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Technischer Ansatz zur strukturellen Analyse einer unbekannten Verbindung in der Huoxiang Zhengqi-oralen Flüssigkeit basierend auf linearer Ionenfallen-Massenspektrometrie

DOI:

10.3791/70672

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April 3rd, 2026

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1General Surgery, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, The First Affiliated Hospital of Chongqing College of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Cardiology, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, The First Affiliated Hospital of Chongqing College of Traditional Chinese Medicine, 3Chongqing Taiji Industry, 4Chongqing Clinical Research Center for Dermatology, Department of Dermatology, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, The First Affiliated Hospital of Chongqing College of Traditional Chinese Medicine

In This Article

Summary

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Hier zeigen wir ein Standardprotokoll, das mehrstufige Massenspektrometriebäume mit einem Fragmentierungsprozess kombiniert, der auf Huoxiang Zhengqi oraler Flüssigkeit basiert.

Abstract

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Chinesische Kräuterverbindungen (CHCs) spielen eine unersetzliche Rolle in der chinesischen Medizin, und die Identifizierung ihrer komplexen Bestandteile war in den letzten Jahren ein bedeutender Forschungsschwerpunkt. Huoxiang Zhengqi orale Flüssigkeit ist eine klassische chinesische Patentmedizin, deren chemische Zusammensetzung eine weitere Untersuchung auf molekularer Ebene erfordert. Traditionelle Massenspektrometer, wie Time-of-Flight und Orbitrap, liefern typischerweise nur sekundäre Fragmentierungsinformationen. Basierend auf einem linearen Ionenfallen-Massenspektrometer könnten Verbindungen gründlicher zerlegt werden, wodurch tiefere Fragmentinformationen gewonnen werden. Dieses Papier entwickelt eine strukturelle Explorationstechnik für unbekannte Verbindungen in CHCs, die Probenvorbehandlung, Ultraleistungs-Flüssigkeitschromatographiepräparation, Massenspektrometrievorbereitung, Vollspektrumtests, sekundäre Massenspektrometrietests, mehrstufige Massenspektrometrietests und Ergebnisanalyse umfasst. Repräsentative Ergebnisse zeigen den Herleitungsprozess der Verbindungsstruktur. Wir besprechen Faktoren, die die experimentelle Technik beeinflussen, wie Isomere, Polyhydroxyverbindungen und die Auflösung der Instrumente. Basierend auf der Herleitung der mikroskopischen Molekularstruktur unbekannter Verbindungen durch mehrstufige Massenspektrometriefragmentierung ist die etablierte experimentelle Methode vielseitig und anwendbar für die strukturelle Charakterisierung bioaktiver kleiner Moleküle in der traditionellen chinesischen Medizin und deren Verbindung zu pharmakologischen Mechanismen.

Introduction

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Chinesische Kräuterverbindungen (CHCs), als unschätzbare Vermögenswerte der traditionellen chinesischen Medizin (TCM), haben Jahrtausende validierter klinischer Erfahrung gesammelt1. Sie erfüllen eine unersetzliche Rolle in der Krankheitsprävention, therapeutischen Intervention und Rehabilitation2. Durch Multi-Kräuter-Synergismus behandeln CHCs den menschlichen Körper ganzheitlich und setzen die Grundprinzipien des Holismus und der syndromdifferenzierungsbasierten Therapieum. Innerhalb moderner medizinischer Rahmenbedingungen erlangen CHCs weltweite Anerkennung für ihre polypharmakologischen Mechanismen, die Multi-Target-Signalwegeeinbinden, mit breiten Anwendungen von Verdauungsstörungen, Atemwegsinfektionen bis hin zur Immunmodulation5. Huoxiang Zhengqi orale Flüssigkeit (HXZQ) verkörpert klassische CHC-Formulierungen6. Seine Zusammensetzung umfasst mehrere Heilkräuter wie Patchouli, Perillablatt, Angelica dahurica, Atractylodes, Poria und getrocknete Mandarinenschale. Es ist bekannt für seine Fähigkeit, zwergende, hitzebefreiende, feuchtigkeitslösende und magen-stimulierende Eigenschaften zu verleihen7. HXZQ wird klinisch gegen feuchtigkeitsinduzierte grippeähnliche Syndrome, epigastrische Dehnung, Erbrechen und Durchfallerkrankungeneingesetzt 8. Technologische Fortschritte haben die CHC-Forschung von phänomenologischer Beobachtung hin zu molekularen, mechanistischen und verbindungsbezogenen Untersuchungen 9verlagert, etwa durch den Einsatz von Proteomik- und Metabolomik-Techniken zur Identifizierung der aktiven Bestandteile und damit wissenschaftliche Grundlagen für die Globalisierung der TCM. Folglich bringt eine rigorose Analyse der chemischen Bestandteile und der Pharmakodynamik von HXZQ nicht nur die CHC-Standardisierung voran, sondern katalysiert auch die innovative Wirkstoffforschung10.

Die HXZQ ist eine Mehrkräuter-Formulierung, deren inhärente chemische Komplexität aus ihren zusammengesetzten botanischen Bestandteilen ergibt11. Gekennzeichnet durch eine vielfältige Palette phytochemischer Klassen – darunter flüchtige Öle, Coumarine, Lignane, Polysaccharide und Alkaloide – enthält HXZQ sowohl gut charakterisierte bioaktive Verbindungen als auch einen erheblichen Pool strukturell nicht annotierter Bestandteile12. Dynamische Schwankungen in Schlüsselkomponenten (z. B. flüchtige Öle, Flavonoide, Alkaloide) können aufgrund von Unterschieden in den Extraktionsprotokollen und Lagerbedingungen auftreten, was den dringenden Bedarf an systematischer chemischer Profilierungunterstreicht. Im Rahmen der Modernisierung der traditionellen chinesischen Medizin (TCM) erläutert eine tiefgehende kompositorische Analyse klassischer Formulierungen wie HXZQ nicht nur die materielle Grundlage ihrer therapeutischen Wirksamkeit, sondern bietet auch empirische Unterstützung für Qualitätskontrolle, standardisierte Herstellung und Überwachung von unerwünschten Ereignissen10. Obwohl Verbindungen mit hoher Häufigkeit in HXZQ umfassend dokumentiert sind, bleibt ein erheblicher Teil seiner chemischen Komponente uncharakterisiert13. Die strukturelle Vielfalt seiner Bestandteile, kombiniert mit der geringen Häufigkeit vieler potenziell bioaktiver Moleküle, stellt eine umfassende Identifikation mit konventionellen analytischen Techniken wie Chromatographie und Spektroskopie allein vor erhebliche Herausforderungen14. Bemerkenswert ist, dass Isomerie in mehreren phytochemischen Klassen in HXZQ verbreitet ist, darunter Coumarine, Lignane und Polysaccharide, was die strukturelle Differenzierung15 weiter erschwert. Weitere Barrieren für eine genaue Verbindungsannotation sind eine geringe Analythenthäufigkeit und Matrixinterferenzeffekte. Zusammen heben diese Faktoren eine wichtige Grenze in der HXZQ-Forschung hervor: die Entwicklung robuster analytischer Strategien zur präzisen, hochdeckenden Identifikation des gesamten chemischen Komplements.

Zeitgenössische Massenspektrometrie-(MS)-Plattformen stoßen bei der Charakterisierung komplexer Matrizen auf inhärente Einschränkungen, darunter Ionen-Co-Elutionsartefakte und unvollständige spektrale Datenbankabdeckung16. In diesem Zusammenhang haben sich Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) und Mehrstufige Massenspektrometrie (MSn) als unentbehrliche analytische Strategien für die de-novo-strukturelle Aufklärung unbekannter Verbindungenerwiesen 17. Während konventionelle hochauflösende MS-Systeme wie Quadrupol-Zeitflug (Q-TOF) MS und Orbitrap MS hochwertige MS/MS-Fragmentdaten erzeugen, ist ihr Nutzen auf einstufige Fragmentierungsereignisse beschränkt. Trotz dieser Einschränkung liefern diese Plattformen reichhaltige strukturelle Einblicke mit außergewöhnlicher Empfindlichkeit und Auflösung, insbesondere bei der Analyse komplexer Mischungen18. Im Gegensatz dazu verwendet die lineare Ionenfallen-MS (LIT) einen mehrstufigen Kollisions-induzierten Dissoziationsmodus (CID), der sequentielle, iterative Fragmentierung molekularer Ionen ermöglicht. Diese einzigartige Fähigkeit ermöglicht eine schrittweise Zerlegung von zusammengesetzten Skeletten und funktionellen Gruppen und ermöglicht so eine eindeutige qualitative Identifizierung strukturell unterschiedlicher unbekannter Analyten19. Um dem unerfüllten Bedarf an einer umfassenden Charakterisierung komplexer CHC-Matrizen gerecht zu werden, präsentiert diese Studie einen LIT-MS-basierten analytischen Workflow, der auf die Identifikation unbekannter Verbindungen zugeschnitten ist. Durch die Nutzung der hohen Ionenerfassungseffizienz und der schnellen Scangeschwindigkeit des LIT verbessert dieser Ansatz den Durchsatz und die Genauigkeit der de-novo-Strukturannotation . Die Anwendung dieses Workflows auf HXZQ zielt darauf ab: (1) bestehende Methoden zur Profilierung uncharakterisierter chemischer Bestandteile in HXZQ zu ergänzen; (2) Einrichtung eines technischen Rahmens zur Unterstützung der Standardisierungsforschung für andere CHC-Formulierungen; und (3) die Übersetzung der TCM von der empirischen Praxis in evidenzbasierte Präzisionsmedizin beschleunigen.

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Protocol

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1. Beispiel-Vorbehandlung

  1. Öffnen Sie die Verpackung des kommerziellen HXZQ. Übertragen Sie 0,1 mL HXZQ genau in eine 2-mL-Probeflasche und fügen Sie dann 0,9 mL Wasser hinzu. Schütteln Sie die Lösung, bis sie vollständig vermischt ist.
  2. Bereiten Sie eine Injektionsspritze (1 mL) und einen mikroporösen Membranfilter (0,22 μm) vor. Filtere die Lösung in eine neue 2-mL-Probeflasche.
    HINWEIS: Ergreifen Sie während der experimentellen Verfahren angemessene persönliche Vorsichtsmaßnahmen.

2. Ultraleistungs-Flüssigkeitschromatographie (UPLC)-Vorbereitung

  1. Doppelklicke auf die Xcalibur-Software . Klicke auf Bereit zum Download und dann auf die Direktsteuerung . Klicken Sie im Pop-up-Fenster auf die Spalte Pumpmodul, setzen Sie %B auf 50, %C auf 0 und %D auf 0 (Abbildung 1).
  2. Klicken Sie auf die Motor-Taste , um in den Ein-Zustand zu wechseln. Klicken Sie auf die Schaltfläche Mehr Optionen , stellen Sie im Pop-up-Fenster den Fluss auf 5 [mL/min] und die Zeit auf 180 [s] ein. Klicken Sie auf die Lösch-Schaltfläche und dann auf die OK-Schaltfläche im Pop-up-Fenster.
    HINWEIS: Die mobile Phase ist konstant bei 0,3 mL/min mit 50 % A (0,1 % Ameisensäurelösung) und 50 % B (Acetonitril) ohne Säulentemperatur, sofern keine chromatographische Säule vorhanden ist. Das Standard-Einspritzvolumen beträgt üblicherweise 1 μL.

3. MS-Vorbereitung

  1. Kehren Sie zum Hauptfenster der Software zurück und klicken Sie auf die Schaltfläche "Sequence Setup View ". Klicken Sie auf die Schaltfläche Öffnen , um die bereits bearbeitete Vorlage zu importieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Methodennamen und klicken Sie auf die Schaltfläche Datei öffnen , um die Methodendatei zu öffnen.
  2. Im Pop-up-Fenster Instrument Setup stellen Sie die Erste Messe (m/z) auf 100 und die letzte Messe (m/z) auf 1200 ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die Methode zu speichern.
    HINWEIS: Die Standard-MS-Bedingungen umfassten Ionenquellentemperatur bei 350 °C, den anfänglichen MS-Bereich von 80 bis 1200 Da, den Kollisionsmodus bei kollisionsinduzierter Dissoziation (CID) und Kollisionsenergie bei 35.

4. Vollständiger MS-Test

  1. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen der Sequenz" und dann auf die OK-Schaltfläche im Pop-up-Fenster. Warten Sie, bis die Probeninjektion abgeschlossen ist (Abbildung 2).
    HINWEIS: Bitte stellen Sie vor dem Test die 2-mL-Probeflasche in das Probenfach des Instruments.
  2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Roadmap View und klicken Sie auf das Qual Browser-Symbol , um das Qual Browser-Fenster zu öffnen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Öffnen , wählen Sie die Datendatei mit .raw Format im Ordner aus und doppelklicken Sie darauf, um die Datei zu öffnen.
  3. Rechtsklick auf das Chromatogramm-Fenster und dann auf die Schaltfläche Bereiche . Im Abschnitt Filter scannen wählen Sie ESI Full MS. Im Abschnitt Plottyp wählen Sie TIC. Klicken Sie auf die OK-Taste , dann zeigt das Fenster das Gesamtionenchromatogramm der Probe an.
  4. Klicken Sie auf den Pushpin-Button oben rechts im Massenspektrumfenster.
  5. Im Chromatogrammfenster klicken und verschieben Sie, um eine Zeitregion mit der stärksten relativen Häufigkeit auszuwählen. Das Massenspektrumfenster zeigt die entsprechenden Massenspektrumionen an. Erfassen Sie die M/Z-Werte für die nächste Stufe der Massenspektrometrie.

5. MS/MS-Test

  1. Kehren Sie zum Fenster der Instrumenteneinrichtung zurück. In der Spalte Parent Mass der n=2-Reihe geben Sie den m/z-Wert der im vorherigen Schritt eingezeichneten Verbindung ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die Methode zu speichern.
  2. Zurück zum Softwarefenster. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Sequence Setup View", ändern Sie den Dateinamen und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Speichern ", um die Sequenz zu speichern.
  3. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen der Sequenz" und dann auf die OK-Schaltfläche im Pop-up-Fenster. Warte, bis die Probeninjektion abgeschlossen ist.
  4. Kehren Sie zum Qual-Browser-Fenster zurück. Klicken Sie auf die Schaltfläche Öffnen , wählen Sie die Datendatei mit .raw Format im Ordner aus und klicken Sie doppelt darauf, um die Datei zu öffnen
  5. Rechtsklick auf das Chromatogramm-Fenster und dann auf die Schaltfläche Bereiche . Im Abschnitt Filter scannen wählen Sie ESI Full MS. Im Abschnitt Plottyp wählen Sie TIC. Klicken Sie auf die OK-Taste , dann zeigt das Fenster das Gesamtionenchromatogramm der Probe an.
  6. Klicken Sie auf den Pushpin-Button oben rechts im Massenspektrumfenster.
  7. Im Chromatogrammfenster klicken und verschieben Sie, um eine Zeitregion mit der stärksten relativen Häufigkeit auszuwählen. Das Massenspektrumfenster zeigt die entsprechenden Massenspektrumionen an. Erfassen Sie die M/Z-Werte für die nächste Stufe der Massenspektrometrie.

6. MSn Test

  1. Zurück zum Instrumenten-Setup-Fenster. In der Spalte Parent Mass der n=3-Reihe geben Sie den m/z-Wert der im vorherigen Schritt aufgezeichneten Verbindung ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern , um die Methode zu speichern.
  2. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.5, um die Probeninjektion und Datenanzeige abzuschließen. Beenden Sie dieMS-n-Analyse , sobald keine stabilen Fragmentionen mehr beobachtet werden.

7. Parameteroptimierung

  1. Zurück zum Instrumenten-Setup-Fenster. Klicken Sie in der Spalte "Akt-Typ" auf CID und wählen Sie dann PQD oder ETD aus, um den Kollisionsmodus zu ändern.
  2. In der Spalte der normalisierten Kollisionsenergie klicken Sie auf 35 und setzen Sie dann auf 20 oder 50, um die Kollisionsenergie zu ändern.
    HINWEIS: Kombinieren Sie alle chemischen Rückstände und Lösungsmittel in den organischen Abfallbehälter.

8. Ergebnisanalyse

  1. Zeichnen Sie das Mutterion und das Fragmentierungsion manuell in der Zeichensoftware, einschließlich Mutterionenstruktur, Verbindungsname und Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z)-Wert.
  2. Zum Beispiel beobachten wir für die unbekannte Verbindung mit m/z=623,21 die resultierende Fragmentierung. Hier hatte das Fragment-Zwischenprodukt ein m/z=461,15 bei MS/MS. Der Massenunterschied betrug 162,06 Da, was einer hexosenartigen Struktur entspricht.
  3. Analysieren Sie dies weiter: Das Fragment-Zwischenprodukt mit m/z=461,15 wurde erneut fragmentiert und bildet Neobyakangelicol mit m/z=315,09 bei MS3. Der Massenunterschied betrug 146,06 Da, was einer Deoxyhexamethylose-Struktur entspricht. Das heißt, das Zwischenprodukt mit m/z=461,15 hatte eine Deoxyhexamethylose-Einheit mehr als Neobyakangelicol.
  4. In der Struktur von Neobyakangelicol sollte die Bindungsposition analysiert werden. Hier war die freiliegende Hydroxylgruppe die wahrscheinlichste Position, um mit einer Deoxyhexamethylose verbunden zu sein. Ähnlich war die Hydroxylgruppe bei C1 auf der Deoxyhexamethylose-Einheit am wahrscheinlichsten mit einer Hexose verbunden. Schließlich erhält man die Struktur der unbekannten Verbindung mit m/z=623,21.

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Results

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Wir schlugen vor, zuerst alle m/z-Informationen zu sammeln und anschließend den Massenunterschiedswert zwischen dem Elternion und dem Fragmention zu berechnen. Ich habe die in der Datenbank oder Literatur gemeldete Verbindung gefunden und dann die unbekannte Verbindungsstruktur auf Basis dieser bekannten Struktur umgekehrt abgeleitet.

Alle detektierten Verbindungen und ihre entsprechenden Fragmentionen wurden durch m/z-Werte dargestellt. Eine Teilmenge dieser Fragmentionen konnte authentifizie...

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Discussion

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Die Kombination von LIT-MS und seinerMSN-Fragmentierungstechnologie bietet eine Methode zur Identifizierung unbekannter Verbindungen in CHCs. Im Gegensatz zu traditionellen Tandem-MS-Modi in Orbitrap und Q-TOF MS kann lineare Ionenfalle gezielt Zielionen einfangen und so effektiv Interferenzen durch das Co-Eluierenvon Ionen 23 vermeiden. Diese Methode erreicht molekulare Präzision und liefert relativ genaue chemische strukturelle Informationen und löst ...

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Disclosures

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde durch ein spezielles Projekt zur Leistungsförderung und Anleitung des Chongqing Scientific Research Institute (cstc2022jxjl120005) finanziert. Forschungsprojekt für Wissenschaft und Technologie der Chongqing Municipal Education Commission (KJZD-K202315102). Chongqing Medizinisches Wissenschaftliches Forschungsprojekt (Gemeinsames Projekt der Chongqing Gesundheitskommission und des Wissenschafts- und Technologiebüros (2022DBXM007)). Spezialkrankenhaus Xinglin-Stipendiat der Chengdu-Universität der TCM (YYZX202160).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrilThermo ScientificCAS 75-05-8Flüssigkeitszustand
AmeisensäureThermo ScientificCAS 64-18-6Flüssigkeitszustand
Huoxiang Zhengqi OralflüssigkeitChongqing Taiji Industry (Group) Co., Ltd.State Drug Standard Code Z50020409Gegenstand der Studie
Lineares Ionenfallen-MassenspektrometerThermo ScientificLTQ XLIT-MS-Gerät
FlüssigkeitschromatographThermo ScientificU3000UPLC-Gerät
XcaliburThermo ScientificVersion 2.0UPLC-IT-MS-Betriebssoftware

References

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