Methodenartikel

Ein kombinatorisches Mausmodell der zirkadianen Störung und Nahrungsstress zur Untersuchung der lebensstilbeschleunigten Alterungspathophysiologie

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DOI:

10.3791/70866

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28. April 2026

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1Department of Chinese Materia Medica, Chengde Medical University, 2School of Pharmacy, Hebei Medical University, 3State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory, 4College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hebei University of Chinese Medicine, 5The Second Clinical Medical College, Heilongjiang University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein Mausmodell eines gestörten zirkadianen Rhythmus sowie einer fettreichen, zuckerreichen (HFHS) Ernährung zu etablieren, die ungesunde Lebensweisen nachahmen und Stoffwechselstörungen sowie Alterserscheinungen hervorruft.

Zusammenfassung

Ziel dieses Protokolls ist es, ein standardisiertes Mausmodell zu etablieren, das die multifaktoriellen Schäden durch moderne, ungesunde Lebensweisen rekonzipikuliert. Zu diesem Zweck entwickelten wir ein neuartiges C57BL/6J-Modell, das randomisierte zirkadiane Rhythmusstörungen und eine fettreiche, zuckerreiche (HFHS) Diät kombiniert, wobei Einzelfaktor-HFHS- und zirkadiane Störungsgruppen als Kontrollgruppen fungieren. Im Vergleich zu den Kontrollgruppen zeigte das zusammengesetzte Modell schwerwiegendere Stoffwechselstörungen, darunter erhöhtes Körpergewicht, erhöhte Nüchternglukose- und Lipidwerte sowie ausgeprägte hepatische Steatose sowie offensichtliche kognitive und motorische Beeinträchtigungen. Das Kompositmodell zeigte zudem ein signifikanteres beschleunigtes Altern, was durch den Frailty-Index sowie die Färbung von Hämatoxylin und Eosin (HE) bestätigt wurde. Dieses integrierte Modell ahmt zuverlässig den lebensstilbedingten stoffwechsel-kognitiven Abbau und vorzeitiges Altern nach. Dieses schrittweise reproduzierbare Protokoll unterstützt mechanistische Studien zum lebensstilvermittelten Altern und die Bewertung gezielter therapeutischer Strategien.

Einleitung

Beschleunigte moderne Lebensstile setzen Bevölkerungen zunehmend rhythmusstörenden Verhaltensweisen und fettleibigen Diäten aus, wobei überzeugende Belege diese Faktoren mit systemischem funktionellen Abbau und chronischer Krankheitspathogenese in Verbindungbringen. 1. Epidemiologische Daten zeigen auffällige Komorbiditäten: Schichtarbeiter zeigen eine hohe Prävalenz von metabolischen Syndrommarkern, während die langfristige Aufnahme einer fett- und zuckerreichen Ernährung stark mit einem erhöhten Demenzrisikoassoziiert ist 2,3. Diese Beleidigungen konvergieren sich und treiben die Multiorganpathologie voran – metabolische Dysfunktion fällt häufig mit beschleunigtem kognitiven Abbau und kardiovaskulärer Remodellierung zusammen, was bidirektionale Übersprechen zwischen peripherer und zentraler Verschlechterung zeigt. Trotz anerkannter klinischer Synergien bleiben standardisierte präklinische Modelle, die die integrierte Pathophysiologie des durch den Lebensstil induzierten Organabbaus abbilden, unterentwickelt.

Auf molekularer Ebene löst eine chronische zirkadiane Fehlstellung eine pathologische Kaskade aus, die im suprachiasmatischen Kern entspringt, die glutamaterge Signalübertragung zum paraventrikulären Hypothalamus stört und die pulsatilität des corticotropinfreisetzenden Hormons abschwächt. Dies beeinträchtigt die Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenachse (HPA) negative Rückkopplung4, was zu einer Desensibilisierung der Glukokortikoidrezeptoren und einer anhaltenden Cortisolerhöhung führt. Die daraus resultierende Aktivierung der hepatischen Glukoneogenese und die Phosphorylierungssuppression des Insulinrezeptorsubstrats 1 im Skelettmuskel treiben gemeinsam die periphere Insulinresistenz an und schaffen so eine metabolische Grundlage für Hyperglykämie und Dyslipidämie 5,6. Gleichzeitig durchdringen gesättigte Fettsäuren aus der Nahrung die geschwächte Blut-Hirn-Schranke, indem sie die Endothel-Tight-Junction-Proteine 7,8 herunterregulieren und so die mikrogliale TLR4/NF-κB-Signalübertragung aktivieren. Dies löst TNF-α/IL-1β-vermittelte Neuroinflammation9 aus. Der entscheidende Punkt ist, dass diese beiden ungesunden Lebensstilfaktoren nicht unabhängig voneinander, sondern vielmehr synergetisch wirken. Allerdings gibt es in der aktuellen Literatur weiterhin einen erheblichen Mangel an systematischer Forschung zu ihrer kombinierten Exposition. Daher ist es sinnvoll, Modellierungsstudien durchzuführen, die Störungen des zirkadianen Rhythmus mit fett- und zuckerreichen Diäten als zusammengesetzte Faktoren integrieren.

Trotz ihres Nutzens bei der Untersuchung isolierter Alterungsmechanismen gelingt es den aktuellen Mausmodellen nicht, die integrierte Pathophysiologie der durch den Lebensstil induzierten Verfall wiederzubilden. Natürliche Alterung weist eine ausgeprägte interindividuelle Variabilität auf und erfordert verlängerte Zeitpläne, die mit experimenteller Effizienz unvereinbar sind. Pharmakologische Wirkstoffe wie Doxorubicin verursachen hauptsächlich DNA-Schäden und akute Alterung, ohne eine chronische Stoffwechseldysregulationzu replizieren. Gentechnisch modifizierte Modelle zielen auf einzelne molekulare Signalwege ab und übersehen dabei das systemische neuroendokrine metabolische Übersprechen11,12. Die Verabreichung von D-Galactose, die zwar oxidativen Stress auslöst, ahmt aber unzureichend die Auswirkungen zirkadianer Störungen auf die Glukokortikoid-Rhythmik oder die durch die Ernährung vermittelte lipidvermittelte Neuroinflammationnach 13. Entscheidend ist, dass Einzelfaktor-Interventionen keine synergistischen Muster des klinisch beobachteten Multiorganabbaus erfassen können. Diese translationale Lücke erfordert eine fortschrittliche kombinatorische Plattform, die gleichzeitig chronische zirkadiane Störungen und fettleibige Ernährungsstressoren einbezieht, um interdependente Neurodegeneration, Herzfunktionsstörungen und metabolische Beeinträchtigungen treu zu beschleunigen.

Um dieses Problem anzugehen, entwickelten wir ein C57BL/6J-Mausmodell, das stochastische zirkadiane Störung mit einer fett- und zuckerreichen Ernährung kombiniert, um synergetische zeitgenössische Lebensstil-Beleidigungen nachzubilden. Das Aussetzen von rotierenden Lichtplänen bei Mäusen in Kombination mit anhaltender obesogener Ernährung führte zu erheblich verstärkten Stoffwechselstörungen, darunter erhöhte Fettleibigkeit, Nüchternhyperglykämie und Dyslipidämie. Kognitive Untersuchungen zeigten ausgeprägte Defizite im räumlichen und Erkennungsgedächtnis, während Lokomotoriktests eine verminderte Ausdauer zeigten. Entscheidend ist, dass die longitudinale Quantifizierung des Gebrechlichkeitsindex eine beschleunigte Anhäufung altersbedingter Defizite zeigte. Unser Dual-Challenge-Paradigma rekapituliert somit die facettenreiche beschleunigte Alterung und bietet eine validierte, neuartige Plattform, um die lebensstilgetriebene Pathophysiologie zu untersuchen.

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Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden vom Ethikkomitee für Tierforschung des Hebei Yiling Pharmaceutical Research Institute genehmigt (Genehmigungsnummer: N2024043). Zweiunddreißig 8 Monate alte männliche C57BL/6J-Mäuse (siehe Materialtabelle) wurden in einer speziellen, pathogenfreien (SPF) Tieranlage untergebracht, die dem New Drug Evaluation Center, Hebei Yiling Pharmaceutical Research Institute, angeschlossen ist. Die Aufzuchtumgebung wurde unter standardisierten Bedingungen aufrechterhalten: Die Umgebungstemperatur lag zwischen 20 und 26 °C, die relative Luftfeuchtigkeit wurde bei 40 % bis 70 % kontrolliert, und ein 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus wurde eingeführt. Die Mäuse hatten freien Zugang zu einer standardmäßigen Laborernährung für Nagetiere und sterilisiertem Trinkwasser.

1. Etablierung eines kombinatorischen Mausmodells der zirkadianen Störung und Nahrungsstress (Abbildung 1)

HINWEIS: Tiere, die während des Experiments unerwartet starben, einen starken Gewichtsverlust zeigten oder das Modellierungsverfahren nicht abschlossen, wurden von der Endanalyse ausgeschlossen. Die anfängliche Anzahl der Tiere betrug 8 pro Gruppe, und die endgültige gültige Stichprobengröße betrug 5 pro Gruppe.

  1. Bereiten Sie vor dem Experiment eine fett- und zuckerreiche (HFHS) Ernährung vor dem Experiment vor, und einen unabhängigen Raum mit programmierbarem Timer für flexible Licht-Dunkel-Zyklusregelungen vorzubereiten.
    HINWEIS: Lagern Sie die Diät bei 4 °C oder -20 °C, um Oxidation zu verhindern; Bringen Sie es vor der Anwendung auf Raumtemperatur, um Kondensation zu vermeiden, die die Zusammensetzung beeinträchtigt.
  2. Tieradaption und zufällige Gruppierung
    1. Halten Sie alle acht Monate alten Mäuse unter Standardbedingungen für eine 7-tägige adaptive Fütterungsphase, bevor das Experiment beginnt.
    2. Nach der Anpassungsphase werden die Mäuse zufällig in vier Gruppen basierend auf dem Körpergewicht (n = 8 pro Gruppe) eingeteilt: Kontrollgruppe, Gruppengruppe für kombiniertes Stressmodell (Modell), HFHS-Gruppe und Stressgruppe für zirkadiane Rhythmusstörungen (CR).
  3. Führen Sie eine 8-monatige Intervention der HFHS-Diät in Kombination mit einer Störung des zirkadianen Rhythmus in der kombinierten Stressmodellgruppe durch. Füttere die HFHS-Gruppe für die gleiche Dauer ausschließlich mit einer HFHS-Diät.
  4. Setzen Sie die CR-Gruppe allein einer Störung des zirkadianen Rhythmus aus. Füttere die Kontrollgruppe während des gesamten Experiments mit einer standardmäßigen Erhaltungsdiät. Bieten Sie allen Tieren kostenlosen Zugang zu Trinkwasser an.
    HINWEIS: Die 8-monatige Intervention kann vorübergehend pausiert werden (z. B. für routinemäßige Gesundheitschecks bei Mäusen), ohne das experimentelle Ergebnis zu beeinträchtigen, und die Intervention kann nach Abschluss der Untersuchung fortgesetzt werden.
  5. Protokoll zur Störung des zirkadianen Rhythmus (Abbildung 2A,B)
    1. Verwenden Sie einen programmierbaren Timer (siehe Materialtabelle), um den wöchentlichen Hell-Dunkel-Zyklus flexibel zu steuern. Wenden Sie vier unterschiedliche Lichtregimes an: schnelles Licht-Dunkel-Schalten (Licht- und Dunkelwechsel alle 7 Minuten für 2 aufeinanderfolgende Stunden täglich), umgekehrter Hell-Dunkel-Zyklus (Licht aus um 8:00 Uhr und täglich um 20:00 Uhr), konstantes Licht (24-Stunden-Beleuchtung) und konstante Dunkelheit (24-Stunden-Dunkelheit).
    2. Generiere zu Beginn jeder Woche eine Zufallssequenz mit statistischer Software (R-Sprache, mit einem festen Zufalls-Seed). Weisen Sie die vier Lichtmodi zufällig jedem Wochentag zu, um sicherzustellen, dass jeder Modus 1–2 Tage nacheinander angewendet wird.
  6. Geben Sie den Mäusen ad libitum die HFHS-Diät und überwachen Sie die Nahrungsaufnahme wöchentlich. Die detaillierte Zusammensetzung der HFHS-Diät ist in Tabelle 1 dargestellt.
    HINWEIS: Eine Inspektion der Nahrungsmittelversorgung ist erforderlich, um Unterernährung oder Nahrungsentzug zu vermeiden.
  7. Wiegen Sie die Mäuse wöchentlich zu einem festen Zeitpunkt (donnerstags um 9:00 Uhr) mit einem elektronischen Saldo während der 8-monatigen Interventionsphase. Erfassen Sie alle Körpergewichtsdaten im Detail.
    HINWEIS: Führen Sie das Wiegen schnell durch (jede Sitzung in weniger als 30 Sekunden abgeschlossen), um Stress und Störungen des zirkadianen Rhythmus zu minimieren.

2. Neue Objekterkennung

  1. Stellen Sie die Mäuse an einem Tag vor dem Training in eine 60 cm × 60 cm × 40 cm große Testbox und lassen Sie sie 5 Minuten lang frei erkunden, um sich an die Testumgebung zu gewöhnen.
    HINWEIS: Entfernen Sie nach jedem Versuch Kot und Urin aus der Box. Wischen Sie die Verpackung mit 75 % Ethanol ab, um Rückstände zu entfernen.
  2. Platzieren Sie zwei identische Zylinder (A und B) in die unteren linken bzw. unten rechten Ecken der Testbox. Führe jede Maus von den Objekten weg in die Box und lasse die Maus 5 Minuten lang frei erkunden.
    1. Wechseln Sie zufällig die Links-Rechts-Position der beiden Zylinder zwischen den Probanden ab, um Positionsverzerrungen zu vermeiden.
    2. Nach dem 5-minütigen Explorationstraining wird das Experiment für bis zu 23 Stunden pausiert und der anschließende Schritt des neuartigen Objektersatzes (Schritt 2.3) innerhalb von 24 Stunden nach dem Training abgeschlossen, um die Validität des Erkennungstests sicherzustellen.
  3. Ersetzen Sie Objekt A in der unteren linken Ecke 24 Stunden nach dem Training durch einen neuen Würfel (Objekt C). Aktiviere die Deckenkamera. Setze die Maus in die Box und nimm das Verhalten für 5 Minuten auf.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein neues Objekt, das in der Größe den vertrauten Objekten ähnelt, sich aber deutlich in Material, Farbe oder Textur unterscheidet, damit die Maus seine Neuartigkeit erkennen kann.
  4. Analysieren Sie die Videos mit dem Video-Tracking-System (siehe Materialtabelle).
    1. Definieren Sie Erkundung als die Maus, die ihre Schnauze auf oder innerhalb von 2 cm an ein Objekt ausrichtet. Nehmen Sie die Zeit auf, die Sie mit der Erkundung des vertrauten Objekts (TB) und des neuen Objekts (TC) verbringen.
    2. Berechnen Sie einen Anerkennungsindex gemäß folgender Formel: Anerkennungsindex = TC / (TB + TC) × 100%.
      HINWEIS: Halte den Analytiker blind gegenüber den experimentellen Gruppen, um subjektive Verzerrungen zu vermeiden; Nicht-explorative Verhaltensweisen wie Klettern oder Nagen werden systematisch aus den Erkundungszeitaufzeichnungen ausgeschlossen.

3. Grifffestigkeitstest

  1. Missen Sie die Griffstärke der Vordergliedmaßen der Mäuse mit einem Griffkraftmessgerät14 (siehe Materialtabelle). Drehen Sie das Kraftmessgerät um 90 Grad vertikal und befestigen Sie es vor jeder Testsitzung sicher an einem Metallhalter, um die vollständige Immobilisierung des Systems sicherzustellen.
  2. Halte die Maus vorsichtig am Schwanzbasis. Lass die Vorderpfoten die Stange natürlich greifen. Stellen Sie das Messgerät nach der stabilen Messung auf null und ziehen Sie den Schwanz dann horizontal mit konstanter, langsamer Geschwindigkeit nach hinten, bis die Maus ihren Griff löst.
  3. Zeichnen Sie die maximale Spitzenkraft (kgf) zum Zeitpunkt des Lösens als Griffstärke auf. Führe drei aufeinanderfolgende Studien pro Maus und Tag durch. Verwenden Sie den Durchschnitt von drei Messungen für die spätere Analyse.
    HINWEIS: Halten Sie die Zuggeschwindigkeit gleichmäßig und ausreichend langsam, damit die Maus den vollen Widerstand gegen den Zug erzeugen kann.
  4. Kein Versuch wird von der Analyse ausgeschlossen, wenn eines der folgenden Punkte eintritt: Die Maus benutzt nur eine Vorderpfote, die Hintergliedmaßen berühren die Stange oder tragen zum Grip bei, die Maus dreht ihren Körper beim Ziehen oder die Stange wird ohne aktiven Widerstand losgeworfen.
    HINWEIS: Markieren Sie mehrdeutige oder Ausreißer-Studien zur Überprüfung. Wiederholen Sie die Messungen, wenn nötig.

4. Gebrechlichkeitsindex (FI)

HINWEIS: Kalibrieren Sie alle Geräteparameter vor dem Test auf standardisierte Einstellungen. Begrenzen Sie die gesamte Beurteilungszeit für jede Maus auf unter 30 Minuten, um durch Ermüdung verursachte phänotypische Veränderungen zu vermeiden. Führen Sie alle Tests innerhalb eines festen Morgenzeitfensters (9:00–12:00 Uhr) durch, um die Auswirkungen des zirkadianen Rhythmus zu minimieren.

  1. Fasten Sie die Mäuse 12 Stunden lang mit freiem Zugang zu Wasser vor dem Test, um die akuten Auswirkungen der Nahrungsaufnahme auf physiologische Messungen zu minimieren.
  2. Bringen Sie die Mäuse 30 Minuten vor der Bewertung in die Testumgebung, um sie zu gewöhnen und stressbedingte Störungen zu reduzieren.
  3. Ausschließen Sie Mäuse mit schweren pathologischen Erkrankungen wie Tumoren, Infektionen oder Gliedmaßendeformitäten, um störende Effekte bei der Beurteilung der Gebrechlichkeit zu vermeiden.
  4. Bewerten Sie den Gebrechlichkeitsindex anhand von 31 phänotypischen Defizitindikatoren in fünf Bereichen: motorische Funktion, Ernährungsstatus, sensorische Funktion, spontane Aktivität und Verhalten sowie physiologische Defekte15,16.
    HINWEIS: Die spezifischen 31 Bewertungspunkte decken fünf Bereiche ab, darunter: motorische Funktion (7 Punkte wie verminderte Griffkraft, abnormaler Gang und verminderte Kletterfähigkeit), Ernährungsstatus (6 Punkte wie Gewichtsverlust, niedrigerer Körperzustand und verringerte Nahrungsaufnahme), sensorische Funktion (5 Punkte wie Sehbehinderung, Hörbeeinträchtigung und taktile Dumpfheit), spontane Aktivität und Verhalten (7 Punkte wie verminderte spontane Aktivität, verringertes Pflegeverhalten und weniger exploratives Verhalten), sowie physiologische Defekte (6 Punkte wie Augendefekte, Ohrendefekte und Hautdefekte). Alle Punkte verwenden eine binäre Bewertungsmethode (0 = kein Defekt, 1 = mit Fehler) und der endgültige Zerbrechlichkeitsindex = Gesamtzahl der fehlerhaften Artikel / 31.
  5. Weisen Sie zwei Forscher, die für die experimentellen Gruppen blind sind, zu, um alle Bewertungen unabhängig voneinander durchzuführen.
  6. Bewerten Sie jeden Indikator mit 0 (kein Defizit) oder 1 (Defizit) gemäß vordefinierten Kriterien, die Griffkraft, Ganggeschwindigkeit, Körpergewichtsveränderung, Fellzustand, sensorische Reaktion, spontane Aktivitätskapazität und körperliche Auffälligkeiten abdecken.

5. Nüchternblutzuckernachweis

HINWEIS: Schnelle Mäuse für 12 Stunden mit freiem Zugang zu Wasser, um akute Futterbedingte Auswirkungen auf den Blutzucker zu minimieren. Führen Sie Messungen zwischen 9:00 Uhr und 12:00 Uhr durch, um zirkadiane Schwankungen zu reduzieren. Kalibrieren Sie das Glukosemessgerät mit einer Standard-Glukoselösung vor dem Experiment zur Konsistenz zwischen den Chargen.

  1. Die Mäuse vorsichtig festhalten, die Schwanzspitzen mit 75 % Ethanol desinfizieren. Machen Sie einen 1–2 mm großen Schnitt in den Schwanzvenen mit einer sterilen Einweglanzette. Werfen Sie den ersten Bluttropfen weg, um eine Gewebe- und Flüssigkeitskontamination zu vermeiden.
  2. Nehmen Sie ein kleines Volumen Kapillarblut ab und analysieren Sie es sofort mit einem tragbaren Blutzuckermesser (siehe Materialtabelle) mit kompatiblen Teststreifen. Teste jede Probe doppelt, um die Datengenauigkeit sicherzustellen.

6. Der Nachweis des Blutfettspiegels beinhaltete das Gesamtcholesterin (TC)

HINWEIS: Proben mit schwerer Hämolyse oder Trübung werden von der Analyse ausgeschlossen. Wiederholte Messungen mit einem Variationskoeffizienten > 10 % bei den Dreifachen.

  1. Lege das gesammelte Blut in nicht-antikoagulanziende Röhren. Lass bei Raumtemperatur 2 Stunden natürlich gerinnen. Zentrifugiere Proben bei 1000 × g für 15 Minuten bei 4 °C, um das Serum zu trennen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge vor dem Betrieb richtig ausbalanciert ist, und schließen Sie den Sicherheitsdeckel sicher.
  2. Aspiriere vorsichtig die obere Serumschicht, aliquotiere sie und lagere sie sofort bei -80 °C, um Lipidoxidation zu verhindern.
    HINWEIS: Nach der Serum-Aliquotierung und Lagerung bei -80 °C kann das Experiment für mehrere Tage bis Wochen pausiert werden; Die anschließende Erfassung des Gesamtcholesterins (Schritt 6.3) kann durchgeführt werden, wenn das Testkit und die Geräte bereit sind, wobei sichergestellt wird, dass das Serum nicht wiederholt eingefroren und aufgetaut wird.
  3. Missen Sie den Gesamtcholesterinspiegel des Serums mit einem kommerziellen Greiss-TC-Testkit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Prüfe jede Probe im Dreifachformat und führe Standardreferenzproben gleichzeitig zur Kalibrierung durch.

7. Hämatoxylin-eosin-Färbung (HE-Färbung)

  1. Betäuben Mäuse mit Natriumpentobarbital (20 mg/kg) nach Verhaltenstests.
  2. Blut über den retro-orbitalen venösen Plexus abnehmen. Seziere Gewebe und fixiere 4 % Paraformaldehyd für 48 Stunden ein.
    HINWEIS: Nach Gewebefixierung in 4 % Paraformaldehyd für 48 Stunden kann das Experiment pausiert werden; Fixiertes Gewebe kann bis zu einer Woche in 4 % Paraformaldehyd bei 4 °C gelagert werden, bevor mit dem Dehydrationsschritt (Schritt 7.3) übergegangen wird.
  3. Dehydrierte Gewebe fixierte mit einem automatisierten Prozessor unter Verwendung einer gradierten Ethanolserie (60 %, 70 %, 90 % Ethanol für 1 Stunde pro Stück; 95 %, 100 % Ethanol für jeweils 2 Stunden).
    VORSICHT: Ethanol ist eine brennbare Flüssigkeit mit einem niedrigen Flammpunkt. Halten Sie sich während der Lagerung und Nutzung von offenen Flammen, Wärmequellen und Funken fern. Verwenden Sie sie in einem gut belüfteten Bereich, tragen Sie nicht statische Handschuhe und einen Laborkittel. Vermeiden Sie großvolumige Lagerung im Versuchsbereich; Lagern Sie sie in einem speziellen brennbaren Flüssigkeitsschrank.
  4. Reinigen Sie dehydriertes Gewebe in Xylol für 2 Stunden, dann mit Paraffin bei 60 °C für 3 Stunden infiltrieren (siehe Materialtabelle). Gewebe einbetten, die auf Standard-Anatomieebenen ausgerichtet sind.
    HINWEIS: Die Entfernungszeit sollte nicht übermäßig lang sein, um Gewebespröde zu vermeiden; während der Infiltration eine konstante Paraffintemperatur aufrechterhalten, um Kristallisation zu verhindern. Nach der Paraffineinbettung können die eingebetteten Gewebeblöcke mehrere Monate bei Raumtemperatur gelagert werden, und der Schnittschritt (Schritt 7.5) kann bei Bedarf durchgeführt werden.
  5. Sobald die Paraffinblöcke vollständig erstarrt sind, schneiden Sie 4 μm kontinuierliche Schnitte mit einem Paraffinschneider (siehe Materialtabelle), übertragen auf poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger, trocknen Sie bei Raumtemperatur an der Luft und versiegeln Sie dann für die Lagerung.
    HINWEIS: Nach dem Montagen und Lufttrocknen können die Objektträger bis zu einem Monat bei Raumtemperatur in staubfreier Umgebung gelagert werden, bevor sie mit dem Färbeschritt (Schritt 7.6) übergehen.
  6. Beize Schnitte mit einem automatischen Beizsystem (siehe Materialtabelle).
    1. Deparaffinisieren in Xylol I und Xylol II (jeweils 10 Minuten).
    2. Rehydrieren Sie in einer absteigenden Ethanolserie (100 %, 95 %, 80 %, jeweils 2 Minuten) und spülen Sie dann mit destilliertem Wasser.
    3. Färben Sie 3–8 Minuten mit Hämatoxylin, bis die Kerne deutlich sichtbar sind, spülen Sie unter fließendem Wasser zur Förderung des Bläuens und Gegenfärben mit Eosin für 1–3 Minuten, um eine ausreichende zytoplasmatische rosa Färbung zu erreichen.
  7. Dehydrieren Sie gefärbte Schnitte in absolutem Alkohol, klar mit Xylol und montieren Sie sie mit neutralem Balsam für die Analyse des Objektträgers (siehe Materialtabelle).

8. Ölrot-O-Färbung

  1. Frisches Lebergewebe innerhalb von 30 Minuten nach der Entnahme in eine optimale Schneidetemperatur (OTC) (siehe Materialtabelle) einbetten.
    HINWEIS: Nach dem Einbetten frischer Lebergewebe in eine rezeptfreie Verbindung können die eingebetteten Gewebe bis zu einem Monat bei -80 °C gelagert werden, bevor sie geschnitten werden (Schritt 8.3), wodurch wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermieden wird.
  2. Lege eingebettete Gewebe in einen Kryostat und lass sie vor der Sektionierung vollständig einfrieren.
  3. Stellen Sie die Kryostattemperatur auf -22 °C ein und schneiden Sie vollständig gefrorene Gewebeblöcke in aufeinanderfolgende 8 μm dicke Abschnitte.
  4. Teile direkt auf unbeschichtete Glasschlitze übertragen und vorsichtig abflachen, um eine enge Haftung zwischen Sektionen und Verschlüssen sicherzustellen.
  5. Befestige die Folien mit neutralem Formalin bei Zimmertemperatur für 10 Minuten. Unmittelbar nach der Fixierung spülen Sie Schnitte 5 Sekunden lang mit 60% Isopropanol ab.
  6. Lege vorbehandelte Abschnitte in eine Feuchtigkeitskammer, gib eine Oil Red O-Färbungslösung hinzu (siehe Materialtabelle) und inkubiere sie 20 Minuten.
  7. Nach der Färbung werden Schnitte mit 60 % Isopropanol differenziert, bis die Grenzen des Lipidtröpfchens und des Zwischengewebes klar erkennbar sind.
    HINWEIS: Beobachten Sie die Schnitte während der Differenzierung genau, um eine Überdifferenzierung zu vermeiden, die zu verblassten Verfärbungen führt.
  8. Untersuchen Sie differenzierte gefärbte Schnitte unter einem Lichtmikroskop, um histopathologische Veränderungen im Zusammenhang mit der hepatischen Lipidablagerung zu beobachten.
    HINWEIS: Nach der Färbung und Differenzierung können Schnitte bis zu 3 Tage bei 4 °C vor der mikroskopischen Untersuchung aufbewahrt werden, um sicherzustellen, dass der Färbungseffekt nicht beeinträchtigt wird.

9. Statistische Analyse

  1. Drücken Sie alle experimentellen Daten als Mittelwert ±± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus
  2. Wenden Sie den Shapiro-Wilk-Test an, um zu überprüfen, ob die Daten einer Normalverteilung entsprechen. Führen Sie den Levene-Test durch, um die Homogenität der Varianz zwischen den Gruppen zu bewerten, falls die Normalität bestätigt ist.
    HINWEIS: Wenden Sie nichtparametrische Tests direkt an, wenn die Daten nicht der Normalitätsannahme entsprechen.
  3. Verwenden Sie eine Einweg-Varianzanalyse (ANOVA), um die statistische Signifikanz der Gesamtunterschiede zwischen mehreren Gruppen zu testen, und führen paarweise Vergleiche mit dem Fisher-Test für die wenigsten signifikante Differenz (LSD) durch.
    HINWEIS: Verwenden Sie stattdessen Welch ANOVA, wenn die Varianzen heterogen sind.
  4. Verwenden Sie einen zweiseitigen Student's t-Test für Vergleiche zwischen zwei unabhängigen Stichprobengruppen.
  5. Definiere statistische Signifikanz als einen zweiseitigen p-Wert < 0,05. Führen Sie alle statistischen Analysen mit einer Analysesoftware durch.

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Ergebnisse

Synergistische Verschlechterung der metabolischen Pathologie in Dual-Expositions-Kohorten
Die longitudinale Körpergewichtsüberwachung zeigte unterschiedliche Wachstumspfade zwischen den Kohorten. Die Modellgruppe und die HFHS-Gruppe zeigten eine beschleunigte Gewichtszunahme im Vergleich zu Kontroll- und CR-Gruppen. Bemerkenswert ist, dass die CR-Gruppe eine moderate Beschleunigung im Vergleich zur Kontrolle zeigte (Abbildung 3A). Weitere...

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Diskussion

Zeitgenössische Forschungen haben eindeutig bestätigt, dass zirkadiane Störungen und eine fettreiche, zuckerreiche Ernährung zwei unabhängige Faktoren für den systemischen funktionellen Rückgang des Organismus sind. Unsere Daten zeigen, dass der pathologische Schaden, der durch die kombinierte Wirkung dieser beiden Faktoren verursacht wird, weitaus schwerwiegender ist als der einfache additive Effekt eines der beiden Faktoren allein. Im Vergleich zu den Einzelfaktor-Interventionsgruppen ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Science and Technology Program Project von Hebei (246W2501D, 252W7716D), DEM S&T-Programm von Hebei (24462501D) und der Yanzhao Golden Platform (A20240022) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ANY-mazeScienceSA225
Accu-Chek Active BlutzuckermessgerätSchweiz, Roche Diagnosticsaccu check active
C75BL/6J MäuseBEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTDNo.110324241101250228
KraftmessgerätUSA, Columbus Instruments1027CSM-E54
Hochfett- und hochsucrosehaltige DiätChina, Xietong Biotechnology Co., Ltd.XT303
HistoCore MULTICUT - Halbautomatisches RotationsmikrotomDeutschland, LeicaRM2245
Oil Red O LösungChina, Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1260
Optimale Schneidtemperatur-VerbindungJapan, Sakura4583
Programmierbare Timer-BuchseChina, GONEOGND-1
Tissue Tech Prisma PlusJapan, Sakura20B2X00014000034
Tissue-Tek TEC 6 EinbettungsmodulJapan, SakuraM01-021E-02
Total Cholesterol (TC) Assay KitChina, Suzhou Grace Biotechnology Co., Ltd.G0909W

Referenzen

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