Eine 3D-Knochenkulturplattform mit menschlichen Osteozyten und einer dezellularisierten extrazellulären Matrix zur Modellierung muskuloskelettaler Erkrankungen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von 3D-Knochenkonstrukten unter Verwendung menschlicher Osteozyten, die in Methacrylgelatine-(GelMA)-Hydrogelen eingebettet sind und mit einer decellularisierten extrazellulären Matrix ergänzt werden. Die Methode ist kostengünstig, skalierbar und kompatibel mit einfachen Laborgeräten und bietet eine translationale Plattform zur Untersuchung von Prozesse muskuloskelettaler Erkrankungen.

Abstract

Die Modellierung muskuloskelettaler Erkrankungen wie Osteoporose erfordert In-vitro-Plattformen , die Schlüsselmerkmale der menschlichen Knochenbiologie genau reproduzieren. Konventionelle 3D-Kultursysteme bieten wertvolle Einblicke in Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen, doch ihre Abhängigkeit von teuren Materialien, Bioprintern oder spezialisierter Infrastruktur begrenzt ihre breitere Verbreitung. Hier beschreiben wir ein robustes und kostengünstiges Protokoll zur Erzeugung von 3D-Knochenkonstrukten unter Verwendung menschlich abgeleiteter Osteozyten, eingebettet in GelMA-Hydrogele, ergänzt durch decellularisierte extrazelluläre Matrix (dECM), die aus gespendeten Femurköpfen gewonnen wird. Diese auf Pipetterung basierende Methode ermöglicht die Herstellung reproduzierbarer, knochenartiger Konstrukte bei physiologischer Temperatur (37 °C) mit Standardlaborausrüstung.

Die daraus resultierenden Konstrukte bewahren eine hohe Lebensfähigkeit und strukturelle Integrität und unterstützen nachgelagerte Anwendungen wie Immunfluoreszenzbildgebung und molekulare Analysen. Die Einbeziehung von patientenabgeleitetem dECM erhöht die translationale Relevanz, indem sie die menschliche Knochenremodellierung und den Krankheitsverlauf besser widerspiegelt. Dieser Ansatz bietet eine zugängliche, skalierbare Plattform für Arzneimitteltests, regenerative Medizin und mechanistische Studien der Knochenbiologie. Insgesamt bietet das Protokoll eine praktische Alternative zu teuren Biodrucktechniken und lässt sich leicht an andere gewebespezifische dECM-Quellen anpassen.

Introduction

Diese Methode zielt darauf ab, eine kosteneffiziente und reproduzierbare 3D-Zellkulturplattform zur Modellierung muskuloskelettaler Erkrankungen, einschließlich Osteoporose, zu etablieren, indem GelMA mit dECM kombiniert wird, das aus menschlichem Knochengewebe gewonnen wird. Diese Strategie ermöglicht die Erzeugung knochenähnlicher Konstrukte, die die physiologische Mikroumgebung näher replizieren als herkömmliche zweidimensionale Kulturen und unterstützt die Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen unter biologisch relevanten Bedingungen¹. Der Einsatz von patientenabgeleiteten Osteozyten und klinisch gewonnener dECM aus Oberschenkelköpfen erhöht den translationalen Wert und stellt eine praktische Verbindung zwischen In-vitro-Experimenten und klinischen Forschungsbedürfnissen^her.

Diese Methode wurde entwickelt, um wesentliche Einschränkungen bestehender 3D-Kultur- und Biofabrikationssysteme zu adressieren, die oft Bioprinter, proprietäre Biomaterialien oder teure Verbrauchsmaterialien (z. B. Matrigel) benötigen und die Zugänglichkeit in vielen ^3,4 einschränken. Darüber hinaus gelingt es synthetischen Hydrogelen häufig nicht, die biochemische Komplexität der mineralisierten extrazellulären Knochenmatrix oder das Verhalten der ansässigen Osteozyten^{wiederzubilden}. Im Gegensatz dazu integriert dieses Protokoll menschliche knochenbasierte dECM, erhält mineralisierte Gehalte, native Proteine und Signalmoleküle und vermeidet dabei die Infrastrukturanforderungen additiver Fertigungstechnologien⁶.

Die Kombination aus GelMA und dECM bietet mehrere Vorteile. GelMA unterstützt zelluläre Adhäsion, Lebensfähigkeit und Differenzierung und kann bei 37 °C verarbeitet werden, wodurch eine Zellkapselung ohne spezielle Geräte möglich ist. Crosslinking mit kostengünstigen ultravioletten (UV)-Quellen (365 nm) erhöht die Zugänglichkeit zusätzlich⁷. Die dECM-Supplementierung bereichert das Konstrukt mit gewebespezifischen Hinweisen, die in synthetischen Substituten fehlen, verbessert die osteogene Kompatibilität und erleichtert nachgelagerte Assays wie Immunfluoreszenz und molekulare Profilierung⁸.

Diese Methode steht im Einklang mit aktuellen Bemühungen, menschenrelevante Knochenmodelle zu entwickeln, die die Abhängigkeit von Tierversuchen verringern, deren Translationsgenauigkeit oft durch interspezifische Unterschiede ^1,9,10 begrenzt ist. Das Protokoll entspricht den Prinzipien des 3Rs¹¹ und kann angepasst werden, um Konstrukte mithilfe anderer gewebespezifischer dECMs zu erzeugen, wodurch potenzielle Anwendungen in der Knorpel-, Haut- und Herz-Kreislauf-Gewebetechnik¹² erweitert werden.

Insgesamt bietet diese Technik eine zugängliche und skalierbare Plattform, um Knochenbiologie unter physiologisch relevanten Bedingungen zu studieren. Seine Kompatibilität mit der routinemäßigen Laborinfrastruktur und die Fähigkeit, menschliche klinische Proben zu integrieren, machen es besonders geeignet für akademische und krankenhausbasierte Forschungsgruppen. Die Methode unterstützt nicht nur eine Plattform für weitere Knochenstudien zu Knochenprozessen, sondern könnte auch ein Ausgangspunkt für translationalere Anwendungen in der regenerativen Medizin und personalisierter therapeutischer Entwicklung sein.

Protocol

Diese Studie wurde vom Wissenschaftlichen Ethikausschuss des Gesundheitsdienstes Concepción genehmigt. Menschliches Knochengewebe wurde von Oberschenkelköpfen gewonnen, die von Patienten gespendet wurden, die sich einer Hüftgelenkersatzoperation im Traumatologiekrankenhaus von Concepción, Chile, nach schriftlicher informierter Zustimmung unterzogen. Die Proben wurden bis zur Nutzung bei −80 °C gelagert. Alle Verfahren entsprachen den institutionellen Richtlinien für den ethischen Einsatz menschlichen Gewebes in der Forschung. Das gesamte menschliche Knochengewebe wurde von Oberschenkelköpfen gewonnen, die von Patienten im Traumatologiekrankenhaus von Concepción, Chile, gespendet wurden, nach informierter Zustimmung und mit Zustimmung des Wissenschaftlichen Ethikausschusses des Gesundheitsdienstes Concepción. Alle Verfahren entsprechen den institutionellen Richtlinien für die Verwendung von menschlichem Gewebe.

1. GelMA-Synthese

1. 10 g Typ-A-Gelatine A in 100 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,5) bei 60 °C unter ständigem Rühren auflösen.
2. Reduzieren Sie die Temperatur auf 50 °C und geben Sie 5 ml Methacrylanhydrid mit einer Geschwindigkeit von 0,5 mL/min und rühren Sie vorsichtig 1–3 Stunden hin.
3. Verdünnen Sie die Reaktionsmischung um 5 × mit PBS, das bei 40 °C vorgewärmt wurde, um die Reaktion zu stoppen.
4. Dialyse die Lösung mit einer 12–14 kDa Membran gegen 3–5 Liter destilliertes Wasser bei 40 °C für 5–7 Tage und ersetze das Wasser täglich.
   HINWEIS: (Kritischer Schritt) Sorgen Sie für einen vollständigen täglichen Wasserersatz, um nicht reagierte Methacrylanhydrid zu entfernen.
5. Lyophilisieren Sie die dialysierte Lösung für 24 Stunden und lagern Sie das lyophilisierte GelMA bei 4 °C bis zur Verwendung.

2. GelMA-Hydrogel-Zubereitung

1. Bereite 10-ml-Chargen von GelMA-Hydrogelen mit 5, 10 oder 15 W/v% her.
2. 0,5, 1,0 oder 1,5 g lyophilisiertes GelMA in 9,5 mL deionisiertes Wasser bei 50 °C auflösen.
3. Die Lösung auf 37 °C abkühlen.
4. Fügen Sie 0,5 ml Irgacure 2959 Photoinitiatorlösung hinzu (0,5 w/v% in absolutem Ethanol).
5. Sanft mischen und die Lösung bei 37 °C halten, bis eine sterile Filtration durch einen 0,22 μm Celluloseacetat-Membranfilter erfolgt.

3. Knochendecellularisierung

1. Schenkelköpfe werden allmählich auf 25 °C aufgetaut. Schneiden Sie jeden Oberschenkelkopf in zwei Hälften und dann in kleinere Stücke.
2. Stücke werden in steriles destilliertes Wasser bei 60 °C eingetaucht und 15 Minuten (40 kHz, kontinuierlich) sonikiert.
3. Waschen Sie die Proben in 300 ml destilliertem Wasser, das bei 60 °C vorgewärmt wird, während es bei 200 U/min geschüttelt wird, für 5 Minuten.
4. Zentrifugiere bei 1850 × g für 15 Minuten bei 25 °C. Wiederhole die Wasch- und Zentrifugenschritte dreimal.
5. Sterilisieren Sie das Gewebe durch Sonikation (40 kHz, kontinuierlich) für 10 Minuten bei 60 °C in einer Lösung, die 3 % Wasserstoffperoxid und 0,02 % Peroxyessigsäure enthält.
6. Das Gewebe wird auf 300 ml 70 % Ethanol übertragen und für 10 Minuten bei 21 °C (40 kHz, kontinuierlich) Sonikat.
7. Waschen Sie die Proben zweimal mit 300 ml destilliertem Wasser, schütteln Sie bei 200 U/min 10 Minuten bei 60 °C und zentrifugieren Sie bei 1850 × g 15 Minuten bei 25 °C.
8. Zunächst wird der Knochen bei -80 °C 4 Stunden vorgefriert und anschließend 24 Stunden lang in einer breiten Basis geblendet, um eine gleichmäßige Trocknung zu gewährleisten und eine übermäßige Probenerhebung bei 0,05 mbar bei -40 bis -60 °C zu vermeiden.
   HINWEIS: (Kritischer Schritt) Stellen Sie sicher, dass die Probe im Behälter nicht 2–3 cm hoch wird, um eine unvollständige Lyophilisation zu vermeiden.

4. Knochenmikropartikelvorbereitung

1. Die decellularisierten Knochenfragmente werden in 250-mL-Erlenmeyer-Kolben in die sterilisierende Lösung gelegt und mit einem Homogenisator homogenisiert, bis eine einheitliche weiße Lösung erreicht ist (ergänzendes Video 1).
2. Zentrifugieren Sie bei 1850 × g für 15 Minuten bei 25 °C, entsorgen Sie das Supernatant und waschen Sie das Pellet zweimal mit 300 ml destilliertem Wasser bei 25 °C unter Rührung bei 200 U/min für 10 Minuten. Führen Sie eine letzte Zentrifugation bei 1850 × g für 15 Minuten bei 25 °C durch.
3. Lyophilisieren (0,05 mbar bei -40 bis -60 °C) das resultierende Material für 48 Stunden und bis zur Anwendung bei -80 °C lagern.
4. Mechanisch wird der lyophilisierte kortikale oder medulläre Knochen mit einem sterilisierten keramischen Mörtel gemahlen, bis feines Pulver gewonnen wird (Abbildung 1).
5. Führen Sie das Pulver durch ein 200 μm großes Sieb oder Gitter, wiegen Sie das Endmaterial und lagern Sie es bei -80 °C.
   HINWEIS: (Kritischer Schritt) Stellen Sie sicher, dass das Pulver vor dem Sieben vollständig trocken ist, um Aggregation und ungenaue Auswahl der Partikelgröße zu vermeiden.

Ergänzendes Video 1: Knochenhomogenisierungsverfahren. Homogenisierung dezellularisierter Knochenfragmente mittels eines Homogenisators, bis eine einheitliche weiße Suspension entsteht. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Abbildung 1: Knochenmikropartikelpräparation. (A) Decellularisierte Knochenfragmente nach Homogenisierung mit OV5-Homogenisator und Lagerung bei -80 °C. (B,C) Sterilisierter keramischer Mörtel, der verwendet wird, um decellularisierten Knochen zu einem feinen Pulver zu mahlen. (D) Endgültige decellularisierte Knochenmikropartikel nach dem Sieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

5. Knochengel-Herstellung

1. Bereiten Sie 10 W/v% GelMA vor, indem Sie 1 g GelMA in 9,5 mL deionisiertem Wasser bei 50 °C auflösen.
2. Kühlen Sie die Lösung auf 37 °C ab und fügen Sie die Irgacure 2959 Photoinitiator-Lösung hinzu.
3. Halten Sie die Lösung bei 37 °C und führen Sie eine sterile Filtration mit einem 0,22-μm-Filter durch.
4. Fügen Sie decellularisierte Knochenmikropartikel (DBMP) mit 1 % w/v hinzu.
5. Mischen und pipetteieren Sie vorsichtig auf und ab, ohne Blasen zu erzeugen, bei 40 °C, bis eine homogene Suspension zur Bildung von Knochengel (BG) entsteht.
6. Lagern Sie den Blutzucker bis zu 2 Wochen bei 4 °C.
   HINWEIS: (Kritischer Schritt) Halten Sie das Hydrogel vor der Zelleinbindung über seiner Gelungstemperatur (≥37 °C), um eine vorzeitige Erstarrung zu vermeiden.

6. Osteozyten-Primärkultur

1. Knochenmarkextraktion und Erstwäsche
   1. Knochenmarkgewebe wird aus dem Inneren des Oberschenkelkopfes mit sterilen chirurgischen Instrumenten extrahiert und zerkleinert (Abbildung 2).
   2. Übertrage das gehackte Gewebe in eine sterile Petrischale.
   3. Waschen Sie das Gewebe dreimal mit α-MEM-Kulturmedium, das mit einer antibiotisch-antimykotischen Lösung (100 μg/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin, 0,25 μg/mL Amphotericin) ergänzt wird.
   4. Einmal mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) abspülen.
      HINWEIS: (Kritischer Schritt) Minimieren Sie die Zeit zwischen Gewebeentnahme und -verarbeitung, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten.
2. Enzymatische Verdauung
   1. Inkubieren Sie das Gewebe 25 Minuten lang in Kollagenase Typ-I-Lösung bei 37 °C mit sanfter Bewegung.
   2. Waschen mit HBSS.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 6.2.1–6.2.2 zweimal (insgesamt drei Kollagenase-Verdauungen).
   4. Inkubieren Sie das Gewebe in 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für 25 Minuten bei 37 °C.
   5. Waschen Sie mit HBSS und wiederholen Sie den EDTA-Schritt zweimal mehrmals.
   6. Führen Sie eine letzte Collagenase-Typ-I-Verdauung durch (25 Minuten bei 37 °C), gefolgt von einer HBSS-Wasch.
      HINWEIS: (Fehlerbehebung) Eine unvollständige Verdauung kann zu geringer Zellausbeute führen; Verlängern Sie die enzymatische Inkubation bei Bedarf um 5–10 Minuten.
3. Zellerneuerung und -kultur
   1. Sammeln Sie die Kollagenase-Lösung auf und übertragen Sie die abschließende HBSS-Waschmaschine in ein 50-mL-Zentrifugenrohr.
   2. Zentrifugiere bei 1.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
   3. Entsorge das Supernatant und suspendiere das Pellet in 2 mL vollständiger α-MEM.
   4. Säen Sie die Zellsuspension in zwei T75-Kulturkolben aus und inkubieren Sie bei 37 °C mit 5 % CO₂.
      HINWEIS: Ersetzen Sie das Kulturmedium alle 2–3 Tage, bis eine ausreichende Konfluenz erreicht ist (Abbildung 3).

Abbildung 2: Knochenmarkgewebeentnahme. (A) Oberschenkelkopf, der durch Hüftgelenkersatz gewonnen wurde und die für die Zellisolierung verwendete Medullarregion zeigt. (B) Gehackte Medullärknochenstücke vor der enzymatischen Verdauung in eine sterile Petrischale gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Primäre Osteozytenkultur. Osteozyten haften sich an und vermehren sich in einer Monoschicht innerhalb eines T75 nach Isolierung vom menschlichen Medullärknochen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

7. 3D Zellkultur

1. Erwärme die Menge BG-Hydrogel bei 37 °C vor.
   HINWEIS: (Kritischer Schritt) Stellen Sie sicher, dass der Arbeitsbereich frei von Zügen ist; Die Abkühlung beschleunigt das vorzeitige Gelieren.
2. Abtrennen Sie kultivierte Osteozyten und zentrifugieren Sie bei 500 × g für 5 Minuten in einem 15-mL-Röhrchen.
3. Das Pellet in 200 μL Kulturmedium wieder suspendieren und mit dem BG-Hydrogel mischen, um eine Endzelldichte von mindestens 1000 Zellen/μL (ab jetzt als Bioink bezeichnet) zu erreichen.
4. Saugen Sie 50 μL der Bioink mit einer 1000 μL Pipette ab und halten Sie bis zur Abscheidung bei 37 °C.
5. Pipette 50 μL der Bioinkt pro Konstrukt in jede Welle der Kulturplatte (Ergänzendes Video 2); erlauben Sie ungefähr 5 Minuten für die physikalische Gelation bei Raumtemperatur (Abbildung 4).
6. Belichte jedes Bohrloch 365 nm UV-Licht für 1 Minute, um eine irreversible Vernetzung (0,30 J/cm²) zu erreichen.
7. Fügen Sie Kulturmedium hinzu und inkubieren Sie die Konstrukte bei 37 °C, 5 %_CO2 für die erforderlichen Zeitpunkte. Verwenden Sie für jeden Zeitpunkt eine separate Platte.

Abbildung 4: Vorbereitung des 3D-Zellkulturkonstrukts. Die Bohrlochplatte mit zellbeladenem GelMA konstruiert unmittelbar nach dem Pipetieren und der anschließenden UV-Vernetzung (365 nm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzendes Video 2: Vorbereitung von 3D-zellenbeladenen Konstrukten. Abscheidung von Hydrogelzellen-Gemischen in eine 12-Well-Platte mittels einer einfachen Pipetttechnik vor UV-Vernetzung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

8. Biokompatibilitätstests

1. Lebende/tote Flecken
   1. Kultivieren Sie das zellbeladene Gerüst für die gewünschten Zeitintervalle.
   2. Waschen Sie vorsichtig mit sterilem PBS.
   3. Inkubieren Sie die Konstrukte 30 Minuten im Dunkeln mit einer lebenden/toten Lösung, die 0,2 % Ethidiumhomodimer-1 (EthD-1) und 0,05 % Calcein AM in PBS enthält.
   4. Bild sofort mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Filtern für Calcein AM (~495/515 nm) und EthD-1 (~495/635 nm). Standard-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und Texas Red Filtersets sind mit der Erkennung von Calcein AM bzw. EthD-1 kompatibel.
   5. Identifizieren Sie lebende Zellen durch grüne zytoplasmatische Fluoreszenz und tote Zellen durch rote Kernfluoreszenz.
      HINWEIS: Planare Bilder können mit ImageJ (Fiji) verarbeitet werden. Objektivlinse, Belichtungszeit, Verstärkung und Beleuchtungsintensität wurden für alle verglichen Proben konstant gehalten und nur angepasst, um eine Signalsättigung zu vermeiden. Um Fehlinterpretationen durch Autofluoreszenz zu minimieren, wurden für alle Proben innerhalb jedes Experiments die gleichen Aufnahmeeinstellungen beibehalten, und Kontrollbeobachtungen von Gerüst-/Knochen-Mikropartikelkonstrukten ohne Zellen wurden verwendet, um das mit dem Biomaterial assoziierte Hintergrundfluoreszenzmuster zu erkennen. Diese Kontrollen ermöglichten es uns, teilchenabgeleitete Signale von echter abgerundeter Zellfärbung während der Bildinterpretation zu unterscheiden.
2. Alamarblue-Quantifikation
   1. Bereiten Sie eine 5%ige Alamarblue-Arbeitslösung in vollständigem Medium vor.
   2. Inkubieren Sie Gerüste in AlamarBlue-Lösung für 2,5 Stunden bei 37 °C und 5 % CO₂, geschützt vor Licht.
   3. Übertragen Sie 100 μL Supernatant dreifach auf eine 96-Well-Platte, einschließlich Kontrollen.
   4. Messung der Fluoreszenz bei 360/40 nm Anregung und 460/40 nm Emission.
   5. Normalisiere Fluoreszenzwerte an Kontrollpersonen, um die relative Stoffwechselaktivität zu bestimmen.

Results

Primäre Osteozyten wurden erfolgreich aus menschlichen Oberschenkelköpfen isoliert und waren etwa 5 Tage nach der Extraktion in Kultur nachweisbar. Die Zellen zeigten eine stellate Morphologie und bildeten miteinander verbundene Netzwerke, die für die Osteozytenmorphologie charakteristisch sind, was eine erfolgreiche Isolation, Anhaftung und Lebensfähigkeit bestätigte (Abbildung 5).

Discussion

Das vorgestellte Protokoll bietet eine zugängliche und translationale Methode zur Erzeugung von 3D-Knochenkonstrukten und adressiert wichtige Einschränkungen aktueller Ansätze wie die Abhängigkeit von teuren Bioprintern oder proprietären Matrizen¹³. Durch die Kombination von GelMA mit der humanen decellularisierten Knochenmatrix⁸ können physiologisch relevante Konstrukte ausschließlich mit Standardlaborausrüstung hergestellt werden. Diese E...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon (Irgacure 2959)	Sigma-Aldrich	410896-10G	Hydrogel-Polymerisationsphotoinitiator
AlamarBlue Zelllebensfähigkeitsreagenz	Invitrogen	DAL1100	Für quantitativen Lebensfähigkeitstest
Antibiotic-Antymycotic (100´)	Gibco	15240-062	Kulturmedium-Komponente
Zellkulturflasche (T75)	SPL Life Sciences	70075	Für Osteozytenkultur
Collagenase Typ 1	Gibco	17100-017	Zur enzymatischen Verdauung von Knochenproben
Konischer Zentrifugenröhrchen, 15 mL	SPL Life Sciences	50015	Zur Hydrogel-Zubereitung
DarkDawn D15-365 nm	DarkDawn	-	Für UV-Vernetzung von Hydrogel
DPBS, Pulver, ohne Calcium, ohne Magnesium	gibco	21600069	Hydrogel-Lösungsmittel, LIVE/DEAD-Kit-Lösungsmittel
EDTA Dinatriumsalz 2-HID	Winkler	ED-0760	Zur enzymatischen Verdauung von Knochenproben
Eppendorf Zentrifuge 5702	Eppendorf	5702000010	Zur Knochenmikropartikel-Zubereitung
Ethanol absolut für die Analyse	Supelco	1,00,98,32,511	Zur Knochendeszellularisierung (verdünnt auf 70%), Photoinitiator-Lösungsmittel
Fötales Rinderserum	Gibco	A52567-01	Kulturmedium-Komponente
Gelatine aus porciner Haut	Sigma-Aldrich	G1890-500G	Hydrogel-Komponente
HBSS (10´)	Gibco	14185-052	Zum Waschen von Knochenmarkproben
L-Ascorbinsäure-2-phosphat	Sigma-Aldrich	A8960-5G	Kulturmedium-Komponente
LIVE/DEAD Lebensfähigkeits-/Zytotoxizitäts-Kit	Invitrogen	L3224	Für qualitativen Lebensfähigkeits-/Zytotoxizitätstest
MEM Alpha (1´)	Gibco	12571-063	Kulturmedium-Komponente
Methacrylsäureanhydrid	Sigma-Aldrich	276685-500G	Hydrogel-Komponente
Mikrozentrifugenröhrchen	Citotest	4610-1844	Zur Zubereitung von alamarBlue und LIVE/DEAD-Farbstoffen
NuncIon delta surface	Thermoscientific	150628	12-Well-Platte für die Aussaat von Proben
OLYMPUS BX43 Fluoreszenzlichtquelle Olympus U- LH100HG	Evident	U- LH100HG	Fluoreszenzanalyselichtquelle
RC-6 Plus Zentrifuge	Thermo Scientific Sorvall	46910	Zur Knochendeszellularisierung und Knochenmikropartikel-Zubereitung
Synergy HTX Multimodus-Reader	BioTek Instruments	-	Spektrophotometer
Spritze mit Nadel	NIPRO	SY3-WN-R-03	Zur Hydrogel-Filtrierung
Gewebekulturplatte 96-Well	Jet Biofil	TCP001096	96-Well für alamarBlue-Lebensfähigkeitstest.
Ultraschallreiniger	VWE	97043-958	Zur Ultraschallbehandlung von Knochenproben