Methodenartikel

Bildgebungsstrategien für Akupunkturinterventionen bei Alzheimer-Modellmäusen

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DOI:

10.3791/70998

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21. April 2026

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1Department of Traditional Chinese Medicine, General Hospital of the Chinese People's Liberation Army, 2Meizhou Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine (Meizhou Hospital of Traditional Chinese Medicine), 3School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University, 4Department of Psychosomatic Medicine, Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine in vivo mikro-PET-Bildgebende Strategie, kombiniert mit Verhaltens- und molekularen Tests, um die Auswirkungen der Elektroakupunktur auf β-Amyloid-Ablagerungen und kognitive Funktionen in einem Alzheimer-Mausmodell dynamisch zu bewerten.

Zusammenfassung

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die hauptsächlich durch fortschreitende kognitive Dysfunktion gekennzeichnet ist. Eines seiner typischen pathologischen Merkmale ist die Bildung seniler Plaques im Gehirn durch die Ablagerung von β-Amyloid-(Aβ)-Proteinen. Akupunktur hat in der klinischen Praxis Potenzial zur Verbesserung der kognitiven Funktion bei AD-Patienten gezeigt. Seine dynamischen Auswirkungen auf die Aβ-Pathologie erfordern jedoch eine objektive Aufklärung durch moderne technologische Ansätze. Die Mikropositronen-Emissionstomographie (Micro-PET) bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für die in vivo, nicht-invasive Beobachtung der Aβ-Ablagerung im Gehirn von AD-Modellmäusen. In diesem Protokoll erläutern wir eine Bildgebungsstrategie, die [18F]AV-45 Micro-PET verwendet, um die Auswirkungen der Elektroakupunkturintervention zu bewerten, ergänzt durch Morris Water Maze-Verhaltenstests und Western-Blot-Molekularanalyse. Der integrierte Ansatz ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung des pathologischen Fortschreitens von Aβ im Gehirn von AD-Modellmäusen. Dies liefert objektive und quantitative Belege, um den regulatorischen Effekt der Akupunktur auf die Aβ-Ablagerung zu untersuchen. Durch die Integration der Prinzipien der traditionellen chinesischen Medizin mit modernen molekularen Bildgebungs- und molekularbiologischen Technologien.

Einleitung

In vivo ist die Überwachung der β-Amyloid(Aβ)-Ablagerung im Gehirn entscheidend, um den pathologischen Verlauf von AD1 zu beurteilen. Nach der klinischen Anwendung von Aβ-gezielten Antikörpertherapien (z. B. Lecanemab) hat sich die longitudinale und quantitative Bewertung der zerebralen Aβ-Belastung mittels PET als Goldstandard zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeitetabliert 2. Während Akupunktur in präklinischen Studien Potenzial zur Modulation des Aβ-Stoffwechsels gezeigt hat, stützen sich traditionelle Forschungsansätze weitgehend auf ex-vivo-Analysen und fehlen effektive Werkzeuge zur direkten und objektiven Bewertung ihrer dynamischen Auswirkungen auf Aβ-Ablagerungen bei lebenden Organismen. In den letzten Jahren haben Fortschritte in molekularen Bildgebungstechnologien Möglichkeiten geschaffen, diese Lücke zu schließen. Micro-PET hat die nicht-invasive, longitudinale Beobachtung der Aβ-Ablagerung bei AD-Modellmäusen1 ermöglicht. Noch wichtiger ist, dass sich neuartige Bildgebungsstrategien von Einzelzielansätzen hin zu multimodalen Paradigmen entwickeln. Beispielsweise haben Studien bestätigt, dass verschiedene strukturelle Subtypen von Aβ-Fibrillen unterschiedliche Bindungsaffinitäten zu häufig verwendeten PET-Tracern aufweisen, was neue Anforderungen an eine präzise Quantifizierungaufwirft. Gleichzeitig bieten aufkommende Techniken wie die neuroimmune Bildgebung (z. B. TSPO PET) und Bewertungen der Funktion der Blut-Hirn-Schranke beispiellose Perspektiven, um die komplexen pathologischen Mechanismen der AD und die multizielreichen Effekte therapeutischer Interventionen umfassend zu erläutern4.

Auf dieser Grundlage verfolgt diese Studie das Ziel, eine fortschrittliche Mikro-PET-Bildgebungsstrategie zu entwickeln, die die neuesten Aβ-spezifischen Sonden nutzt, um dynamisch und quantitativ die Auswirkungen der Akupunkturintervention auf die Aβ-Ablagerung im Gehirn von AD-Modellmäusen in vivo zu bewerten. Die Studie wird nicht nur die therapeutische Wirksamkeit der Akupunktur validieren, sondern auch bemühen, direkte Belege für die zugrunde liegenden Mechanismen auf molekularer Bildgebungsebene zu liefern.

Protokoll

Durchführung aller Experimente gemäß den Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren, die von den National Institutes of Health herausgegeben wurden. Das Studienprotokoll wurde vom Ethischen Komitee für experimentelle Tiere der Pekinger Universität für Chinesische Medizin (Nr.: bucm-4-2021102707-5421) genehmigt.

1. Zubereitung von Versuchstieren

  1. Besorge 6 Monate alte männliche APP/PS1-Mäuse sowie alters- und geschlechtsgleiche C57BL/6-Mäuse mit einem Gewicht von 28,0 ± 2,0 g.
  2. Halten Sie die Mäuse in Standardkäfigen bei Raumtemperatur von 24 ± 2 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 40 % bis 60 %.
    HINWEIS: Die Tiere wurden in Standardkäfigen im Labor Animal Center der Beijing University of Chinese Medicine, Capital Medical University, untergebracht.
  3. Halten Sie die Tiere unter einem standardmäßigen 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus (Dunkelzeit: 20:00 Uhr bis 8:00 Uhr) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Wechseln Sie die Einstreu täglich, um saubere und trockene Wohnverhältnisse zu gewährleisten.
  4. Gewöhnen Sie die Tiere für 7 Tage an die Laborumgebung. Beginnen Sie die Experimente am achten Tag nach der Akklimatisierung.

2. Tiergruppierung und Interventionen

  1. Zufällig werden zwanzig 6 Monate alte männliche APP/PS1-Mäuse einer Alzheimer-Modellgruppe (AD-Gruppe, n = 10) und einer Elektroakupunkturgruppe (EA-Gruppe, n = 10) zugeteilt. Zuweisen Sie zehn alters- und geschlechtsgerechten C57BL/6N-Mäusen einer normalen Kontrollgruppe zu (N-Gruppe, n = 10).
  2. Identifizieren Sie die drei Akupunktpunkte auf dem Kopf für die Intervention: GV20 (Baihui), GV26 (Shuigou) und GV29 (Yintang).
    HINWEIS: Die Lokalisierung der Akupunkturpunkte basiert auf dem "Animal Acupuncture Acupoint Atlas", der von der Experimental Acupuncture Research Society der China Association of Acupuncture-Moxibustion formuliert wurde. GV20 befindet sich in der Mitte zwischen den Spitzen beider Ohren; GV29 liegt in der Mitte zwischen den medialen Enden der Augenbrauen; und GV26 befindet sich unterhalb des Nasenseptums der Maus, an der Verbindung der unteren zwei Drittel und des oberen Drittels der Mittellinie der Lippenspalte. Das schaltende Diagramm ist in Abbildung 1 dargestellt.
  3. Verabreichen Sie der EA-Gruppe einmal täglich für 20 Minuten über 15 aufeinanderfolgende Tage eine Elektroakupunkturstimulation.
    1. Sichern Sie die Maus sicher mit identischen, maßgefertigten Stoff-Sicherungshüllen. Stellen Sie sicher, dass der Körper bequem umwickelt ist, während der Kopf vollständig freiliegt, um einen präzisen Nadeleinstich und eine normale Atmung zu gewährleisten.
    2. Bereiten Sie Einweg-sterile Akupunkturnadeln vor (0,25 mm × 13 mm).
    3. Wenden Sie eine schnelle Stichmethode (schnelles Einsetzen und sofortiges Absetzen ohne Verspannung) am GV26 (Shuigou) Akupunktur mit der sterilen Akupunkturnadel an.
    4. Verbinden Sie die Griffe der Nadeln an GV20 und GV29 mit den Ausgangsklammern eines elektronischen Elektroakupunkturapparats.
    5. Stellen Sie die Stimulationsparameter des Geräts so ein, dass eine kontinuierliche, spärliche Welle mit einer Frequenz von 2 Hz, einer konstanten Spannung von 2 V und einer Stromintensität von 0,1 mA geliefert wird.
    6. Beobachten Sie die Maus genau und stellen Sie sicher, dass die Stimulationsintensität ein leichtes, rhythmisches Zittern des Kopfes hervorruft.
  4. Halten Sie Mäuse in den N- und AD-Gruppen unter identischen Unterkunftsbedingungen ohne jegliche Intervention. Unterwerfen Sie die N- und AD-Gruppen während des gesamten 15-Tage-Zeitraums denselben täglichen Handhabungs- und Fixierungsverfahren wie die EA-Gruppe, um die Konsistenz der experimentellen Bedingungen sicherzustellen.

3. Der Morris-Wasserlabyrinth-Test (MWM)

HINWEIS: Das Verhaltensrahmen (Morris Water Maze) baut auf unserer früheren Arbeitauf 5.

  1. Vorbereitung des Geräts
    1. Stellen Sie einen runden Wassertank (90 cm im Durchmesser, 50 cm tief) im Prüfraum auf. Füllen Sie das Becken mit Wasser (22 ± 2 °C) bis zu einer Tiefe von 30 cm.
    2. Gib 0,5 kg Magermilchpulver ins Wasser, um es deckig zu machen. Man teilt den Panzer praktisch in vier gleich große Quadranten (I, II, III und IV).
    3. Positionieren Sie eine Fluchtplattform (rund, 5 cm Durchmesser, 28 cm Höhe) in der Mitte von Quadrant I.
    4. Platzieren Sie unterschiedliche visuelle Hinweise verschiedener Formen an der Innenwand jedes Quadranten, um der Maus zu helfen, die Position der Plattform zu lernen und sich zu merken.
    5. Installieren Sie eine Digitalkamera 2 m über der Mitte des Tanks an der Decke und verbinden Sie sie mit einem Bildaufnahmesystem6.
  2. Gewöhnung
    1. Entfernen Sie die Plattform am Tag vor dem Test der versteckten Plattform aus dem Tank. Lassen Sie die Maus morgens und nachmittags 90 Sekunden lang frei im Becken schwimmen, um sich an die experimentelle Umgebung zu gewöhnen.
  3. Test der versteckten Plattform
    1. Führen Sie den Test der versteckten Plattform an fünf aufeinanderfolgenden Tagen durch.
    2. Wählen Sie Startpunkte aus dem zweiten, dritten und vierten Quadranten aus, wobei jeder Startpunkt gleich weit vom Zentrum des Panzers entfernt ist.
    3. Setze die Maus ins Wasser, mit Blick zur Beckenwand. Lassen Sie die Maus 10 Sekunden ihre Umgebung beobachten, nachdem sie ins Wasser gesetzt wurde.
    4. Nimm die Fluchtlatenz und den Schwimmweg auf, wenn die Maus die versteckte Plattform findet und 5 Sekunden innerhalb eines 60-Sekunden-Limits darauf bleibt. Führe die Maus manuell auf die Plattform, falls sie die Plattform innerhalb von 60 Sekunden nicht findet.
    5. Lassen Sie das Tier 10 Sekunden auf der Plattform bleiben, um den Ort zu beobachten und sich einzuprägen, und zeichnen Sie die Fluchtlatenz mit 60 Sekunden auf.
  4. Räumlicher Sondentest
    1. Entfernen Sie die versteckte Plattform nach fünf aufeinanderfolgenden Tagen des Trainings der versteckten Plattform aus dem Panzer.
    2. Setze jede Maus von einem der Startpunkte im zweiten, dritten oder vierten Quadranten ins Wasser. Lass die Maus 60 Sekunden lang frei schwimmen. Zeichnen Sie den Schwimmweg und die Zeit im Zielquadranten (Quadrant I) auf.
    3. Bringen Sie alle Mäuse sofort zwischen den Versuchen zurück in ihre Hauskäfige, um den direkten Kontakt mit dem Experimentator zu minimieren.

4. Western-Blot-Analyse

  1. Sechs Mäuse pro Gruppe 24 Stunden nach Abschluss der 15-tägigen Intervention eingeschläfert. Seziziere und isoliere schnell frisches hippocampales Gewebe auf Eis.
  2. Wiegen Sie das hippocampale Gewebe und legen Sie es in vorgekühlte Mikrozentrifugenröhren. Fügen Sie einen kalten RIPA-Lysepuffer hinzu, ergänzt durch einen 1%igen Proteaseinhibitor-Cocktail und einen 1%igen Phosphatase-Inhibitor-Cocktail im Verhältnis von 10 μL Puffer pro 1 mg Gewebe.
  3. Homogenisieren Sie das Gewebe gründlich mit einem mechanischen Gewebehomogenisator auf Eis. Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 12.000 x g für 15 Minuten bei 4 °C, um Zellreste zu entfernen. Sammeln Sie vorsichtig den Überstandsstoff ein und übertragen Sie ihn in ein neues, vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr.
  4. Mischen Sie die Proteinproben mit einem 5× SDS-Ladepuffer und kochen Sie die Mischung bei 95 °C für 10 Minuten, um die Proteine vollständig zu denaturieren. Gleiche Mengen Protein (20 μg) pro Bohrloch auf ein 15%iges SDS-PAGE-Gel laden. Fügen Sie einen vorgefärbten Molekulargewichtmarker für Proteine in einem benachbarten Brunnen ein.
  5. Lasse das Stapelgel bei einer konstanten Spannung von 80 V für 30 Minuten laufen und löse dann die Proteine im Trenngel bei 120 V auf, bis die Front des Bromphenol-blauen Farbstoffs den Boden des Gels erreicht.
  6. Übertragen Sie die getrennten Proteine auf eine 0,22 μm Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran mit einem konstanten Strom von 250 mA für 90 Minuten auf Eis. Blockieren Sie die PVDF-Membran mit 5 % fettfreier Magermilch, gelöst in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (TBST), für 1 Stunde bei Zimmertemperatur und sanftem Rühren auf einem Shaker.
  7. Inkubieren Sie die Membran mit einem primären Antikörper gegen Aβ (verdünnt [1:1000] im Blockpuffer) und einem primären Antikörper gegen GAPDH (verdünnt [1:5000] im Blockpuffer) über Nacht bei 4 °C auf einem horizontalen Shaker. Inkubieren Sie die Membran mit einem Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörper (verdünnt [1:2000] im Blockpuffer) für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
  8. Waschen Sie die Membran jeweils dreimal mit TBST für jeweils 10 Minuten, um ungebundene sekundäre Antikörper zu entfernen.
  9. Übertragen Sie ein verstärktes Chemilumineszenz-(ECL)-Substrat auf die Membran und fangen Sie das Signal mit einem chemilumineszenz-Bildgebungssystem auf.
  10. Quantifizieren Sie die Proteinbandintensitäten mit der ImageJ-Software (Version 1.53a). Normalisieren Sie die Graustufenwerte der Zielbänder auf die von GAPDH und berechnen Sie die relativen Expressionsniveaus der interessierten Proteine.

5. [18F]AV-45 Radiosynthese

  1. Führen Sie eine Radiomarkierung durch nukleophile Substitution von 3,0 mg der Vorläuferverbindung mit [18F]KF durch.
  2. Reinigen Sie das Produkt mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), um eine radiochemische Reinheit (RCP) von über 95 % zu erreichen.
  3. Lösen Sie die beschriftete Verbindung in Ethanol auf.
  4. Verdünnen Sie die Lösung mit 0,9 % Natriumchlorid und bereiten Sie das Endprodukt in 10 % Ethanol für die spätere Verwendungvor. 7.

6. In vivo PET-Bildgebung

  1. Wählen Sie zufällig vier Mäuse aus jeder Versuchsgruppe aus.
    1. Stellen Sie die Maus vor dem Eingriff 5–10 Minuten auf ein zirkulierendes Wasserheizpad (37 °C) oder unter eine Wärmelampe, um die Vasodilatation der Schwanzvenen zu fördern.
    2. Sichern Sie die Maus in einem geeigneten transparenten zylindrischen Nagetier-Fixier, wobei der Schwanz vollständig freiliegt. Desinfizieren Sie den Schwanz und sehen Sie die lateralen Schwanzvenen weiter vor, indem Sie die Haut mit einem 70%igen Ethanolabstrich abwischen.
  2. Ziehen Sie den formulierten[18F]AV-45 Radiotracer in eine 0,5 mL Insulinspritze mit einer Nadel. Bereiten Sie ein Injektionsvolumen von etwa 100–150 μL vor, um eine Ziel-Radioaktivitätsdosis von 3,0 MBq (radiochemische Reinheit > 95 %)2 zu erreichen.
  3. Messen und registrieren Sie die anfängliche Radioaktivität der mit Tracer gefüllten Spritze mit einem Dosiskalibrator.
  4. Führen Sie die Nadel mit dem Abschrägen nach oben in einem flachen Winkel (etwa 10°–20°) in die seitliche Schwanzvene ein. Warte 60 Minuten nach der Verabreichung und betäube die Maus dann durch Inhalation von 2 % Isofluran.
  5. Positionieren Sie die Maus und machen Sie einen 15-minütigen dreidimensionalen statischen PET-Scan.
  6. Rekonstruiere die PET-Daten mit einem dreidimensionalen Algorithmus zur Erwartungsmaximierung der geordneten Teilmenge (OSEM).
  7. Verarbeiten Sie die rekonstruierten Daten mit PMOD-Software (Version 4.5).
    1. Registrieren Sie die Daten gemeinsam in eine Gehirnvorlage, die für kleine bis mittelgroße Mäuse im PMOD-Fusionsmodul geeignet ist. Ermöglicht es der Software, die Interessenbereiche (ROIs) im Maushirn automatisch abzugrenzen.
  8. Berechnen Sie die standardisierten Aufnahmewerte (SUVs). Ermitteln Sie das standardisierte Aufnahmewertverhältnis (SUVR), indem Sie den SUV jedes ROI mit dem des Kleinhirns8 vergleichen.
    HINWEIS: Die akzeptable Variabilität der verabreichten Dosis (2,0–3,8 MBq) berücksichtigt tägliche Schwankungen im Radiotracer-Ertrag und das individuelle Körpergewicht der Maus. Da nachfolgende Quantifizierungen auf dem standardisierten Aufnahmewertverhältnis (SUVR) basieren – das die Zielregion gegen eine Referenzregion (Kleinhirn) normalisiert – beeinträchtigen absolute Dosisvariationen innerhalb dieses Bereichs die vergleichenden Bildgebungsergebnisse nicht. Die Mikropositronen-Emissionstomographie (Micro-PET) ist in Abbildung 2 dargestellt.

7. Statistische Analyse

  1. Führen Sie alle statistischen Analysen mit SPSS-Software (Version 19.0) durch.
  2. Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD).
  3. Wenden Sie Einweg-ANOVA an, um die Testergebnisse der versteckten Plattform zu analysieren.
  4. Analysieren Sie die Daten aus dem räumlichen Sondentest und der PET-Bildgebung mittels wiederholter ANOVA oder Einweg-ANOVA, gefolgt von LSD-Post-hoc-Tests für paarweise Vergleiche.

Ergebnisse

Auswirkungen der Elektroakupunktur auf die kognitive Funktion bei APP/PS1-Mäusen

Um die räumliche Lernfähigkeit zu beurteilen, durchliefen die Mäuse von Tag 1 bis Tag 5 Trainingsversuche. Im Hidden Platform-Test (Abbildung 3A,B) zeigte die Fluchtlatenz von Mäusen in allen Gruppen einen abnehmenden Trend über die Trainingsphase. Im Vergleich zur N-Gruppe zeigte die AD-Gruppe eine signifikant verlängerte Fluchtlatenz (p < 0,05), was auf ausgeprägte Lern- und Gedächtnisdefizite bei 6 Monate alten APP/PS1-Mäusen hinweist. Die Fluchtlatenz in der AD-Gruppe war signifikant länger als in den N- und EA-Gruppen (p < 0,01). Bemerkenswert ist, dass am Tag 5 die Fluchtlatenz in der EA-Gruppe signifikant kürzer war als in der AD-Gruppe (p < 0,05) (Abbildung 3C). Nach der 5-tägigen Trainingsphase wurde das räumliche Gedächtnis mittels des Spatial Probe-Tests bewertet. Das Verhältnis der im Ziel- (Plattform-)Quadranten verbrachten Schwimmzeit zu der Gesamtschwimmzeit wurde berechnet; Ein höheres Verhältnis deutet auf eine bessere Gedächtnisspeicherung hin. Die Ergebnisse zeigten, dass das Schwimmzeitverhältnis in der AD-Gruppe signifikant niedriger war als in der N-Gruppe (p < 0,01). Im Gegensatz dazu zeigte die EA-Gruppe ein signifikant höheres Verhältnis als die AD-Gruppe (p < 0,01). Das Verhältnis in der EA-Gruppe blieb jedoch niedriger als in der N-Gruppe (p < 0,05) (Abbildung 3D).

Auch die Anzahl der Bahnsteigübergänge, die die Präzision des räumlichen Speichers widerspiegelt, wurde analysiert. Eine größere Anzahl von Kreuzungen deutet auf eine bessere Gedächtniserhaltung hin. Die AD-Gruppe zeigte signifikant weniger Bahnsteigüberquerungen als die N-Gruppe (p < 0,05), während die EA-Gruppe im Vergleich zur AD-Gruppe (p < 0,05) einen signifikanten Anstieg zeigte. Dennoch hatte die EA-Gruppe immer noch weniger Kreuzungen als die N-Gruppe (p < 0,05) (Abbildung 3E).

Auswirkungen der Elektroakupunktur auf die Aβ-Ablagerung im Hippocampus von APP/PS1-Mikrofone

Die Aβ-Ablagerung wurde mittels PET-Bildgebung bewertet, und das standardisierte Aufnahmewertverhältnis (SUVR) des radioaktiv markierten Aβ-Tracers wurde im Hippocampus von APP/PS1-Mäusen berechnet (Abbildung 4A). Micro-PET-Scans zeigten, dass sowohl die N-Gruppe als auch die EA-Gruppe signifikant niedrigere SUVR-Werte im Vergleich zur AD-Gruppe aufwiesen (Abbildung 4B). Weitere quantitative Analysen bestätigten, dass der hippocampale SUVR und Aβ in der EA-Gruppe signifikant höher waren als die der N-Gruppe (p < 0,05), während sie nach der Elektroakupunkturintervention (p < 0,05) signifikant niedriger blieben als in der AD-Gruppe (Abbildung 4C).

Auswirkungen der Elektroakupunktur auf die Aβ-Proteinexpression

Nach den Verhaltens- und bildgebenden Bewertungen wurde die Aβ-Proteinexpression im Hippocampus mittels Western-Blot-Analyse untersucht (Abbildung 5A). Quantitative Analysen zeigten, dass die relative Expression von Aβ in der AD-Gruppe im Vergleich zur N-Gruppe signifikant erhöht war (S. < 0,05). Die EA-Gruppe zeigte eine signifikante Reduktion der hippocampalen Aβ-Expression im Vergleich zur AD-Gruppe (S. < 0,05). Die Expressionswerte in der EA-Gruppe blieben jedoch höher als in der N-Gruppe, was darauf hindeutet, dass die Intervention zwar die Aβ-Akkumulation effektiv abschwächte, aber die vorhandenen Plaques nicht vollständig befreite (Abbildung 5B).

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Abbildung 1: Schaltplan, das die Standorte der Akupunktpunkte GV20 (Baihui), GV26 (Shuigou) und GV29 (Yintang) bei Mäusen zeigt. Diese Figur wurde mit Erlaubnis von Sun et al.5 wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Mikropositronen-Emissionstomographie (Micro-PET). Das IRIS PET/CT (Inviscan) ist ein präklinisches Bildgebungssystem für Mäuse und Ratten mit hoher Empfindlichkeit (>9 %) und einer räumlichen Auflösung von 1 mm bei einem axialen Sichtfeld von 96 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Wirkung der Elektroakupunktur auf die kognitive Funktion. (A) MWM-Gerät. (B) Die Mäuse wurden mit dem Morris Water Maze (MWM)-Gerät getestet. (C) Trends in der Fluchtlatenz während des Hidden Platform-Tests. Im Vergleich zur N-Gruppe < ◆◆p 0,05; im Vergleich zur Alzheimer-Gruppe (AD) < ▲▲p 0,05. (D) Anteil der Schwimmzeit im ersten Quadranten. Im Vergleich zur N-Gruppe < ◆◆p 0,05; im Vergleich zur AD-Gruppe < ▲▲p 0,05. (E) Anzahl der Bahnsteigübergänge im Bahnsteigquadranten. Im Vergleich zur N-Gruppe < ◆◆p 0,05; im Vergleich zur AD-Gruppe < ▲▲p 0,05. Diese Figur wurde mit Erlaubnis von Sun et al.5 wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 4: Auswirkungen der Elektroakupunktur auf die Aβ-Ablagerung. (A) Das Interessensgebiet im Hippocampus der Maus ist grün dargestellt. (B) Mikropositronen-Emissionstomographie von Aβ bei Mäusen aus jeder Gruppe. (C) Vergleich der [18F]AV-45 standardisierten Aufnahmewertverhältnisse (SUVR; Zielregion/Kleinhirn) im Hippocampus jeder Gruppe, quantifiziert durch Mikro-PET. Im Vergleich zur N-Gruppe < ◆◆p 0,05; im Vergleich zur Alzheimer-Krankheit (AD)-Gruppe < ▲▲p 0,05. Diese Figur wurde mit Erlaubnis von Sun et al.5 wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 5: Auswirkungen der Elektroakupunktur auf die Expression von Aβ-Proteinen. (A) Repräsentative Westliche Blot-Bänder, die die Expressionsniveaus von Aβ (4 kDa) und GAPDH (146 kDa) als Belastungskontrolle zeigen. Die Bänder zeigen eine niedrige Aβ-Expression in der N-Gruppe, eine hohe Expression in der AD-Gruppe und eine reduzierte Expression in der EA-Gruppe im Vergleich zum AD-Modell. (B) Quantitative Analyse der relativen Expression von Aβ zu GAPDH in den experimentellen Gruppen. Im Vergleich zur N-Gruppe < ◆◆p 0,05; im Vergleich zur Alzheimer-Gruppe (AD) < ▲▲p 0,05. Diese Figur wurde mit Erlaubnis von Sun et al.5 wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Die Visualisierung und Quantifizierung einer Ablagerung im Hippocampus bietet ein entscheidendes Fenster in den pathologischen Verlauf von9 n. Chr. Obwohl es mehrere Neuroimaging-Modalitäten gibt, bleibt die Erreichung hochauflösender, quantitativer und artübergreifender Translation eine bedeutende Hürde. So ist beispielsweise die Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung häufig durch die räumliche Auflösung eingeschränkt, und das MRT – obwohl es strukturelle Veränderungen kartieren kann – erfordert oft übermäßig hohe Kontrastdosen, um Amyloid-Plaques in vivo abzugrenzen. Im Gegensatz dazu stellt PET ein optimales translationales Werkzeug dar, das die dynamische Bewertung von Neuroinflammation, Glukosestoffwechsel und A-Akkumulation sowohl in Tiermodellen als auch in klinischen Populationenermöglicht. Molekulare Bildgebung mittels PET erleichtert nicht nur eine frühzeitige Diagnose und präzise pathologische Stadieneinteilung. ist aber auch unverzichtbar zur Überwachung der Zielbindung und Wirksamkeit neuer AD-Therapeutika12. Das Aufkommen der Mikro-PET-Technologie im präklinischen Bereich hat die Nützlichkeit von PET über klinische Einrichtungen und die Forschung an nichtmenschlichen Primaten hinaus erheblich erweitert. Gekennzeichnet durch eine überlegene räumliche Auflösung und hohe Empfindlichkeit, die auf kleine Sichtfelder zugeschnitten ist, ermöglicht Micro-PET Forschern, den neurodegenerativen Fortschreiten in Nagetiermodellen längs13,14 zu verfolgen. Entscheidend ist, dass etablierte quantitative Metriken wie die von SUVR berechnete Referenzregionen ohne robuste A-Pathologie, wie das Kleinhirn, nahtlos vom Labor auf dasBett 15 übertragen werden können. Historisch gesehen zeigte PET-Bildgebung mit spezifischen Tracern eine hohe diagnostische Sensitivität (bis zu 90 %) und Spezifität (89 %) fürAD 16,17. Während [11C]PIB-Tracer die frühe Amyloid-Visualisierung revolutionierte, schränkte seine kurze Halbwertszeit seine weitverbreitete Verbreitung18 ein. Die anschließende Entwicklung und FDA-Zulassung von [18F]AV-45 (Florbetapir) im Jahr 2012 milderte diese Einschränkungen19 und bot eine längere Halbwertszeit sowie eine ausgezeichnete Bindungsaffinität und Selektivität für Aβ. Folglich ist [18F]AV-45 zu einem festen Bestandteil sowohl der klinischen Diagnostik als auch der präklinischen Bewertungengeworden.

Bei der Nutzung dieses Protokolls müssen mehrere kritische Schritte und mögliche Modifikationen berücksichtigt werden. Erstens ist eine strenge Steuerung der Radiosyntheseparameter unerlässlich; jede Abweichung in der Vorläufermenge oder Reaktionstemperatur kann die radiochemische Reinheit und Ausbeute von [18F]AV-45 stark beeinträchtigen. Zweitens ist eine präzise stereotaktische Ausrichtung während der PET-Bildgebung entscheidend, um Teilvolumeneffekte zu vermeiden, die die SUVR-Berechnungen in kleinen hippocampusalen Mäuseregionen künstlich verzerren können. Um niedrige Signal-Rausch-Verhältnisse in PET-Bildern zu beheben, sollten Forscher die spezifische Aktivität des injizierten Tracers überprüfen und sicherstellen, dass die Tiefe der Isofluran-Anästhesie stabil bleibt, da Atembewegungen Bilder verschärfen können.

Diese Methodik hat gewisse Einschränkungen. Während das [18F]AV-45 micro-PET eine makroskopische Ansicht der regionalen Aβ-Last bietet, erlaubt seine räumliche Auflösung nicht die Sichtbarkeit einzelner, mikroskopischer Amyloid-Plaques. Darüber hinaus zeigte die in dieser Studie eingesetzte 15-tägige Elektroakupunkturintervention eine signifikante Abschwächung der Aβ-Belastung im Vergleich zu unbehandelten AD-Mäusen; da jedoch die vollständige Räumung etablierter Aβ-Plaques typischerweise Monate anhaltender Intervention erfordert, spiegelt das aktuelle Paradigma in erster Linie eine frühe Modulation der löslichen Aβ-Dynamik oder einen Stopp der progressiven Ablagerung wider, anstatt eine vollständige strukturelle Plaque-Räumung. Zusätzlich würde die Entnahme von PET-Scans vor und nach der Intervention beim selben Versuchsperson eine stärkere Längskontrolle bieten, eine Strategie, die in zukünftigen experimentellen Designs übernommen werden sollte.

Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Studie darauf hin, dass die Elektroakupunkturintervention (EA) die Aβ-Ansammlung signifikant mindert und die räumliche kognitive Funktion bei APP/PS1-Mäusen bewahrt. Die mechanistische Grundlage für diese Verbesserung könnte mit den neuromodulatorischen Effekten der stimulierenden Governor Vessel (Du Mai) Akupunkte21 zusammenhängen, die anatomisch mit faszialen und neurovaskulären Netzwerken verknüpft sind, die den kopalen Blutfluss und die Clearance-Pfade fördern. Durch die Bereitstellung robuster, quantifizierbarer molekularer Bildbelege unterstreicht dieses Protokoll die Bedeutung der Integration traditioneller therapeutischer Methoden mit fortschrittlicher Neurobildgebung. Dieser methodische Rahmen ebnet den Weg für tiefere Untersuchungen der therapeutischen Wege der Akupunktur zur Bekämpfung von AD.

Offenlegungen

Alle Autoren haben keine potenziellen Interessenkonflikte angegeben.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 82004482, 82274654, 82274644), der Beijing Natural Science Foundation (Nr. 7252219) und dem Innovation Cultivation Fund des Sechsten Medizinischen Zentrums des PLA General Hospital (Nr. CXPY202405). Wir danken Biorender (biorender.com) für die Bereitstellung der grafischen Werkzeuge, die in dieser Studie verwendet werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
[18F]AV-45Radiopharmazeutisches Labor der Pekinger Normaluniversität— —Der am weitesten verbreitete Tracer in der Branche
0,22 μ m PVDF-MembranBeyotimeFFP71Effizienter Filmtransfer
15 % SDS-PAGE GelBeyotimeP0066Die Migration kleiner molekulärer Proteine behindern
5& Mal; SDS-LadepufferBeyotimeP0015Sorgen Sie für klare Streifen und eine genaue Trennung.
6 Monate alte männliche APP/PS1-MäuseCavenberg(Suzhou) Labotatory Animal Research Co., Ltd.SCXK (Su) 2018-0002Weit verbreitet für die Alzheimer-Forschung.
 
6 Monate alter männlicher C57BL/6 MäuseCavenberg(Suzhou) Labotatory Animal Research Co., Ltd.SCXK (Su) 2018-0002Für die normale Kontrollgruppe
Aβ Antikörperproteintech25524-1-APErkennung von A & Beta; Monomer
Einweg-sterile AkupunkturnadelnZhongYan TaiHe Medicial Instrument Co., LtdZYTH2013030504Gängige Akupunkturwerkzeuge
ECL-SubstratThermo Fisher (Pierce)  32106 (500 mL)Detektion von Zielproteinen
Elektroakupunktur-(EA)-ApparatBeijing Huawei Industrial Development Co., Ltd.HANSLH202In China häufig verwendete Elektroakupunkturgeräte
GAPDHproteintech23567-1-CBKlassisches Referenzprotein (1:5000)
HRP-konjugierter sekundärer AntikörperThermo Fisher Scientific (Invitrogen)31430 (2mL) / C31430100 (100 & mu; L)Detektion von Zielproteinen (1:2000)
ImageJ-SoftwareNIH  Version 1.53aAnalyse der Graustufenwerte der Streifen
IsofluraneZentaur30135687 (250 ml)Sichere und schnelle Anästhesie von Mäusen
PET-CTIRIS PET/CT-BildgebungssystemIRISHohe PET-Sensitivität und ausgezeichnete quantitative Leistung
Phosphatase-Inhibitor-CocktailBeyotimeP0055BAufrechterhaltung des Phosphorylierungszustands von Proteinen
PMOD-SoftwarePMOD-Technologien  Version 4.5 Verwendet für  Verarbeitung und Analyse von PET-Bilddaten
Vorgefärbter Molekulargewichtmarker des ProteinsThermo Fisher (Pierce)26619 (2&Times; 250µ L) Überwachung der Elektrophorese und Membranübertragung  
Proteaseinhibitor-CocktailBeyotimeP1046Breitbandhemmung der endogenen Proteaseaktivität
RIPA-LysepufferBeyotimeP0013CAufrechterhaltung der Proteinphosphorylierungsmodifikation
Abgeschottetes Milchpulver, das im Morris Water Maze-Gerät verwendet wirdYili6907992637815Mach Wasser undurchsichtig und verstecke Unterwasserplattformen
Das Morris-WasserlabyrinthsystemChengdu Taimeng Software Co., Ltd.WMT-100SWasserlabyrinth-Ausrüstung, die in China weit verbreitet ist

Referenzen

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