Ein dreidimensionales Kulturmodell, das die Entwicklung von sekundären bis antralen Follikeln beim Menschen in vitro unterstützt

Zusammenfassung

Diese Studie etablierte ein dreidimensionales (3D-)Kulturmodell, das die menschliche Follikelentwicklung vom sekundären bis zum antralen Stadium in vitro unterstützt. Dieses System ermöglicht das Wachstum der Follikel und die Bildung des Antrums, während somatische zellmolekulare Merkmale erhalten bleiben und ein entscheidendes Modell für die Forschung zur menschlichen Follikogenese dargestellt werden.

Zusammenfassung

Die humane ovariale Follikulogenese ist ein komplexer, streng regulierter Prozess, der direkt in vivo schwer zu untersuchen ist. Obwohl In-vitro-Modelle für die mechanistische Forschung unerlässlich sind, bleiben bestehende Systeme suboptimal, da sie die räumlich-zeitlichen Dynamiken der Follikelentwicklung nicht nachbilden können. Diese Studie präsentiert ein 3D-Kulturmodell, das die Entwicklung der menschlichen Follikel vom sekundären bis zum antralen Stadium unterstützt. Dieses Modell repapituliert erfolgreich wichtige morphologische Ereignisse in vivo , darunter anhaltendes follikelwachstum, eine deutliche Durchmesserexpansionsphase ab Tag 10 und die Bildung der Geweihhöhle um Tag 20. Wichtig ist, dass dieser Entwicklungsfortschritt in der erfolgreichen Gewinnung lebensfähiger Eizellen im Keimbläschenstadium (GV) gipfelte. Darüber hinaus zeigte die Immunfluoreszenzanalyse deutliche Expressionsmuster von Gonadotropinrezeptoren in somatischen Zellen, was mit der Identität von Granulosa und Theca-Zellen übereinstimmt. Innere granulosaähnliche Zellen wiesen einen hohen follikelstimulierenden Hormonrezeptor (FSHR) auf, während äußere theca-ähnliche Zellen eine hohe Expression des luteinisierenden Hormonrezeptors (LHR) aufwiesen. Dieses Modell bietet eine wertvolle Plattform zur Untersuchung der menschlichen Follikogenese und Reproduktionstoxikologie und dient als Referenz zur Optimierung von In-vitro-Follikelkultursystemen für die Entwicklung von Sekundär- bis Antralstadium.

Einleitung

Der physiologische Prozess der Entwicklung der Eierstockfollikel, vom Urstadium bis zum präovulatorischen Stadium, ist grundlegend für die weibliche Fruchtbarkeit¹. Dieser Prozess umfasst eine hochkoordinierte Reihe von Ereignissen, darunter das Wachstum und die Reifung der Eizellen sowie die Proliferation/Differenzierung der Granulosenzellen². Störungen dieser komplexen Mechanismen sind eine Hauptursache für Unfruchtbarkeit und Eierstockdysfunktion. Ein detailliertes Verständnis der regulatorischen Netzwerke, die der Follikulogenese zugrunde liegen – einschließlich parakriner Signalübertragung, Interaktionen zwischen Eierzellen und somatischen Zellen sowie der Dynamik der extrazellulären Matrix – ist daher von entscheidender pathophysiologischer Bedeutung. Die direkte Untersuchung der menschlichen Follikulogenese in vivo bleibt jedoch durch ethische und praktische Einschränkungen eingeschränkt, was den Bedarf an zuverlässigen In-vitro-Modellen zur Aufklärung dieser Mechanismen vorantreibt. Trotz der Fortschritte bleibt ein kritischer Mangel an einem langfristigen Kulturmodell, das die menschliche Follikelentwicklung unterstützt, insbesondere vom sekundären bis zum antralen Stadium.

Während die humane Follikelkultur in zweidimensionalen (2D) oder dreidimensionalen (3D) Matrizen ein fortgeschrittenes Verständnis der frühen Follikelentwicklung ^3,4 bietet, bleiben solche Systeme darin eingeschränkt, den Fortschreiten zu späteren Stadien zu unterstützen. Es ist bemerkenswert, dass die Erreichung der humanen Follikuelogenese in vitro über spätere Entwicklungsstadien besonders herausfordernd bleibt, da die Follikelgröße und die verlängerte Reifungszeit^verlängert sind. Selbst unter der begrenzten Anzahl von humanen in-vitro-Follikelkultursystemen, die erfolgreich MII-Oozyten hervorgebracht haben, bleiben die Reifungsraten niedrig (höchstens etwa 20 %)^6,7,8,9. Vielleicht ist eine grundlegendere Herausforderung die Wiederholung des sekundären zu antralen Übergangs, einer kritischen und strukturell komplexen Phase, die noch nicht ausreichend in vitro modelliert wurde.

Diese Studie etablierte ein 3D-Kulturmodell, das die in-vitro-Entwicklung menschlicher sekundärer Follikel zu antralen Follikeln mit unterschiedlichen Hohlraumstrukturen unterstützt. Dieses Modell bietet eine grundlegende Grundlage für die weitere Untersuchung der regulatorischen Mechanismen, die der Entwicklung menschlicher Follikel zugrunde liegen, und dient als Referenz für die zukünftige Optimierung von Follikelkultursystemen, die auf sekundäre bis antrale Entwicklung abzielen.

Protokoll

Dieses Studienprotokoll wurde vom Ethikkomitee des Dritten Krankenhauses der Peking-Universität überprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer M2024151). Alle gesetzlichen Vormünder von Minderjährigen, die an der Studie teilnehmen, haben das Formular zur informierten Einwilligung unterschrieben.

Gewebequelle
Das in diesem Protokoll verwendete humane Eierstockmedullärgewebe stammt von vier pädiatrischen Patienten mit der Diagnose Eierstockteratom (im Alter von 2, 6, 13 und 16 Jahren), die Eierstockgewebe für Forschungszwecke spendeten (Tabelle 1). Der Ovarialkortex wurde für Untersuchungen zur Kryokonservierung des Eierstockgewebes verwendet, während das verbleibende Medullärgewebe für die In-vitro-Follikelkultur in dieser Studie verwendet wurde. Insgesamt wurden 33 sekundäre Follikel isoliert, wobei 16 Follikel der Kontrollgruppe und 17 der 3D-Kulturgruppe zugeordnet wurden.

Reagenzvorbereitung
Das Transportmedium bestand aus Leibovitz' L-15-Medium, ergänzt mit einem 10%igen Serumersatz und wurde bei 4 °C gelagert. Die vollständige Verdauungslösung wurde durch Ergänzung von MEMα mit 0,04 mg/mL Liberase DH, 10 IU/mL DNase I und 100 IU/mL Penicillin-Streptomycin hergestellt und bei -20 °C gelagert. Die Verdauungsstopplösung wurde mit DPBS ergänzt, mit einem 10%igen Serumersatz ergänzt und bei 4 °C gelagert. Das vollständige Wachstumsmedium wurde durch die Ergänzung von MEMα mit 10 % Serumsubstitut, 1 % Insulin-Transferrin-Selen, 50 μg/mL L-Ascorbinsäure, 2 mM Natriumpyruvat und 100 IU/mL Penicillin-Streptomycin hergestellt. Das Medium wurde bei 4 °C gelagert. Rekombinantes humanes follikelstimulierendes Hormon (FSH) wurde zu einer Endkonzentration von 100 mIU/mL bei Kulturbeginn hinzugefügt, wie in einer früheren^{Studie 10} beschrieben. Nach visueller Erkennung der frühen Antrumbildung (etwa Tag 20) wurde das rekombinante humane luteinisierende Hormon (LH) bei Mediumwechsel auf eine Endkonzentration von 10 mIU/mL ergänzt. Die Festkulturmatrix wurde hergestellt, indem eine 70%ige (v/v) Basalmembranmatrix mit 30% (v/v) eiskaltem Vollwachstumsmedium gemischt und während aller Handhabungsschritte auf Eis gehalten wurde.

Gewebeverdauung und sekundäre Follikelisolation
Ovarialgewebe wurde in Transportmedium gelegt und bei 4 °C ins Labor gebracht. Unter sterilen Bedingungen wurde das Eierstockmedulla mit einem Skalpell seziert. Das Gewebe wurde in dünne Stücke (~3 × 3 × 1 mm) geschnitten und mit einem Gewebeschneider weiter in kleine Fragmente (~0,5 × 0,5 × 1 mm) zerkleinert, wodurch das Gewebe durchgehend feucht blieb. Das gehackte Gewebe wurde in eine 35-mm-Schale überführt, und eine voraufgewärmte, vollständige Verdauungslösung mit 2 ml pro 100 mg Gewebe wurde hinzugefügt. Die Brutzeit erfolgte bei 37 °C für 45–80 Minuten (Mittelwert: 60 ± 15 Minuten), wobei alle 10 Minuten sanft gemischt wurde. Die Verdauung wurde beendet, als eine mikroskopische Untersuchung eine Lockerung der Strommatrix und die Freisetzung einzelner Follikel zeigte (Abbildung 1). Gesunde sekundäre Follikel (Durchmesser 100–200 μm, mit ≥ 2 Granulosa-Zellschichten und einer sichtbaren Eizelle) wurden unter einem Stereomikroskop mit einer Glas-Mund-gesteuerten Pipette (Innendurchmesser 200 μm) ausgewählt und zweimal mit vorerwärmtem Vollwachstumsmedium gewaschen.

3D-Einbettung und langfristige Kultur
Ein Zellkultur-Einsatz wurde in eine 35 mm große Schale gelegt, die mit 2 ml vollständigem Wachstumsmedium befeuchtet und für 2 Stunden in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO₂) vorausgegliblibbt wurde. Ausgewählte sekundäre Follikel wurden unter denselben Bedingungen in den Einsatz überführt und über Nacht vorkultiviert. Am Ende der Vorkultur wurden die Follikel der Kontrollgruppe direkt im Insert kultiviert (2D-Kultur). Im Gegensatz dazu wurden Follikel, die für die 3D-Kulturgruppe vorgesehen waren, für die Einbettung in eine wachstumsfaktor-reduzierte Basalmembranmatrix vorbereitet (Gesamtproteinvolumen 8~12 mg/mL). Die Matrix wurde auf Eis aufgetaut und mit 30 % (v/v) eiskaltem Vollwachstumsmedium vermischt. Tröpfchen von 40 μL der Mischung wurden in eine 35 mm große Schale (maximal sechs Tröpfchen pro Schale) gegeben, um eine gleichmäßige Gelschicht von etwa 1,5 mm Höhe zu bilden. Anschließend wurde in jeden Tropfen ein einzelner sekundärer Follikel mit einer glasgesteuerten Pipette übertragen, die sorgfältig im mittleren bis oberen Drittel des Tropfens positioniert war, um ein Einsinken zu verhindern. Die Schale wurde für 30 Minuten in einen Brutkasten (37 °C, 5 % CO₂) gestellt, um die Gelation zu ermöglichen. Nach der Verhärtung wurden 2 ml vollständiges Wachstumsmedium vorsichtig in die Schale gegeben, um eine Langzeitkultur einzuleiten.

Kulturpflege und Überwachung
Alle 48 Stunden wurde ein 50%iger Mediumwechsel mit frischem Vollwachstumsmedium (mit FSH) durchgeführt. Die Follikel wurden täglich unter einem Stereomikroskop beobachtet, und ihre Durchmesser sowie morphologischen Eigenschaften wurden erfasst. Bei der visuellen Erkennung der frühen Antrumbildung (etwa Tag 20) wurde rekombinantes menschliches LH dem Medium bei späteren Veränderungen hinzugefügt. Die Kultur wurde bis zu 30 Tage aufrechterhalten oder bis die Follikel das antrale Stadium erreichten (Durchmesser > 400 μm mit einer klar definierten, flüssigkeitsgefüllten Kavität).

Zelldissoziation nach der Kultur
Am Ende der Kultur wurden die antralen Follikel in eine Schale mit frischem DPBS übertragen und mechanisch mit einer sterilen 29-Gauge-Spritze dissoziiert. Die isolierten Kumulus-Ozyten-Komplexe (COCs) wurden zur weiteren Analyse in eine separate Schale überführt. Die verbleibende Granulosa- und Thecazellsuspension wurde in eine neue 35-mm-Schale mit 2 ml vorgeheiztem vollständigem Wachstumsmedium übertragen, sanft für gleichmäßige Verteilung gewirbelt und für 48 Stunden (37 °C, 5 % CO₂) inkubiert.

Immunfluoreszenzanalyse
Nach der Kultur wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 30 Minuten bei Zimmertemperatur fixiert. Anschließend wurden die Proben dreimal mit PBS gewaschen, mit 0,5 % Triton X-100 für 20 Minuten permeabilisiert und dann über Nacht bei 4 °C mit 1 % BSA in PBS blockiert. Die Zellen wurden über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert. Die primären verwendeten Antikörper waren Anti-FSHR (Kaninchen, 1:200) und Anti-LHR (Maus, 1:100). Nach der Inkubation wurden die Zellen jeweils dreimal für 15 Minuten mit PBS gewaschen, das 1 % BSA enthielt. Anschließend wurden sie mit fluoreszierenden sekundären Antikörpern (Anti-Kaninchen und Anti-Maus, 1:200) zwei Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Abschließend wurden die Zellen drei letzte Waschen unterzogen, jeweils 20 Minuten lang. Die Kerne wurden 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur mit DAPI gefärbt. Anschließend wurden die Proben dreimal für 5 Minuten mit PBS gewaschen, das 1 % BSA enthielt. Die Bildgebung erfolgte mit einem Operetta CLS High-Content Imaging System im konfokalen Modus. Fluoreszenzsignale wurden mit folgenden Kanälen aufgenommen: DAPI (405 nm), Alexa Fluor 488 (LHR) und Alexa Fluor 647 (FSHR), mit konstanten Belichtungseinstellungen über alle Proben.

Statistische Analyse
Vergleiche des Follikeldurchmessers zwischen der Kontrollgruppe und der 3D-Kulturgruppe an den Tagen 5, 10 und 15 wurden mit einem unabhängigen Proben-t-Test durchgeführt. Ein p-Wert < 0,05 galt als statistisch signifikant. Eine statistische Analyse des Follikeldurchmessers wurde nach Tag 15 nicht durchgeführt, da fast alle Follikel der Kontrollgruppe nach Tag 15 nicht überlebten. Dies führte zu einer unzureichenden Stichprobengröße, was zuverlässige und sinnvolle Gruppenvergleiche ausschloss. Alle statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism (Version 9.0) durchgeführt.

Ergebnisse

Entwicklung eines 3D-Kulturmodells, das das Wachstum der menschlichen Follikel bis zur antralen Phase unterstützt
Eine große Herausforderung in der Eierstockfollikelforschung ist die Entwicklung eines in-vitro-Kultursystems , das die vollständige Follikelentwicklung unterstützt, wobei die Bildung der Gehhöhlenhöhle ein wichtiger Meilenstein ist. Daher etablierte diese Studie ein 3D-Kulturmodell für humane Follikel in vitro (Abbil...

Diskussion

Die erfolgreiche Erhaltung der humanen Ovarialfollikel in vitro durch den sekundären zum antralen Übergang stellt einen bedeutenden technischen Fortschritt dar. In dieser Studie ermöglichte ein 3D-Kultursystem, das angemessene biophysikalische Unterstützung und stadiumspezifische hormonelle Hinweise bietet, diesen Verlauf. Diese Ergebnisse stimmen mit aktuellen Erkenntnissen überein, die die Notwendigkeit von 3D-Kultursystemen unterstreichen, um die Gewebephysiologie nachzubilde...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-FSHR	HuaBio	ER1909-08
Anti-LHR	Santa Cruz	sc-293165
Anti-mouse(sekundär)	Abcam	AB150113
Anti-rabbit(sekundär)	Abcam	AB205718
Basement membrane matrix für Organoid-Kultur	MCE	K6004
BSA	Sigma	A1933
Zellkultur-Einsatz	Millipore	PICMORG50
Kulturschale	Corning	430165
DAPI	Beyotime	C1006
DNase I	Thermo	EN0525
DPBS	Gibco	14190144
FSH	Merck	F4021
Inkubator	Thermo	Heracell 3111
Insulin-Transferrin-Selen	Gibco	41400045
L-Ascorbinsäure	MCE	HY-B0166
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	11415064
LH	Merck	L6420
Liberase DH	Roche	5401054001
McIlwain Gewebeschneider	Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd.	MP10180-220
MEMα	Gibco	41061029
Paraformaldehyd	Solarbio	P1110
PBS	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Serumersatz-Supplement	FUJiFILM Irvine	90194
Natriumpyruvat	Gibco	11360070
Stereomikroskop	Nikon	SMZ1270
Das Hochleistungs-Imaging-System	PerkinElmer	Operetta CLS
Triton X-100	Sigma	X100