Identifikation von Hub-Genen, Einzelnukleotid-Polymorphismen und potenziellen Wirkstoffzielen bei Brustkrebs mittels transkriptomischer Analyse

Summary

Diese Studie untersuchte mitochondriale Gene mit oxidativem Stress, die mit therapeutischer Resistenz bei HER2-positivem Brustkrebs assoziiert sind. Anhand transkriptomischer Datensätze, integrierter Bioinformatik und klinischer Daten (n = 4.929) identifizierten die Autoren MTHFD2 und PRDX3 als wichtige differenziell exprimierte Gene mit potenzieller prognostischem Wert. In Silico. Analysen deuten auf funktionelle Effekte genetischer Varianten hin.

Abstract

HER2-positiver (HER2⁺) Brustkrebs entwickelt häufig Resistenzen gegen Therapien wie Lapatinib, was möglicherweise mitochondriale Stoffwechsel- und Redox-Reprogrammierung einschließt. Diese Studie hatte zum Ziel, mitochondriale Gene mit oxidativem Stress (MOS-DEGs) als Biomarker der Resistenz zu identifizieren und deren funktionelle nsSNPs sowie strukturelle Auswirkungen zu charakterisieren. RNA-seq-Datensätze (GSE231524, GSE231525) wurden mit DESeq2 analysiert, um DEGs zu identifizieren, die mit mitochondrialen oxidativen Stressgenen kombiniert wurden, um MOS-DEGs zu erhalten. Funktionelle Anreicherung, PPI-Analyse, ROC-Analyse, Expressionsprofilierung und Überlebensanalyse wurden durchgeführt. nsSNPs wurden mit mehreren prädiktiven Werkzeugen bewertet, und strukturelle Auswirkungen wurden durch sekundäre und 3D-Modellierung bewertet. Integrierte transkriptomische und klinische Analysen identifizierten MTHFD2 und PRDX3 als zentrale MOS-DEGs mit gegensätzlichen regulatorischen Rollen im mitochondrialen Redoxstoffwechsel. MTHFD2 war signifikant hochreguliert und mit einer schlechten Prognose assoziiert (HR = 1,53, p = 1,1 × 10⁻¹⁶), während PRDX3 schützende Expressionsmuster zeigte (HR = 0,73, p = 7,7×10⁻¹⁰). Die ROC-Analyse deutete auf ihr Potenzial als Prädiktoren der therapeutischen Reaktion hin. Die nsSNP-Analyse ergab fünf schädliche Varianten in MTHFD2 und vier schädliche Varianten in PRDX3, wobei rs1471336772 (MTHFD2) und rs747786383 (PRDX3.) als die pathogensten Varianten identifiziert wurden. Diese Varianten wurden anhand mehrerer rechnergestützter Bewertungssysteme als schädlich vorhergesagt, darunter SIFT ≤ 0,05, PolyPhen-2 ≥ 0,85, schädliche CADD-Werte und hohe REVEL-Werte, und lagen in katalytischen oder redox-aktiven Domänen. Strukturelle Modellierungen deuteten darauf hin, dass diese Substitutionen die Konformation destabilisieren, Metall- und Kofaktorbindungsstellen stören und die NADPH-Regeneration oder die thioredoxinabhängige Peroxidaseaktivität beeinflussen können. Molekulardynamische Vorhersagen deuteten auf einen möglichen Verlust struktureller Stabilität und veränderte Flexibilität hin, was auf eine mögliche funktionelle Beeinträchtigung der mitochondrialen Redoxkontrolle hindeutet. Diese Studie identifiziert MTHFD2 und PRDX3 als Regulatoren des mitochondrialen oxidativen Stresses bei HER2⁺ -Brustkrebs. Schädliche nsSNPs in diesen Genen können zu einem veränderten Redox-Gleichgewicht beitragen und so potenziell die metabolische Anpassung (MTHFD2) und die antioxidative Abwehr (PRDX3) beeinflussen.

Introduction

Brustkrebs ist weltweit die am häufigsten diagnostizierte Krebserkrankung bei Frauen und eine Hauptursache krebsbedingter Todesfälle trotz erheblicher Fortschritte bei der Früherkennung und gezielten Therapien ^1,2,3. Molekulare Heterogenität in Brusttumoren liegt vielfältigen klinischen Ergebnissen und Behandlungsreaktionen zugrunde und stellt für die Präzisionsonkologie anhaltende Herausforderungen^dar. Unter den anerkannten molekularen Subtypen macht der humane epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2)-positiver Brustkrebs etwa 15–20 % aller Brustkrebserkrankungen aus und ist durch HER2-Genamplifikation und Überexpression des HER2-Rezeptors Tyrosinkinase ^6,7 gekennzeichnet. Obwohl HER2-gezielte Therapien wie Trastuzumab und Lapatinib die Patientenprognose deutlich verbessert haben, treten häufig primäre und erworbene Resistenzen gegen diese Wirkstoffe auf, was zu einem Tumorrückfall und Krankheitsprogression^{führt 8,9}. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die HER2-Therapieresistenz antreiben, bleibt daher ein wesentlicher unerfüllter Bedarf in der klinischen Onkologie.

Neue Belege deuten darauf hin, dass mitochondriale Dysfunktion und oxidativer Stress eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der Medikamentenresistenz bei Brustkrebs spielen. Mitochondrien sind über ihre kanonische Rolle bei der ATP-Produktion hinaus wichtige Regulatoren der Apoptose, der Redox-Signalgebung und der metabolischen Plastizität – alles Prozesse, die Krebszellen nutzen, um therapeutischen Druck zu überleben. Insbesondere zeigen resistente HER2^+- Krebszellen eine metabolische Verschiebung hin zu oxidativer Phosphorylierung (OXPHOS), verstärkter Pufferung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und veränderter mitochondrialer Biogenese. Diese Anpassungen ermöglichen es den Zellen, die Überlebenssignalübertragung aufrechtzuerhalten und Apoptose trotz anhaltender Hemmung der HER2-Signalwege zu vermeiden. Gene, die mitochondriale Komplex-Untereinheiten und redoxregulierende Enzyme codieren, sind daher potenzielle Biomarker und therapeutische Ziele zur Überwindung von Resistenz.

Parallel dazu können nicht-synonyme Single-Nukleotid-Polymorphismen (nsSNPs) in mitochondrialen oder oxidativen, stressbedingten Genen die Proteinstruktur und -funktion verändern und so die Enzymaktivität, die Arzneimittelantwort und die Anfälligkeit für Krankheiten^beeinflussen. Computergestützte Vorhersage der schädlichen Auswirkungen von nsSNPs unter Verwendung von in silico.Werkzeuge wie SIFT, PolyPhen-2 und CADD bieten eine schnelle Möglichkeit, funktionelle Varianten zu identifizieren, die zur Krebsheterogenität und therapeutischen Resistenz beitragen könnten. Die Integration von transkriptomischen und mutationalen Daten bietet somit eine multidimensionale Sicht auf Gendysregulation und strukturelle Veränderungen sowohl auf transkriptionaler als auch auf genomischer Ebene.

Jüngste Fortschritte in der Bioinformatik und Systembiologie haben die hochdurchsatzfähige Identifikation potenzieller Treibergene durch großflächige Expressionsprofilierung und netzwerkbasierte Analyse ermöglicht. Öffentliche Repositorien wie der Gene Expression Omnibus (GEO) bieten wertvolle RNA-Sequenzierungsdatensätze, die molekulare Veränderungen zwischen experimentellen Modellen und Patientenkohorten erfassen. In Verbindung mit analytischen Werkzeugen wie DESeq2, clusterProfiler und STRING–Cytoscape-Netzwerkanalyse ermöglichen diese Ressourcen eine umfassende Charakterisierung differenziell exprimierter Gene (DEGs), Signalweganreicherung und Entdeckung von Hubgenen. Wichtig ist, dass die Integration mitochondrialer oxidativer Stress-Gensignaturen mit DEGs neuartige molekulare Mechanismen hinter der HER2-gezielten Therapieresistenz aufzeigen und potenzielle Biomarker für therapeutische Interventionen identifizieren kann.

Die von HER3 gesteuerte Resistenzachse hat kürzlich als wichtiger kompensatorischer Weg nach der HER2-Hemmung Aufmerksamkeit erlangt erhalten. Die Aktivierung von HER3 stellt die nachgeschaltete PI3K/AKT-Signalübertragung wieder her und fördert das zelluläre Überleben und die Arzneimitteltoleranz (Abbildung 1). Die DUSP6 (Dual Specificity Phosphatase 6), ein negativer Regulator der ERK-Signalübertragung, wurde an der Modulation dieser adaptiven Antwort beteiligt. Die Hemmung von DUSP6 reaktiviert die ERK-Signalübertragung und kann die HER3-vermittelte Resistenz entgegenwirken, aber ihr Zusammenspiel mit mitochondrialem oxidativem Stress und metabolischer Anpassung ist weiterhin unzureichend verstanden. Daher bieten vergleichende transkriptomische Analysen von HER2^+- Zelllinien (BT474 und MDA-MB-453) unter DUSP6-Hemmung und chronischer Lapatinib-Exposition ein ideales Modell, um die molekularen Determinanten der Arzneimittelresistenz zu analysieren.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der molekularen Landschaft, die mitochondriale Dysfunktion, oxidativen Stress und Brustkrebsprogression verknüpft. Diese integrierten molekulare Mechanismen, die der mitochondrialen oxidativen Stress-vermittelten Onkogenese bei Brustkrebs zugrunde liegen. Dysregulierte mitochondriale Elektronentransportkettenkomplexe, insbesondere mit DUFS3, UQCRC1, COX4I1, SDHA und ATP5PO, führen zu einer übermäßigen Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), was zu oxidativen DNA-Schäden, Lipidperoxidation und beeinträchtigtem Mitochondrienmembranpotenzial führt. Diese oxidativen Störungen aktivieren onkogene Signalwege wie PI3K/AKT, MAPK und NF-κB, während sie apoptotische Regulatoren wie p53 und BAX unterdrücken und so das Überleben, die Proliferation und die Immunvermeidung von Tumorzellen fördern. Das Diagramm hebt außerdem die doppelte Wirkung des mitochondrialen oxidativen Stresses auf den Krebsstoffwechsel und die Tumormikroumgebung hervor und betont seinen Beitrag zur Therapieresistenz und zur Immunmodulation unter HER2+-Brustkrebserkrankungen. Dieses integrative Modell bildet die mechanistische Grundlage für nachfolgende transkriptomische und SNP-basierte Analysen, die darauf abzielen, mitochondriale Treibergene und potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Die vorliegende Studie wurde darauf ausgelegt, systematisch Hub-Gene, funktionelle nsSNPs und potenzielle Arzneimittelziele im Zusammenhang mit mitochondrialem oxidativem Stress bei HER2^+- Brustkrebs zu identifizieren. Durch die Integration transkriptomischer Daten von GSE231524 und GSE231525 mit kuratierten mitochondrialen und oxidativ-stressbezogenen Gensets zielte die aktuelle Studie darauf ab, mitochondriale oxidative, stressbedingte, differenziell exprimierte Gene (MOS-DEGs) zu definieren, die zur Therapieresistenz beitragen. Downstream-Analysen umfassten Genontologie (GO) und KEGG-Weganreicherung, Aufbau von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI), Priorisierung von Hub-Gens und Überlebenskorrelationsanalyse mittels der Kaplan–Meier Immunotherapy Database. Darüber hinaus wurden wichtige Gene weiter auf nsSNP-Variation und potenzielle strukturelle Auswirkungen untersucht, um mutationsgetriebene funktionelle Folgen abzugrenzen.

Durch die Kombination von transkriptomischem Profiling, Netzwerkbiologie und in silico. Mutationsanalyse bietet diese Studie einen integrierten Rahmen zur Entdeckung potenzieller mitochondrialer Biomarker und therapeutischer Ziele bei HER2⁺ -Brustkrebs. Die Identifizierung oxidativer, phosphorylationsgebundener Hubgene und ihrer funktionellen SNPs könnte den Weg für die Entwicklung präzisionstherapeutischer Strategien ebnen, um HER2-gezielte Arzneimittelresistenzen zu überwinden und die Patientenergebnisse zu verbessern.

Protocol

Datenabruf und Vorverarbeitung

Diese Studie wurde mit öffentlich verfügbaren transkriptomischen und genetischen Daten durchgeführt; Menschen oder Tiere waren nicht direkt beteiligt. Transkriptomische Datensätze, die für die HER2⁺-Brustkrebstherapieresistenz relevant sind, wurden aus der NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)¹¹ abgerufen. Zwei RNA-seq-Datensätze, GSE231524 und GSE231525, wurden aufgrund ihres spezifischen Fokus auf HER3-getriebene Resistenzen und DUSP6-Hemmung in HER2+-Brustkrebszelllinien (BT474 und MDA-MB-453) ausgewählt. Diese Datensätze umfassten parentale, arzneimitteltolerante und arzneimittelresistente Phänotypen, abgeleitet von Lapatinib (1 μM)-Exposition und DUSP6-Knockdown. Rohzählmatrizen und entsprechende Metadatendateien wurden mit den Paketen GEOquery (v2.70.0) und Biobase (v2.62.0) in RStudio (v4.3.2)¹² abgerufen. Die Metadaten wurden kuratiert, um zwei Hauptkontraste für jeden Datensatz zu definieren: GSE231524 verglichen die Kontrollgruppe (BT474 parental, Tag 0) mit arzneimitteltoleranten und arzneimittelresistenten Proben (Tag 9–Monat 9), während GSE231525 die Kontrollgruppe (Scrambled siRNA) mit DUSP6 Knockdown (DUSP6-KD) verglichen. Qualitätskontrolle und Datennormalisierung wurden mit dem DESeq2 (v1.42.0)-Framework durchgeführt, das eine varianzstabilisierende Transformation (VST) anwendet, um die Heteroszedastizität zu reduzieren und Vergleichbarkeit zwischen den Stichproben sicherzustellen. Die Datenverteilung und die Clustering-Muster wurden visuell mit ggplot2 (v3.5.0) und pheatmap (v1.0.12) bewertet, um die Datengleichmäßigkeit zu bestätigen und potenzielle Ausreißer vor der Analyse der differenziellen Expression^13,14 zu identifizieren.

In dieser Studie wurde eine klare Unterscheidung zwischen Befunden aus Zelllinientranskriptomdaten und solchen aus patientenabgeleiteten klinischen Datensätzen gehalten. Zellliniendaten wurden hauptsächlich für explorative Analysen verwendet, einschließlich der Identifikation differenziell exprimierter Gene und der Generierung vorläufiger mechanistischer Erkenntnisse in kontrollierten experimentellen Modellen. Im Gegensatz dazu wurden von Patienten abgeleitete Datensätze zur externen Validierung von Genexpressionsmustern und zur Bewertung der klinischen Relevanz, einschließlich prognostischer Bewertung, verwendet. Dementsprechend werden Ergebnisse aus Zelllinienmodellen und klinischen Kohorten getrennt interpretiert, um Überverallgemeinerungen zu vermeiden und einen angemessenen translationalen Kontext für alle Ergebnisse zu gewährleisten.

Analyse der differenziellen Genexpression

Eine differentielle Expressionsanalyse wurde durchgeführt, um Gene zu identifizieren, die zwischen Kontroll- und Behandlungsbedingungen signifikant moduliert waren. Normalisierte Zählungen wurden mit dem in DESeq2 integrierten angepassten Regressionsmodell (ARM) verarbeitet, um log₂-Faltenänderungen und statistische Signifikanz genau zu schätzen. Die Entwurfsformel wurde als ~condition definiert, die die Kontroll- versus behandelte Gruppen repräsentiert. Gene mit einem angepassten p-Wert (FDR) < 0,05 und absoluter log₂-facher Änderung ≥ 1 wurden als signifikant differenziell exprimiert angesehen. Die Schrumpfung der Log₂-Faltungsänderung wurde mit der Apeglm-Methode durchgeführt, um die Robustheit bei der Effektgrößenschätzung zu erhöhen. Die Ergebnisse der Analyse wurden mit EnhancedVolcano (v1.22.0)¹⁵ und ggplot2¹⁶ visualisiert, die Vulkandiagramme und MA-Diagramme erzeugten, die die Beziehung zwischen Ausdrucksgröße und statistischer Sicherheit zeigten. Innerhalb von DESeq2 wurden auch Dispersionsschätzungen bewertet, um eine genaue Varianzmodellierung und konsistente Normalisierung über biologische Replikate¹⁷ zu gewährleisten.

Abruf und Identifizierung mitochondrialer oxidativer, stressbedingter differenziell exprimierter Gene (MOS-DEGs)

Um den Zusammenhang zwischen Energiestoffwechsel, oxidativem Stress und Arzneimittelresistenz zu untersuchen, wurde eine umfassende Liste mitochondrialer und oxidativ-stressassoziierter Gene aus mehreren Datenbanken zusammengestellt, darunter Human MitoCarta3.0¹⁸ (https://personal.broadinstitute.org/scalvo/MitoCarta3.0/human.mitocarta3.0.html), Gene Ontology (GO:0006979, response to oxidative stress) (http://geneontology.org/), der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) oxidativer Phosphorylierungsweg (https://www.genome.jp/kegg/) sowie die Human Oxidative Stress Gene Database (HOSGDB) (http://hosgdb.com/). Alle abgerufenen Gene wurden mit org auf HGNC-zugelassene Gensymbole standardisiert. Hs.eg.db (v3.18.0) und AnnotationDbi (v1.64.0), während doppelte Einträge, Pseudogene und nicht-kodierende RNAs entfernt wurden, um die Annotationsgenauigkeit zu gewährleisten. Das daraus resultierende kuratierte mitochondriale oxidative Stressgen-Panel (MOS-Gene) wurde anschließend als Referenzsatz für die Integration mit den differenziell exprimierten Genen verwendet, die aus beiden transkriptomischen Datensätzen identifiziert wurden.

Die Schnittmenge der kuratierten MOS-Genliste mit den DEGs aus GSE231524 und GSE231525 wurde in R mittels dplyr (v1.1.3)¹⁹ und der Base R intersect()-Funktionen durchgeführt. Dieser integrative Ansatz ermöglichte die Identifikation von MOS-DEGs, die Gene repräsentieren, die funktionell mit mitochondrialum Stoffwechsel, Redoxregulation und oxidativer Stressanpassung verknüpft sind. Die Überschneidung der Datensätze wurde mit dem VennDiagram-Paket (v1.7.3) in R visualisiert, um gemeinsame und einzigartige Gene in den experimentellen Modellen²⁰ zu illustrieren. Die verfeinerte Liste der MOS-DEGs wurde für nachgelagerte Analysen verwendet und liefert mechanistische Einblicke in die zugrunde liegende transkriptionelle und metabolische Reprogrammierung der HER2-gezielten Therapieresistenz.

Expressionsprofilierung und Visualisierung von MOS-DEGs

Die Expressionsprofilierung der identifizierten MOS-DEGs wurde mit den Paketen ComplexHeatmap (v2.18.0)²¹ und pheatmap (v1.0.12) in RStudio durchgeführt, um globale Ausdrucksmuster über elterliche, arzneimitteltolerante und resistente Bedingungen zu visualisieren. Normalisierte Zähldaten wurden mittels Z-Score-Skalierung transformiert, um die Genexpressionsmatrix über die Proben hinweg zu standardisieren. Das Clustering wurde mit euklidischen Distanz- und vollständigen Verknüpfungsmethoden durchgeführt, um Koexpressionsmuster zu erkennen und zustandsspezifische transkriptionelle Profile zu unterscheiden. Heatmaps und Clustering-Diagramme wurden mit ggplot2 generiert, um eine klare visuelle Unterscheidung zwischen den Bedingungen sicherzustellen. Dieser Visualisierungsansatz erleichterte die Identifikation von Gengruppen, die mit mitochondrialer Aktivität, oxidativer Stressmodulation und metabolischer Umprogrammierung unter arzneimittelresistenten Zuständen assoziiert sind.

Funktionale Anreicherung und Wegannotation

Um die biologische Bedeutung und regulatorischen Mechanismen der identifizierten MOS-DEGs zu untersuchen, wurden Gene Ontology (GO) und die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen mit R Studio (Version 4.3.1) durchgeführt. Die Analysen wurden in der tidyverse-Umgebung unter Verwendung mehrerer Bioconductor-Pakete für reproduzierbare Berechnungen und Visualisierungen durchgeführt. Genannotation und Identifikationskartierung wurden mit der Organisation durchgeführt. Hs.eg.db Datenbank (https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/) basierend auf dem Homo sapiens-Referenzgenom (GRCh38). Die GO-Anreicherungsanalyse wurde mit dem clusterProfiler-Paket (Version 4.8.1; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/) durchgeführt, das Gene in drei Hauptontologien einteilt – Biological Process (BP), Cellular Component (CC) und Molecular Function (MF). Die^{EnrichGO-22-Funktion} wurde mit Parametern verwendet, die auf p-Wert < 0,05 gesetzt und p-Wert angepasst wurden. (FDR) < 0,05, wobei die Benjamini–Hochberg-Korrekturmethode angewendet wurde. Visualisierungen, darunter Balkendiagramme, Punktdiagramme und Akkorddiagramme, wurden mit Enrichplot (https://bioconductor.org/packages/enrichplot/), ggplot2¹³ (https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/) und GOplot (https://cran.r-project.org/web/packages/GOplot/) erstellt. Diese Werkzeuge boten einen strukturierten Überblick über die angereicherten GO-Begriffe und deren Genassoziationen.

Die KEGG-Anreicherung des Pfades wurde mit der Funktion enrichKEGG() innerhalb des clusterProfiler-Pakets durchgeführt, wobei die menschliche KEGG-Datenbank (https://www.genome.jp/kegg/) referenziert wurde. Das KEGGREST-Paket (https://bioconductor.org/packages/KEGGREST/) wurde für die Abruf und Annotation von Pfaddaten verwendet. Wege mit bereinigtem p-Wert. (q-Wert) < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Visualisierung und Pfadkartierung wurden mit Pathview (https://bioconductor.org/packages/pathview/), ggplot2 und Enrichplot durchgeführt, während igraph und ggraph für Netzwerkdarstellung²³ verwendet wurden. Alle Anreicherungsanalysen und -visualisierungen wurden in R Studio (v4.3.1) unter Verwendung reproduzierbaren Codes und standardisierter Bioconductor-Workflows implementiert, um eine zuverlässige Identifikation der angereicherten funktionalen Kategorien und biologischen Signalwege zu gewährleisten, die mit den MOS-DEGs verbunden sind.

ROC-basierte Validierung prädiktiver Biomarker bei Brustkrebs

Zur Validierung der klinischen Prädiktionskraft der MOS-DEGs wurde die Analyse der Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC) mit dem ROCplotter Online-Tool (https://www.rocplot.org/)²⁴ durchgeführt. ROCplotter ist eine integrierte webbasierte Plattform, die Genexpressionsdaten mit klinisch annotierten Behandlungs-Response-Datensätzen von 3.104 Brustkrebspatientinnen kombiniert, darunter solche, die mit Chemotherapie, Hormontherapie oder Anti-HER2-Medikamenten behandelt wurden.

Die Analyse wurde unter Verwendung der Parameter "pathologische vollständige Antwort" als Ergebnisvariable und "jede Chemotherapie" als Behandlungskategorie durchgeführt. Genexpressionswerte, die aus Affymetrix-Mikroarray-Datensätzen abgeleitet wurden, wurden automatisch in Responder- und Nonresponder-Gruppen basierend auf klinischen Annotationen innerhalb der Plattform geschichtet.

Die Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC)-Kurve (AUC), der Mann–Whitney-U-Test, der Faltungswechsel und der Chi-Quadrat-Test wurden angewandt, um die Fähigkeit jedes Gens zu bewerten, Responder von Nicht-Respondern zu unterscheiden. Die Fläche unter der Kurve (AUC) wurde als primäre Kennzahl zur Bewertung diskriminierender Leistung verwendet. AUC-Werte über 0,55 mit ROC-p-Werten < 0,05 wurden als signifikant angesehen und entsprechen der moderaten prädiktiven Leistung, die typisch für transkriptomische Biomarker ist, während die Korrektur der False Discovery Rate (FDR) angewandt wurde, um die analytische Strenge aufrechtzuerhalten.

Alle ausgewählten MOS-DEGs wurden mit ihren entsprechenden Affymetrix-Sonden-IDs abgefragt. Das diskriminative Potenzial jedes Gens wurde in klinischen Brustkrebskohorten bewertet, wobei die Expressionsdaten in Responder- und Nonresponder-Gruppen geschichtet wurden. ROC-Kurven, Boxplots und zugehörige statistische Ausgaben wurden direkt von der ROC-Plotter-Plattform generiert und zur nachgeschalteten Visualisierung und zum Vergleich exportiert. Die Analyse quantifizierte den prädiktiven Wert von Redox- und Stoffwechselregulatoren, die an mitochondrialem oxidativem Stress beteiligt sind. Gene, die über klinische Proben hinweg eine konsistente prädiktive Signifikanz zeigten, wurden für die Aufnahme in das endgültige Prädiktionspanel beibehalten.

Differentialexpressionsanalyse in Tumor-, normalen und metastatischen Geweben (TNM-Plot-Analyse)

Die Expressionsmuster der oberen MOS-DEGs wurden über normale, tumorale und metastatische Brustgewebe mit dem TNMplot-Webtool v2 (https://tnmplot.com/analysis/)²⁵ analysiert. Sowohl RNA-Seq (TCGA + GTEx + MET500) als auch Genchip-Datensätze wurden untersucht, um plattformübergreifende Validierung sicherzustellen. Das Modul "Multiple Gene Analysis" wurde mit Breast Invasive Carcinoma als ausgewähltem Gewebetyp²⁶ verwendet. Die Expressionswerte wurden log₂-transformiert und in den Gruppen Tumor vs. Normal (TvsN), Metastasion vs. Tumor (MvsT) sowie Metastasion vs. Normal (MvsN) verglichen. TNMplot berechnete automatisch Fold-Change (FC) und p-Werte mithilfe des Mann–Whitney U-Tests zur Bewertung der statistischen Signifikanz. Die Expressionsverteilungen wurden als Boxplots und Dichteplots visualisiert, die direkt aus der TNM-Schnittstelle generiert wurden, wobei grün, rot und grau normale, tumor- bzw. metastatische Gewebe darstellten. Alle Figuren wurden in hoher Auflösung exportiert, um in den Ergebnisbereich integriert zu werden. Diese Dual-Plattform-Analyse ermöglichte eine robuste Identifizierung und Validierung wichtiger mitochondrialer Redox-Metabol-Regulatoren, die mit dem Fortschreiten von Brustkrebs^{assoziiert sind 27}.

Überlebens- und prognostische Analyse mit dem Kaplan–Meier-Plotter

Um die prognostische Relevanz von MOS-DEGs bei Brustkrebs zu bewerten, wurde eine Überlebensanalyse mit dem Online-Tool Kaplan–Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis/)²⁸ durchgeführt. Diese Datenbank integriert Genexpressions- und Überlebensdaten von mehr als 4.900 Brustkrebspatientinnen, abgeleitet aus mehreren GEO-, EGA- und TCGA-Datensätzen. Die Analyse wurde auf rezidivfreies Überleben (RFS) mit einzelnen Affymetrix-Sonden-IDs durchgeführt, die den priorisierten Genen entsprechen: 225609_at (GSR), 201761_at (MTHFD2), 201619_at (PRDX3/AOP1) und 201128_s_at (ACLY). Die Patienten wurden anhand des medianen Expressionsgrenzwerts in Hoch- und Niedrigausdrucksgruppen eingeteilt, und die Überlebenswahrscheinlichkeiten wurden mit der Kaplan–Meier-Methode geschätzt. Der Log-Rang-Test wurde verwendet, um die statistische Signifikanz zwischen Überlebenskurven zu bewerten, und Hazard Ratios (HRs) mit 95%-Konfidenzintervallen (KI) wurden automatisch vom Tool berechnet. Alle Analysen wurden mit dem RFS-Endpunkt durchgeführt, ohne Restriktion basierend auf dem Hormonrezeptor oder HER2-Status (ER, PR, HER2 = alle). Redundante Stichproben wurden entfernt, und Annahmen zu proportionalen Gefahren wurden überprüft, um die statistische Robustheit sicherzustellen. Qualitätskontrollfilter schlossen verzerrte Mikroarrays aus. Es wurde keine manuelle Sondenauswahl oder p-Wertkorrektur für mehrfache Tests durchgeführt, gemäß den Standardeinstellungen des KM Plotters. Die statistische Signifikanz wurde als S. < 0,05 definiert. Überlebensdiagramme wurden visualisiert und in hoher Auflösung zur weiteren Interpretation heruntergeladen, wobei die Ergebnisse zwischen hohen und niedrigen Expressern jedes Kandidaten-MOS-Gens^29,30 verglichen wurden.

Die vorliegende Analyse wurde mit Datensätzen eingeleitet, die ausschließlich HER2^+- Brustkrebsproben enthalten, um differenziell exprimierte Gene (DEGs) und Hub-Gene zu identifizieren. Anschließend wurde eine Überlebensanalyse ohne Einschränkung auf den HER2-Status (ER, PR, HER2 = alle) durchgeführt, um die breitere prognostische Relevanz und Generalisierbarkeit der identifizierten Gene zu bewerten. Dieser Ansatz wurde als sekundärer Validierungsschritt angewandt, anstatt den Studienfokus neu zu definieren. Daher werden die prognostischen Implikationen der identifizierten Hub-Gene vorsichtig interpretiert, wobei die primären Schlussfolgerungen weiterhin spezifisch für HER2^+- Brustkrebs bleiben.

Die kanonischen Transkriptsequenzen von MTHFD2-201 (ENST00000394053.7) und PRDX3-201 (ENST00000298510.4) wurden vom Ensembl Genome Browser (https://www.ensembl.org)^31,32 abgerufen. Die Variantenannotation und -klassifikation wurden mit dem Ensembl Variant Effect Predictor (VEP) (https://www.ensembl.org/vep) durchgeführt, der detaillierten genomischen Kontext, Codon-Veränderungen und Aminosäuresubstitutionen für jede identifizierte Variante bereitstellte. Für die nachgelagerte Analyse wurden nur Missense-Varianten (nicht-synonyme SNPs) ausgewählt.

Vorhersage der Pathogenizität und Variantenpriorisierung

Die funktionalen Folgen jedes nsSNP wurden mit einer Kombination von rechnergestützten Vorhersagewerkzeugen bewertet. SIFT (https://sift.bii.a-star.edu.sg) wurde angewendet, um die Aminosäurekonservierung zu bewerten und Varianten mit einem Wert ≤ 0,05 als schädlich³³ zu klassifizieren. PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2) schätzte die strukturelle und evolutionäre Wirkung von Substitutionen, wobei Werte ≥ 0,85 wahrscheinlichen Schaden^{von 34} anzeigten. CADD (https://cadd.gs.washington.edu) lieferte einen zusammengesetzten Schadenswert, der mehrere Annotationen integrierte, wobei Werte ≥ 20 ein hohes pathogenes Potenzial³⁵ anzeigten. Komplementäre Metriken von MetaLR³⁶, Mutation Assessor und REVEL wurden aus der VEP-Schnittstelle integriert, um die Prädiktionszuverlässigkeit³⁷ zu verbessern. Varianten, die die Schwellenwerte MetaLR ≥ 0,70, Mutation Assessor ≥ 3,5 und REVEL ≥ 0,75 erreichten, wurden als wahrscheinlich pathogen bewertet.

Strukturelle und mechanistische Auswirkungsprognose

Um zu bewerten, wie Aminosäuresubstitutionen die strukturelle Integrität und biochemische Funktion beeinflussen, wurde jedes top-bewertete nsSNP mit MutPred2 (http://mutpred.mutdb.org)³⁸ und DynaMut (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut)³⁹ weiter analysiert. MutPred2 schätzte die Wahrscheinlichkeit einer funktionellen Störung, einschließlich veränderter katalytischer Aktivität, Gewinn oder Verlust metallbindender Rückstände, Veränderungen der Lösungsmittelzugänglichkeit und allosterischer Modulation, wobei Werte ≥ 0,80 als hochpathogen klassifiziert wurden. DynaMut berechnete die Gibbs-Freienergieveränderung (ΔΔG) zwischen Wildtyp- und Mutantenproteinen, bewertete die Richtung und Größe der Stabilitätsänderung und erstellte Visualisierungen von atomaren Verschiebungen und Wasserstoffbrücken-Neuordnungen.

Sekundäre und 3D-Strukturmodellierung sowie Sichtbarkeitsprofilierung

Die experimentell aufgelösten Kristallstrukturen von MTHFD2 und PRDX3 wurden aus der Protein Data Bank (PDB) gewonnen und mit PyMOL V:3.1 (https://pymol.org)⁴⁰ verarbeitet, um die räumliche Verteilung schädlicher Reste zu visualisieren. Mutante Modelle wurden durch die Einführung der entsprechenden Aminosäuresubstitutionen, gefolgt von struktureller Verfeinerung und Energieminimierung erstellt. Eine vergleichende 3D-Inspektion zeigte Verschiebungen sekundärer Elemente, veränderte interatomare Kontakte und die räumliche Nähe von nsSNPs zu katalytischen und kofaktorbindenden Domänen hervor und zeigte potenzielle Störungen der Redox- und Stoffwechselfunktionen auf.

Sekundärstruktur- und Lösungsmittelexpositionsanalysen wurden mit PSIPRED V: 3.2 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred^)41,42 und NetSurfP 3.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetSurfP-2.0)⁴³ durchgeführt. Diese Werkzeuge sagten α-Helices, β-Stränge, Spiralen und ungeordnete Regionen sowie relative Solvent Accessibility (RSA)-Werte voraus. Reste mit moderaten bis hohen RSA-Werten und struktureller Ordnung wurden kartiert, um lösungsmittelexponierte und funktional kritische Positionen zu identifizieren. Die betroffenen Stellen wurden in 2D-Topologiediagrammen visualisiert, um zu bestimmen, ob schädliche Mutationen in starren katalytischen Kernen oder flexiblen Schleifregionen auftreten, wodurch ihre wahrscheinlichen Auswirkungen auf die Proteinfaltungsdynamik und enzymatische Effizienz vorhergesagt wurden.

Datenbank-Crossvalidierung, funktionale Integration und Stabilitätsvalidierung

Jedes priorisierte nsSNP wurde mit populationsbezogenen genomischen Datenbanken wie dbSNP, 1000 Genomes, ExAC und gnomAD abgeglichen, um Variantenhäufigkeit, globale Allelverteilung und zuvor berichtete klinische Assoziationen zu bestätigen. Die Integration von evolutionärer Konservierung, struktureller Modellierung und maschinell-learningbasierter funktionaler Vorhersage ermöglichte die Identifizierung von hochkonfidenzbasierten schädlichen Varianten in MTHFD2 und PRDX3. Diese wirkungsvollen Mutationen wurden anschließend auf funktionelle Domänen abgestuft, um ihre potenzielle Rolle bei mitochondrialem oxidativem Stressungleichgewicht, veränderter metabolischer Signalübertragung und therapeutischer Resistenz bei Brustkrebs aufzuklären. Um die thermodynamischen Folgen jeder schädlichen Substitution weiter zu bestätigen, wurde iMutant 3.0 (https://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant3.0.html)⁴⁴ verwendet, um die Auswirkungen von Mutationen auf die Proteinstabilität anhand von Sequenz- und Strukturdaten vorherzusagen. Die Analyse berechnete ΔΔG-Werte (kcal/mol), die die Veränderung der freien Energie zwischen Wildtyp- und Mutantenproteinen repräsentieren. Varianten mit negativen ΔΔG-Werten wurden als destabilisierende Mutationen klassifiziert, was auf eine verminderte Proteinstabilität und eine erhöhte Entfaltungswahrscheinlichkeit hinweist. Die Integration von iMutant-Vorhersagen mit DynaMut- und MutPred2-Ergebnissen ermöglichte eine Kreuzvalidierung zur Identifizierung strukturell kritischer Reste, die wahrscheinlich die Redoxfunktion, katalytische Integrität und die allgemeine Proteinkonformationsstabilität beeinflussen.

Integrierte funktionelle Interpretation und therapeutische Relevanz

Alle identifizierten schädlichen nsSNPs wurden durch Querverweise mit dbSNP-, gnomAD- und ExAC-Populationsdatenbanken validiert, um Häufigkeiten kleiner Allele und zuvor berichtete Assoziationen mit Krebsphänotypen zu überprüfen. Integrative Interpretation von Daten zur evolutionären Konservierung, struktureller Modellierung und Stabilität zeigte, dass die hochwirkungsvollen Mutationen rs1471336772 (MTHFD2) und rs747786383 (PRDX3) die stärksten schädlichen Effekte auf die Proteinkonformation und katalytische Effizienz haben. Die rechnergestützten Ergebnisse legen zusammen nahe, dass Mutationen in MTHFD2 den NADPH-abhängigen Redoxstoffwechsel destabilisieren, während Mutationen in PRDX3 die durch Peroxidase-vermittelten oxidativen Stressabwehr beeinträchtigen, was zu mitochondrialer Dysfunktion und Tumoraggressivität beiträgt. Diese auf nsSNP basierende strukturelle und funktionelle Analyse bietet eine rechnergestützte Grundlage für zukünftige therapeutische Screenings und mutationale Validierung und hebt MTHFD2 und PRDX3 als Präzisionsbiomarker für redox-gezielte Brustkrebstherapien hervor. Um die Klarheit zu verbessern und einen umfassenden Überblick über die analytische Strategie zu geben, wird in Abbildung 2 ein schematischer Workflow mit der Zusammenfassung der wichtigsten Schritte der Studie dargestellt. Der Arbeitsablauf integriert die Analyse der differentiellen Genexpression, mitochondriale Genfilterung, den Aufbau von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken, klinische Validierung mittels ROC-Analyse und nsSNP-basierte strukturelle Charakterisierung. Dieses stufenweise Framework hebt den logischen Fortschritt von der transkriptomischen Datenverarbeitung zur Biomarker-Identifikation und funktionalen Interpretation hervor.

Abbildung 2. Integrativer mehrstufiger Workflow zur Identifizierung und Validierung mitochondrialer biomarker mit oxidativem Stress bei HER2^+- Brustkrebs. Dieses Schema fasst die in der Studie verwendete analytische Pipeline zusammen. Zunächst wurde eine Analyse der differenziellen Genexpression (DEG) an RNA-seq-Datensätzen (GSE231524 und GSE231525) durchgeführt, um signifikant veränderte Gene zu identifizieren. Diese DEGs wurden mit kuratierten mitochondrialen oxidativ-stressbezogenen Genen kombiniert, um MOS-TEGs zu erhalten. Anschließend wurde eine Analyse des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) mit STRING und Cytoscape durchgeführt, um Hub-Gene und funktionelle Module zu identifizieren. Anschließend wurde die Analyse der Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC) mit der ROCplotter-Plattform angewendet, um die prädiktive Leistung ausgewählter Gene in klinischen Kohorten zu bewerten. Abschließend wurden nicht-synonyme SNP-(nsSNP)-Analysen und strukturelle Modellierungen durchgeführt, um die potenziellen funktionellen und strukturellen Auswirkungen von Schlüsselvarianten in priorisierten Genen (MTHFD2 und PRDX3) zu bewerten. Dieser integrative Workflow verbindet transkriptomische, Netzwerk-, klinische und strukturelle Analysen, um potenzielle Biomarker und therapeutische Ziele zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Results

Analyse der differenziellen Genexpression

Differenzielle Expressionsprofilierung wurde durchgeführt, um transkriptionelle Veränderungen im Zusammenhang mit HER2^+- Brustkrebsprogression und Therapieresistenz anhand von zwei unabhängigen RNA-seq-Datensätzen, GSE231524 und GSE231525, zu untersuchen. Im ersten Datensatz (GSE231524) wurden insgesamt 19.727 Gene zunächst quantifiziert. Nach Normalisierung, Filterung und Anwendung des angepassten Regressionsmodells (ARM) für die differentielle Expression blieben 6.604 Gene als signifikant exprimiert erhalten (Ergänzungstabelle S1). Nach der Standardisierung von Gensymbolen, der Entfernung von Duplikaten und der Verfeinerung der Annotation wurden 6.300 einzigartige Gene für nachgelagerte Analysen finalisiert. Die Vulkandiagramme, MA-Diagramme und Dispersionsschätzungen (Abbildung 3A-C) zeigen deutlich die Verteilung signifikant hoch- und abregulierter Gene (angepasst p < 0,05, |log₂FC| ≥ 1). Die Dispersionsschätzungen zeigen gut angepasste Varianzmuster über mittlere normalisierte Zählungen, was auf eine robuste Normalisierung und angemessene Modellanpassung im DESeq2-Workflow⁴⁵ hinweist.

Ebenso wurde für den zweiten Datensatz (GSE231525) ein Anfangssatz von 18.372 Genen erhalten. Nach Anwendung derselben ARM-basierten differenziellen Expressionsanalyse-Pipeline wurden 9.508 Gene als signifikant exprimiert identifiziert (Ergänzungstabelle S2). Nach Umbenennung, Entfernung von Duplikaten und Qualitätskontrollfilterung wurden 8.510 einzigartige Gene für weitere vergleichende Analysen beibehalten. Die Visualisierungen (Abbildung 3D-F) zeigen konsistente Muster der Genexpressionsvariation über Proben hinweg mit klar definierten Clustern von hoch- und herunterregulierten Genen unter experimentellen Bedingungen. Die MA-Diagramme und Dispersionsschätzungen zeigen, dass die Daten eine gut stabilisierte Varianz und keinen wesentlichen Ausreißereinfluss aufweisen, was die Zuverlässigkeit der nachgelagerten integrativen Analysen^{bestätigt 46}.

Zusammen heben diese Analysen die Reproduzierbarkeit und Integrität der Genexpressionsmuster zwischen den beiden Datensätzen hervor. Sowohl GSE231524 als auch GSE231525 wiesen unterschiedliche transkriptionelle Profile auf, die mit HER2-assoziierten Signalstörungen und therapieinduziertem metabolischem Stress übereinstimmen. Die nun harmonisierten und qualitätskontrollierten verarbeiteten Datensätze bilden die Grundlage für die Identifizierung mitochondrialer oxidativer, stressbezogener Gene und anschließende netzwerkbasierte Anreicherungsanalysen⁴⁷.

Abbildung 3. Analyse der unterschiedlichen Genexpression von HER2⁺ Brustkrebsdatensätzen. Ergebnisse für (A-C) GSE231524 (Kontrolle vs. Brustkrebs) und (D-F) für GSE231525 (Kontrolle vs. DUSP6 Knockdown). (A,D) Vulkandiagramme zeigen deutlich hochregulierte (rote) und abregulierte (blaue) Gene (padj. < 0,05, |log₂FC| ≥ 1). (B,E) MA-Diagramme zeigen die Log₂-Falz-Änderung im Vergleich zu den mittleren normalisierten Zählungen und bestätigen stabile Varianz über die Stichproben hinweg. (C,F) Dispersionsdiagramme zeigen angepasste Varianztrends und validieren die korrekte Normalisierung in DESeq2. Zusammen zeigen die Datensätze konsistente Transkriptionsänderungen und eine robuste Modellanpassung, die für die nachgelagerte Analyse geeignet ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Identifikation von mitochondrialen, oxidativ-stressbedingten, differenziell exprimierten Genen (MOS-DEGs)

Nach der differentiellen Expressionsanalyse wurden die beiden Datensätze (GSE231524 und GSE231525) verglichen, um gemeinsame transkriptionelle Veränderungen zu identifizieren, die mit der HER2^+- Brustkrebstherapieresistenz assoziiert sind. Um sich speziell auf metabolische und oxidative-stressbezogene Signalwege zu konzentrieren, wurden beide DEG-Listen mit einem kuratierten mitochondrialen Gen-(MG)-Datensatz überlappt, der 1.137 Gene aus den Datenbanken MitoCarta3.0, KEGG Oxidative Phosphorylation und GO:0006979 (response to oxidative stress) enthält.

Das Venn-Diagramm (Abbildung 4A) zeigt die Überschneidung zwischen DEGs sowohl aus Datensätzen als auch aus dem mitochondrialen Genset. Aus dieser Schnittmenge wurden insgesamt 262 überlappende Gene identifiziert, die als mitochondriale oxidative, stressbezogene differenziell exprimierte Gene (MOS-DEGs) bezeichnet werden. Diese überlappenden Gene stellen eine konvergente mitochondriale Reaktion auf HER2-gezielten Therapiestress dar, indem sie oxidative Stressanpassung, metabolische Umprogrammierung und Redoxhomöostase integrieren. Konkret waren 2.706 einzigartige DEGs exklusiv für GSE231524, 4.870 für GSE231525, während 3.167 Gene zwischen den beiden Datensätzen geteilt wurden. Das überlappende Set von 262 Genen mit mitochondrialer Herkunft unterstreicht die biologische Konvergenz zwischen Redox-Signalübertragung, Energiestoffwechsel und mitochondrialer Funktion bei resistenten Brustkrebsphänotypen (Ergänzungstabelle S3). Um diese MOS-DEGs weiter zu charakterisieren, wurde eine Expressions-Heatmap erstellt, um transkriptionelle Variationen über experimentelle Bedingungen hinweg zu visualisieren (Abbildung 4B). Mit RStudio (v4.3.2) wurde hierarchisches Clustering über die Pakete ComplexHeatmap (v2.18.0) und pheatmap (v1.0.12) durchgeführt, während Datennormalisierung und Skalierung mit DESeq2 (v1.42.0) und ggplot2 (v3.5.0) erreicht wurden. Die Heatmap zeigt die z-Score-skalierten Expressionsprofile der 262 MOS-DEGs über alle Proben hinweg und zeigt deutliche Clustermuster, die Kontroll-, arzneimitteltolerante und resistente Phänotypen unterscheiden.

Bemerkenswert ist, dass mehrere Gene, die mit der mitochondrialen Atmung und der Abwehr gegen oxidativen Stress assoziiert sind, darunter PRDX3, SOD2, NDUFA1, COX6C, ATP5ME und GPX1 , eine erhebliche Hochregulation in resistenten und DUSP6-Knockdown-Proben aufwiesen, während metabolische Regulatoren wie IDH2, ACLY und SDHA erheblich aufwiesen. zeigte variable Modulation, was auf dynamische Veränderungen im mitochondrialen Energiestoffwechsel hinweist. Diese transkriptionelle Reprogrammierung stützt die Hypothese, dass HER2+-resistente Zellen auf mitochondrialen oxidativen Stressanpassungen und metabolische Plastizität für das Überleben unter therapeutischem Druck angewiesen sind. Insgesamt lieferte die Integration mitochondrialer Gensets mit unterschiedlichen Expressionsergebnissen eine gezielte Teilmenge funktionell relevanter Gen-MOS-DEGs, die zentral für das Redox-Gleichgewicht, die oxidative Phosphorylierung und metabolische Resilienz in resistenten Brustkrebszellen sind. Die Expressions-Heatmap bestätigt, dass diese Gene eine kohärente transkriptionelle Signatur bilden, die mit Therapieanpassung und mitochondrialer funktioneller Remodellierung assoziiert ist.

Abbildung 4. Identifikation und Expressionsprofilierung von MOS-DEGs. (A) Venn-Diagramm, das die Überschneidung zwischen DEGs aus GSE231524, GSE231525 und 1.137 mitochondrialen Genen zeigt. Die Schnittstelle identifiziert 262 gemeinsame MOS-DEGs, die an oxidativem Stress und mitochondrialem Stoffwechsel beteiligt sind. (B) Heatmap, die z-Score-skalierte Expressionsprofile der 262 MOS-DEGs über Kontroll-, arzneimitteltolerante und resistente Proben hinweg darstellt. Die Heatmap wurde in RStudio mithilfe der ComplexHeatmap-, pheatmap-, ggplot2- und DESeq2-Pakete erzeugt, zeigte eine klare Clusterbildung zwischen experimentellen Bedingungen und hob die Hochregulation wichtiger mitochondrialer oxidativer Stressregulatoren in resistenten Phänotypen hervor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Analyse des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) und der Signalweganreicherung

Eine anschließende Analyse der Protein-Protein-Interaktion (PPI) mit der STRING-Datenbank zeigte ein dicht miteinander verbundenes mitochondriales, oxidatives, stressbezogenes DEG-(MOS-DEG)-Netzwerk mit 210 Knoten und 951 Kanten, mit einem durchschnittlichen Knotengrad von 9,06 und einem lokalen Clusteringkoeffizienten von 0,457 (Abbildung 5A). Der PPI-Anreicherungs-p-Wert (< 1,0 × 10⁻¹⁶) zeigte, dass die beobachtete Konnektivität signifikant größer war als zufällig erwartet, was eine funktional kohärente mitochondriale Interaktionslandschaft widerspiegelt. Kern-Hubproteine wie COX6C, NDUFA10, ATP5F1, PRDX3 und SOD2 traten als zentrale Vermittler der Redoxhomöostase und mitochondrialen Stoffwechselregulation hervor, was ihre Bedeutung für die Aufrechterhaltung des oxidativen Gleichgewichts und der Energiestabilität während therapiebedingtem Stress unterstreicht.

Um das Netzwerk zu verfeinern und die einflussreichsten regulatorischen Elemente zu identifizieren, wurde das MOS-DEG-Interaktom in Cytoscape importiert und mit dem CytoHubba MCC (Maximal Clique Centrality) Algorithmus analysiert (Abbildung 5B). Das Ranking zeigte die 50 besten Hub-MOS-DEGs, die mit STRING für funktionale Anreicherung und Netzwerkclustering neu analysiert wurden (Abbildung 5C,D). Das resultierende Subnetzwerk zeigte eine außergewöhnlich hohe funktionale Kohäsion, bestehend aus 369 beobachteten Wechselwirkungen (erwartet = 39), einem durchschnittlichen Knotengrad von 14,76, einem lokalen Clusteringkoeffizienten von 0,698 und einem Anreicherungs-p-Wert von 0,0. Diese Metriken bestätigten, dass die Organisation des Netzwerks nicht zufällig war, sondern eine streng regulierte molekulare Architektur darstellte, die mitochondrialen Stoffwechsel und oxidatives Stresssignal integrierte. Die MCL-Clustering-Analyse zeigte drei hoch verbundene funktionelle Module: eines, das dem zentralen Energiestoffwechsel entspricht, einschließlich wichtiger TCA-Zyklus- und oxidativer Phosphorylierungsenzyme (SDHA, IDH2, ACO2, DLAT, UQCRC1, COX10); eine zweite repräsentiert die mitochondriale Translationsmaschinerie (MRPL16, MRPL45, DAP3, LYRM7), die die mitochondriale Proteinsynthese und die Integrität des respiratorischen Komplexes aufrechterhält; und ein drittes, das Aminosäurekatabolismus und Redoxregulation (GLUD1, GLS2, PRODH, L2HGDH, ALDH18A1) umfasst, was für die Auffüllung von TCA-Zwischenprodukten und die Aufrechterhaltung des NADH/FADH₂-Gleichgewichts für die Kontrolle zellulärer Redoxe verantwortlich ist. Die funktionelle Anreicherung zeigte eine starke Überrepräsentation der mitochondrialen Lokalisation (FDR = 3,39 × 10⁻⁵⁰), des Carbonsäurestoffwechsels (FDR = 6,33 × 10⁻²³) und der zellulären Atmung (FDR = 9,18 × 10⁻¹⁴), was darauf hindeutet, dass diese Gene eine integrierte bioenergetisch-oxidative Stressachse bilden, die oxidative Phosphorylierung, antioxidative Abwehr und Aminosäurestoffwechsel verbindet.

Basierend auf Netzwerktopologie und funktioneller Anreicherung wurden zehn Master-regulatorische MOS-Gene für eine weitere Charakterisierung priorisiert: PRDX3, MTHFD2, SDHA, NDUFV1, PDK1, ACLY, GLS2, GSR, DAP3 und LYRM7 (Abbildung 5E). Die STRING-basierte Analyse dieser kuratierten Teilmenge zeigte einen hochkohärenten Interaktionskern mit 13 direkten Assoziationen, einem durchschnittlichen Knotengrad von 2,6, einem Clusteringkoeffizienten von 0,843 und einem Netzwerkanreicherungs-p-Wert von 3,3 × 10^⁻8. Fast alle Proteine waren auf das Mitochondrium lokalisiert (9 von 10; FDR = 2,27 × 10⁻⁷) oder mitochondriale Matrix (7 von 10; FDR = 2,27 × 10⁻⁷). Die Hauptwege, die durch diese Proteine repräsentiert wurden, umfassten den Dikarboxylsäurestoffwechsel (SDHA, GLS2, MTHFD2, ACLY; FDR = 1,6 × 10⁻³), dem Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDK1, ACLY; FDR = 3,9 × 10⁻³), und der TCA-Zyklus (SDHA, ACLY; FDR = 1,68 × 10⁻²). Parallel dazu sind redoxbezogene Funktionen wie die Oxidationoreduktase-Aktivität (GSR, SDHA, PRDX3, MTHFD2, NDUFV1; FDR = 1 × 10⁻³) und Flavoprotein-Motivanreicherung (GSR, SDHA, NDUFV1; FDR = 3,9 × 10⁻³) signifikant angereichert wurden, was die Rolle des Netzwerks bei der ROS-Entgiftung und der Regulierung der mitochondrialen Redox bestätigt. Die stärksten Wechselwirkungen, darunter SDHA-NDUFV1 (Score = 0,999), SDHA-ACLY (0,964), DAP3-LYRM7 (0,678) und GSR-PRDX3 (0,661), etablierten zwei miteinander verbundene Subnetzwerke: ein Energie-Redox-Modul (SDHA-NDUFV1-ACLY-GSR-PRDX3), das oxidative Phosphorylierung mit der antioxidativen Kapazität verbindet, und ein Translations-Assemblermodul (DAP3-LYRM7), das die Funktion des mitochondridalen Ribosoms mit der Biogenese des respiratorischen Komplexes III integriert.

Zusammen bilden diese zehn Gene einen kohärenten mitochondrialen Kern, der Energiestoffwechsel, Redoxpufferung und biosynthetische Anpassung integriert. PRDX3 und GSR bilden den antioxidativen Arm, der die mitochondriale Umwelt schützt, während MTHFD2 die NADPH-Regeneration und den Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel unterstützt, die für das proliferative Überleben unerlässlich sind. SDHA und NDUFV1 verankern das Elektronentransportsystem und verbinden den TCA-Fluss mit der ATP-Produktion, während PDK1 und ACLY die metabolische Neuverdrahtung orchestrieren, die das anabole Wachstum unter Stress unterstützt. DAP3 und LYRM7 stellen strukturelle und translationale Stabilisatoren dar, die die mitochondriale Integrität erhalten. Dieses mehrstufige molekulare Rahmenwerk definiert einen bioenergetisch-redoxen regulatorischen Kern, der für die HER2-gezielte Therapieresistenz grundlegend ist. Die integrative Analyse unterstreicht, wie oxidativer Stoffwechsel und Redoxadaption vereinnahmt werden, um mitochondriale Funktionalität und zelluläre Lebensfähigkeit in resistenten Brustkrebsphänotypen zu erhalten, und zeigt potenzielle Ziele für metabolische Interventionen und Präzisionstherapie auf (Tabelle 1).

Abbildung 5. Netzwerkanalyse und Priorisierung mitochondrialer oxidativer, stressbezogener Gene. (A) STRING-basiertes PPI-Netzwerk der Top 210 MOS-DEGs, das die Gesamtinteraktionsdichte veranschaulicht. (B) Import des PPI-Netzwerks in Cytoscape zur Visualisierung und topologischen Analyse. (C) Extraktion der 50 wichtigsten Hub-MOS-DEGs mit dem CytoHubba MCC-Algorithmus. (D) Die STRING-Reanalyse der 50 wichtigsten Hub-Gene zeigt drei Hauptfunktionsmodule: zentralen Energiestoffwechsel, mitochondriale Translation und Aminosäurekatabolismus/Redoxregulation. (E) STRING-basierte Visualisierung der top 10 priorisierten MOS-DEGs, die ein hoch vernetztes oxidativ-metabolisches Netzwerk darstellen (durchschnittlicher Knotengrad = 2,6; Clusterkoeffizient = 0,843; PPI-Anreicherung p = 3,3 × 10^⁻8). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 1: Endgültiges priorisiertes Genpanel (Top 10 MOS-Masterregulatoren). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Funktionale Anreicherungsanalyse der Top 10 MOS-DEGs

Um die biologische Relevanz und die molekularen Mechanismen der mit den zehn wichtigsten priorisierten MOS-DEGs zu erläutern, wurden Gene Ontology (GO) und die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen durchgeführt. Die GO-Anreicherung wurde in drei Hauptontologien unterteilt – Biologischer Prozess (BP), Zelluläre Komponente (CC) und Molekulare Funktion (MF) –, um ihre biologischen Rollen im oxidativen Stoffwechsel und in der mitochondrialen Regulation aufzudecken.

Die Analyse des GO Biological Process (BP) zeigte eine signifikante Anreicherung in metabolischen und redoxbezogenen Signalwegen, darunter den Dicarboxylsäure-Stoffwechselprozess (GO:0043648; Anreicherungsscore = 6,87; p = 1,33 × 10⁻⁷), den Acetyl-CoA-Biosynthetikprozess (GO:0006085; Anreicherung = 4,40), die Erzeugung von Vorläufermetaboliten und Energien (GO:0006091; Anreicherung = 4,06) sowie die Elektronentransportkette (GO:0022900; Anreicherung = 4,03). Weitere angereicherte biologische Prozesse umfassten die Zellredoxhomöostase und die zelluläre Reaktion auf oxidativen Stress, was den engen Zusammenhang zwischen oxidativer Phosphorylierung, Redox-Gleichgewicht und metabolischer Umprogrammierung im Tumorfortschritt unterstreicht. Die Anreicherung der GO-Zellkomponenten (CC) zeigte eine vorherrschende Lokalisierung dieser MOS-DEGs innerhalb mitochondrialer Strukturen, insbesondere in der mitochondrialen Matrix (GO:0005759; p = 5,79 × 10⁻¹⁰), der mitochondrialen inneren Membran, dem Oxidoreduktasekomplex und dem respiratorischen Kettenkomplex.

Das Vorhandensein von Genen wie MTHFD2, NDUFV1, PRDX3, GSR und SDHA spiegelt ihre direkte Rolle im Elektronentransport und in oxidativen Phosphorylierungssystemen wider und stützt ihre Bedeutung für die mitochondriale Energieumwandlung und Redox-Signalübertragung. Die Analyse der GO-Molekularfunktion (MF) hob wichtige katalytische und Redoxfunktionen hervor, darunter die Oxidoreduktase-Aktivität, die auf die Schwefelgruppe der Spender wirkt, NAD(P) als Akzeptor (GO:0016668; Anreicherung = 4,68; p = 2,07 × 10⁻⁵), Elektronentransferaktivität (GO:0009055; Anreicherung = 4,43), antioxidative Aktivität (GO:0016209; Anreicherung = 3,02) und Flavin-Adenin-Dinukleotidbindung (FAD) (GO:0050660; Anreicherung = 3,03). Die konstante Anreicherung von PRDX3, GSR, MTHFD2 und SDHA über mehrere redoxbezogene Funktionen hinweg unterstützt ihre Beteiligung an der Aufrechterhaltung des oxidativen Gleichgewichts in mitochondrialen Kompartimenten weiter. Zusammenfassend heben diese GO-Ergebnisse die zentrale Rolle von MOS-DEGs an der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung, dem NAD(P)H-vermittelten Redoxzyklus und den antioxidativen Abwehrmechanismen hervor – Prozessen, die für die Aufrechterhaltung des Tumorstoffwechsels und die Anpassung an oxidativen Stress unerlässlich sind (Abbildung 6A-D).

Abbildung 6. Genontologie-Anreicherungsanalyse der Top 10 MOS-DEGs. (A) Biologische Prozessbegriffe, die eine signifikante Anreicherung des oxidativen Stoffwechsels und der Energieerzeugung zeigen. (B) Zellanreicherung, die auf mitochondriale Lokalisation und Assoziation der respiratorischen Kette hinweist. (C) Molekularfunktionsanreicherung, die Oxidoreduktase, Elektronentransfer und antioxidative Aktivität hervorhebt. (D) Balkendiagramm, das die wichtigsten GO-Begriffe über BP-, CC- und MF-Kategorien basierend auf Anreicherungswerten und -log₁₀(p-Werte) zusammenfasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

KEGG-Anreicherungsanalyse des Signalwegs

Die KEGG-Signalweganalyse bot eine komplementäre systemebene Perspektive und zeigte, dass die Top 10 MOS-DEGs in mehreren oxidativen Stoffwechsel- und krankheitsassoziierten Wegen signifikant angereichert waren (Abbildung 7A-E). Die am stärksten angereicherten Signalwege waren der Citratzyklus (TCA-Zyklus) (hsa00020; p = 0,0002; Anreicherungsscore = 3,69), diabetische Kardiomyopathie (hsa05415; p = 0,0003), zentraler Kohlenstoffstoffwechsel bei Krebs (hsa05230; p = 0,0011) und oxidative Phosphorylierung (hsa00190; p = 0,0042). Darüber hinaus spiegelt die Anreicherung in Signalwegen wie der nicht-alkoholischen Fettlebererkrankung (NAFLD), chemischen karzinogenen-reaktiven Sauerstoffspezies, Parkinson und Prionenkrankheit die breite Verbindung dieser Gene mit oxidativen Schäden und mitochondrialer Dysfunktion wider, die häufige Merkmale von Krebs und Neurodegeneration sind. Unter den Genen, die diese Anreicherungen antreiben, waren SDHA und NDUFV1 konsistent in oxidativen Phosphorylierungen, ROS-Entgiftung und mitochondrialen Komplex-I/II-gelinkten Signalwegen vertreten. MTHFD2 und GLS2 trugen im TCA-Zyklus zum Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel und zum von Glutamin abgeleiteten anaplerotischen Fluss bei, während GSR und PRDX3 am Glutathion-Redoxzyklus teilnahmen. Diese Ergebnisse zeigen, dass metabolisch-oxidatives Crosstalk, vermittelt durch diese MOS-DEGs, sowohl der onkogenen Energie-Reprogrammierung als auch der mitochondrialen Resilienz gegenüber Stress zugrunde liegt.

Abbildung 7. KEGG-Signalweganreicherungsanalyse von MOS-DEGs. (A) Sankey-Diagramm, das MOS-DEGs mit ihren angereicherten KEGG-Wegen verknüpft und Überschneidungen bei oxidativer Phosphorylierung, TCA-Zyklus und metabolischer Umprogrammierung zeigt. (B-E) Netzwerk- und Punktdiagramme, die Gen-Weg-Beziehungen und Anreicherungsniveaus über metabolische und oxidativ-stressbezogene Signalwege veranschaulichen. Hervorgehobene Signalwege sind der TCA-Zyklus, oxidative Phosphorylierung und neurodegenerationsbedingte oxidative Schäden, was die mitochondriale oxidative Stressregulation als zentrale funktionelle Achse dieser Gene bestätigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

ROC-basierte klinische Validierung von MOS bei Brustkrebs

Eine Analyse der Empfänger-Funktionseigenschaften (ROC) wurde durchgeführt, um die Fähigkeit der priorisierten mitochondrialen oxidativen, stressbezogenen Gene zu bewerten, zwischen Chemotherapie-Respondern und Nicht-Respondern zu unterscheiden. Wie in Abbildung 8A-J gezeigt, zeigten alle untersuchten Gene eine begrenzte diskriminierende Leistung, mit AUC-Werten von etwa 0,50 bis 0,66.

Konkret zeigten PRDX3, MTHFD2, SDHA und ACLY eine relativ höhere, aber dennoch moderate Diskriminierungsfähigkeit (AUC ~0,57–0,66), während Gene wie GSR, GLS2 und mehrere elektronentransportbezogene Gene AUC-Werte nahe 0,50 aufwiesen, was auf eine nahezu zufällige Klassifikationsleistung hindeutet. Im Panel zeigte ACLY den höchsten AUC (~0,65), gefolgt von SDHA (~0,59) und MTHFD2 (~0,58), was auf eine schwache Trennung zwischen Responder- und Nichtresponder-Gruppen hindeutet.

Obwohl signifikante Unterschiede für mehrere Gene beobachtet wurden, waren die Effektgrößen gering, und die ROC-Leistung zeigt eine begrenzte prädiktive Genauigkeit bei individueller Betrachtung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mitochondriale oxidative, stressbezogene Gene allein als eigenständige prädiktive Biomarker für die Chemotherapie-Antwort nicht ausreichen. Stattdessen können sie inkrementelle Informationen innerhalb eines breiteren Multi-Gen- oder Multi-Omics-Prädiktionsrahmens beitragen. Daher sollten diese Ergebnisse als explorativ und hypothesengenerierend interpretiert werden und nicht als Hinweis auf unmittelbaren klinischen Nutzen (Abbildung 8).

Abbildung 8. ROCplotter-basierte Validierung von mitochondrialen, oxidativ-stressbezogenen Masterregulatoren bei Brustkrebs. (A-H) Empfänger-Betriebscharakteristika-Analysen der 10 bewerteten MOS-Masterregulatoren: (A) PRDX3, (B) MTHFD2, (C) SDHA, (D) NDUFV1, (E) PDK1, (F) ACLY, (G) GLS2, (H) GSR, (I) LYRM7 und (J) DAP3. Jedes Panel zeigt den AUC-Wert und die entsprechenden statistischen Kennzahlen (ROC-p-Wert und Mann-Whitney-p-Wert), die die diskriminierende Fähigkeit jedes Gens zeigen, zwischen Chemotherapie-Respondern und Nicht-Respondern zu unterscheiden. Erhöhte AUC-Werte (>0,55) deuten auf schwache bis moderate prädiktive Assoziationen zwischen Genexpression und therapeutischer Reaktion hin. Die Ergebnisse heben ACLY und PDK1 als moderate prädiktive Beiträge hervor, gefolgt von PRDX3, MTHFD2 und SDHA, während GSR und GLS2 moderate prädiktive Beiträge zur mitochondrialen Redoxhomöostase während der Chemotherapieanpassung aufweisen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Differentielle Expressionsprofilierung von Top-MOS-DEG

Um das transkriptionelle Verhalten von MOS-DEGs im Brustkrebsverlauf zu untersuchen, wurde eine vergleichende Expressionsanalyse durchgeführt, die sowohl RNA-Seq als auch Genchip-Daten aus dem Cancer Genome Atlas (TCGA), Genotype-Tissue Expression (GTEx) und MET500-Datensätzen integriert. Acht Schlüsselgene wurden über normale, tumorale und metastatische Brustgewebe analysiert, um konsistente transkriptionelle Trends zu bewerten und diejenigen zu identifizieren, die am relevantesten für Tumorentstehung und Metastasen sind.

Es wurde ein strenges Auswahlkriterium angewandt, das signifikante Upregulation als Fold-Change (FC) ≥ 1,3 für Tumor vs. Normal (TvsN) und FC ≥ 1,5 für Metastatic vs. Normal (MvsN) auf beiden Plattformen definierte. Gene, die diese Schwellenwerte in einer konsistenten Richtung erreichten, wurden als biologisch relevant angesehen und für die funktionelle Interpretation priorisiert. Wie in Abbildung 9A,B gezeigt, zeigte die RNA-Seq-basierte Expressionsanalyse, dass GSR und MTHFD2 sowohl im Tumor- als auch im metastasierten Gewebe im Vergleich zu normalen Kontrollgruppen deutlich hochreguliert waren. GSR zeigte den auffälligsten Anstieg (TvsN = 2,73; MvsN = 4,83), während MTHFD2 eine substanzielle und konsistente Induktion zeigte (TvsN = 1,88; MvsN = 1,96). Diese Ergebnisse wurden im Genchip-Datensatz validiert (Abbildung 9C, D), wo GSR erneut eine robuste Expressionserhöhung zeigte (TvsN = 1,76; MvsN = 2,19) und MTHFD2 behielt eine hohe transkriptionelle Aktivierung bei (TvsN = 2,03; MvsN = 2,55). Die starke und reproduzierbare Hochregulation dieser beiden Gene über unabhängige Plattformen hinweg unterstreicht ihre zentrale Rolle in der Regulierung des mitochondrialen Redox – GSR als primäres Enzym zur Aufrechterhaltung des Glutathion-Gleichgewichts und MTHFD2 als metabolischer Katalysator für die NADPH-Produktion und den Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel.

Für PRDX3 wurde eine moderate, aber konstante Erhöhung beobachtet, die die RNA-Seq-Einschlussschwelle erfüllte (TvsN = 1,39; MvsN = 1,58) und zeigte eine stabile Expression im Genchip-Datensatz (TvsN = 1,02; MvsN = 1,12). Funktionell unterstützt PRDX3 die mitochondriale ROS-Entgiftung und ergänzt GSR bei der Aufrechterhaltung des oxidativen Gleichgewichts. ACLY zeigte eine nahezu schwellenwerte Hochregulation (RNA-Seq: TvsN = 1,24; MvsN = 1,28; Gen-Chip: TvsN = 1,11; MvsN = 0,89), was seine metabolische Kopplungsrolle zwischen oxidativer Phosphorylierung und anaboler Lipidbiosynthese widerspiegelt. Im Gegensatz dazu zeigten PDK1, NDUFV1 und SDHA minimale oder inkonsistente Faltenveränderungen, was auf stabile mitochondriale Ausgangsaktivität mit begrenzter transkriptioneller Reaktion auf onkogener Stress hindeutet. GLS2 hingegen zeigte über beide Plattformen hinweg ein konsistentes und starkes Downregulationsmuster (RNA-Seq: TvsN = 0,32; MvsN = 0,45; Gen-Chip: TvsN = 0,66; MvsN = 0,38), was seine potenzielle Rolle als metabolischer Suppressor bestätigt, dessen Verlust das Tumorprogression durch eine gestörte, glutaminvermittelte Redoxhomöostase fördern kann (Tabelle 2).

Die Anwendung der festgelegten Schwellenwerte ermöglichte die Priorisierung von vier Genen – GSR, MTHFD2, PRDX3 und ACLY – als die konsistenstesten und biologisch relevantesten Regulatoren der mitochondrialen oxidativen Stressanpassung bei Brustkrebs. Unter diesen traten GSR und MTHFD2 als führende Masterregulatoren hervor, die eine hohe Reproduzierbarkeit und funktionelle Bedeutung für Redoxabwehr und metabolische Umprogrammierung aufwiesen. PRDX3 und ACLY. bildeten die sekundäre regulatorische Schicht und verband den antioxidativen Schutz mit der biosynthetischen Anpassung. Zusammen definieren diese Gene eine hierarchische mitochondriale Redox-metabolische Regulationsachse, die für das Überleben von Krebszellen, die oxidative Resilienz und die metabolische Flexibilität während des Tumorfortschritts und der Metastasierung unerlässlich ist (Abbildung 9A-D).

Tabelle 2: Plattformübergreifende Expressionszusammenfassung und schwellenwertbasierte Priorisierung von MOS-Masterregulatoren bei Brustkrebs. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Abbildung 9. Vergleichende Expressionsprofilierung von MOS-DEGs bei Brustkrebs. (A,B) RNA-Seq-basierte Expressionsanalyse von acht Schlüssel-MOS-Genen SDHA, PRDX3, PDK1, NDUFV1, MTHFD2, GSR, GLS2 und ACLY über normales (grünes), Tumor- (rotes) und metastasiertes (graues) Brustgewebe. Boxplots (A) zeigen die log₂-transformierten Genexpressionsniveaus, während Dichtediagramme (B) die Wahrscheinlichkeitsverteilungen über die Stichprobenkategorien hinweg veranschaulichen. (C,D) Die entsprechenden Genchip-basierten Expressionsdaten bestätigen konsistente Expressionstrends, die in der RNA-Seq-Analyse beobachtet wurden. MTHFD2 und GSR zeigen eine starke tumorspezifische Upregulation, PRDX3 eine moderate Erhöhung, PDK1 und ACLY spiegeln die metabolische Aktivierung wider, und GLS2 zeigt eine konstante Suppression, was die koordinierte Redox-Metabolische Umprogrammierung mitochondrialer Signalwege während des Fortschreitens von Brustkrebs hervorhebt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Prognostische Bewertung priorisierter MOS-DEGs

Da die Überlebensanalyse in einer breiteren Brustkrebskohorte ohne Einschränkung auf HER2-Status durchgeführt wurde, sollten diese prognostischen Ergebnisse als unterstützend und nicht als HER2-spezifisch interpretiert werden. Zur Bewertung der prognostischen Signifikans der identifizierten MOS-DEGs wurden Kaplan-Meier-Überlebenskurven erstellt, um den Zusammenhang zwischen MOS-Genexpression und rezidivfreiem Überleben (RFS) bei Brustkrebspatientinnen zu untersuchen (Abbildung 10A-D). Die Analyse umfasste 4.929 Brustkrebspatientinnen und bewertete das rezidivfreie Überleben (RFS) anhand der medianen Expressionswerte von vier ausgewählten MOS-DEGs: MTHFD2 (201761_at), PRDX3 (209766_at), GSR (225609_at) und ACLY (201128_s_at).

Wie in Abbildung 10A-D dargestellt, wurden zwischen diesen MOS-DEGs unterschiedliche prognostische Muster beobachtet. MTHFD2 zeigte eine starke negative prognostische Assoziation (HR = 1,53; 95%-KI: 1,39–1,70; Log-Rang p = 1,1×10⁻¹⁶), wobei erhöhte Expressionsniveaus signifikant mit kürzerem RFS korrelierten, was seine Rolle als onkogener metabolischer Regulator für den Einkohlenstoffstoffwechsel und die Redoxadaption unterstreicht (Abbildung 10B). Umgekehrt zeigte PRDX3 (209766_at) einen signifikanten Schutzeffekt (HR = 0,73; 95%-KI: 0,66–0,81; log-Rang p = 7,7×10⁻¹⁰), wobei eine höhere Expression mit verlängertem RFS verbunden war, was seine Funktion als mitochondriales Antioxidansenzym zur Reduktion von oxidativem Stress betonte (Abbildung 10C). Im Gegensatz dazu zeigten GSR (HR = 1,05; p = 0,50) und ACLY (HR = 1,02; p = 0,77.) keinen signifikanten Zusammenhang mit einem rezidivfreien Überleben (Abbildung 10A,D), was auf eine sekundäre, unterstützende Rolle bei der Aufrechterhaltung des Redox-Gleichgewichts und der metabolischen Homöostase hindeutet, anstatt die klinischen Ergebnisse direkt zu beeinflussen. Insgesamt identifizieren diese Ergebnisse MTHFD2 als ein zentrales MOS-DEG mit schlechter Prognose, das die metabolische Proliferation und das Redox-Ungleichgewicht vorantreibt, während PRDX3 als schützendes MOS-DEG hervorgeht, das zur Redoxstabilität und einer günstigen Prognose beiträgt. Zusammen repräsentieren diese beiden Gene gegensätzliche molekulare Kräfte im mitochondrialen oxidativen Stressrahmen MTHFD2, das die metabolische Aggressivität fördert, und PRDX3, das antioxidative Abwehrmechanismen bei Brustkrebs verstärkt (Abbildung 10A-D).

Abbildung 10. Kaplan-Meier-Überlebensanalyse von MOS-DEGs bei Brustkrebs. (A) GSR (225609_at) zeigt keine signifikante Korrelation mit dem rezidivfreien Überleben (HR = 1,05; p = 0,50). (B) MTHFD2 (201761_at) zeigt einen starken Zusammenhang mit schlechter Prognose, wobei eine hohe Expression eine reduzierte RFS vorhersagt (HR = 1,53; p = 1,1×10⁻¹⁶). (C) PRDX3 (209766_at) weist auf eine schützende Assoziation hin, wobei eine höhere Expression einem längeren RFS entspricht (HR = 0,73; p = 7,7×10⁻¹⁰). (D) ACLY (201128_s_at) zeigt keinen signifikanten prognostischen Effekt (HR = 1,02; p = 0,77). Hochausdrucksgruppen sind rot dargestellt, während niedrigausdrucksstarke Gruppen schwarz dargestellt werden. Kreuzzeichen stehen für zensierte Proben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

nsSNP-Charakterisierung und Priorisierung von MTHFD2 und PRDX3

Die Analyse des Ensembl Variant Effect Predictor (VEP) des kanonischen Transkripts MTHFD2-201 (ENST00000394053.7) ergab insgesamt 40 nicht-synonyme Varianten. Unter diesen zeigten fünf Varianten – rs1471336772, rs2103841302, rs1428567735, rs1694270227 und rs1694375712 – starke Belege für schädliche funktionale Auswirkungen auf mehrere prädiktive Werkzeuge. Diese Substitutionen wurden über mehrere rechnergestützte Werkzeuge hinweg konstant als Proteinstruktur und -funktion vorhergesagt, darunter SIFT ≤ 0,05, PolyPhen-2 ≥ 0,85, CADD-Werte von 29 bis 36, MetaLR von 0,73 bis 0,86, Mutation Assessor > 3,5 und REVEL-Werte von fast 0,99. Die schädlichste Variante, rs147136772 (T>G), zeigte einen CADD-Wert von 33, einen PolyPhen-2-Wert von 0,99 und einen REVEL-Wert von 0,997, was auf eine mögliche strukturelle Destabilisierung und mögliche Beeinträchtigung der NADPH-abhängigen katalytischen Aktivität des Enzyms hindeutet (Supplemental Table S4). Die meisten hochpunktbaren Varianten befanden sich in den katalytischen Domänen der NADP⁺-Bindung und der Methylentetrahydrofolat-Dehydrogenase, die für die Redoxregulation und den Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel entscheidend sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass solche Substitutionen den Stoffwechselfluss und das Redox-Gleichgewicht stören könnten und mit onkogener Reprogrammierung bei Brustkrebs in Verbindung stehen könnten.

Für PRDX3-201 (ENST00000298510.4) wurden 28 nicht-synonyme SNPs identifiziert, von denen fünf Varianten – rs747786383, rs2133647474, rs761292643, rs377652956 und rs1847844616 – durchgehend schädliche Profile zeigten. Diese Varianten erreichten mehrere schädliche Schwellenwerte: SIFT ≤ 0,05, PolyPhen-2 ≥ 0,85, CADD-Werte zwischen 28 und 32, MetaLR zwischen 0,43 und 0,99 und REVEL ≥ 0,9. Die Variante mit dem stärksten Impakt, rs747786383 (A>G), präsentierte CADD = 28, MetaLR = 0,993 und REVEL = 0,97, was auf ein starkes pathogenes Potenzial hinweist (Ergänzungstabelle S5). Diese Mutation tritt in der thioredoxinabhängigen Peroxidase-Domäne auf, einem Bereich, der für die Reduktion von Wasserstoffperoxid und die Aufrechterhaltung der mitochondrialen oxidativen Stress-Homöostase unerlässlich ist. Veränderungen in diesem Bereich können die katalytische Effizienz der Peroxidase beeinträchtigen, die antioxidative Abwehr beeinträchtigen und die Anfälligkeit für oxidative Schäden erhöhen. Eine vergleichende Zusammenfassung beider Gene zeigte, dass MTHFD2 und PRDX3 unterschiedliche, aber komplementäre funktionelle Schwachstellen im oxidativen Stoffwechsel des mitochondrialen Stoffwechsels aufweisen. MTHFD2-Varianten beeinflussen hauptsächlich den enzymatischen Redoxzyklus und die NADPH-Regeneration und fördern die metabolische Aggressivität, während PRDX3-Varianten die durch Peroxidase-vermittelte Entgiftung beeinträchtigen und die Widerstandsfähigkeit der Antioxidantien verringern. Unter allen Mutationen wurden rs1471336772 in MTHFD2 und rs747786383 rs74786383 in PRDX3 als die am meisten pathogenen nsSNPs identifiziert, basierend auf ihren kumulativen Highscores in CADD-, REVEL- und Mutation Assessor-Vorhersagen. Abbildung 11 bietet einen grafischen Überblick über die vergleichenden Pathogenitätsprofile der beiden Proteine und hebt die durchgehend hohen Werte bei SIFT, PolyPhen-2, CADD, MetaLR, REVEL und Mutation Assessor hervor. Beide Gene wiesen ein starkes schädliches Potenzial auf, wobei MTHFD2 (CADD = 33, REVEL = 0,997) auf maximale strukturelle Störung hinweist und PRDX3 (MetaLR = 0,99, REVEL = 0,97) einen vergleichbaren funktionellen Einfluss auf die Integrität der Antioxidantiendomäne zeigt (Abbildung 11). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass MTHFD2 und PRDX3 hochschädliche nsSNPs besitzen, die die mitochondriale Redoxhomöostase und den Energiestoffwechsel kritisch beeinträchtigen könnten, was ihre potenzielle Relevanz als oxidative-stressbezogene Gene und potenzielle therapeutische Ziele in der Brustkrebspathogenese unterstützt.

Eine systematische Neubewertung des nsSNP-Annotationsrahmens wurde durchgeführt, um eine Konsistenz zwischen quantitativen Pathogenitätswerten und kategorialen Klassifikationen über alle berichteten Varianten zu gewährleisten. Insbesondere wurden Abweichungen zwischen CADD-Werten und ihren qualitativen Bezeichnungen korrigiert, indem standardisierte Interpretationsschwellenwerte angewendet wurden (CADD ≥20 als schädlich und ≥30 als sehr schädlich), um sicherzustellen, dass alle priorisierten Varianten echte wirkungsstarke Substitutionen widerspiegeln. Darüber hinaus wurden die Varianten-Identifizéierer mit denen in den Primärergebnissen berichtet, um die Konsistenz zwischen den tabellierten Daten und der narrativen Interpretation zu gewährleisten. Diese Verfeinerung stärkt die analytische Strenge der Studie und stellt sicher, dass die berichteten nsSNPs eine kohärente, hochkonfidenzielle Menge funktional relevanter Varianten bilden, die für nachgelagerte strukturelle und translationale Untersuchungen geeignet sind (Tabelle 3).

Abbildung 11. Vergleichende nsSNP-Pathogenitätswerte für MTHFD2 und PRDX3. Balkendiagramm, das die aggregierten prädiktiven Werte der Schädlichkeit für MTHFD2 (ENST00000394053,7) und PRDX3 zeigt. (ENST00000298510,4) über sechs Rechenwerkzeuge hinweg zeigt: SIFT, PolyPhen-2, CADD, MetaLR, REVEL und Mutation Assessor. Höhere Werte entsprechen einer erhöhten Wahrscheinlichkeit einer funktionellen Störung, was darauf hindeutet, dass beide Gene hochschädliche nsSNPs besitzen, die die mitochondriale Redoxität und metabolische Integrität beeinträchtigen können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Tabelle 3: Die wichtigsten vorhergesagten schädlichen nsSNPs in MTHFD2 und PRDX3. Die PolyPhen-Klasse war wahrscheinlich schädlich für alle nsSNPs. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Sekundärstruktur- und 2D-Modellierungsanalyse von MTHFD2- und PRDX3-Proteinen

Um den strukturellen und positionsbezogenen Kontext schädlicher nsSNPs weiter zu interpretieren, wurde eine 2D-Sekundärstrukturmodellierung von MTHFD2 (MTDC_HUMAN) und PRDX3 (PRDX3_HUMAN) Proteinen mit PSIPRED und NetSurfP 2.0 durchgeführt. Diese Analysen lieferten detaillierte Einblicke in die sekundären Strukturelemente, die Neigung zur Reststörung und die relative Lösungsmittelzugänglichkeit (RSA) jedes Proteins und hoben die Auswirkungen pathogener Mutationen auf lokale Faltung und Lösungsmittelexposition hervor.

Im MTHFD2-Protein (Abbildung 12A) zeigte das 2D-Modell ein abwechselndes Muster von α-Helices (orange) und β-Strängen (violett), die den kompakten Kern der katalytischen und NADP⁺-bindenden Regionen des Enzyms bilden. Die schädlichen Reste, die durch das nsSNP-Screening identifiziert wurden, P208R, A247E, D248G, G291V und G313D, befanden sich überwiegend in oder nahe strukturierten Regionen (α-Helices und β-Sheets) mit mäßiger bis hoher Lösungsmittelzugänglichkeit. Diese Reste wurden in gut geordneten, unordentlichen Segmenten kartiert, was auf strukturelle Rigidität hinweist, die für die Aufrechterhaltung der enzymatischen Stabilität und Kofaktorbindung unerlässlich ist. Bemerkenswert ist, dass A247E und D248G, die in einer kurzen α-helikalen Kurve neben der aktiven Stelle positioniert sind, eine hohe relative Oberflächenzugänglichkeit (RSA ≥ 0,25) aufwiesen, was darauf hindeutet, dass diese Substitutionen katalytische Oberflächenwechselwirkungen direkt beeinflussen könnten. Ähnlich zeigten G291V und G313D, die sich im β-Blatt-Bereich nahe der NADP⁺-Tasche befinden, ein lokales Verzerrungspotenzial aufgrund von Flexibilitätsverlust und erhöhtem Seitenkettenvolumen, was sich in den dickeren Unordnungslinien in diesen Bereichen widerspiegelt. Die P208R-Mutation trat innerhalb einer Helical-Coil-Übergangszone auf, einem Bereich, der typischerweise präzise Rückgratsteifigkeit erfordert, was darauf hindeutet, dass der Ersatz von Prolin durch Arginin lokale Instabilität einführen und die Faltungsdynamik verändern kann. Zusammen zeigen diese Daten, dass die schädlichen Rückstände in MTHFD2 an strukturell begrenzten, lösungsmittelexponierten Stellen liegen, wo selbst geringfügige Substitutionen katalytische Geometrie und Redoxkopplung beeinträchtigen können.

Im PRDX3-Protein (Abbildung 12B) zeigte die Sekundärstrukturkarte eine konservierte Thioredoxinfaltung, die aus wechselnden α-Helices und β-Strängen bestand, die durch flexible Spulenschleifen verbunden waren. Die kritischen Mutationen P70R, P101R, A218V und P230S wurden in lösungsmittelzugänglichen Schleifenregionen oder angrenzend an sekundäre strukturelle Elemente gefunden, was ihren potenziellen Einfluss auf die Zugänglichkeit von redoxaktivem Cystein und die Dimerstabilisierung widerspiegelt. Die P70R- und P101R-Varianten traten in der Nähe von ungeordneten und lösungsmittelbesetzten Spulen auf, was die dynamische Flexibilität stören kann, die für die Peroxidase-Katalyse und die Interaktion mit Thioredoxin erforderlich ist. A218V und P230S hingegen kartierten Helixschleifenübergänge, Regionen, die während des katalytischen Zyklus für das konformationelle Schalten entscheidend sind. Diese Reste zeigten eine erhöhte Exposition und reduzierte Unordnung, was darauf hindeutet, dass Mutationen an diesen Positionen lokale strukturelle Elemente versteifen und die Anpassungsfähigkeit der Redox-Konformationen einschränken könnten. Insgesamt zeigte die 2D-Topologie, dass schädliche PRDX3-Varianten hauptsächlich die Stabilität von Schleife zu Helix, die Lösungsmittelexposition und lokale Unordnung verändern, was mit der vorhergesagten Beeinträchtigung katalytischer und antioxidativer Funktionen übereinstimmt. Die kombinierte Analyse der MTHFD2- und PRDX3-2D-Modelle zeigte, dass pathogene nsSNPs in Regionen gruppieren, die Rigidität und Flexibilität ausbalancieren, wo Störungen in Wasserstoffbrückenbindungen oder Polarität verstärkte Auswirkungen auf die Proteinfunktion haben können. Die betroffenen Reste besetzen strukturell konservierte, funktionell exponierte Stellen und bestätigen ihr Potenzial, die enzymatische Konformation und die mitochondriale Redoxregulation zu verändern.

Abbildung 12. Sekundärstruktur und relative Oberflächenzugänglichkeit schädlicher nsSNP-Standorte. (A) Die 2D-Topologie von MTHFD2 (MTDC_HUMAN) zeigt vorhergesagte α-Helices (orange), β-Stränge (violett) und ungeordnete Regionen (schwarze Liniendicke). Rote vertikale Boxen markieren schädliche Rückstände (P208R, A247E, D248G, G291V und G313D), die sich in strukturierten und mäßig lösungsmittelbesetzten Regionen nahe der katalytischen Stelle lokalisieren. (B) Die PRDX3 (PRDX3_HUMAN) 2D-Sekundärstruktur-Darstellung, die α-Helices, β-Sheets und Coil-Regionen hervorhebt. Schädliche Rückstände (P70R, P101R, A218V und P230S) sind in Rot eingepackt und besetzen hauptsächlich lösungsmittelzugängliche Schleifen und helikale Grenzflächen, die für die Redoxaktivität entscheidend sind. Die relative Oberflächenzugänglichkeit wird in Rot (freiliegend) und Schwarz (vergraben) angegeben, während die Unordnungsneigung durch die Liniendicke dargestellt wird. Zusammen zeigen die Modelle, dass krankheitsassoziierte nsSNPs in funktionell sensitiven und strukturell eingeschränkten Domänen positioniert sind, die für die enzymatische Aktivität und das mitochondriale Redox-Gleichgewicht unerlässlich sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Vorhergesagte strukturelle und funktionelle Auswirkungen schädlicher nsSNPs

Um die strukturellen und mechanistischen Implikationen der priorisierten nsSNPs, die in MTHFD2 und PRDX3 identifiziert wurden, weiter zu validieren, wurde eine molekulardynamische computergestützte Analyse mit DynaMut- und MutPred2-Servern durchgeführt. Diese Werkzeuge lieferten ergänzende Einblicke in mutationsinduzierte Veränderungen in der Proteinflexibilität, Stabilität, Lösungsmittelzugänglichkeit und katalytischer Set-Konformation.

Für MTHFD2 zeigten fünf hochkonfidenzielle Substitutionen (A247E, D248G, P208R, G291V und G313D) MutPred2-Werte ≥ 0,90, was auf ein starkes pathogenes Potenzial hinweist. Die funktionale Motivkartierung zeigte, dass diese Varianten innerhalb oder neben PROSITE-Motiven (PS00006, PS00008, PS00767) und ELM-funktionalen Regionen (ELME000233, ELME000335) lokalisiert sind, die mit der NADP⁺-Bindung und katalytischer Funktion verbunden sind. Die Mutationen A247E und D248G, die sich in der Nähe der katalytischen Tasche des Enzyms befinden, zeigten eine tiefgreifende Störung der Metallbindungsstellen (p = 3,0×10⁻4-4,4×10⁻⁵) und veränderte geordnete Interface-Interaktionen, die für die Enzym-Substrat-Erkennung und Kofaktorstabilität unerlässlich sind. Es wurde vorhergesagt, dass diese Substitutionen neue allosterische und katalytische Stellen (bei D248 und I251) gewinnen würden, während gleichzeitig die native katalytische Funktionalität verloren ging, was auf eine destabilisierende Konformationsverschiebung hindeutet. Die G291V- und G313D-Varianten zeigten Gewinn allosterischer Stellen (F295, G313) und veränderte Transmembranneigung, was auf mögliche Fehlfaltungen und subzelluläre Lokalisationsdefekte hinweist. Wichtig ist, dass beide Varianten mit reduzierter Methylierung und erhöhter Flexibilität der Schleife verbunden waren, was potenziell die strukturelle Integrität des Enzyms beeinflusst. Ähnlich führte P208R (MutPred2 = 0,916) zu einer veränderten DNA-Bindungsaffinität und Gewinn einer helikalen Struktur, was auf eine Störung der Stabilität zwischen den Domänen und der elektrostatischen Koordination innerhalb der NADP⁺-Bindungsrinne hindeutet. Gemeinsam konvergieren die MTHFD2 nsSNPs auf Mechanismen, die metallbindende Störungen, allosterische Regulationgewinn und katalytische Setstörung betreffen, was darauf hindeutet, dass sie die enzymatische Aktivität sowie die Redoxregulation und metabolische Rollen beeinträchtigen könnten, die für die Proliferation und Resistenz von Krebszellen entscheidend sind.

Für PRDX3 wurden vier große Substitutionen: P230S, A218V, P101R und P70R, als funktional schädlich vorhergesagt (MutPred2 ≥ 0,80). Diese Varianten werden innerhalb konservierter Motive (ELME000053, ELME000085, ELME000146, ELME000137) abgebildet, die der thioredoxinabhängigen Peroxidase-Domäne entsprechen. Die P230S-Mutation (MutPred2 = 0,836) war mit veränderter Metallbindung (p = 1,2 × 10⁻³), Gewinn der Disulfidbindung bei C229 und dem Verlust einer allosterischen Stelle bei W233 assoziiert, was auf eine Interferenz mit Redox-aktiven Cysteinresten hindeutet, die für die Peroxidase-Katalyse entscheidend sind. Die A218V-Variante führte zum Verlust der Lösungsmittelzugänglichkeit und zur Gewinnung einer allosterischen Stelle bei R214, was auf eine reduzierte katalytische Exposition und eine mögliche Redoxinaktivierung hinweist. Darüber hinaus zeigten P101R und P70R hohe MutPred2-Werte (0,924–0,945) und führten zu strukturellen Störungen im N-terminalen Bereich. Diese Mutationen verursachten verändertes Transmembranpotenzial, Zunahme von β-Strang-Konformationen und den Verlust posttranslationaler Modifikationsstellen (Sulfation und Pyrrolidonbildung), was zusammen auf eine beeinträchtigte Faltung und Redoxstabilität hindeutet. Insgesamt zeigten PRDX3-Varianten ein konsistentes Muster veränderter Metallkoordination, erhöhter Unordnung und Gewinn/Verlust katalytischer Standorte, was die Peroxidase-Effizienz beeinträchtigen und die antioxidativen Abwehrmechanismen der Mitochondrien schwächen konnte. Diese strukturellen Störungen, kombiniert mit den schädlichen Vorhersagen aus VEP-, CADD- und REVEL-Analysen, zeigen, dass sowohl MTHFD2 als auch PRDX3 hochwirksame nsSNPs besitzen, die die Proteinkonformation destabilisieren, die katalytische Architektur stören und molekulare Interaktionen verändern, die für die Aufrechterhaltung des Redox-Gleichgewichts unerlässlich sind. Die Konvergenz dieser schädlichen Mutationen an metallbindenden und katalytischen Resten unterstreicht ihre potenzielle pathogene Rolle bei der Beeinträchtigung der mitochondrialen oxidativen Stressregulation bei Brustkrebs. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Ergebnisse auf rechnergestützten Vorhersagen basieren und eine experimentelle Validierung erfordern, um ihre biologische und funktionelle Relevanz zu bestätigen (Tabelle 4).

Tabelle 4: Vorhergesagte funktionelle und strukturelle Folgen schädlicher nsSNPs in MTHFD2 und PRDX3 basierend auf DynaMut- und MutPred2-Analysen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Strukturelle Visualisierung und atomare Interpretation schädlicher nsSNPs in MTHFD2 und PRDX3

Um die strukturellen Folgen der schädlichsten nicht-synonymen Varianten im atomaren Maßstab zu erläutern, wurden für MTHFD2 und PRDX3 molekulare Visualisierung und 3D-Strukturmodellierung mit PyMOL- und DynaMut-Simulationen durchgeführt. Diese Analysen zielten darauf ab, konformationelle Störungen, Restwechselwirkungsverschiebungen und katalytische Umstellungen der Standorte zu identifizieren, die durch Hochwirkungssubstitutionen entstehen. Für PRDX3 wurden die vorhergesagten schädlichen Mutationen P230S, A218V, P101R und P70R im thioredoxinabhängigen Peroxidasebereich modelliert. Das Wildtyp-Protein zeigte eine kompakte α/β-Faltung, die durch ein umfangreiches Wasserstoffbrückennetz gekennzeichnet ist, das die katalytischen Cysteinreste stabilisiert. Die Einführung von Mutationen führte jedoch zu spürbaren strukturellen Abweichungen, die in der Nähe der katalytischen und Substrat-Erkennungstaschen lokalisiert sind.

Konkret ersetzte die P230S-Substitution (Abbildung 13A,B) ein starres, unpolares Prolin durch einen polaren Serinrest. Diese Substitution erhöhte die Flexibilität der Seitenkette, führte ein neues Wasserstoffbrückenpotenzial ein und störte gleichzeitig die für die Stabilität der Peroxidase-Domäne erforderliche natürliche Schleifensteifigkeit. Das Ergebnis war eine erhöhte Zugänglichkeit des Oberflächenlösungsmittels und eine teilweise Entfaltung in der Nähe der Redox-Aktivität. Ähnlich ersetzte A218V (Abbildung 13B) einen kleinen Alaninrest durch ein voluminäreres Valin, was eine sterische Behinderung im hydrophoben Kern verursachte und die Kofaktorakkommodation möglicherweise störte. Die P101R- und P70R-Mutationen (Abbildung 13C, D) ersetzten Prolin durch Argininreste und führten in ursprünglich von unpolaren Kontakten dominierten Regionen positiv geladene Seitenketten ein. Diese Veränderungen werden voraussichtlich elektrostatische Veränderungen und potenzielle Schleifenverzerrungen in der Nähe des N-terminalen Bereichs einführen, die wahrscheinlich das Thioredoxin-Andocken und die Dimerisationsstabilität beeinträchtigen. Zusammenfassend deuten diese strukturellen Vorhersagen darauf hin, dass PRDX3-Varianten eine veränderte Redoxoberflächengeometrie, erhöhte Unordnung und eine verminderte Peroxidase-Effizienz aufweisen könnten, was die Fähigkeit des Enzyms, Wasserstoffperoxid zu neutralisieren und das mitochondriale oxidative Gleichgewicht aufrechtzuerhalten, beeinträchtigt.

Für MTHFD2 wurden die modellierten Varianten A247E, D248G, P208R, G291V und G313D über die NADP⁺-bindenden und katalytischen Domänen verteilt, die für den Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel und die NADPH-Regeneration entscheidend sind. Die Wildtyp-Struktur offenbarte eine eng gepackte katalytische Tasche, die durch divalente Metallionen und Wasserstoffbrücken-Interaktionen koordiniert wird, die für die Folat-Substratbindung unerlässlich sind. Im Gegensatz dazu führten alle modellierten Substitutionen zu Ladungs-, Polaritäts- oder Größenungleichgewichten, die diese Regionen destabilisierten. Die A247E-Mutation (Abbildung 14B) brachte einen negativ geladenen Glutaminsäurerest ein, der die Koordination der Metallbindung und das elektrostatische Gleichgewicht in der katalytischen Höhle störte. Ähnlich führte D248G (Abbildung 14F) zum Verlust einer Aspartinsäure-Carboxylgruppe, wodurch ein zentraler katalytischer Kontakt aufgelöst und die lokale Sekundärstruktur destabilisiert wurde. Die G291V-Substitution (Abbildung 14A) brachte einen volumineren Valin-Rückstand ein, der sterische Kollisionen und eine partielle Verzerrung der an der NADP⁺ -Tasche angrenzenden Schleife verursachte.

Die G313D-Variante (Abbildung 14C) führte einen negativ geladenen Rest in einem Bereich ein, der typischerweise von einem kleinen Glycin eingenommen wird, was zu veränderten Wasserstoffbrückenmustern und einer verminderten Flexibilität an der katalytischen Grenzfläche führte. Schließlich ersetzte P208R (Abbildung 14E) ein starres Prolin durch ein positiv geladenes Arginin, was potenziell die Interdomäneninteraktionen störte und die Unordnung in der zentralen helikalen Struktur des Proteins erhöhte. Diese kombinierten Veränderungen werden voraussichtlich die Enzymstabilität erheblich verringern, die Koordination der Metallionen beeinträchtigen und die katalytische Effizienz verringern. Zusammen zeigen sowohl MTHFD2- als auch PRDX3-Mutanten eine lokale Destabilisierung innerhalb funktional konservierter katalytischer und redoxaktiver Stellen. MTHFD2-Varianten betreffen überwiegend die NADPH-Bindung und katalytische Reste, was den metabolischen Redoxzyklus beeinträchtigt, während PRDX3-Mutationen die Thioredoxin-Bindung und Disulfidbildung beeinträchtigen und so die mitochondriale Antioxidorenkapazität schwächen. Diese Erkenntnisse unterstreichen, dass schädliche nsSNPs zur molekularen Destabilisierung mitochondrialer Redoxnetzwerke beitragen und so potenziell die Tumorstoffwechsel-Umprogrammierung und Therapieresistenz antreiben.

Abbildung 13. Strukturelle Modellierung schädlicher nsSNPs in PRDX3 (ENST00000298510.4). (A) Banddiagramm der PRDX3-Tertiärstruktur, das Mutationsstellen (grün) innerhalb des thioredoxinabhängigen Peroxidase-Bereichs hervorhebt. (B) Die Substitution von Prolin mit Serin an Position 230 und Alanin mit Valin an Position 218 induziert konformationelle Relaxation und lokale Entfaltung in der katalytischen Schleife. (C,D) Der Ersatz von Prolin durch Arginin an den Positionen 101 und 70 führt zu positiven Ladungen und stört die N-terminale Helixpackung. Jedes Mutationsschema zeigt den chemischen Übergang der betroffenen Reste und die veränderte Seitenkettenorientierung innerhalb der 3D-Struktur. Die vorhergesagten Effekte umfassen eine erhöhte Lösungsmittelbelastung, eine Umlagerung der Wasserstoffbrücken und eine verminderte Stabilität der Peroxidase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 14. Strukturelle Visualisierung schädlicher nsSNPs in MTHFD2 (ENST00000394053.7). (A) Die MTHFD2-Monomerstruktur illustriert hochwirkungsvolle nsSNP-Positionen

Ergänzende Tabelle S1. Liste der Gene zusammen mit ihren entsprechenden normalisierten Expressionswerten und zugehörigen Probeninformationen aus dem GSE231524-Datensatz, die für die nachgelagerte Analyse verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S2. Liste der Gene zusammen mit ihren entsprechenden normalisierten Expressionswerten und zugehörigen Stichprobeninformationen aus dem GSE231525-Datensatz, die für die nachgelagerte Analyse verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S3. Liste der differenziell exprimierten Gene (DEGs), die aus den 3-MOS-DEGs identifiziert wurden, einschließlich Gennamen, Faltenänderungswerte und statistische Signifikanz, die für die nachgelagerte Interpretation verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S4. Varianten, die mit dem MTHFD2-201-Transkript assoziiert sind, einschließlich Variantentyp, genomischer Position und verwandter Annotationsinformationen, die für die nachgelagerte Analyse verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle S5. Varianten, die mit dem PRDX3-201-Transkript assoziiert sind, einschließlich Variantentyp, genomischer Position und verwandter Annotationsinformationen, die für die nachgelagerte Analyse verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Mitochondrialer oxidativer Stress ist ein prägendes Merkmal der Tumoranpassung und steuert das Überleben zellulär, die metabolische Plastizität und die Therapieresistenz. Die vorliegende Studie untersuchte systematisch mitochondriale oxidative, stressbezogene, differenziell exprimierte Gene (MOS-DEGs) im Brustkrebs von HER2⁺ , indem sie transkriptomische Daten, funktionelle Anreicherung, klinische Validierung sowie detaillierte Analysen von Mutationen und Strukturen in Silico integrierte. Die Integration der differenziellen Expression mit Mutationsprofiling ermöglichte ein multidimensionales Verständnis dafür, wie die Redoxstoffwechselregulation mit genomischer Instabilität zusammenhängt. Unter den identifizierten MOS-DEGs traten MTHFD2 und PRDX3 als entscheidende mitochondriale Determinanten hervor, die unterschiedliche, aber komplementäre Funktionen bei der Anpassung an oxidativem Stress, der Stoffwechselregulation und der therapeutischen Antwort zeigen⁴⁸. Die Identifizierung mehrerer schädlicher, nicht-synonymer SNPs (nsSNPs) in diesen Genen zeigte weiter, wie Einzel-Aminosäure-Substitutionen die Enzymaktivität, die Proteinfaltung und die mitochondriale Resilienz in Brustkrebszellen modulieren können. Es ist wichtig zu betonen, dass die in dieser Studie präsentierten Ergebnisse aus integrativen, rechnergestützten und in silico-Analysen stammen und daher weitere experimentelle Validierung erfordern, um ihre biologische und klinische Relevanz zu bestätigen.

MTHFD2 als metabolisches Onkogen und prognostischer Treiber

MTHFD2 (Methylentetrahydrofolatdehydrogenase 2) codiert ein bifunktionales mitochondriales Enzym, das zentral für den Ein-Kohlenstoffstoff-Stoffwechsel (OCM)-Weg ist. Durch die Erzeugung von Formate und NADPH unterstützt MTHFD2 die Nukleotidbiosynthese und die Redoxhomöostase – Funktionen, die in schnell proliferierenden Tumorzellen hyperaktiviert werden. Obwohl MTHFD2 in normalen adulten Geweben weitgehend still ist, wird es in über 80 % der Malignitäten, einschließlich Brust-, Nieren-, Darm- und Leberzellkrebs, abweichend reexprimiert. Eine erhöhte Expression korreliert stark mit schlechten klinischen Endpunkten und erhöhtem metastasiertem Potenzial⁴⁹.

In dieser Studie wurde MTHFD2 sowohl in Tumor- als auch in metastatischen Geweben über RNA-seq- und Microarray-Datensätze hinweg konstant hochreguliert, wobei die Kaplan–Meier-Analyse die negative prognostische Assoziation bestätigte (HR = 1,53, p = 1,1×10⁻¹⁶). Funktional passt dies zu seiner Rolle bei der NADPH-Regeneration, die für die Auffüllung reduzierter Glutathion- und Thioredoxinmoleküle unerlässlich ist, die reaktive Sauerstoffspezies (ROS)⁵⁰ neutralisieren. Eine solche metabolische Umprogrammierung verbessert die Toleranz gegenüber oxidativem Stress und unterstützt anaboles Wachstum, insbesondere unter therapeutischem Druck wie der HER2-Hemmung⁵¹. Obwohl sich diese Studie hauptsächlich auf die HER2-zielgerichtete Therapieresistenz konzentriert, insbesondere im Zusammenhang mit Wirkstoffen wie Lapatinib, wurde die ROC-Analyse mit Datensätzen durchgeführt, die mit der Reaktion auf "jede Chemotherapie" verbunden sind, um die übergeordnete prädiktive Leistung der identifizierten Hub-Gene zu bewerten. Dieser Ansatz wurde als sekundäre Validierungsstrategie eingesetzt, um ihre allgemeine klinische Anwendbarkeit zu bewerten. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Ergebnisse nicht ausschließlich die HER2-zielgerichtete Therapieantwort darstellen, weshalb Schlussfolgerungen bezüglich therapiespezifischer Resistenz mit Vorsicht interpretiert werden. Zukünftige Studien mit Datensätzen, die speziell mit HER2-gezielten Behandlungen verknüpft sind, sind erforderlich, um diese Ergebnisse weiter zu validieren.

Auf genomischer Ebene zeigte die nsSNP-Analyse mehrere äußerst schädliche Varianten – insbesondere rs1471336772 (G291V), rs2103841302 (G313D), rs1694270227 (P208R), rs1428567735 (A247E) und rs1694375712 (D248G), die innerhalb der NADP⁺-bindenden und katalytischen Domänen lokalisiert sind. Diese Mutationen zeigten durchweg SIFT ≤ 0,05, PolyPhen-2 ≥ 0,99 und CADD-Werte von 29 bis 36, was auf schwere strukturelle Störungen hindeutet. Sekundäre und 3D-strukturelle Modellierungen deuteten darauf hin, dass diese Reste in α-helikalen oder β-Strang-Regionen liegen, die für die katalytische Koordination und Kofaktoraffinität⁵² entscheidend sind. Analysen von DynaMut und MutPred2 zeigten zudem einen Verlust des Metallbindungspotenzials, veränderte Wasserstoffbrückenbindungen und reduzierte Veränderungen der Proteinstabilität, die die enzymatische Aktivität und die Kofaktorbindung beeinträchtigen können.

Interessanterweise wird vorhergesagt, dass solche Varianten die Enzymstruktur destabilisieren, paradoxerweise kompensatorische Redoxkreise aktivieren können, die es Krebszellen ermöglichen, den metabolischen Fluss über parallele Wege wie Serinbiosynthese oder mitochondriales Folatzyklus umzuleiten. Diese mutative Anpassungsfähigkeit unterstreicht das dynamische Zusammenspiel zwischen Enzyminstabilität und metabolischer Resilienz in Tumormitochondrien⁵³. Insgesamt fungiert MTHFD2 als metabolisches Onkogen, dessen Überexpression und pathogene Varianten die Redoxplastizität und Arzneimittelresistenz verstärken und es zu einem überzeugenden therapeutischen Ziel für redox-disruptive Therapien macht.

PRDX3 als mitochondriales Antioxidans und schützendes Biomarker

PRDX3 (Peroxiredoxin 3) dient als thioredoxinabhängiges Peroxidase, das für die Entgiftung von Wasserstoffperoxid in der mitochondrialen Matrix verantwortlich ist. Es stellt einen wichtigen Abwehrmechanismus dar, der das Redox-Gleichgewicht der oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) aufrechterhält und Atemwegskomplexe vor oxidativen Schäden schützt. Bei Krebs ist die Funktion von PRDX3 zweigeteilt: Während eine Überexpression die antioxidative Abwehr und das Überleben unter oxidativem Stress unterstützt, verstärkt sein Verlust die mitochondriale Dysfunktion und Apoptose.

Unsere Daten zeigten, dass PRDX3 in Tumoren und metastasiertem Gewebe moderat hochreguliert ist und signifikant mit einer günstigen Prognose assoziiert ist (HR = 0,73, p = 7,7×10⁻¹⁰). Dies deutet auf eine Schutzfunktion hin, bei der die verstärkte PRDX3-Expression die Akkumulation des mitochondrialen ROS puffert, die Redoxhomöostase erhält und oxidative Schäden während onkogener Belastung mindert. Mechanistisch interagiert PRDX3 mit Signalknoten wie NF-κB und HIF-1α und moduliert mitochondriale Apoptoseregulatoren, einschließlich BCL2 und AIFM1, wodurch die ROS-Regulation mit der Überlebenssignalisierung^54,55 verknüpft wird.

Bemerkenswert ist, dass das nsSNP-Profiling mehrere schädliche Varianten identifizierte, darunter rs747786383 (P230S), rs2133647474 (A218V), rs761292643 (P101R) und rs377652956 (P70R) im konservierten Thioredoxinperoxidase-Bereich. Diese Substitutionen wurden durch SIFT (≤0,05), PolyPhen-2 (≥0,99) und CADD (≥28) als schädlich vorhergesagt. Strukturelle Modellierungen und DynaMut-Simulationen zeigten, dass diese Mutationen die lokale Wasserstoffbrückengänge stören, die Lösungsmittelbelastung erhöhen und die α/β-fache, die für die Zugänglichkeit katalytischer Cystein notwendig ist, verzerren. Insbesondere induzieren P230S und A218V Instabilität von Schleife zu Helix und sterische Hindernisse, während P70R und P101R elektrostatische Abstoßung einführen und die N-terminale Helixpackung destabilisieren. Diese Veränderungen beeinträchtigen wahrscheinlich die Peroxidaseeffizienz und die Thioredoxinbindung, wodurch die antioxidative Kapazität von PRDX3⁵⁶ geschwächt wird.

Solche Varianten könnten die mitochondriale Abwehr verringern, die Anhäufung von ROS fördern und potenziell die Therapieansprache in redoxabhängigen Tumorumgebungen beeinflussen. Frühere Studien haben schädliche PRDX3-Varianten mit hepatozellulären und Hirntumoren in Verbindung gebracht, was ihre breitere Rolle bei der Anfälligkeit für oxidative Erkrankungen unterstützt. Im Kontext von Brustkrebs heben diese Ergebnisse PRDX3 sowohl als schützenden Biomarker als auch als mutationsempfindliches Antioxidansenzym hervor, dessen Funktionsstörung Zellen für oxidative Schäden und metabolischen Stress prädisponieren kann.

Integrative Interpretation: Die mitochondriale Redox-Stoffwechsel-Achse

Zusammen definieren MTHFD2 und PRDX3 zwei miteinander verbundene Arme der mitochondrialen Redox-Stoffwechsel-Achse. MTHFD2 unterstützt die Produktion von NADPH und den biosynthetischen Stoffwechsel, was die oxidative Stressresistenz fördert, während PRDX3 ROS entgiftet und mitochondriale Komponenten schützt. Ihre Expression und Mutationsmuster deuten auf einen Rückkopplungsmechanismus hin: Die MTHFD2-Hochregulation regeneriert Redox-Cofaktoren, während PRDX3 das resultierende ROS neutralisiert und ein synchronisiertes Verteidigungsnetzwerk bildet, das eine anhaltende Proliferation unter Stress^{ermöglicht 57,58}.

Die Entdeckung schädlicher nsSNPs in beiden Genen führt eine genetische Schicht in dieses Regulationssystem ein. Mutationen in katalytischen oder redoxaktiven Resten könnten das Redox-Gleichgewicht verschieben, indem sie die Enzymstabilität und die Kofaktorwechselwirkung verändern und beeinflussen, wie sich Krebszellen an therapieinduzierten oxidativen Stress anpassen. Dieses Zusammenspiel zwischen transkriptioneller Dysregulation und struktureller Verwundbarkeit unterstreicht die Notwendigkeit der Bewertung von Dual-Parameter-Biomarkern – die Integration von Expressionsprofiling mit Mutationsanalyse –, um therapeutische Vorhersagen und Patientenstratifizierung zu verfeinern.

Klinische und therapeutische Auswirkungen

Aus klinischer Sicht stellen MTHFD2 und PRDX3 komplementäre therapeutische Ziele im mitochondrialen oxidativen Stressnetzwerk dar. Die Zielsetzung von MTHFD2 mit Kleinmolekülinhibitoren (z. B. DS18561882, LY345899) hat in präklinischen Krebsmodellen Wirksamkeit gezeigt, indem sie die NADPH-Erzeugung unterdrückt, oxidativen Stress induziert und mit HER2-Inhibitoren wie Lapatinib und Trastuzumab synergiert. Umgekehrt könnte die Modulation der PRDX3-Expression oder -Aktivität genutzt werden, um das Redox-Gleichgewicht entweder zu feinjustieren, um Tumorzellen für ROS-induzierende Substanzen zu sensibilisieren oder um normales Gewebe vor kollateralen oxidativen Schäden zu schützen.

Um die analytische Genauigkeit zu gewährleisten, stellten wir klar, dass Überlebensanalysen in einer unstratifizierten Brustkrebskohorte durchgeführt wurden und die ROC-basierte Validierung die allgemeine Chemotherapie-Reaktion statt einer HER2-gezielten Therapie widerspiegelte.

Dieser dual-targeting-Ansatz, MTHFD2-Hemmung in Verbindung mit PRDX3-Modulation, könnte eine potenzielle Strategie darstellen, um redoxgesteuerte Resistenzmechanismen zu stören und gleichzeitig die mitochondriale Funktion in nicht-malignen Zellen aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus kann das Screening auf schädliche nsSNPs in diesen Genen das genotypbasierte Therapiedesign leiten und vorhersagen, welche Tumore am anfälligsten für redox-perturbationsbasierte Interventionen sind.

Um Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Varianteninterpretation zu gewährleisten, wurden die priorisierten nsSNPs in MTHFD2 und PRDX3 systematisch auf allen analytischen Ebenen harmonisiert, einschließlich transkriptomischer Filterung, Pathogenizitätsbewertung und struktureller Modellierung. Die endgültigen Varianten Sets rs1471336772, rs2103841302, rs1428567735, rs1694270227 und rs1694375712 für MTHFD2 sowie rs747786383, rs2136474744, rs761292643 und rs377652956 für PRDX3 stellen hochvertrauenswürdige schädliche Substitutionen dar, die konsequent von mehreren prädiktiven Rahmen unterstützt werden. Die Ausrichtung der rsID-basierten Berichterstattung auf entsprechende Aminosäuresubstitutionen gewährleistet zudem eine interpretative Klarheit zwischen genomischen und strukturellen Analysen. Diese Harmonisierung stärkt die interne Validität der Studie und erleichtert zukünftige experimentelle Validierung, indem sie einen einheitlichen und nachverfolgbaren Variantenrahmen bietet.

Alle funktionalen und mechanistischen Interpretationen in dieser Studie basieren auf rechnergestützten Vorhersagen und sollten daher als vermutet betrachtet werden. Während integrative Bioinformatik und strukturelle Modellierung starke Belege für potenzielle Effekte identifizierter nsSNPs in MTHFD2 und PRDX3 liefern, stellen diese Ergebnisse keine experimentell validierten Mechanismen dar. Dementsprechend werden alle Schlussfolgerungen bezüglich Proteindysfunktion, Redoxstörung und therapeutischer Relevanz als prädiktive Hypothesen präsentiert, die eine weitere experimentelle Validierung erfordern.

Einschränkungen und zukünftige Ausrichtungen

Trotz robuster Rechen- und Multi-Omics-Integration müssen mehrere Einschränkungen anerkannt werden. Die Analysen dieser Studie basieren vollständig auf in silico - und computergestützten Ansätzen ohne direkte experimentelle Validierung. Daher sollten die Ergebnisse eher als vorhersagend und hypothesenbildend als endgültig interpretiert werden. Funktionelle Assays wie enzymatische Aktivitätsmessungen, mitochondrialer Redoxfluss und strukturelle Kristallographie sowie in vivo.Modelle sind notwendig, um die vorhergesagten schädlichen Effekte von nsSNPs zu bestätigen. Darüber hinaus zeigen klinische Datensätze eine inhärente Heterogenität in der Subtypverteilung und der Behandlungsexposition, was die Genexpressionsprofile beeinflussen kann. Darüber hinaus basiert die vorliegende Studie auf einer begrenzten Anzahl transkriptomischer Datensätze, die die Generalisierbarkeit der Ergebnisse beeinflussen könnten. Obwohl zwei unabhängige RNA-Seq-Datensätze analysiert und durch groß angelegte klinische Validierung unterstützt wurden, würde die Einbeziehung zusätzlicher unabhängiger Kohorten die Robustheit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse weiter stärken.

Posttranslationale Modifikationen, die sowohl für die MTHFD2- als auch die PRDX3-Regulation entscheidend sind, wurden nicht bewertet, und dynamische Redox-Interaktionen in lebenden Systemen müssen noch experimentell überprüft werden. Wichtig ist, dass die in dieser Studie identifizierten Schlüsselgene, insbesondere MTHFD2 und PRDX3, in früheren Studien als bedeutende Rollen im Krebsstoffwechsel und der Redoxregulation berichtet wurden, was die biologische Konsistenz unserer Ergebnisse über verschiedene Studien hinweg unterstützt. Zukünftige Forschung sollte Multi-Omics-Validierung (Proteomik, Metabolomik und Einzelzell-Transkriptomik) und molekulardynamische Simulationen einsetzen, um die volle Wirkung dieser Varianten zu erfassen. Das Herstellen von kausalen Zusammenhängen zwischen Genotyp, Enzymfunktion und Therapieansprache wird das translationale Potenzial dieser Ergebnisse steigern. Die Integration mutationaler Erkenntnisse mit experimenteller Validierung könnte letztlich genotypgetriebene Redoxtherapien ermöglichen, bei denen mitochondriale Stoffwechselhemmer und Redoxmodulatoren ko-optimiert werden, um Resistenzresistenz zu überwinden und klinische Ergebnisse bei HER2⁺ -Brustkrebs zu verbessern.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnnotationDbi	Bioleiter	v1.64.0	R-Annotationspaket, das für die Standardisierung und Annotation von HGNC-Gensymbolen verwendet wird.
apeglm	Bioleiter	Methode in DESeq2	Methode für die Schrumpfung der log2-fachen Änderung in der Differentialausdrucksanalyse.
Biobase	Bioleiter	v2.62.0	R-Paket, das zum Zugriff auf und Verwaltung von GEO-abgeleiteten Ausdrucks- und Metadatenobjekten verwendet wird.
CADD	University of Washington / Kircher Labor	Web-Tool	Kombinierter Annotationsabhängiger Depletionsscore, der zur Vorhersage der nsSNP-Pathogenität verwendet wird.
clusterProfiler	Bioleiter	v4.8.1	R-Paket, das für GO- und KEGG-Anreicherungsanalysen verwendet wird.
ComplexHeatmap	Bioleiter	v2.18.0	R-Paket, das für Heatmap-Erstellung und Expression-Clustering verwendet wird.
Zytoscape	Cytoscape-Konsortium	Software	Netzwerkvisualisierungsplattform, die mit STRING-abgeleiteten PPI-Netzwerken und CytoHubba-Priorisierung verwendet wird.
dbSNP	NCBI	Datenbank	Datenbank für Populationsvarianten, die zur Kreuzvalidierung priorisierter nsSNPs verwendet wird.
DESeq2	Bioleiter	v1.42.0	R-Paket, das für Normalisierung, Varianzmodellierung und Differentialausdrucksanalyse verwendet wird.
DPLYR	CRAN / Tidyverse	v1.1.3	R-Paket, das für Datenmanipulation und Durchschnitt von Gensets verwendet wird.
DynaMut	Universität Melbourne / BioSig	Webserver	Werkzeug zur Schätzung mutationsassoziierter Stabilitäts- und Flexibilitätsänderungen in Proteinen.
EnhancedVolcano	Bioleiter	v1.22.0	R-Paket, das zur Darstellung differenzialer Ausdrucksergebnisse als Vulkandiagramme verwendet wird.
Ensembl Genome Browser	EMBL-EBI / Ensembl	Datenbank	Quelle der kanonischen Transkriptsequenzen für MTHFD2 und PRDX3.
Ensembl-Varianteneffekt-Prädiktor (VEP)	EMBL-EBI / Ensembl	Web-Tool	Tool zur Annotation von Missense-Varianten und zur Integration prädiktiver Scores.
ExAC	Broad Institute	Datenbank	Populationsebene Exom-Datenbank, die für nsSNP-Kreuzvalidierung verwendet wird.
Genexpressions-Omnibus (GEO)	NCBI	Datenbank	Repository zum Abruf von transkriptomischen Datensätzen für HER2-positive Brustkrebsanalysen.
Genontologie	Genontologie-Konsortium	LOS: 0006979	Ontologische Ressource, die zur Gewinnung von oxidativ stressbezogenen Genen und zur Anreicherungsanalyse verwendet wird.
GEOquery	Bioleiter	v2.70.0	R-Paket, das zum Zugriff auf GEO-Zählermatrizen und Metadaten verwendet wird.
ggplot2	CRAN / Tidyverse	v3.5.0	R-Paket, das für Datenvisualisierung, Clusterdiagramme und grafische Ausgaben verwendet wird.
ggraph	CRAN	R-Paket	R-Paket, das für Graphen- und Netzwerkvisualisierung während der Anreicherung und Pfaddarstellung verwendet wird.
gnomAD	Broad Institute	Datenbank	Datenbank für Populationsvarianten, die zur Überprüfung von Häufigkeit und Verteilung priorisierter nsSNPs verwendet wird.
GOplot	CRAN	R-Paket	R-Paket, das für die GO-Anreicherungsvisualisierung einschließlich Akkord- und Zusammenfassungsdiagrammen verwendet wird.
GSE231524	NCBI GEO	Thronbesteigung	RNA-seq-Datensatz zur Analyse von parentalen, arzneimitteltoleranten und resistenten BT474-Phänotypen verwendet.
GSE231525	NCBI GEO	Thronbesteigung	RNA-seq-Datensatz verwendet zur Analyse des DUSP6-Knockdowns in HER2-positiven Brustkrebszellen.
Menschliches MitoCarta3.0	Broad Institute	Datenbank	Kuratierte mitochondriale Genressource zur Definition mitochondrialer Gensätze.
Datenbank für Humane oxidative Stress-Gen (HOSGDB)	HOSGDB	Datenbank	Datenbank, die zum Abruf von oxidativ stressbezogenen Genen verwendet wird.
igraph	CRAN	R-Paket	R-Paket, das für Netzwerkdarstellung und Pathway-Visualisierung verwendet wird.
iMutant 3.0	Universität Bologna / Biofold	Webserver	Werkzeug zur Vorhersage von Mutationseffekten auf die Proteinstabilität.
Kaplan– Meier-Verschwörer	KMplot	Web-Tool	Online-Plattform für rezidivfreie Überlebensanalysen in Brustkrebskohorten.
KEGG	Universität Kyoto	Datenbank	Signalwegdatenbank, die für oxidative Phosphorylierung und Analyse der Signalweganreicherung verwendet wird.
KEGGREST	Bioleiter	R-Paket	Paket, das zum Abrufen und Annotieren von KEGG-Pfadinformationen verwendet wird.
Lapatinib	Im Manuskript nicht spezifiziert	1 & mu; Behandlungsbedingung M	HER2-gezielter Inhibitor wird in den Quelldatensätzen verwendet, um arzneimitteltolerante/resistente Phänotypen abzuleiten.
MetaLR	Integriert über Ensembl VEP	Punktestand	Rechengestützte Pathogenitätsmetrik zur Priorisierung von Varianten.
MutPred2	MutPred	Webserver	Werkzeug zur Vorhersage der funktionellen Folgen von Aminosäuresubstitutionen.
NetSurfP 3.0	Technische Universität Dänemarks	Webserver	Werkzeug zur Vorhersage der Sekundärstruktur und der Zugänglichkeit von Lösungsmitteln.
org. Hs.eg.db	Bioleiter	v3.18.0	Humangenom-Annotationspaket, das zur Kartierung von Genidentifikatoren verwendet wird.
Pathview	Bioleiter	R-Paket	Paket, das verwendet wird, um angereicherte Gene auf KEGG-Signalwege zu mappen.
Pheatmap	CRAN	v1.0.12	R-Paket, das für Heatmap-Diagramme und Cluster-Visualisierung verwendet wird.
PolyPhen-2	Harvard / Brigham and Women's Hospital	Web-Tool	Rechengestützter Prädiktor zur Abschätzung der strukturellen/funktionellen Auswirkungen von Aminosäuresubstitutionen.
Proteindatenbank (PDB)	RCSB PDB	Datenbank	Quelle experimentell aufgelöster Proteinstrukturen für MTHFD2 und PRDX3.
PSIPRED	University College London	v3.2	Protein-Sekundärstruktur-Vorhersageserver für 2D-Topologieanalysen verwendet.
PyMOL	Schrö dinger / PyMOL	v3.1	Molekulare Grafiksoftware zur Visualisierung von Proteinstrukturen und Mutationsstellen.
FEIER	Integriert über Ensembl VEP	Punktestand	Ensemble-Pathogenizitätsscore, der für die Priorisierung der Missense-Variante verwendet wird.
ROCplotter	ROCplot.org	Web-Tool	Online-Plattform zur ROC-basierten Validierung der Genexpression in Brustkrebs-Response-Kohorten.
RStudio	Posit	v4.3.1/v4.3.2 Umgebung	Statistische Rechenumgebung, die für transkriptomische, Anreicherungs- und Visualisierungs-Workflows genutzt wird.
SIB	A*STAR	Web-Tool	Prädiktives Werkzeug, das verwendet wird, um Aminosäuresubstitutionen als toleriert oder schädlich zu klassifizieren.
STRING	STRING-Konsortium	Datenbank	Protein– Proteininteraktionsdatenbank für Netzwerkanalysen und Hub-Gen-Identifikation verwendet.
TNM-Handlung	TNMplot.com	Web-Tool	Die Plattform wird verwendet, um die Genexpression über normale, Tumor- und metastasierte Brustgewebe zu vergleichen.
VennDiagram	CRAN	v1.7.3	R-Paket, das zur Visualisierung von Überlappungen zwischen DEGs und kuratierten mitochondrialen Gensets verwendet wird.