abbildung 3B). Diese isolierten Fasern können in einem schwimmenden Kulturmedium (bestehend aus DMEM + GlutaMAX mit 10 % Pferdeserum, 1 % AB, 0,5 % CEE) für 3 Tage aufbewahrt werden, gefolgt von einer Immunkennzeichnung (Abbildung 3B). Es wird nicht empfohlen, die schwimmenden Fasern länger als 4 Tage zu behalten. Unter den beschriebenen Bedingungen der schwimmenden Fasern neigen Myofasern nach dieser Zeit dazu, sich zu aggregieren, was die anschließende Immunkennzeichnungsanalyse beeinträchtigt.

Die vorgestellte Technik kann auch für die Immunblottung im myogenen Programm eingesetzt werden (Abbildung 3C). Tatsächlich wurden SOL- und EDL-abgeleitete Myoblasten in 24-Bohrlochplatten mit etwa 70 % Konfluenz verschichtet. Die Zellen wurden entweder einen Tag lang im Wachstumsmedium gehalten (Myoblasten) oder für zwei oder vier Tage zur Differenzierung veranlasst (frühbildende bzw. differenzierte Myotuben). Fünf μg Protein wurden für die Immunoblotting-Analyse geladen.

Die Expression von MyHC I wurde fast spezifisch in SOL-abgeleiteten Muskelfasern exprimiert, mit minimaler Expression in Myoröhren und vernachlässigbar in Myoblasten (Abbildung 3C). MyHC II wurde sowohl in den SOL- als auch in EDL-Muskelfasern exprimiert. Dieser Ausdruck spiegelt die SOL wider, die hauptsächlich aus Typ-I und IIa besteht, während die EDL hauptsächlich aus IIx- und IIb-Fasern besteht. Myoblasten exprimierten MyHC II nicht, aber dessen Expression stieg während der Differenzierung schrittweise an. Die oxidativ verwandten Proteine PGC-1α und COXIV zeigten die erwartete höhere Expression in SOL-abgeleiteten Fasern. Außerdem wurde eine höhere Expression von GLUT4 in isolierten SOL-Fasern im Vergleich zu EDL-Fasern nachgewiesen. Ein Problem, mit dem Skelettmuskelbiologen konfrontiert sein könnten, ist, dass weit verbreitete Haushaltsproteine und Belastungskontrollen wie α-Tubulin-, β-Aktin-, GAPDH- und Gesamtprotein-Färbungen einschließlich Ponceau S nicht stabil über Myoblasten, Myoröhren und isolierte Muskelfasern hinweg stabil bleiben, wobei jede eine deutliche Variabilität aufweist. Die Signalintensität von α-Tubulin und β-Actin war in Myotuben am höchsten, während die Ponceau-S-Färbung in Myoblasten relativ schwach war. Im Gegensatz dazu zeigte GAPDH eine stärkere Expression in den EDL-Muskelfasern. Dennoch kann je nach experimentellem Zweck eines dieser Housekeeping-Proteine weiterhin anwendbar sein; alternativ können Normalisierungsfaktoren wie das Wärmeschockprotein 70 (HSP70) untersucht werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Dissektion des Musculus Soleus. (A) Für die Sektion erforderliche Ausrüstung. 1: Mikro-Schere, 2: feine Pinzette, 3: Sezierschere und 4: Dissektionsnadeln. (B) Die PLA-Sehne wurde aus GAS- und SOL-Sehnenbündeln abgeschnitten (gelber Pfeil). Die distale PLA (weiße Pfeil) Sehne wurde mit einer Zange angehoben. (C) Ein Dissektionsstift wurde in den Raum zwischen der proximalen Sehne des SOL (roter Pfeil) und GAS (grüner Pfeil) eingesetzt. (D) SOL wurde mit einem Dissektionsstift vom GAS getrennt. (E) Die GAS- und SOL-Sehnenbündel wurden dann auf der GAS-Seite durchtrennt. (F) Die proximale Sehne SOL wurde dann mit einer Mikroschere geschnitten. (G) Zusätzliche distale Sehnenbündel wurden entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Isolierung der Soleusfasern. (A) Ausrüstung, die für die Isolation erforderlich ist. 1: Schmalrohr- und 2: Breitrohr-Pasteur-Pipetten. (B) Stereomikroskop zur Isolierung. (C) Kollagenase-verdauter Soleus wurde mit 1 % AB auf DMEM übertragen. (D) Soleusfasern dissoziierten nach den ersten 10 Spülsitzungen vom Muskel. (E) Einzelfasern in die zweite Schale übertragen. (F) Bild zeigt saubere Fasern, die von Ablagerungen und geschrumpften Fasern entfernt wurden. (G) Schmutzfreie Einzelfasern in die dritte Schale übertragen. (H) Intakte einzelne Fasern, deutlich sichtbar. Maßstabsleiste = 10 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3. Erweiterung der Zellkultur und Analyse von EDL- und SOL-abgeleiteten Proben. (A) Nach 6 Tagen nach der Isolierung zeigen die kultivierten Proben des Proliferationsmediums eine reine Myoblastkultur, die aus isolierten Soleusfasern gewonnen wurde. Skalenbalken = 100 μm. (B) SOL- und EDL-abgeleitete Einzelfasern zeigen unmittelbar oder 3 Tage nach der Isolierung Satellitenzellen, die immunmarkiert für Pax7 (grün) sind. Das Fehlen von MyoD (rot) bestätigt, dass Satellitenzellen sich noch nicht zur myogenen Aktivierung verpflichtet haben. Die Fasern wurden mit DAPI (Blau) gemotmet. Die Zellen wurden anschließend mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Scale Bar = 20 μm. (C) 5 μg Protein wurden zur Immunblottung von Myoblasten, Myotuben und Myofaserproben verwendet. Immunoblotting-Panels zeigen die Expression von MyHC I, MyHC II, PGC-1α, COX IV, GLUT4, α-Tubulin, β-Actin und GAPDH wurden als Haushalts- und Normalisierungsziele verwendet. Die Ponceau-S-Färbung wurde als vollständige Kontrolle zur Proteinbelastung verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Der erste Schlüssel zur Isolierung einer großen Anzahl von Muskelfasern vom Soleus (SOL) besteht darin, die strukturelle Integrität des Muskels während der Dissektion zu erhalten. Wenn das Epimysium des SOL gerissen wird oder der Muskel während der Dissektion stark gezogen wird, insbesondere entlang seiner Längsachse, wird die Isolationsausbeute stark beeinträchtigt. Diese Dissektionsfehler sind meist leicht nachträglich zu erkennen. Tatsächlich schrumpft der Muskel nach der Kollagenase-Verdauung gleichmäßig und bildet eine weiße, kompakte Masse. Unter solchen Bedingungen können nur sehr wenige lebensfähige Fasern dissoziiert werden.

Der zweite entscheidende Faktor für eine erfolgreiche Soleus-Isolierung ist die Effizienz der Typ-I-Kollagenase-Verdauung. Wenn die Kollagenase optimal funktioniert, können während der ersten 10 Spülsitzungen etwa 100–200 Soleusfasern gewonnen werden. Im Gegensatz dazu können bei suboptimaler Verdauung selbst nach den ersten 20 Spülungen weniger als 50 Ballaststoffe freigesetzt werden. Um einen höheren Ballaststoffertrag zu erzielen, sind intensiveres Abspülen und zusätzliche Spülzyklen erforderlich. Da SOL-Fasern jedoch außergewöhnlich empfindlich sind, führt dies oft zu einer Faserschrumpfung beim Ausspülen.

Für die Etablierung einer reinen, SOL-abgeleiteten primären Myoblastkultur spielt die Kollagenaseverdauung erneut eine entscheidende Rolle. Wenn die Verdauung effizient ist, bleiben weniger Fasern am Restgewebe gebunden, und die Übertragung der Fasern in ein Kulturmedium führt zu einer minimalen Fibroblastenkontamination. Im Gegensatz dazu bleiben dissoziierte Fasern bei schlechter Verdauung am Restgewebe haften und kontaminieren die Myoblastkultur mit Fibroblasten. Forscher sollten nach den typischen Anzeichen einer Fibroblastenkontamination in den zusammengesetzten Zellproben suchen; dazu gehören viel größere Zellgrößen und umfangreiche zytoskelettale Auswüchsungen, verglichen mit den deutlich kleineren, spindelförmigen Satellitenzellen in anhafteten, matrigelbeschichteten Schüsseln. Sollte eine Kontamination auftreten, können Forscher die Zellen den Vorbeschichtungsschritten unterziehen, wie an anderer Stellebeschrieben 45. Kurzzeitig werden SCs nach der Isolation drei Tage lang kultiviert, dann trypsinisiert und kurzzeitig auf kollagenüberzogenen Schalen vorbereitet. Während der 15–30 Minuten Inkubation haften die Fibroblasten, während die SCs suspendiert bleiben und auf frische, matrigelbeschichtete Platten übertragen werden.

Wie oben erwähnt und mit unserer Erfahrung übereinstimmend, sind SOL-Fasern länger und empfindlicher als Fasern des Extensor digitorum longus (EDL) und des Flexor digitorum brevis (FDB). Das macht das Umsetzen von Fasern mit Pasteur-Pipetten schwierig. Es ist unerlässlich, die Fasern entlang ihrer Längsachse zu aspirieren, anstatt sie aus der Mitte zu ziehen; ansonsten falten und schrumpfen die Fasern unter der Belastung. Abgesehen von den entscheidenden Faktoren, die direkt bestimmen, ob die Glasfaserisolierung erfolgreich ist, sind einige zusätzliche technische Schritte unerlässlich, um die Ausbeute der Soleusfaser zu verbessern. Eine davon ist, alle Pasteur-Pipetten, Schalen und Sammelröhrchen mit 5 % BSA zu beschichten. Dies verhindert, dass frisch dissoziierte Muskelfasern an Oberflächen haften, wodurch Faserfaltungen und anschließende Schrumpfungen verhindert werden. Es wird empfohlen, bei jeder Isolierung von Muskelproben neue wärmesterilisierte, BSA-beschichtete Pasteur-Pipetten herzustellen. Alternativ könnten Forscher ein Set von Pasteur-Pipetten für den Langzeiteinsatz vorbereiten. Wenn ja, jedes Mal heißsterilisieren und vor der Anwendung frisch mit BSA auftragen.

Das konventionelle Protokoll zur Isolierung einzelner Muskelfasern war hauptsächlich für glykolytische Muskeln wie FDB und EDL37 optimiert. Oxidative Muskeln, wie der SOL, sind jedoch strukturell unterschiedlich. Transkriptomische Analysen haben gezeigt, dass die extrazelluläre Matrix (ECM)-bezogene Genexpression zwischen dem SOL und EDL46 unterscheidet, einschließlich Gene wie Dystrophin, einem zytoskelettalen Linkerprotein der Skelettmuskulatur44. Folglich ist die Standardbedingung für die EDL-Muskelverdauung mit 0,2 % (2 mg/mL) Kollagenase für 60–90 Minuten für SOL-Muskeln nicht optimal, was nach der Verdauung zu kompakten Ballastbündeln oder geschrumpften Fasern führt. In dieser Studie haben wir mehrere wichtige Schritte optimiert, um das Protokoll für oxidative SOL-Muskeln anzupassen. Durch Anpassung der Typ-I-Kollagensäurekonzentration auf 0,5 % (5 mg/mL), Verlängerung der Inkubationszeit auf 130 Minuten und Minimierung mechanischer Belastung während des Ausspülens können von einer einzelnen Maus konstant 300–500 intakte Fasern aus einer einzelnen Maus gewonnen werden. Im Vergleich zu EDL bleiben die Faserzahl und die Ausbeute der SOL-Proben geringer (die EDL kann > 500 Fasern liefern); dennoch sind die Faseranzahl und, was wichtig ist, die hohe Qualität unserer SOL-abgeleiteten Fasern robust und für nachgelagerte Anwendungen wie Immunkennzeichnung und Immunoblotting geeignet. Obwohl unsere Immunblotting-Ergebnisse aus zusammengelegten Einzelfaserproben bestanden, kann die in diesem Bericht vorgestellte Technik zuverlässig intakte einzelne Fasern extrahieren, wodurch sie für nachgelagerte Anwendungen wie Immunoblotting, Proteomik und RNA-Sequenzierung47 bei Einzelfaserauflösung geeignet sind. Forscher auf diesem Gebiet können diese Technik nutzen, um metabolische und kontraktile Unterschiede zwischen oxidativen und glykolytischen Muskelfasern zu untersuchen.

Insgesamt bietet dieses Protokoll eine reproduzierbare und zugängliche Methode, um intakte oxidative Fasern vom Soleusmuskel zu isolieren und erweitert damit das Toolkit zur Untersuchung der typspezifischen Physiologie und molekularen Mechanismen von Muskelfasern.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Danksagungen

Diese Studie wurde durch die Einrichtung von universitären Stipendien zur Schaffung von Science-Tech-Innovation (JST, Zuschussnummer JPMJFS2139 an T.H.) und Stipendien der Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI 23H00457, verliehen an N.L.F., 20J12849 an Y.Mi., 24K22254 an Y. Ma). Diese Studie wurde außerdem durch den Advanced Research Grant [R2-2] der Tokyo Metropolitan Government an Y.Ma., N.L.F., sowie den strategischen Forschungsfonds der TMU für innovative Forschungsprojekte [R3] an N.L.F. unterstützt. Vielen Dank an Yasuro Furuichi für seine Ratschläge und nützlichen Kommentare.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Basic fibroblast growth factorPeprotech450-33
Bovine serum albuminSigmaA9418
Butorphanol tartrateMeiji Yakuka Co., Ltd711-12Produktname: Vetorphale Injektion
Chicken Embryo ExtractUS BiologicalC3999
Collagenase type IWorthingtonM9B2717
DAPISigma-AldrichD9542
Fetal bovine serumGibco10437-028
Glucose-free DMEMGibcoA14430-01
GlutaMAXGibco10569
High-glucose DMEM+GlutaMAXGibco10569-010
Horse serumLife technology16050-130
Low-protein binding filterMilliporeSLGVR33RB
MatrigelCorning354230
Medetomidine hydrochloridKyoritsu Seiyaku Co., Ltd8816Produktname: Dorbene Injektion
MidazolamMaruishi Pharmaceutical Co., Ltd4987211762100Produktname: Dormicum Injektion
Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspensionWako161-23181
Ponceau S stain solutionSigma-Aldrich24-3875-5
Trypsin-EDTA (0,25%), phenol redGibco25200056
Equipment
Zentrifugenrohren (25 ml)IWAKI2362-025
FluoreszenzmikroskopKeyenceBZ-X810
Pasteur PipettenIWAKI5 3/4 IK-PAS-5P
StereomikroskopLeicaM165C
Sterilin-Schalen (100 mm)Thermo Scientific3020-100Als Petrischale im Manuskript bezeichnet
Antikörper für die Immunmarkierung
Goat anti-mouse (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-327231:400
Goat anti-rabbit (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-110121:400
Mouse Anti-Myosin Heavy ChainR&D SystemsMAB44701:400
Mouse Anti-Pax7DSHBAB-5284281:100
Rabbit Anti-MyoDSanta Cruz Biotechnologysc-7601:100
Antikörper für das Immunblotting
HRP-konjugierter Anti-Maus IgGCytivaNA9311:1000/ Pferderadische Peroxidase
HRP-konjugierter Anti-Kaninchen IgGCytivaNA9341:1000/ Pferderadische Peroxidase
Mouse Anti-MyHC ISigmaM84211:1000/ Myosin Heavy Chain I
Mouse Anti-MyHC IISigmaM42761:1000/ Myosin Heavy Chain II
Mouse Anti-PGC-1αSanta Cruz Biotechnologysc-5173801:1000/ Pparg-Coaktivator 1 alpha
Mouse Anti-α-TubulinCell Signaling Technology#38731:1000/ Alpha-Tubulin
Rabbit Anti-COXIVCell Signaling Technology#48501:1000/ Cytochrom c Oxidase IV
Rabbit Anti-GAPDHCell Signaling Technology#22181:10000/ Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
Rabbit Anti-GLUT4Cell Signaling Technology#22131:1000/ Glucosetransporter 4
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