Methodenartikel

Ein standardisiertes ex vivo porcines oromukosales Modell zur Bewertung von Peptidflüssen

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DOI:

10.3791/70935

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9. Juni 2026

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1UCD School of Veterinary Medicine and UCD Conway Institute, University College Dublin, 2UCD School of Mechanical and Materials Engineering, University College Dublin

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Screening-Plattform, die frisch isolierte Schleimhaut aus dem buccalen Epithelgewebe von Schweinen verwendet, um die Peptiddurchdringung zu bewerten. Die Methode integriert die Permeation eines GLP-1RA in Anwesenheit eines Permeationsverstärkers aus Lösungen, Hilltop-Kammern und Filmen in Franz-Diffusionszellen sowie 3D-gedruckte Einsätze, begleitet von histologischer schleimhautbeurteilung.

Zusammenfassung

Die oromukosale Verabreichung von Medikamenten in Filmen, Tabletten, Lutschtabletten und anderen Dosierungsformen bietet einen bequemen systemischen Behandlungsweg für pädiatrische und ältere Patienten sowie für Patienten, die Kapseln oder Tabletten nicht leicht schlucken können. Die Entwicklung buckaler und sublingualer Peptidformulierungen erfordert präklinische Modelle, die mit den nicht-keratinisierten oromukosalen Epithelstrukturen des Menschen übereinstimmen, von denen Schweine und Hunde am geeignetsten sind. Wir bezogen frische, weggeworfene Schweineoromukosale Gewebe aus einem Schlachthof. Die Schleimhäute wurden von der darunterliegenden glatten Muskulatur mit kontrollierter Erhitzung seziert und dann entweder in Franz-Diffusionszellen oder in neuartigen, niedrigvolumigen 3D-gedruckten, harzgehärteten Einsätzen montiert. Peptid-Permeations-Enhancer-Kombinationen wurden auf der Spenderseite hinzugefügt, und permeierte Moleküle wurden von der Empfängerseite entnommen und durch ultra-leistungsstarke Flüssigkeitschromatographie (uHPLC) quantifiziert. Für die Einsätze wurden die transepithelialen elektrischen Widerstandswerte (TEER) der montierten Schleimhäute mit EVOM-Essstäbchen-Elektroden gemessen. Die Gewebehistologie wurde nach der Inkubation sowohl in Franz-Diffusionszellen als auch in 3D-Einsätzen untersucht. Die optimale Konzentration des Permeationsverstärkers wurde ausgewählt, wenn wässrige Mischungen aus Peptid und Verstärker zu einer Zunahme der Permeation führten. Die Peptidpermeation erreichte 4,3 % über 3 Stunden in dreidimensionalen (3D) Einsätzen und 1,7 % in Hilltop-Kammermodellen, wobei letztere die direkte Belichtung aus einem buckalen Film simuliert. Schichtweise polymere mukoadhäsive Filme mit Peptid-Verstärker-Kombinationen wurden entwickelt und auf das schleimhautige Gewebe für Permeationsstudien mit Diffusionskammern aufgetragen. Die Ex-vivo Peptidpermeation über die buckale Schleimhaut des Schweins erreichte 2 %, als die Schleimhäute der optimalen Kombination von Glycodeoxycholat (GDC) in die buccalen Filme ausgesetzt waren. Diese ex-vivo-Screening-Studien bieten einen Weg zur anschließenden pharmakokinetischen Bewertung peptidgeladener Filmformulierungen, die über den oromukosalen Weg bei Schweinen und Menschen verabreicht werden.

Einleitung

Buccale und sublinguale Oromucosae sind attraktive Wege der oralen Medikamentenverabreichung, da sie direkt zugängliche Stellen bieten und den Leber-First-Pass-Stoffwechsel vermeiden, was die Bioverfügbarkeit und Patientenakzeptanz im Vergleich zu anderen Wegen, einschließlich oraler 1,2, verbessern kann. Peptide werden in der Regel durch Injektion statt oraler Verabreichung verabreicht, da die Darmepithel schlecht durchdringt, was auf ihr höheres Molekulargewicht, Hydrophilität und Anfälligkeit für enzymatische Zersetzungzurückzuführen ist. Die FDA hat 102 Peptide für therapeutische Anwendungen zugelassen, wobei ~450 therapeutische Peptide in präklinischen oder klinischen Studien geprüft werden4. Dazu gehören orale Tabletten, die mit Permeationsverstärkern (z. B. Semaglutid, Rybelsus)5 und oromukosale Plattformen (Minirin Melt und Nocdurna sublinguales Desmopressinacetat) entwickelt wurden, die mit Catalents Zydis orally disintegral-Tablet (ODT) Technologie6 entwickelt wurden. Trotz umfangreicher Untersuchungen zu Studien zur Permeabilität von Bukkalen Medikamenten zeigen die Permeabilitätswerte von Molekülen eine schlechte Reproduzierbarkeit und eine begrenzte Vergleichbarkeit in denStudien 7,8. Diese Inkonsistenzen resultieren größtenteils aus Unterschieden in den verwendeten experimentellen Tiermodellen und aus Unterschieden im Umgang mit und in der Herstellung isolierter Mundschleimhaut9.

Ex-vivo-Permeabilitätstests mit isolierten buccalen und sublingualen Gewebeschleimhäuten sind ein wertvolles Werkzeug zur Vorhersage der in vivo oromukosalen kleinen Molekülpermeabilität und zur präklinischen Überprüfung von Formulierungskomponenten, die für Dosierungsformen relevant sind 10,11,12; Ihre Verwendung beim Peptidscreening ist jedoch eingeschränkt, da die Basaldurchlässigkeit vernachlässigbar ist. In den letzten Jahren ist die Schweine-Mundschleimhaut zum bevorzugten Modell geworden, da ihre nicht-keratinisierte Struktur sowie ihre physiologischen und biochemischen Eigenschaften denen des Menschen sehr ähneln. Mundproben von Hunden sind noch weniger zugänglich als Schweinegewebe aus Schlachthöfen, obwohl beide Quellen nicht keratinisiertsind. Es besteht weiterhin erhebliche Variabilität in der Epitheldicke und den Verarbeitungsmethoden. Die Standardisierung der buckalen und sublingualen oromukosalen Präparation ist unerlässlich. Variablen wie kurz- und langfristige Speicherbedingungen, Gewebedicke und die Erhaltung der Lebensfähigkeit während der Experimente beeinflussen alle die Ex-vivo-Permeabilitätsergebnisse 8. Die Gewebeerhaltung ist entscheidend, da sowohl die strukturelle Integrität als auch die metabolische Aktivität der Schleimhaut direkt die Diffusionsprofilebeeinflussen 12,15. Der Verlust der Barrierefunktion kann zu künstlich erhöhten Arzneimitteldurchdringungsraten führen. Über die Lagerung hinaus bringt die Methode zur Zerlegung von buckalen Schleimhäuten für die Montage in Permeationskammern weitere Variabilität. Unterschiede bei der Entfernung submukosales Bindegewebes, sei es mechanisch, chemisch oder thermisch, können die Permeabilitätverändern 18. Obwohl einige Berichte nahelegen, dass die Wärmetrennung zur Isolierung des Epithels von glatten Muskeln die Permeabilität19 bewahrt, herrscht ein Konsens. Derzeit existiert keine allgemein anerkannte Methode, um isolierte buckale Schleimhaut20 zu sezieren und die Integrität zu bewerten. Das markierte hydrophile Zuckerfluorescein Isothiocyanat-Dextran (FITC dextran 4000, FD-4) wird häufig als Integritätsmarker für die buckale Schleimhaut des Schweins verwendet, da nur kleine Moleküle unter ~500 Da passiv in das Gewebe eindringen können. Im Gegensatz dazu schränkt eine intakte Schleimhaut den FD-4-Transport ein, und ein Spender-zu-Empfänger-Transfer unter 0,6 % gilt typischerweise über 2–4 Stunden21,22 als akzeptabel. Zusätzlich liefert die Hämatoxylin- und Eosin-Gewebefärbung eine einfache Einschätzung der epithelialen Morphologie23.

In dieser Arbeit etablierten wir ein standardisiertes Protokoll für die schleimhäutige Handhabung isolierter buckaler Schleichschleimhaut, das darauf ausgelegt ist, die Integrität und Permeabilität der Schleimhaut über einen bestimmten Zeitraum zu optimieren. Unsere Ziele waren es, einen experimentellen Rahmen zur Zerlegung des Schweine-Bukkalepithelgewebes bereitzustellen und die Zuverlässigkeit der ex vivo Permeabilitätsbewertungen von Peptiden in Oromukosae, die in Diffusionskammern und Einsätzen montiert sind, zu verbessern. Zunächst führten wir visuelle Analysen durch, um die beschädigte buckale Schleimhaut aus dem Schlachthaus zu identifizieren. Wir optimierten Gewebeverarbeitungstechniken, die Schleimhautstärke und Methoden zur Aufrechterhaltung der Gewebeintegrität während der Experimente. Mit einem stabilen, niedrigpotenten Glukagon-ähnlichen Peptid-1-Rezeptoragonisten (GLP-1 RA)-Analogon als Werkzeugmolekül führten wir Peptidpermeationsstudien in Anwesenheit und Abwesenheit eines Gallensalzpermeationsverstärkers, Natriumglycodeoxycholat (GDC), an buckalen Schleimhäuten durch, die in Franz-Diffusionszellen montiert wurden, sowie an selbstgemachten 3D-gedruckten Transwell-Einsätzen. GDC und die GLP-1 RA wurden buccalen Schleimhäuten aus Lösungen, Hilltop-Kammern und mukoadhäsiven polymeren Doppelschichtschichten vorgestellt. Wir verwendeten Permeabilitätsmarker, Gewebehistologie und transepitheliale/endotheliale elektrische Widerstandswerte (TEER) als primäre Bewertungspunkte.

Protokoll

Die in dieser Studie verwendeten Schweinebäckchen wurden aus einem örtlichen Schlachthaus gesammelt; daher war keine ethische Zustimmung erforderlich.

1. Isolierung, Präparation und Lagerung des buckalen Epithels des Schweins

  1. Sammeln Sie Schweinewangengewebe aus einem örtlichen Schlachthof und transportieren Sie es innerhalb von 90 Minuten in eiskalten Phosphatpuffersalzlösung (PBS, pH 7,4) ins Labor. Innerhalb der nächsten 60 Minuten bereiten Sie das Gewebe gemäß der zuvor beschriebenenMethodik 19,24 vor, mit geringfügigen Änderungen für verschiedene Oromucosae-Stellen, wie in Abbildung 1 dargestellt.
  2. Trennen Sie mit einem Skalpell die buckale Schleimhaut vom darunterliegenden Gewebe und spülen Sie das Gewebe dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entsorge die Schleimhaute mit sichtbaren Flächenschäden.
  3. Intakte Schleimhaut in PBS bei 65 °C für 3 Minuten eintauchen und das Epithel sowie das verbleibende darunterliegende Bindegewebe mit einer Uhrmacherzange Größe 5 von glattem Muskelgewebe trennen. Diese Methode ist auch zur Isolierung sublingualer und zungenepitihelialer Schleimhaut anwendbar.
  4. Trocknen Sie die dissektionierten Oromucosae vorsichtig auf Zellulosefilterpapier und beginnen Sie mit Permeationsuntersuchungen (die bevorzugte Option) oder frieren Sie maximal 4 Wochen ein.
  5. Für den Einfrierprozess nach der Trennung wird Oromucosae für 2 Stunden in ein Kryoprotektionsmittel mit 85 % Glycerol25 unter sanftem Schütteln eingetaucht. Hochviskoses Glycerol ersetzt das interzelluläre Wasser, um die Bildung von Wasserkristallen zu verhindern, die die Gewebestruktur schädigen könnten.
  6. Nach dieser Zeit ersetzen Sie Glycerol durch frisches PBS und 10 % Glycerol. Kühlen Sie die Schleimhäutproben je nach Lagerdauer bei -20 °C oder -70 °C ein. Führen Sie das Einfrierverfahren mit einer kontrollierten Geschwindigkeit von ~-1 °C·min-1 durch.
    HINWEIS: Alle Experimente werden mit mindestens drei Gewebeproben von den Wangen verschiedener Tiere durchgeführt.

2. Ex-vivo-Permeationsstudie in Schleimhäuten, montiert in Franz-Diffusionszellen, und Einsatz von Hilltop-Kammern zur Präsentation von GLP-1 RA und GDC

HINWEIS: Ex-vivo-Permeabilitätsstudien werden zunächst an frisch isolierten Schweineschleimhäuten mit Franz-Diffusionszellen (FDC) durchgeführt.

  1. Bringen Sie die dissektionierte Gewebeschleimhaut in Kammern (Fensterfläche 1,2 cm2) in Abbildung 2 an und gleichen Sie sich 30 Minuten mit PBS, pH 6,8 (Spenderseite, 1 mL Volumen) und PBS, pH 7,4 (Empfängerseite, 10 mL Volumen) aus.
  2. Nach 30 Minuten Gleichgewicht wird die Spenderlösung PBS (pH 6,8) durch 1 ml PBS ersetzt, das ein Verhältnis von 1:1 zwischen GLP-1RA (25 mg/mL) und GDC (25 mg/ml) enthält.
  3. Rühren Sie weiter in der Empfängerkammer mit 10 ml PBS pH 7,4, gehalten bei 37 °C bei 300 U/min. Probe alle 60 Minuten 1 ml aus dem Empfängerfach für 180 Minuten. Nehmen Sie zu Beginn und am Ende des Experiments dreifache Proben aus Spender-Kompartimenten. Nach jeder Probenahme werden die Kammern mit 1 ml PBS aufgefüllt.
  4. Am Ende des Experiments wird das Gewebe in 10 % Formalin für die Histologie gelagert oder homogenisiert, um das verbleibende GLP-1RA-Peptid im Gewebe zu quantifizieren.
  5. Ebenso wird die Permeabilität des GLP-1RA mit Hilltop-Kammern (HTC) durchgeführt.
    HINWEIS: Der Zweck der Verwendung von HTC ist es, die oromukosale Permeationsverstärkende Wirkung von GDC auf die GLP-1 RA in Lösung zu bestätigen, bevor ein doppelschichtiger buckaler Film formuliert wird. Die HTC ist eine Kammer, die aus Kraton G-2705 besteht, einem biokompatiblen Styrol-Ethylen-Butylen-Styrol (SEBS) Blockkopolymer mit einem Außendurchmesser von 19 mm, und enthält ein Webril-Pad (12,7 mm Durchmesser), das zu 100 % aus nicht gewebten Baumwollfasern besteht und als saugfähiges Antihaftmaterial für die Lösung26 dient.
  6. Ebenso sollte die ex vivo Permeabilität von GLP-1RA und GDC (1:1-Verhältnis) in mukoadhäsiven Doppelschichtschichten bewertet werden, indem die Filme in Spenderkammern von FDCs oder in 3D-Einsätzen platziert werden, wie für HTC beschrieben.
  7. Um die Integrität des porcinen buccalen Epithelgewebes zu bestätigen, verwenden Sie FD-4 (0,05 mM) als fluoreszierenden Flussmarker und fügen Sie es auf die Spenderseite hinzu, um die Leckage im Gewebe zu beurteilen.
    HINWEIS: Gewebe mit Leck sind bei Permeabilitätsberechnungen ausgeschlossen.
  8. Nach dem 3-Stunden-Experiment quantifizieren Sie den kumulativen GLP-1-RA-Fluss durch uHPLC-Analyse der aus dem basolateralen Kompartiment entnommenen 200-μL-Proben in dreifacher Form. Wiederhole alle Permeationsexperimente dreimal. Quantifizieren Sie den kumulativen Fluss von GLP-1RA anhand einer Kalibrierungskurve, die aus festgelegten GLP-1RA-Konzentrationen generiert wird.

3. Herstellung von buckalen Filmen, die mit GLP-1RA und GDC eingeschlossen sind

HINWEIS: Bukkale Doppelschichtschichten, die eine Mukoklebstoff- und Rücklagenschicht enthalten, werden mit Lösungsmittelguss und halbautomatischem Coater27 hergestellt.

  1. Bereiten Sie einen Doppelschichtfilm vor, um GLP-1RA einzuschließen, wobei HPMC und PVP-K90 als filmbildende Polymere verwendet werden, sowie eine mukoadhäsive Komponente, Na-CMC.
    HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung der mukoklesierenden und hinterliegenden Schicht des Wangenfilms. GDC wird mit einem GLP-1-RA-Peptid in Modellfilmen in niedrigen mg-Mengen eingesetzt, um seine Wirkung auf die Peptiddurchdringung über in Kammern montierte Schleimhäute des schweineschen Mundhäutes zu untersuchen.
  2. Bereiten Sie die Schleimklebschicht vor, indem Sie die filmbildenden Polymere – 45 mg HPMC, 10 mg Na-CMC und 25 mg PVP-K90 – in deionisiertem Wasser mit 3 % Glycerol bei 400 U/min für 10 Minuten mit einem magnetischen Heizplattenrührer auflösen.
    HINWEIS: HPMC ist bei Raumtemperatur löslich, während PVP-K90 bei 40 °C für 30 Minuten erhitzt werden muss, um sich aufzulösen.
  3. Fügen Sie beim Rühren 2 mg Aerosil 200 F hinzu, gefolgt von der Zugabe des GLP-1 RA. Dann gib GDC hinzu und verteilt es bei 600 U/min für 30 Minuten.
  4. Ultraschallen Sie die endgültige Polymerlösung 90 Minuten lang mit einem Ultraschallbad zur Entfernung von Blasen.
  5. Folien auf einen Polyethylenterephthalat (PET)-Liner gegossen und mit einer Doktorklinge auf 2600 μm bei 2 mm/s beschichtet. Trocknen Sie die Filme in einem Heißluftofen bei 40 °C für ~1 Stunde.
  6. Für die Rücklageschicht lösen Sie 5 % Ethylcellulose (EC) und 5 % Propylenglycerol (PG) in hydroalkoholischem Wasser (Ethanol: Wasser) und gießen Sie die gelöste Suspension auf eine PET-Beschichtung. Zum Schluss schneiden Sie die getrockneten Filme in 1 cm × 1 cm große Quadrate, packen Sie sie in Aluminiumbeutel und lagern Sie sie bei 4 °C.

4. Drucken eines individuellen 3D-Transwell-nachahmenden Inserts

HINWEIS: Die 3D-gedruckten maßgefertigten Einsätze werden nach einer zuvor beschriebenen Methode mit geringfügigen Änderungen28 gefertigt.

  1. Kurz gesagt: Entwerfen Sie das 3D-Modell mit computerunterstützter Designsoftware (CAD).
  2. Halten Sie die Maße des 3D-Einsatzes gleich mit dem Haupt-Zylinderkörper (Spenderkammer), mit einer maximalen Oberfläche von 1659,06 mm2 und insgesamt 25,20 mm entlang der x-Achse, 14,50 mm entlang der y-Achse und 21,63 mm entlang der z-Achse.
  3. Zusätzlich sollte ein abnehmbarer kreisförmiger Sicherungsring entworfen werden, um das Epithelgewebe zu stützen. Der Ring hat einen Außendurchmesser von etwa 19,90 mm und einen Innendurchmesser von 17,93 mm, was den Abmessungen des Hauptzylindrkörpers entspricht, und kann in Transwell-12-Well-Platten passen (Abbildung 3).
  4. Fertigen Sie alle Komponenten mit einem Desktop-Stereolithografie-(SLA)-3D-Drucker mit einem UV-aushärtenden, klaren Harz an. Alle Maße sind ungefähr und können bei Bedarf angepasst werden, um eine ordnungsgemäße Passung in Transwells und experimentelle Kompatibilität zu gewährleisten.
    HINWEIS: Um die Entfernung unreaktionierter Monomere und potenzieller Laugstoffe sicherzustellen, unterzogen sich alle Teile einem standardisierten Nachbearbeitungsprotokoll, einschließlich einer 10-minütigen Wasche in unberührtem 99%igen Isopropylalkohol (IPA), gefolgt von UV-Aushärtung gemäß Herstellerspezifikationen, d. h. 1 Minute bei Umgebungstemperatur in einem Form Cure 2. Die Stereolithographie-Datei (STL) für das 3D-Modelldesign ist unter https://doi.org/10.5281/zenodo.19368577- oder Ergänzungsdateien (Supplementary File 1 und Supplementary File 2) zu finden.

5. Permeation über die Schleimhaut montiert in 3D-Einsätzen

HINWEIS: Die Ex-vivo-Permeabilität von GLP-1RA und GDC, die in mukoadhäsive Doppelschicht-Buckalfilme eingebaut sind, kann ebenfalls mit niedrigvolumenartigen, maßgefertigten, transwell-nachahmenden 3D-Einsätzen als Alternative zu FDCs bewertet werden (Abbildung 2). Dies liegt daran, dass die 10-mL-Empfängerseite von FDCs das Peptid verdünnt und so die Detektionsempfindlichkeit von uHPLC herausfordert. Das FDC-Design ist daher weder kosteneffizient noch praktisch für Peptidflüsse, da es eine kontinuierlich enzymgebundene Erkennung von Immunsorbent-Tests (ELISA) oder Radioimmunoassay (RIA) erfordern würde.

  1. Die Einsätze werden in einem UV-aushärtenden Harz mit einem Desktop-SLA 3D-Drucker28 hergestellt und in 12-Well-Gewebekulturplatten montiert.
  2. Positionieren Sie die buckale Schleimhaut des Schweins über eine Fensterfläche von 1,4 cm² zwischen der Lipal- und der basolateralen Kammer, messen Sie den grundlegenden transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) mit einem EVOM-2-Voltohmmeter und STX2-Essstäbchenelektroden, die an den Spender- und Empfängerseiten der Einsätze platziert sind. TEER wird nach dem Ohmschen Gesetz berechnet.
  3. Nachdem der Film (1,0 × 1,0 cm2) auf das obere Gewebe gelegt wurde, pipettieren Sie 0,5 ml PBS (pH 6,8) in die apikale Kammer und 1,5 ml PBS (pH 7,4) in die basolaterale Kammer.
  4. Entnehmen Sie Proben (0,2 mL) von den Empfängerseiten im Abstand von 1 Stunde über 3 Stunden und ersetzen Sie sie durch gleiche Volumina frischen Puffer.
  5. Quantifizieren Sie das fluxierte GLP-1-RA-Peptid mittels uHPLC.
    HINWEIS: Nach 3 Stunden wird keine Adsorption von GLP-1RA mit 3D-Einsätzen beobachtet, wie in ergänzender Abbildung 1 und ergänzender Datei 3 gezeigt.
  6. Messen Sie den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) mit einem EVOM-2-Volt-Ohmmeter und STX2-Essstäbchen-Elektroden in 1-Stunden-Intervallen über 3 Stunden. TEER wird nach dem Ohmschen Gesetz berechnet.
  7. Um die Integrität des buckalen und sublingualen epithelialen Gewebes bei Schwanken zu bestätigen, verwenden Sie FD-4 (0,05 mM) als fluoreszierenden Marker.
    HINWEIS: Alle Experimente werden dreifach durchgeführt, und die berichteten Ergebnisse entsprechen dem durchschnittlichen ± SD von drei Datensätzen.

6. uHPLC-Erkennung des GLP-1 RA

  1. Quantifizieren Sie die Menge der GLP-1-RA, die über Oromucosae permeiert wird, die in FDCs und Einsätzen montiert ist, aus jeder der Donor-Lösungen, HTCs und Filme, mittels uHPLC mittels einer CSH C18-Säule (130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm) mit einer mobilen Phase von 0,1 % TFA in Acetonitril (Eluent A) und 0,1 % TFA im Wasser (Eluent B), Gradient-Elution über 8 Minuten bei 30 °C, mit 20 μL Einspritzvolumen und 0,7 mL/min Durchflussrate sowie UV-Detektion bei 214 nm (Retentionszeit: ~4,2 min).
  2. Führen Sie eine Linearitätsstudie durch.
    1. Entwerfen Sie eine Linearitätsstudie, um die analytische Antwort der optimierten uHPLC-Bedingungen mithilfe von GLP-1-Kalibrierungsstandards im Bereich von 2,5–20,0 μg·mL⁻1 zu schätzen.
    2. Bereite Kalibrierungsstandards (n = 6–8 Stufen) unabhängig vor und injiziere Proben in dreifacher Form. Führen Sie eine kleinste Quadrat-Linearregression der Spitzenfläche (mAU) im Vergleich zur nominalen Konzentration durch und bewerten Sie die Linearität anhand des Bestimmungskoeffizienten (r2), des prozentualen y-Interzeps und der Verteilung der Residuen (beobachtet–vorhergesagte Antwort).
      HINWEIS: Die visuelle Inspektion des Kalibrierungsdiagramms und des Residuendiagramms zeigte eine unbedeutende Abweichung von der Linearität am niedrigsten Sensitivitätsniveau (2,5 μg·mL⁻1), wobei die Residuen innerhalb des vordefinierten Akzeptanzlimits (±3 %) liegen. Der Kalibrierungsbereich ist anschließend auf einen Bereich von 2,5–20,0 μg·mL⁻1 beschränkt, bei dem die Regression akzeptable Linearität zeigte (r2 ≥ 0,999, % y-Interzept < 2 % und alle Residuen innerhalb von ±3 %).

7. Schätzung der GLP-1RA, die im Mundgewebe zurückbleibt

  1. Entfernen Sie die porcine buckale Epithelschleimhaut, die GLP-1 RA und GDC von FDCs/Einsätzen ausgesetzt sind.
  2. Spülen Sie das Gewebe dreimal mit PBS, um adsorbierte Medikamente und Film-Hilfsstoffe zu entfernen.
  3. Anschließend homogenisiere das Gewebe in 5 ml PBS mit einem Tischhomogenisator, bis es vollständig fragmentiert ist.
  4. Die Probe wird über Nacht bei 4 °C gelagert, um die Gleichgewicht der Peptidverteilung zwischen homogenisiertem Gewebe und PBS zu ermöglichen.
  5. Anschließend wird das Gemisch bei 5000 × g für 5 Minuten zentrifugiert, um die Fragmente ausfällen zu lassen und das Supernatant für die Quantifizierung zu sammeln.
  6. Sterilisieren Sie das Überstandsmittel mit 0,22 μm-Zentrifugenfiltern, um Restpartikel vor der uHPLC-Analyse zu entfernen.

8. Histologie des oromukosalen Gewebes

HINWEIS: Nach 3 Stunden Durchdringen des GLP-1 RA aus Mischungen, HTCs oder Filmen werden die Schleimhäute zur Beurteilung des Schadens behandelt.

  1. Fixiere die Gewebe in 10 % Formalin für 48 Stunden und bette die fixierten Gewebe dann in Paraffin ein.
  2. Die Gewebe mit einer Größe von 5 μm mit einem Mikrotom durchschneiden.
  3. Anschließend färben Sie Gewebe mit Hämatoxylin und Eosin (HE), um die histologische Integrität mittels Lichtmikroskopie mit 4× Vergrößerung zu untersuchen.
  4. Die Objektträger werden mit einem aufrechten Mikroskop fotografiert und mit Bildanalysesoftware analysiert.
    HINWEIS: Der gesamte Arbeitsablauf ist in Abbildung 4 zusammengefasst.

Ergebnisse

Isolierung und Sektion von schweine-bukkalen Epithelgeweben
Die buckale Schleimhaut von Schwein wird häufig als Ersatzgewebe für humane Oromucosae verwendet, da sie vergleichbare anatomische Merkmale und physiologische Barriereeigenschaften aufweisen29. Schweinse buckale Epithelgewebe werden sowohl mit chirurgischer als auch mit Erhitzungsmethoden isoliert, wie in Abbildung 4 gezeigt. Anfangs wird ein Skalpell verwendet, um Muskeln und tiefere Bindegewebe aus den Wangen zu entfernen. Die isolierten Gewebestücke mit kombinierten und intakten Schleimhautschichten und Bindegewebe werden dann in warmes PBS gegeben, das auf 65 °C für 3 Minuten erhitzt wird. Das Gewebe wird aus dem Puffer entfernt, und das Epithel sowie die darunterliegende Lamina propria werden mit der Pinzette Größe 5 abgezogen. Die Erhitzung ermöglicht eine konstante, gleichmäßige Dicke des resultierenden zerschnittenen Epithels.

Ex-vivo-Permeation eines GLP-1RA über schweinebe, buckale Oromukose, montiert in FDCs und 3D-gedruckten Einsätzen
Die Ex-vivo-Permeation von GLP-1RA wurde mit porcinen buccalen epithelialen Gewebe-Schleimhäuten, die in FDCs und Einsätzen montiert wurden, untersucht. Um das optimale Konzentrationsverhältnis des GLP-1 RA: GDC zu bewerten, wurden HTCs mit Baumwollpads mit einer Fläche von 12,7 mm an der Spenderseite der in FDCs montierten Schleimhäuten befestigt, und das Peptid-Verstärker-Gemisch wurde auf das Baumwollpad pipettiert. Die kumulative Durchdringung der GLP-1 RA erreichte etwa 4,3 % über 3 Stunden, wenn GDC im Verhältnis 1:1 einbezogen wurde (GLP-1RA 25 mg: GDC 25 mg). Im Gegensatz dazu wurde bei Abwesenheit von GDC kein nachweisbarer GLP-1RA-Flussbeobachtet. Quantitative Permeabilitätsparameter, einschließlich derP-App, werden mit folgender Formel berechnet:

Papp = figure-results-1

Wobei:
Papp: scheinbarer Permeabilitätskoeffizient (cm/s).
dQ/dt: Transportrate des GLP-1RA im stationären Zustand, berechnet als die Menge des pro Zeiteinheit transportierten Peptids (μg/s).
A: Bereich des 3D-Einsatzes (cm2).
Co: die Anfangskonzentration des Peptids im Donor- (apikalen) Kompartiment (μg/mL).

Der scheinbare Permeabilitätskoeffizient (Papp) von GLP-1RA über die buckale Schleimhaut des Schweins ist in ergänzender Abbildung 2 dargestellt. Wenn das GLP-1RA:GDC-Verhältnis 1:1 betrug, wurden die gleichen Konzentrationen wie bei HTCs in Doppelschichtfilme eingebaut; die Durchdringung von GLP-1RA über isolierte porgene buckale Gewebe war jedoch mit dem herkömmlichen FDC-Setup nicht quantifizierbar, da die Präsentation des GLP-1RA aus den Filmen auf die Schleimhaut langsamer ist als bei Mischungen in Lösung oder HTCs. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden maßgeschneiderte, niedrigvoluminierte 3D-gedruckte Einsätze entwickelt, um die Empfängerlautstärke auf 1,5 ml zu reduzieren und so die Erkennungsempfindlichkeit zu verbessern. Mit 3D-Einsätzen war die kumulative Durchschlagung von GLP-1RA aus buckalen Filmen über 3 Stunden messbar und erreichte etwa 1,8 %, wie in Abbildung 5 dargestellt. TEER-Werte und FD-4-Flüsse wurden verwendet, um die Integrität der epithelialen Barrieren und die parazelluläre Permeabilität zu bewerten. In den Behandlungsgruppen wurde ein zeitabhängiger Rückgang des TEER beobachtet (ergänzende Abbildung 3) und korrespondierte mit einer erhöhten GLP-1RA-Permeation. PBS und mit Blankfilm behandelte Gewebe zeigten keine Veränderungen im TEER, was darauf hindeutet, dass die Doppelschicht-Filmmatrix die Barriere nicht störte. Diese Daten bezeichnen GDC als den Hauptbeitragenden zum permeationssteigernden Effekt.

Zellhistologische Begutachtung des Schweinegewebes
Eine histologische Untersuchung der ex vivo porcinen buckalen Schleimhaut wurde durchgeführt, um die Auswirkungen von Gewebeisolationsmethoden zu bewerten und die Epithelintegrität nach 3-stündiger Exposition gegenüber GLP-1RA und GDC zu untersuchen. Wie in Abbildung 6 gezeigt, bewahrten frisch isolierte Gewebe, die durch die Erwärmungsmethode gewonnen wurden, die normale physiologische Epithelarchitektur mit intakten, geschichteten Schichten und kontinuierlichem Oberflächenschleim und zeigten keine Hinweise auf strukturelle Schäden. Im Gegensatz dazu zeigten Gewebe, die durch mechanische Trennung isoliert oder gelagert/gefroren wurden, geringe Veränderungen in der Morphologie der Epithelzellen und eine Verringerung der Oberflächenschleimdichte. Buccale Schleimhäute, die 25 mg GLP-1RA in Anwesenheit von 25 mg GDC ausgesetzt waren, bewahrten die Epithhelintegrität und ähnelten unbehandelten Kontrollen stark. Es wurden nur leichte Ödeme und oberflächliche Epithelerosion beobachtet. Exposition gegenüber GLP-1RA allein oder mit Blank und GLP-1RA: GDC-geladene Doppelschicht-Filme verursachten keine sichtbaren Gewebeschäden, und die histologischen Merkmale waren mit denen von PBS-behandelten Kontrollgeweben vergleichbar.

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Abbildung 1: Mundhöhle des Schweins, die die buckalen und sublingualen Schleimhautbereiche zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Abbildung 2: FDCs und Komponenten. Sechs Kammern sind in einem integrierten System (links) montiert. Eine Person, Franz Cell, ist zu sehen (in der Mitte). Das Montagesystem für das Mundgewebe in einer einzelnen Kammer (rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Komponenten von 3D-gedruckten 1 cm 2-Harz-Einsätzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Arbeitsablauf für die Isolierung, Montage, Permeation und histologische Charakterisierung des buckalen Epithels bei Soffen. Erstellt in BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5: Kumulative Menge des GLP-1 RA. Ex-vivo kumulierte Menge des GLP-1 RA durchdrungen auf der Empfängerseite der porcinen buckalen Epithelschleimhaut nach 180 Minuten Anwendung von 25 mg/mL GLP-1RA (Rot), 25 mg/mL GLP-1RA: 25 mg/mL GDC-Lösung (Schwarz) und 25 mg/mL GLP-1RA: 25 mg/mL GDC, in Filmen (lila), aufgetragen durch HTC, FDC und 3D-Einsätze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 6: HE-gefärbte mikroskopische Bilder von schweineschen buccalen Epithelschleimhäuten unter verschiedenen Belichtungsbedingungen. (A) Blankfilm, (B) wässrige Mischung aus GLP-1RA: GDC, (C) Filme, die mit GLP-1RA:GDC eingeschlossen sind, (D) Schleimhäute, die nach Wärmebehandlung aus frischem Gewebe isoliert wird (65 °C), (E) Bukkalepithel, isoliert aus gefrorenem Gewebe nach Wärmebehandlung, (F) Schleimhaut isoliert mit mechanischer Methode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Zusammensetzung der mukoadhäsiven Schicht
KomponentenKonzentration (mg)
GLP-1RA12,5 mg
GDC12,5 mg
HPMC45 mg
Na-CMC10 mg
PVP-K9025 mg
Glycerol3 mg
Aerosil 200F2 mg
Rücklagenschicht
Ethylcellulose5 mg
Propylenglykol5 mg

Tabelle 1: Zusammensetzung der mukoklesierenden und hinterliegenden Schichten des buckalen Films.

Ergänzende Abbildung 1: Adsorption von GLP-1RA nach 6 Stunden Inkubation von 0,5 mg GLP-1RA mit 3D-Einsätzen. Die Daten sind der Mittelwert ± SD von drei Experimenten (n = 3).Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Scheinbarer Permeabilitätskoeffizient (Papp) eines GLP-1RA nach 3-stündiger Exposition von scheinem buckalem Schleimhautgewebe, das in 3D-Einsätzen montiert ist. 25 mg/mL GLP-Lösung (rot), 25 mg/mL GLP + 25 mg/mL GDC-wässrige Lösung (schwarz) und 25 mg/mL GLP + 25 mg/mL GDC in buccalen Filmen (lila). Die dargestellten Daten sind der Mittelwert ± SD (n = 3). Statistische Signifikanz zwischen den Gruppen wurde beobachtet: p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Transepitheliale Resistenz (TEER). Allmähliche Reduktion des transepithelialen Widerstands (TEER) aus isoliertem schweine-buckalem Epithelgewebe, das in 3D-Einsätzen fixiert ist, nach der Exposition gegenüber 25 mg/mL GLP-1 + 25 mg/mL GDC-Lösung (rot), 25 mg/mL GLP-1 + 25 mg/mL GDC in buckalen Filmen (grün) und 25 mg/mL GLP-1RA in PBS (blau). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Gewebeintegrität und Leckage. Gewebeintegrität und Leckage wurden bewertet, indem porcine buckale Epithelgewebe in 3D-Einsätzen auf 0,05 mM FD4 auf der Spenderseite exponiert wurden. Die Proben wurden in festen Abständen von 60 Minuten über 6 Stunden entnommen. Mittelwert +SD von drei Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 1: transwell-Oring-v7 (JOVE).stl.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzungsakte 2: transwell-v9 (JOVE).stl.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 3: Zusätzliche experimentelle Details.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Diese Methodik beschreibt experimentelle Protokolle zur Isolierung von buccalen und anderen oromukosalen Epithel sowie Permeabilitätstests für peptidbasierte Therapeutika unter Verwendung eines niedrigpotenten stabilen GLP-1RA-Analogons als Beispiel30. Peptide sind hydrophile Makromoleküle mit vernachlässigbarer Permeabilität über die Schleimhäute17. Die erfolgreiche Ausführung des oben genannten Protokolls beruht auf der präzisen Isolierung und Montage der buckalen und sublingualen Schleimhaut. Die Isolation erfordert spezialisierte Fähigkeiten und eine strenge Temperaturkontrolle; Selbst geringfügige thermische Schwankungen während des Erhitzungsprozesses können schädliche physiologische und morphologische Veränderungen im Epithelgewebe hervorrufen und letztlich die Integrität der Permeationsdaten beeinträchtigen. Darüber hinaus stellt die Fixierung des isolierten Gewebes in den individuell gestalteten 3D-gedruckten Einsätzen einen entscheidenden Schritt dar. Aufgrund der empfindlichen Natur der Epithelschichten besteht ein höheres Risiko für Gewebereiße oder -undichtigkeiten während der Montage. Um dem entgegenzuwirken, setzten wir einen FD4-Lecktest ein, der als Qualitätskontrollmaßnahme dient und die Membranintegrität vor Beginn der Flussstudien sicherstellt. Die FD4-Leckage wurde zunächst visuell bewertet und mit UV-sichtbarer Spektroskopie weiter quantifiziert. Die entsprechenden Daten werden in den ergänzenden Daten bereitgestellt (ergänzende Abbildung 4 und Ergänzende Datei 3).

Konventionelle FDC, die als Standard für ex-vivo-Studien gilt, stellt häufig Herausforderungen bei der Quantifizierung von Peptidtherapien dar, da die Empfängerkammer hohe Volumina typischerweise 10 ml stark ist. Das hohe Volumen führt zu einer übermäßigen Probenverdünnung, wodurch die permeierten Peptidkonzentrationen für Standardanalysemethoden unter den unteren LOD gedrückt werden. Um dies zu vermeiden, entwickelten wir einen neuartigen 3D-gedruckten Einsatz, der die Größe und das Volumen der Transwells-Systeme nachahmt, die für Epithelzell-Monoschichten verwendet werden, einschließlich Caco-231. Die Einsätze können direkt in Standard-12-Well-Gewebekulturplatten eingesetzt werden und beherbergen isolierte schweine-buckale Epithelschleimhaut sicher. Diese Modifikation reduziert das Volumen des Spenderkompartiments deutlich um fast das 7-fache auf 1,5 ml, wodurch sich die Analyten und die Überwindung der Empfindlichkeitsbeschränkungen von uHPLC verstärkt. Diese Anpassung ist besonders wichtig für die Quantifizierung kostspieliger Peptidmedikamente mit geringer Durchlässigkeit.

Mit dem 3D-Insert-System wurde eine Zunahme der GLP-1-RA-Durchdringung in Gegenwart von GDC beobachtet. Die kumulative permeierte Menge von GLP-1RA erreichte ~55,3 μg nach 3 Stunden, was ~4,3 % der ursprünglich auf die Spenderseite aufgetragenen Konzentration entspricht. Im Gegensatz dazu wurde kein messbarer GLP-1-RA-Fluss festgestellt, als ähnliche Konzentrationen von GLP-1RA und GDC, die in Mundfilmen eingeschlossen waren, auf Mundschleimhäute in FDCs aufgetragen wurden, was darauf hindeutet, dass eine Peptiddurchdringung stattgefunden haben könnte, aber aufgrund übermäßiger Verdünnung des großen Empfängervolumens analytisch nicht nachweisbar blieb. Die kumulative Durchdringung von GLP-1 RA aus der Bilayer-Bukkalfilm-Formulierung erreichte jedoch etwa 1,8 % nach 3 Stunden in 3D-Einsätzen über 3 Stunden, was die Machbarkeit demonstriert, niedrigstufigen Peptidtransport über Bukkalgewebe aus Dosierungsformen mit dem miniaturisierten Empfängersystem zu erkennen. Die Ex-vivo-Durchdringung von GLP-1 RA wurde ebenfalls mit HTCs untersucht, die eine mit dem Peptid und GDC gefüllte Baumwollpads enthielten. Dies ist ein sehr nützliches anfängliches Screening-Gerät, um das Konzept zu beweisen, dass die Präsentation eines Peptides aus Filmen mit einem Permeationsverstärker möglich sein kann. Die Barriereintegrität des buckalen Epithels des Schweines kann während des Experiments mittels TEER- und FD-4-Leckagen überwacht werden. Ein langsamer, zeitabhängiger Rückgang des TEER wurde während der Exposition gegenüber GLP-1-Rezeptoragonisten (GLP-1 RA) beobachtet, was mit einem erhöhten parazellulären Transport übereinstimmt, der in der Mundschleimhaut durch das Gallensalz32 induziert wird.

Eine Einschränkung dieser Technik ist die Abhängigkeit von frischem Schweinegewebe, das nicht immer auf Abruf in Schlachthöfen verfügbar ist, und die Gewebequalität kann variieren. Um die Einschränkungen der Gewinnung von frischem Gewebe in angemessener Entfernung vom Labor zu berücksichtigen, haben wir die Kryoprotektion für die Lagerung hochwertiger Proben bewertet, die wir später verwenden könnten. Während die Verwendung von frischem Gewebe optimal ist, erfordert die Verwendung isolierter gelagerter Schleimhautgewebe einen sorgfältigen Einsatz von Kryoprotektionen und Gefrierraten, um die Bildung von Eiskristallen und daraus resultierenden Barrierenschäden zu verhindern. Das Protokoll hat die Fähigkeit, die Lücke zwischen Standard-Makro-Permeationsstudien und hochsensitiver Peptidanalyse zu schließen. Durch die Optimierung sowohl des Gewebeisolationsprozesses als auch des Permeationsprotokolls mit 3D-Einsätzen haben wir einen höheren Grad an Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit erreicht als üblicherweise bei FDCs. Darüber hinaus bietet der Einsatz von 3D-Einsätzen einen Rahmen, in dem Forscher Nachweisgrenzen für kostspielige Peptidmoleküle festlegen können, was eine deutliche Verbesserung der Flexibilität und Durchsatz der ex-vivo-Schleimhautforschung darstellt.

Diese Protokolle bilden eine Grundlage für eine zuverlässige Messung der Schleimhautdurchdringung unter Verwendung von Arzneimittelklassen über Peptide hinaus. Die Fähigkeit, hochauflösende Permeationsprofile aus ex vivo Modellen zu erzeugen, wird Vorhersagen für präklinische Absorptionsdaten aus Tiermodellen unterstützen. Die GLP-1 RA ex vivo Permeation wurde ebenfalls mit HTCs untersucht, die eine mit dem Peptid durchsetzte Baumwollpolster und GDC, eine Permeationsverstärkerlösung, enthielten. Diese Verabreichungsmethode gewährleistete einen intimen, reproduzierbaren Kontakt zwischen der Mischung und der Schleimhautoberfläche. Ein signifikanter Anstieg der Permeation von GLP-1RA wurde mit einem 1:1-Verhältnis von GDC in transwell-nachahmenden 3D-Einsätzen beobachtet. Dies ist ein sehr nützliches Screening-Gerät, um das Konzept zu beweisen, dass die Präsentation eines Peptids aus Filmen mit einem Permeationsverstärker in einem konstruierten Design möglich ist, das aus kultivierten Monoschichten von Epithelzellen bis zu Gewebeschleimhäuten angepasst ist. Die Barrierenintegrität des buckalen Epithels des Schweines kann während des Experiments mittels TEER-Messung und FD4-Leckage überwacht werden.

Insgesamt zeigen die ex-vivo Permeations- und histologischen Untersuchungen, dass eine zuverlässige Beurteilung des buckalen und sublingualen Peptidtransports in Anwesenheit eines Permeationsverbesserers von der Gewebepräparation, Flussprotokollen und analytischer Empfindlichkeit abhängt. Unter den untersuchten Isolationsansätzen bot die Trennung von frisch gefördertem buckalem und sublingualem Epithel mit der Wärmemethode ein gutes Gleichgewicht zwischen der Erhaltung der epithelialen Integrität und der Reproduzierbarkeit der Gewebedissektion, was sich durch stabilen Ausgangs-TEER, minimale FD4-Leckage und erhaltene Gewebezellstrukturen zeigt. Wichtig ist, dass der 3D-gedruckte Insert die experimentelle Zuverlässigkeit deutlich verbesserte, indem er die Verdünnung des Empfängerkompartiments reduzierte und so die Quantifizierung niedriger Peptidflüsse ermöglichte, die in FDCs nicht nachweisbar waren. Zusammenfassend stützen diese Ergebnisse die Verwendung isolierter porceller buckaler Epithelschleimhaut in einer Gewebeeinsatzkammer als ex vivo Plattform zur Bewertung der buccalen Verabreichung therapeutischer Peptide für systemische Abgabe.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine finanziellen Verpflichtungen oder Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.

Danksagungen

Die Autoren danken Ben Shovlin (UCD School of Veterinary Medicine) für die technische Unterstützung. Wir danken auch Dr. Hans Eckhardt (UCD School of Chemistry) für die Unterstützung bei der uHPLC-Analyse. Dieses Projekt wurde vom Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon Europe der Europäischen Union im Rahmen der Fördernummer 101071054 gefördert. Wir erkennen außerdem zusätzliche Fördermittel aus Grant Number 13/RC/2073_P2, dem Research Ireland CURAM Center for Medical Devices und dem Europäischen Entwicklungsfonds an. Die Autoren möchten Kenneth McNamara von Rosderra Irish Meats für die Bereitstellung von Schweinebäckchen danken.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Computer / LaptopGenerischJedes Standardsystem≥8 GB RAM empfohlen
DatenerfassungsskriptBenutzerdefiniertcollect.pyPython-basiertes Erfassungsskript
Einmalige Gel-ElektrodenGenerischVorgelte Ag/AgCl-ElektrodenEinmalig, klebend
EEG-ErfassungsmodulUpside Down LabsBioAmp EXG PillAnaloge Front-End für Biopotentialsignale
Elektrodengel (bei wiederverwendbaren Elektroden)GenerischLeitfähiges GelVerbessert die Signalleitfähigkeit
Interaktive Anwendung (Spiel)GenerischJedes einfache Spiel (z. B. Rennspiel)Tastaturgesteuerte Schnittstelle
VerbindungsdrähteGenerischStecker von Mann zu FrauStandard-Brötchen-Drähte
Matplotlib / SeabornOpen-SourceNeueste VersionenVisualisierungsbibliotheken
Mikrocontroller-PlatineArduinoUno / Maker Uno10-Bit-ADC, USB-Schnittstelle
Python-ProgrammierumgebungPython Software FoundationPython ≥3.8Open-Source-Programmiersprache
PyTorch-BibliothekMeta AIVersion ≥1.12Deep Learning Framework
Scikit-learnOpen-SourceNeueste stabile VersionML-Dienstprogramme
SignalverarbeitungsbibliothekenSciPyNeueste VersionFiltern, STFT
USB-KabelGenerischUSB Typ-A zu BDatenübertragungskabel

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