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Datenabruf und Vorverarbeitung
Diese Studie wurde mit öffentlich verfügbaren transkriptomischen und genetischen Daten durchgeführt; Menschen oder Tiere waren nicht direkt beteiligt. Transkriptomische Datensätze, die für die HER2+-Brustkrebstherapieresistenz relevant sind, wurden aus der NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)11 abgerufen. Zwei RNA-seq-Datensätze, GSE231524 und GSE231525, wurden aufgrund ihres spezifischen Fokus auf HER3-getriebene Resistenzen und DUSP6-Hemmung in HER2+-Brustkrebszelllinien (BT474 und MDA-MB-453) ausgewählt. Diese Datensätze umfassten parentale, arzneimitteltolerante und arzneimittelresistente Phänotypen, abgeleitet von Lapatinib (1 μM)-Exposition und DUSP6-Knockdown. Rohzählmatrizen und entsprechende Metadatendateien wurden mit den Paketen GEOquery (v2.70.0) und Biobase (v2.62.0) in RStudio (v4.3.2)12 abgerufen. Die Metadaten wurden kuratiert, um zwei Hauptkontraste für jeden Datensatz zu definieren: GSE231524 verglichen die Kontrollgruppe (BT474 parental, Tag 0) mit arzneimitteltoleranten und arzneimittelresistenten Proben (Tag 9–Monat 9), während GSE231525 die Kontrollgruppe (Scrambled siRNA) mit DUSP6 Knockdown (DUSP6-KD) verglichen. Qualitätskontrolle und Datennormalisierung wurden mit dem DESeq2 (v1.42.0)-Framework durchgeführt, das eine varianzstabilisierende Transformation (VST) anwendet, um die Heteroszedastizität zu reduzieren und Vergleichbarkeit zwischen den Stichproben sicherzustellen. Die Datenverteilung und die Clustering-Muster wurden visuell mit ggplot2 (v3.5.0) und pheatmap (v1.0.12) bewertet, um die Datengleichmäßigkeit zu bestätigen und potenzielle Ausreißer vor der Analyse der differenziellen Expression13,14 zu identifizieren.
In dieser Studie wurde eine klare Unterscheidung zwischen Befunden aus Zelllinientranskriptomdaten und solchen aus patientenabgeleiteten klinischen Datensätzen gehalten. Zellliniendaten wurden hauptsächlich für explorative Analysen verwendet, einschließlich der Identifikation differenziell exprimierter Gene und der Generierung vorläufiger mechanistischer Erkenntnisse in kontrollierten experimentellen Modellen. Im Gegensatz dazu wurden von Patienten abgeleitete Datensätze zur externen Validierung von Genexpressionsmustern und zur Bewertung der klinischen Relevanz, einschließlich prognostischer Bewertung, verwendet. Dementsprechend werden Ergebnisse aus Zelllinienmodellen und klinischen Kohorten getrennt interpretiert, um Überverallgemeinerungen zu vermeiden und einen angemessenen translationalen Kontext für alle Ergebnisse zu gewährleisten.
Analyse der differenziellen Genexpression
Eine differentielle Expressionsanalyse wurde durchgeführt, um Gene zu identifizieren, die zwischen Kontroll- und Behandlungsbedingungen signifikant moduliert waren. Normalisierte Zählungen wurden mit dem in DESeq2 integrierten angepassten Regressionsmodell (ARM) verarbeitet, um log₂-Faltenänderungen und statistische Signifikanz genau zu schätzen. Die Entwurfsformel wurde als ~condition definiert, die die Kontroll- versus behandelte Gruppen repräsentiert. Gene mit einem angepassten p-Wert (FDR) < 0,05 und absoluter log₂-facher Änderung ≥ 1 wurden als signifikant differenziell exprimiert angesehen. Die Schrumpfung der Log₂-Faltungsänderung wurde mit der Apeglm-Methode durchgeführt, um die Robustheit bei der Effektgrößenschätzung zu erhöhen. Die Ergebnisse der Analyse wurden mit EnhancedVolcano (v1.22.0)15 und ggplot216 visualisiert, die Vulkandiagramme und MA-Diagramme erzeugten, die die Beziehung zwischen Ausdrucksgröße und statistischer Sicherheit zeigten. Innerhalb von DESeq2 wurden auch Dispersionsschätzungen bewertet, um eine genaue Varianzmodellierung und konsistente Normalisierung über biologische Replikate17 zu gewährleisten.
Abruf und Identifizierung mitochondrialer oxidativer, stressbedingter differenziell exprimierter Gene (MOS-DEGs)
Um den Zusammenhang zwischen Energiestoffwechsel, oxidativem Stress und Arzneimittelresistenz zu untersuchen, wurde eine umfassende Liste mitochondrialer und oxidativ-stressassoziierter Gene aus mehreren Datenbanken zusammengestellt, darunter Human MitoCarta3.018 (https://personal.broadinstitute.org/scalvo/MitoCarta3.0/human.mitocarta3.0.html), Gene Ontology (GO:0006979, response to oxidative stress) (http://geneontology.org/), der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) oxidativer Phosphorylierungsweg (https://www.genome.jp/kegg/) sowie die Human Oxidative Stress Gene Database (HOSGDB) (http://hosgdb.com/). Alle abgerufenen Gene wurden mit org auf HGNC-zugelassene Gensymbole standardisiert. Hs.eg.db (v3.18.0) und AnnotationDbi (v1.64.0), während doppelte Einträge, Pseudogene und nicht-kodierende RNAs entfernt wurden, um die Annotationsgenauigkeit zu gewährleisten. Das daraus resultierende kuratierte mitochondriale oxidative Stressgen-Panel (MOS-Gene) wurde anschließend als Referenzsatz für die Integration mit den differenziell exprimierten Genen verwendet, die aus beiden transkriptomischen Datensätzen identifiziert wurden.
Die Schnittmenge der kuratierten MOS-Genliste mit den DEGs aus GSE231524 und GSE231525 wurde in R mittels dplyr (v1.1.3)19 und der Base R intersect()-Funktionen durchgeführt. Dieser integrative Ansatz ermöglichte die Identifikation von MOS-DEGs, die Gene repräsentieren, die funktionell mit mitochondrialum Stoffwechsel, Redoxregulation und oxidativer Stressanpassung verknüpft sind. Die Überschneidung der Datensätze wurde mit dem VennDiagram-Paket (v1.7.3) in R visualisiert, um gemeinsame und einzigartige Gene in den experimentellen Modellen20 zu illustrieren. Die verfeinerte Liste der MOS-DEGs wurde für nachgelagerte Analysen verwendet und liefert mechanistische Einblicke in die zugrunde liegende transkriptionelle und metabolische Reprogrammierung der HER2-gezielten Therapieresistenz.
Expressionsprofilierung und Visualisierung von MOS-DEGs
Die Expressionsprofilierung der identifizierten MOS-DEGs wurde mit den Paketen ComplexHeatmap (v2.18.0)21 und pheatmap (v1.0.12) in RStudio durchgeführt, um globale Ausdrucksmuster über elterliche, arzneimitteltolerante und resistente Bedingungen zu visualisieren. Normalisierte Zähldaten wurden mittels Z-Score-Skalierung transformiert, um die Genexpressionsmatrix über die Proben hinweg zu standardisieren. Das Clustering wurde mit euklidischen Distanz- und vollständigen Verknüpfungsmethoden durchgeführt, um Koexpressionsmuster zu erkennen und zustandsspezifische transkriptionelle Profile zu unterscheiden. Heatmaps und Clustering-Diagramme wurden mit ggplot2 generiert, um eine klare visuelle Unterscheidung zwischen den Bedingungen sicherzustellen. Dieser Visualisierungsansatz erleichterte die Identifikation von Gengruppen, die mit mitochondrialer Aktivität, oxidativer Stressmodulation und metabolischer Umprogrammierung unter arzneimittelresistenten Zuständen assoziiert sind.
Funktionale Anreicherung und Wegannotation
Um die biologische Bedeutung und regulatorischen Mechanismen der identifizierten MOS-DEGs zu untersuchen, wurden Gene Ontology (GO) und die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen mit R Studio (Version 4.3.1) durchgeführt. Die Analysen wurden in der tidyverse-Umgebung unter Verwendung mehrerer Bioconductor-Pakete für reproduzierbare Berechnungen und Visualisierungen durchgeführt. Genannotation und Identifikationskartierung wurden mit der Organisation durchgeführt. Hs.eg.db Datenbank (https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/) basierend auf dem Homo sapiens-Referenzgenom (GRCh38). Die GO-Anreicherungsanalyse wurde mit dem clusterProfiler-Paket (Version 4.8.1; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/) durchgeführt, das Gene in drei Hauptontologien einteilt – Biological Process (BP), Cellular Component (CC) und Molecular Function (MF). DieEnrichGO-22-Funktion wurde mit Parametern verwendet, die auf p-Wert < 0,05 gesetzt und p-Wert angepasst wurden. (FDR) < 0,05, wobei die Benjamini–Hochberg-Korrekturmethode angewendet wurde. Visualisierungen, darunter Balkendiagramme, Punktdiagramme und Akkorddiagramme, wurden mit Enrichplot (https://bioconductor.org/packages/enrichplot/), ggplot213 (https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/) und GOplot (https://cran.r-project.org/web/packages/GOplot/) erstellt. Diese Werkzeuge boten einen strukturierten Überblick über die angereicherten GO-Begriffe und deren Genassoziationen.
Die KEGG-Anreicherung des Pfades wurde mit der Funktion enrichKEGG() innerhalb des clusterProfiler-Pakets durchgeführt, wobei die menschliche KEGG-Datenbank (https://www.genome.jp/kegg/) referenziert wurde. Das KEGGREST-Paket (https://bioconductor.org/packages/KEGGREST/) wurde für die Abruf und Annotation von Pfaddaten verwendet. Wege mit bereinigtem p-Wert. (q-Wert) < 0,05 wurden als signifikant angesehen. Visualisierung und Pfadkartierung wurden mit Pathview (https://bioconductor.org/packages/pathview/), ggplot2 und Enrichplot durchgeführt, während igraph und ggraph für Netzwerkdarstellung23 verwendet wurden. Alle Anreicherungsanalysen und -visualisierungen wurden in R Studio (v4.3.1) unter Verwendung reproduzierbaren Codes und standardisierter Bioconductor-Workflows implementiert, um eine zuverlässige Identifikation der angereicherten funktionalen Kategorien und biologischen Signalwege zu gewährleisten, die mit den MOS-DEGs verbunden sind.
ROC-basierte Validierung prädiktiver Biomarker bei Brustkrebs
Zur Validierung der klinischen Prädiktionskraft der MOS-DEGs wurde die Analyse der Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC) mit dem ROCplotter Online-Tool (https://www.rocplot.org/)24 durchgeführt. ROCplotter ist eine integrierte webbasierte Plattform, die Genexpressionsdaten mit klinisch annotierten Behandlungs-Response-Datensätzen von 3.104 Brustkrebspatientinnen kombiniert, darunter solche, die mit Chemotherapie, Hormontherapie oder Anti-HER2-Medikamenten behandelt wurden.
Die Analyse wurde unter Verwendung der Parameter "pathologische vollständige Antwort" als Ergebnisvariable und "jede Chemotherapie" als Behandlungskategorie durchgeführt. Genexpressionswerte, die aus Affymetrix-Mikroarray-Datensätzen abgeleitet wurden, wurden automatisch in Responder- und Nonresponder-Gruppen basierend auf klinischen Annotationen innerhalb der Plattform geschichtet.
Die Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC)-Kurve (AUC), der Mann–Whitney-U-Test, der Faltungswechsel und der Chi-Quadrat-Test wurden angewandt, um die Fähigkeit jedes Gens zu bewerten, Responder von Nicht-Respondern zu unterscheiden. Die Fläche unter der Kurve (AUC) wurde als primäre Kennzahl zur Bewertung diskriminierender Leistung verwendet. AUC-Werte über 0,55 mit ROC-p-Werten < 0,05 wurden als signifikant angesehen und entsprechen der moderaten prädiktiven Leistung, die typisch für transkriptomische Biomarker ist, während die Korrektur der False Discovery Rate (FDR) angewandt wurde, um die analytische Strenge aufrechtzuerhalten.
Alle ausgewählten MOS-DEGs wurden mit ihren entsprechenden Affymetrix-Sonden-IDs abgefragt. Das diskriminative Potenzial jedes Gens wurde in klinischen Brustkrebskohorten bewertet, wobei die Expressionsdaten in Responder- und Nonresponder-Gruppen geschichtet wurden. ROC-Kurven, Boxplots und zugehörige statistische Ausgaben wurden direkt von der ROC-Plotter-Plattform generiert und zur nachgeschalteten Visualisierung und zum Vergleich exportiert. Die Analyse quantifizierte den prädiktiven Wert von Redox- und Stoffwechselregulatoren, die an mitochondrialem oxidativem Stress beteiligt sind. Gene, die über klinische Proben hinweg eine konsistente prädiktive Signifikanz zeigten, wurden für die Aufnahme in das endgültige Prädiktionspanel beibehalten.
Differentialexpressionsanalyse in Tumor-, normalen und metastatischen Geweben (TNM-Plot-Analyse)
Die Expressionsmuster der oberen MOS-DEGs wurden über normale, tumorale und metastatische Brustgewebe mit dem TNMplot-Webtool v2 (https://tnmplot.com/analysis/)25 analysiert. Sowohl RNA-Seq (TCGA + GTEx + MET500) als auch Genchip-Datensätze wurden untersucht, um plattformübergreifende Validierung sicherzustellen. Das Modul "Multiple Gene Analysis" wurde mit Breast Invasive Carcinoma als ausgewähltem Gewebetyp26 verwendet. Die Expressionswerte wurden log₂-transformiert und in den Gruppen Tumor vs. Normal (TvsN), Metastasion vs. Tumor (MvsT) sowie Metastasion vs. Normal (MvsN) verglichen. TNMplot berechnete automatisch Fold-Change (FC) und p-Werte mithilfe des Mann–Whitney U-Tests zur Bewertung der statistischen Signifikanz. Die Expressionsverteilungen wurden als Boxplots und Dichteplots visualisiert, die direkt aus der TNM-Schnittstelle generiert wurden, wobei grün, rot und grau normale, tumor- bzw. metastatische Gewebe darstellten. Alle Figuren wurden in hoher Auflösung exportiert, um in den Ergebnisbereich integriert zu werden. Diese Dual-Plattform-Analyse ermöglichte eine robuste Identifizierung und Validierung wichtiger mitochondrialer Redox-Metabol-Regulatoren, die mit dem Fortschreiten von Brustkrebsassoziiert sind 27.
Überlebens- und prognostische Analyse mit dem Kaplan–Meier-Plotter
Um die prognostische Relevanz von MOS-DEGs bei Brustkrebs zu bewerten, wurde eine Überlebensanalyse mit dem Online-Tool Kaplan–Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis/)28 durchgeführt. Diese Datenbank integriert Genexpressions- und Überlebensdaten von mehr als 4.900 Brustkrebspatientinnen, abgeleitet aus mehreren GEO-, EGA- und TCGA-Datensätzen. Die Analyse wurde auf rezidivfreies Überleben (RFS) mit einzelnen Affymetrix-Sonden-IDs durchgeführt, die den priorisierten Genen entsprechen: 225609_at (GSR), 201761_at (MTHFD2), 201619_at (PRDX3/AOP1) und 201128_s_at (ACLY). Die Patienten wurden anhand des medianen Expressionsgrenzwerts in Hoch- und Niedrigausdrucksgruppen eingeteilt, und die Überlebenswahrscheinlichkeiten wurden mit der Kaplan–Meier-Methode geschätzt. Der Log-Rang-Test wurde verwendet, um die statistische Signifikanz zwischen Überlebenskurven zu bewerten, und Hazard Ratios (HRs) mit 95%-Konfidenzintervallen (KI) wurden automatisch vom Tool berechnet. Alle Analysen wurden mit dem RFS-Endpunkt durchgeführt, ohne Restriktion basierend auf dem Hormonrezeptor oder HER2-Status (ER, PR, HER2 = alle). Redundante Stichproben wurden entfernt, und Annahmen zu proportionalen Gefahren wurden überprüft, um die statistische Robustheit sicherzustellen. Qualitätskontrollfilter schlossen verzerrte Mikroarrays aus. Es wurde keine manuelle Sondenauswahl oder p-Wertkorrektur für mehrfache Tests durchgeführt, gemäß den Standardeinstellungen des KM Plotters. Die statistische Signifikanz wurde als S. < 0,05 definiert. Überlebensdiagramme wurden visualisiert und in hoher Auflösung zur weiteren Interpretation heruntergeladen, wobei die Ergebnisse zwischen hohen und niedrigen Expressern jedes Kandidaten-MOS-Gens29,30 verglichen wurden.
Die vorliegende Analyse wurde mit Datensätzen eingeleitet, die ausschließlich HER2+- Brustkrebsproben enthalten, um differenziell exprimierte Gene (DEGs) und Hub-Gene zu identifizieren. Anschließend wurde eine Überlebensanalyse ohne Einschränkung auf den HER2-Status (ER, PR, HER2 = alle) durchgeführt, um die breitere prognostische Relevanz und Generalisierbarkeit der identifizierten Gene zu bewerten. Dieser Ansatz wurde als sekundärer Validierungsschritt angewandt, anstatt den Studienfokus neu zu definieren. Daher werden die prognostischen Implikationen der identifizierten Hub-Gene vorsichtig interpretiert, wobei die primären Schlussfolgerungen weiterhin spezifisch für HER2+- Brustkrebs bleiben.
Die kanonischen Transkriptsequenzen von MTHFD2-201 (ENST00000394053.7) und PRDX3-201 (ENST00000298510.4) wurden vom Ensembl Genome Browser (https://www.ensembl.org)31,32 abgerufen. Die Variantenannotation und -klassifikation wurden mit dem Ensembl Variant Effect Predictor (VEP) (https://www.ensembl.org/vep) durchgeführt, der detaillierten genomischen Kontext, Codon-Veränderungen und Aminosäuresubstitutionen für jede identifizierte Variante bereitstellte. Für die nachgelagerte Analyse wurden nur Missense-Varianten (nicht-synonyme SNPs) ausgewählt.
Vorhersage der Pathogenizität und Variantenpriorisierung
Die funktionalen Folgen jedes nsSNP wurden mit einer Kombination von rechnergestützten Vorhersagewerkzeugen bewertet. SIFT (https://sift.bii.a-star.edu.sg) wurde angewendet, um die Aminosäurekonservierung zu bewerten und Varianten mit einem Wert ≤ 0,05 als schädlich33 zu klassifizieren. PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2) schätzte die strukturelle und evolutionäre Wirkung von Substitutionen, wobei Werte ≥ 0,85 wahrscheinlichen Schadenvon 34 anzeigten. CADD (https://cadd.gs.washington.edu) lieferte einen zusammengesetzten Schadenswert, der mehrere Annotationen integrierte, wobei Werte ≥ 20 ein hohes pathogenes Potenzial35 anzeigten. Komplementäre Metriken von MetaLR36, Mutation Assessor und REVEL wurden aus der VEP-Schnittstelle integriert, um die Prädiktionszuverlässigkeit37 zu verbessern. Varianten, die die Schwellenwerte MetaLR ≥ 0,70, Mutation Assessor ≥ 3,5 und REVEL ≥ 0,75 erreichten, wurden als wahrscheinlich pathogen bewertet.
Strukturelle und mechanistische Auswirkungsprognose
Um zu bewerten, wie Aminosäuresubstitutionen die strukturelle Integrität und biochemische Funktion beeinflussen, wurde jedes top-bewertete nsSNP mit MutPred2 (http://mutpred.mutdb.org)38 und DynaMut (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut)39 weiter analysiert. MutPred2 schätzte die Wahrscheinlichkeit einer funktionellen Störung, einschließlich veränderter katalytischer Aktivität, Gewinn oder Verlust metallbindender Rückstände, Veränderungen der Lösungsmittelzugänglichkeit und allosterischer Modulation, wobei Werte ≥ 0,80 als hochpathogen klassifiziert wurden. DynaMut berechnete die Gibbs-Freienergieveränderung (ΔΔG) zwischen Wildtyp- und Mutantenproteinen, bewertete die Richtung und Größe der Stabilitätsänderung und erstellte Visualisierungen von atomaren Verschiebungen und Wasserstoffbrücken-Neuordnungen.
Sekundäre und 3D-Strukturmodellierung sowie Sichtbarkeitsprofilierung
Die experimentell aufgelösten Kristallstrukturen von MTHFD2 und PRDX3 wurden aus der Protein Data Bank (PDB) gewonnen und mit PyMOL V:3.1 (https://pymol.org)40 verarbeitet, um die räumliche Verteilung schädlicher Reste zu visualisieren. Mutante Modelle wurden durch die Einführung der entsprechenden Aminosäuresubstitutionen, gefolgt von struktureller Verfeinerung und Energieminimierung erstellt. Eine vergleichende 3D-Inspektion zeigte Verschiebungen sekundärer Elemente, veränderte interatomare Kontakte und die räumliche Nähe von nsSNPs zu katalytischen und kofaktorbindenden Domänen hervor und zeigte potenzielle Störungen der Redox- und Stoffwechselfunktionen auf.
Sekundärstruktur- und Lösungsmittelexpositionsanalysen wurden mit PSIPRED V: 3.2 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)41,42 und NetSurfP 3.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetSurfP-2.0)43 durchgeführt. Diese Werkzeuge sagten α-Helices, β-Stränge, Spiralen und ungeordnete Regionen sowie relative Solvent Accessibility (RSA)-Werte voraus. Reste mit moderaten bis hohen RSA-Werten und struktureller Ordnung wurden kartiert, um lösungsmittelexponierte und funktional kritische Positionen zu identifizieren. Die betroffenen Stellen wurden in 2D-Topologiediagrammen visualisiert, um zu bestimmen, ob schädliche Mutationen in starren katalytischen Kernen oder flexiblen Schleifregionen auftreten, wodurch ihre wahrscheinlichen Auswirkungen auf die Proteinfaltungsdynamik und enzymatische Effizienz vorhergesagt wurden.
Datenbank-Crossvalidierung, funktionale Integration und Stabilitätsvalidierung
Jedes priorisierte nsSNP wurde mit populationsbezogenen genomischen Datenbanken wie dbSNP, 1000 Genomes, ExAC und gnomAD abgeglichen, um Variantenhäufigkeit, globale Allelverteilung und zuvor berichtete klinische Assoziationen zu bestätigen. Die Integration von evolutionärer Konservierung, struktureller Modellierung und maschinell-learningbasierter funktionaler Vorhersage ermöglichte die Identifizierung von hochkonfidenzbasierten schädlichen Varianten in MTHFD2 und PRDX3. Diese wirkungsvollen Mutationen wurden anschließend auf funktionelle Domänen abgestuft, um ihre potenzielle Rolle bei mitochondrialem oxidativem Stressungleichgewicht, veränderter metabolischer Signalübertragung und therapeutischer Resistenz bei Brustkrebs aufzuklären. Um die thermodynamischen Folgen jeder schädlichen Substitution weiter zu bestätigen, wurde iMutant 3.0 (https://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant3.0.html)44 verwendet, um die Auswirkungen von Mutationen auf die Proteinstabilität anhand von Sequenz- und Strukturdaten vorherzusagen. Die Analyse berechnete ΔΔG-Werte (kcal/mol), die die Veränderung der freien Energie zwischen Wildtyp- und Mutantenproteinen repräsentieren. Varianten mit negativen ΔΔG-Werten wurden als destabilisierende Mutationen klassifiziert, was auf eine verminderte Proteinstabilität und eine erhöhte Entfaltungswahrscheinlichkeit hinweist. Die Integration von iMutant-Vorhersagen mit DynaMut- und MutPred2-Ergebnissen ermöglichte eine Kreuzvalidierung zur Identifizierung strukturell kritischer Reste, die wahrscheinlich die Redoxfunktion, katalytische Integrität und die allgemeine Proteinkonformationsstabilität beeinflussen.
Integrierte funktionelle Interpretation und therapeutische Relevanz
Alle identifizierten schädlichen nsSNPs wurden durch Querverweise mit dbSNP-, gnomAD- und ExAC-Populationsdatenbanken validiert, um Häufigkeiten kleiner Allele und zuvor berichtete Assoziationen mit Krebsphänotypen zu überprüfen. Integrative Interpretation von Daten zur evolutionären Konservierung, struktureller Modellierung und Stabilität zeigte, dass die hochwirkungsvollen Mutationen rs1471336772 (MTHFD2) und rs747786383 (PRDX3) die stärksten schädlichen Effekte auf die Proteinkonformation und katalytische Effizienz haben. Die rechnergestützten Ergebnisse legen zusammen nahe, dass Mutationen in MTHFD2 den NADPH-abhängigen Redoxstoffwechsel destabilisieren, während Mutationen in PRDX3 die durch Peroxidase-vermittelten oxidativen Stressabwehr beeinträchtigen, was zu mitochondrialer Dysfunktion und Tumoraggressivität beiträgt. Diese auf nsSNP basierende strukturelle und funktionelle Analyse bietet eine rechnergestützte Grundlage für zukünftige therapeutische Screenings und mutationale Validierung und hebt MTHFD2 und PRDX3 als Präzisionsbiomarker für redox-gezielte Brustkrebstherapien hervor. Um die Klarheit zu verbessern und einen umfassenden Überblick über die analytische Strategie zu geben, wird in Abbildung 2 ein schematischer Workflow mit der Zusammenfassung der wichtigsten Schritte der Studie dargestellt. Der Arbeitsablauf integriert die Analyse der differentiellen Genexpression, mitochondriale Genfilterung, den Aufbau von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken, klinische Validierung mittels ROC-Analyse und nsSNP-basierte strukturelle Charakterisierung. Dieses stufenweise Framework hebt den logischen Fortschritt von der transkriptomischen Datenverarbeitung zur Biomarker-Identifikation und funktionalen Interpretation hervor.
Abbildung 2. Integrativer mehrstufiger Workflow zur Identifizierung und Validierung mitochondrialer biomarker mit oxidativem Stress bei HER2+- Brustkrebs. Dieses Schema fasst die in der Studie verwendete analytische Pipeline zusammen. Zunächst wurde eine Analyse der differenziellen Genexpression (DEG) an RNA-seq-Datensätzen (GSE231524 und GSE231525) durchgeführt, um signifikant veränderte Gene zu identifizieren. Diese DEGs wurden mit kuratierten mitochondrialen oxidativ-stressbezogenen Genen kombiniert, um MOS-TEGs zu erhalten. Anschließend wurde eine Analyse des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI) mit STRING und Cytoscape durchgeführt, um Hub-Gene und funktionelle Module zu identifizieren. Anschließend wurde die Analyse der Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC) mit der ROCplotter-Plattform angewendet, um die prädiktive Leistung ausgewählter Gene in klinischen Kohorten zu bewerten. Abschließend wurden nicht-synonyme SNP-(nsSNP)-Analysen und strukturelle Modellierungen durchgeführt, um die potenziellen funktionellen und strukturellen Auswirkungen von Schlüsselvarianten in priorisierten Genen (MTHFD2 und PRDX3) zu bewerten. Dieser integrative Workflow verbindet transkriptomische, Netzwerk-, klinische und strukturelle Analysen, um potenzielle Biomarker und therapeutische Ziele zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.
