Untersuchung des Ovarialmikroumfelds: Methoden zur Isolierung, 2D-Kultur und organoiden Kultur somatischer Maus-Ovarialzellen

Zusammenfassung

Wir beschreiben Methoden zur Isolierung somatischer maus-ovarialer Zellen aus einem stroma-angereicherten Anteil des Eierstocks und zur Erzeugung maus-ovarialer somatischer Organoide mittels eines gerüstfreien Ansatzes.

Zusammenfassung

Der Eierstock besteht aus heterogenen Populationen somatischer Zellen sowohl im Follikel als auch im umliegenden Stroma, die entscheidend für die Unterstützung der Ovarialfunktion und die Bildung hochwertiger Gameten sind. Wir berichten über Methoden zur Isolierung somatischer Zellen aus Maus-Eierstöcken, darunter endotheliale, epitheliale, steroidogene, stromale und Immunzellen. Wenn diese primären ovarialen somatischen Zellen plattiert und in einem traditionellen 2D-Kultursystem kultiviert werden, gehen die zelluläre Heterogenität, Organisation sowie Zell-Zell- und Zellmatrix-Interaktionen, die typischerweise im Eierstock zu finden sind, verloren. So beschreiben wir auch, wie man somatische Organoide bei Maus-Ovarialen mit einem gerüstfreien Ansatz erzeugt. Diese Organoide organisieren sich selbst, erhalten vielfältige Zellpopulationen und produzieren extrazelluläre Matrix sowie sekretierte Faktoren, einschließlich Zytokine. Organoide können für Kokultur-Experimente verwendet werden und können mindestens 3 Wochen lang mit hoher Lebensfähigkeit in Kultur erhalten bleiben. Insgesamt ermöglichen diese Modelle die Untersuchung der Ovarialphysiologie und -pathologie aus somatischer Zellperspektive.

Einleitung

Obwohl die Eizelle oder weibliche Gamet für die Entstehung der nächsten Generation unerlässlich ist, spielen somatische Zellpopulationen im Eierstock eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung der Gameten, der Produktion von Steroidhormonen und der Ovarialhomöostase. Oocyten, umgeben von somatischen Granulosen und Theca-Zellen, bilden die funktionalen Einheiten des Eierstocks, die als Follikel bekannt sind. Granulosenzellen sind physisch durch transzonale Projektionen mit der Eizelle verbunden und bieten der Eierzelle Stoffwechsel- und Nährstoffunterstützung sowie regulieren den meiotischen Stillstand ^1,2. Darüber hinaus produzieren Granulosa- und Thecazellen als Reaktion auf Gonadotropine Steroidhormone, darunter Östrogen, Progesteron und Androgene, die über das Fortpflanzungssystem hinausgehen und das kardiovaskuläre, muskuloskelettale und Nervensystem beeinflussen und somit die allgemeine weibliche Gesundheit^{beeinträchtigen}. Ovariale Follikel entwickeln sich in einem heterogenen Ovarialstroma, das aus Gefäß-, Immunzellen, mehreren Populationen interstitieller Fibroblasten und mesenchymalen Zellen sowie einer hochgeordneten extrazellulären Matrix (ECM)⁴ besteht. Diese stromale Mikroumgebung liefert physikalische und chemische Hinweise, die das Wachstum der Follikel, den Eisprung und die Luteinisierung^beeinflussen.

Es existieren mehrere Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Gameten und Follikeln in vitro, und diese Methoden haben unser Verständnis von Oogenese und Follikogenese^{vorangebracht}. Das somatische Kompartiment des Eierstocks ist jedoch relativ wenig erforscht, teilweise aufgrund des Mangels robuster in-vitro-Modelle. Aktuelle Modelle des ovarialen somatischen Kompartments sind weitgehend auf einen einzelnen Zelltyp beschränkt, wie Fibroblasten, ovariale Oberflächenepithelzellen, Endothel-, Immun- oder Granulosenzellen 6,7,8,9,10,11. Die Kultur breit definierter primärer ovarialer somatischer Zellen in 2D bevorzugt im Laufe der Zeit Makrophagenpopulationen, was zu einem Verlust der zellulären Heterogenität¹² führt. Darüber hinaus berücksichtigt die traditionelle zweidimensionale (2D) Monoschichtkultur nicht die vielfältigen Wechselwirkungen zwischen Zelle und Zellmatrix, die im Eierstock vorhanden sind. Ovarialgewebe-Explants erhalten die zelluläre und strukturelle Komplexität des nativen Gewebes, variieren jedoch in ihrer Zusammensetzung je nachdem, wo sie im Eierstock stammen^13,14.

Organoide sind dreidimensionale (3D), mehrzellige, miniaturisierte Versionen von Organen oder Geweben, die sich in vivo organisieren und funktionieren^15,16. Organoide können aus Stammzellen oder primären Zellen, die aus normalem oder krankem Gewebe¹⁵ isoliert wurden, gebildet werden. Im Kontext des weiblichen Fortpflanzungssystems wurden Organoide erzeugt, um das Endometrium, den Eileiter, den Gebärmutterhals und die Plazenta¹⁷ zu modellieren. Bezüglich des Eierstocks waren organoide Modelle bis vor Kurzem jedoch auf einen einzelnen Zelltyp beschränkt, wie etwa ovariale Oberflächenepithel- oder Krebszellen, oder wurden aus induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt, um Follikelstrukturen statt dem Ovarialstroma^17,18 zu ähneln. Jüngste Studien haben Organoide mit heterogenen Populationen somatischer Zellen erzeugt und charakterisiert, die aus Maus-, Rhesumappe- und menschlichem Ovarialgewebe isoliert^wurden 19,20,21. Diese organoiden Modelle haben die Untersuchung zellulärer Mechanismen der Eierstockalterung sowie der Auswirkungen der Phthalatexposition auf die ECM-Zusammensetzung^ermöglicht.

Angesichts der entscheidenden Bedeutung somatischer Zellen sowohl im Follikel als auch im Stroma für die Ovarialfunktion beschreiben wir Methoden zur Isolierung somatischer Zellen aus einem stromaangereicherten Anteil der Maus-Eierstöcke und zur Kultivierung in vitro entweder mittels traditioneller Monoschichtkultur oder in einem organoiden Modell. Mit gerüstfreien Agarose-Mikroformen bilden ovariale somatische Zellen innerhalb von 1–3 Tagen Organoide. Organoide bewahren wichtige Ovarialzellpopulationen, darunter Fibroblasten, Makrophagen und steroidogene Zellen, und können bis zu 3 Wochen mit hoher Lebensfähigkeit kultiviert werden. Ovarialsomatische Organoide eignen sich förderlich für transkriptomische und histologische Untersuchungen, die Analyse konditionierter Medien, Kokultivierung mit anderen Zelltypen und Methoden zur Untersuchung von Verbindungen. Insgesamt sind diese Organoide ein robustes Modell für die in-vitro-Befragung und Modulation des somatischen Kompartiments der Eierstocke und können auf die Untersuchung der Eierstockentwicklung, des Alterns, der Physiologie und der Pathologie angewandt werden.

Protokoll

Die Verwendung von Tieren zur Entwicklung dieses Protokolls erfolgte gemäß dem Institutional Animal Care and Use Committee der Northwestern University und den National Institutes of Health Guidelines for Care and Use of Laboratory Animals (Northwestern University Animal Welfare Assurance Number: A3283-01; IACUC-Protokoll-ID: IS00013082_IM12). Herstellerinformationen und Katalognummern für alle Materialien, einschließlich Silikonabgüsse für Agarose-Mikroformen, Medien und Ergänzungsmittel, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Ein Überblick über die Protokollschritte ist in Abbildung 1 dargestellt. Alle Protokollschritte sollten mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden, in Übereinstimmung mit allen institutionellen Biosicherheits- und Umweltschutzvorschriften und, sofern nicht anders angegeben, in einem Biosicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt werden.

Abbildung 1: Schematisch der somatischen Zellisolation der Ovarial, der Erzeugung somatischer organoider Ovarialzellen und nachgelagerter Anwendungen. Die Eierstöcke der Maus werden isoliert und der Stromanteil angereichert. Die angereicherte stromale Fraktion wird enzymatisch und mechanisch verdaut. Unverdautes Gewebe wird abgeseift. Die Zellen werden pelletiert, gewaschen, gezählt und für die Kultur in 2D plattiert. Für die Organoid-Erzeugung werden nach einer über Nacht 2D-Kultur die Zellen mit Trypsin entnommen und anschließend pelletiert, gewaschen und gezählt. Die Zellen werden in Agarose-Mikroformen für die Organoidkultur ausgesaat. Organoide können für Histologie, RNA/Protein-Extraktion, Conditioned-Media-Analyse, Behandlungen und Medikamentenscreenings sowie für Kokultur verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

1. Herstellung von Medien für die somatische Isolierung und Kultur der ovarialen Zellen

HINWEIS: Die Verdauung von Ovarialgewebe sowie die anschließende Isolierung und Kultur primärer somatischer Zellen erfordern vier Arten von Medien: Dissektionsmedien (DM; verwendet in den Schritten 2.3–2.4 für die Dissektion und Punktion von Maus-Eierstöcken), enzymatische Medien (EM; verwendet in den Schritten 2.5–2.8 zur enzymatischen Verdauung stromareicher Maus-Eierstöcke), Abschreckmedien (QM; verwendet in Schritt 2.9 zur Verlangsamung der enzymatischen Verdauung), und Beschichtungsmedien (PM; verwendet in den Schritten 2.11–2.14 und Schritt 4.6 zum Waschen, Plattieren und 2D-Kultur primärer somatischer Ovarialzellen sowie zur Inaktivierung von Trypsin bei der Entnahme der Zellen aus der 2D-Kultur). Alle Medien sollten in einem sterilisierten biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II oder einer laminaren Flusshaube vorbereitet werden. Die unten aufgeführten Medienrezepte reichen für die Verarbeitung von Eierstöcken von 5–6 Mäusen aus, sollten aber bei Bedarf skaliert werden. Alle Medien können bis zu einer Woche im Voraus vorbereitet und bei 4 °C gelagert werden, aber die Enzyme für das EM müssen am Tag der Zellisolation frisch hinzugefügt werden.

1. Bereiten Sie DM (15 ml) mit 1 % fetalem Rinderserum (FBS) und 0,5 % Penicillin-Streptomycin (PS) im L-15-Medium von Leibovitz vor. Sterilisiere das Medium mit einem sterilen Filter.
   HINWEIS: DM wird für den Austausch der Umgebungsluft gepuffert und während der Mikrodissektion des Eierstocks aus dem umliegenden Gewebe sowie zur Anreicherung des Stromanteils verwendet.
2. Bereiten Sie EM (10 mL) mit 1 % FBS und 0,5 % PS in αMM vor. Fügen Sie 82 enzymatische Einheiten/mL Kollagenase IV und 0,2 mg/mL DNase I hinzu (≥400 enzymatische Aktivitätseinheiten/mg). Lösen Sie die Enzyme durch Invertieren auf und sterilisieren Sie das Medium anschließend mit einem sterilen Filter.
   HINWEIS: Enzymatische Medien sind mit Natriumbicarbonat für den Luftaustausch bei 5 %_CO2 gepuffert und werden für die enzymatische Verdauung von Ovarialgewebestücken verwendet.
3. Bereite QM (20 mL) mit 10 % FBS und 0,5 % PS in αMEM-Medium vor. Sterilisiere das Medium mit einem sterilen Filter.
   HINWEIS: QM wird mit Natriumbicarbonat für den Luftaustausch mit 5 %_CO2 gepuffert und zur Abschreckung der enzymatischen Verdauung genutzt.
4. Bereiten Sie PM (30 mL) vor, das 10 % FBS und 1 % PS in RPMI 1640 enthält (mit 25 mM HEPES und 2 mM L-Glutamin). Sterilisiere das Medium mit einem sterilen Filter.
   HINWEIS: PM ist mit Natriumbicarbonat für den Luftaustausch mit 5 %_CO2 gepuffert und wird zur Beschichtung primärer ovarialer somatischer Zellen sowie zur Kultur in 2D verwendet.

2. Verdauung des Eierstockgewebes und Isolierung primärer somatischer Zellen

HINWEIS: Maus-Eierstöcke werden sowohl enzymatisch als auch mechanisch isoliert und verdaut, um primäre somatische Zellen zu isolieren. Eierstöcke von 5–6 Mäusen können zusammen in derselben Schale verarbeitet werden. Die folgenden Schritte sollten mit der aseptischen Technik durchgeführt werden, vorzugsweise mit einem Sektionsmikroskop in einer laminaren Flusshaube.

1. Geben Sie 10 ml EM, 20 ml QM und 20 ml PM in separate 100-mm-Petrischalen. Die Schalen in einem Gewebekultur-Inkubator (befeuchtete Umgebung, 37 °C mit 5 % CO2_{) für} mindestens 1 Stunde vor der Anwendung ausgleichen.
2. Erwärmen Sie Dampf in einem Wasserbad (37 °C) vor der Benutzung.
3. Sezieren Sie die Maus-Eierstöcke in eine 35 mm große Petrischale mit 3 ml DM. Trennen Sie die Eierstöcke vom angesetzten Fettgewebe, Eileiter und Ovarialbursa mit einer fein spitzen Pinzette und/oder Mikroscheren (Abbildung 2Ai,ii). Verwenden Sie bei Bedarf ein Seziermikroskop für die Mikrodissektion.
4. Übertragen Sie die dissektionierten Eierstöcke auf ein 45-mm-Uhrglas mit 2–3 ml DM. Unter einem Seziermikroskop verankert und punktiert man alle Bereiche der Eierstöcke mit 28-G-Insulinnadeln mit der nichtdominanten bzw. dominanten Hand für etwa 10 Minuten. Rotieren Sie häufig das Eierstockgewebe, um sicherzustellen, dass alle Bereiche gestört sind.
   HINWEIS: Das Punktieren der Eierstöcke bereichert die stromale Fraktion, indem präantrale Follikel sowie Kumulus-Oocytenkomplexe und Granulosazellen aus antralen Follikeln freigesetzt werden (Abbildung 2Aiii–iv).
5. Verwenden Sie eine fein gespitzte Pinzette, um stromaangereicherte Mauseierstöcke mit ausgeglichenem EM zur Petrischale zu bewegen (Abbildung 2Bi).
6. Um Temperatur- und pH-Veränderungen des Mediums zu minimieren, reißt man die stromaangereicherten Eierstöcke mit feiner Zange in etwa 2–3 mm Stücke (Abbildung 2Bii).
7. Halten Sie die Petrischale schräg und pipetieren Sie wiederholt EM mit Eierstockgewebestücken mit einer p1000-Pipette, eingestellt auf 1 mL, 100× oder für 3 Minuten, je nachdem, was zuerst eintritt (Abbildung 2Biii). Wirbeln Sie die Petrischale nach Bedarf, um sicherzustellen, dass alle Gewebestücke pipettiert sind.
   HINWEIS: Wenn das Gewebe zu groß ist, um mit einer P1000-Spitze pipettiert zu werden, kann die Spitze mit einem sterilen Skalpell geschnitten werden, um die Öffnung zu verbreitern. Die Bohrung sollte breit genug sein, damit die meisten (>50 %), aber nicht alle Gewebestücke eindringen können, was einen Schereffekt erzeugt.
8. Die Petrischüssel mit EM und Ovarialgewebestücken werden in einen Gewebekulturinkubator (befeuchtete Umgebung, 37 °C mit 5 %_CO2) übertragen und insgesamt 30 Minuten inkubiert, wobei die Schale entnommen und nach 15 Minuten wiederholt (100× oder 3 Minuten) gepipettert wird, und dann erneut am Ende der 30-minütigen Inkubation (Abbildung 2Biii).
   HINWEIS: Nach der ersten 15-minütigen Inkubation sollten die Gewebestücke so gut verdaut sein, dass >80 % durch eine P1000-Pipettenspitze passen, ohne dass die Spitze geschnitten werden muss, um die Öffnung zu verbreitern. Die gesamte Dauer der Verdauung und der erforderliche Pipettenbedarf hängen von der Anfangsgröße der zerrissenen Gewebestücke ab. Darüber hinaus können Alter und Belastung der Maus, die Aktivität der Enzyme von Partie zu Partie sowie die Rohrgröße der Pipette die Geschwindigkeit des Gewebeabbaus beeinflussen. Die Verdauung sollte abgeschreckt werden, wenn die Ovarialgewebestücke in etwa 1 mm große Fragmente zerlegt sind, die noch mit dem Auge sichtbar sind (Abbildung 2Biv). Überverdauung kann zu Zellverlust und verminderter Zelllebensfähigkeit führen.
9. Verdünnen Sie die Enzyme, um die Gewebeverdauung zu verlangsamen, indem Sie 20 ml präequilibrierte QM hinzufügen (Abbildung 2Ci).
10. Führen Sie die Zellsuspension durch ein 40 μm Zellsieb, das über ein 50 mL konisches Rohr gelegt wird, um unverdaute Gewebestücke zu entfernen (Abbildung 2Cii). Zentrifugiere das Filtrat bei 300 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren (Abbildung 2Ciii).
11. Waschen Sie die Zellen, indem Sie das Übersetzungsmittel durch Aspiration entfernen, das Zellpellet in 1 mL vorausgegleichtes PM wieder suspendieren, die Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen und bei Raumtemperatur bei 300 × g für 5 Minuten zentrifugieren, um die Zellen erneut zu pelletieren (Abbildung 2Civ).
12. Entfernen Sie das Supernatant, suspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml PM, färben Sie ein 10 μL Aliquot von Zellen mit Trypanblau, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten, und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozyometer.
    HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die erwartete Anzahl primärer ovarialer somatischer Zellen, abhängig von Mausstamm und Alter, in diesem Stadium des Isolationsprotokolls. Die Zelllebensfähigkeit sollte in diesem Stadium bei >80 % liegen.
13. Platten werden die Zellen auf einem mit Gewebekulturen behandelten Gefäß mit einer Dichte von etwa 1,25 × 10⁵–1,5 × 10⁵/cm^² (z. B. bei Zellzählungen von etwa 3 × 10⁶ Plattenzellen auf eine kulturbehandelte 60-mm-Schale und bei Zellzählungen von etwa 1 × 10⁶ Plattenzellen auf einen Brunnen einer kulturbehandelten 6-Well-Platte).
    1. Fügen Sie je nach Gesamtvolumen des Tellers oder der Schüssel zusätzliches PM hinzu (z. B. zusätzlich 4 ml PM, wenn Sie eine 60-mm-Schüssel verwenden, oder zusätzlich 2 mL PM, wenn Sie einen Brunnen einer 6-Wellen-Platte verwenden).
       HINWEIS: Die oben aufgeführte Beschichtungsdichte wird empfohlen, wenn die Zellen über Nacht für die Organoid-Erzeugung nach einer 2D-Kultur genutzt werden. Für eine längere 2D-Kultur können Zellen mit geringerer Dichte plattiert werden. Zusätzliches Beschichtungsmedium, das nicht ausgeglichen wurde, kann bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden. PM ist sowohl für die Bildung von Organoiden als auch zur Erhaltung somatischer Ovarialzellen in 2D-Kultur erforderlich. An diesem Punkt des Protokolls können die ovarialen somatischen Zellen in einer 2D-Monoschichtkultur erhalten werden (Schritt 2.14) oder zur Erzeugung von Organoiden verwendet werden (siehe Abschnitt 3). Eine 2D-Kultur über Nacht vor der Organoidentstehung ist notwendig, um Eizellen aus frühen Follikeln zu entfernen, die möglicherweise durch das 40-μm-Zellsieb gegangen sind.
14. Nach der nächtlichen Plattierung (mindestens 16 Stunden) wird die Zellen mit phosphatgepuffertem Kochsalzlösungsmittel (PBS; Mg/Ca-frei, pH 7,0–7,3) zur Entfernung von toten Zellen und Ablagerungen (Abbildung 3A). Nach dem Waschen fügen Sie frisches PM hinzu und ersetzen Sie das Medium alle zwei Tage während der Kultur durch frisches PM (Abbildung 3B).
    HINWEIS: Trotz hoher Zelllebensfähigkeit nach der Isolierung wird typischerweise ein großer Verfall der Gesamtzellzahl nach der Plattierung über Nacht beobachtet, entweder aufgrund von Zelltod oder der Unfähigkeit, sich am Gewebekulturgefäß anzuheften (Abbildung 3A).

Abbildung 2: Schematische Schaltung der somatischen Zellisolation der Maus-Eierstockzellen. (A) Repräsentative Bilder der (i,ii) Maus-Ovarium-Dissektion und (iii,iv) der Stroma-Anreicherung. Der Eierstock der Maus ist mit einer gestrichelten Linie in A i. umrandet. (B) Repräsentative Bilder von Ovarialgewebestücken während der mechanischen und enzymatischen Verdauung. Stroma-angereicherte Eierstöcke (i) vor und (ii) nach dem Reißen, (iii) Eierstockgewebestücke während der Pipettierung und (iv) Eierstockgewebestücke nach der Verdauung. (C) Repräsentative Bilder von (i) der Löschung der Verdauung, (ii) der Filterung der Zellsuspension und (iii,iv) der Pelletierung der primären somatischen Maus-Ovarialzellen. Einsätze in Cii und Ciii zeigen unverdaute Gewebestücke, die nach der Zentrifugation vom Zellsieb bzw. Zellpellet gefangen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Primäre ovariale somatische Zellen können in 2D kultiviert werden. (A) Repräsentative Lichtaufnahmen von primären ovarialen somatischen Zellen, die 16 Stunden nach der Anplattierung, vor und nach dem Waschen mit PBS, in einer 60-mm-Schale verplattet wurden. (B) Repräsentative, übertragene Lichtbilder primärer ovarialer somatischer Zellen, die in einer 24-Well-Platte über 3 Tage in Kultur verplatten wurden. Maßstabsbalken = 400 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Herstellung von Agarose-Mikroformen und Medien zur Erzeugung und Kultivierung von Organoiden

HINWEIS: Ovariale somatische Organoide werden in gerüstfreien Agarose-Mikroformen mit ovarialen organoiden Medien erzeugt und kultiviert. Agarose-Mikroformen und ovariale organoide Medien sollten mit aseptischer Technik in einem sterilisierten biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II oder in einer laminaren Flusshaube vorbereitet werden.

1. Herstellung von Agarose-Mikroformen
   1. Silikonabgüsse für Mikroformen und Graefe-Pinzetten werden in einen Sterilisationsbeutel und ein Autoklav mit einem Trockenzyklus zur Sterilisation gegeben (Manteldruck: 20 psi, Kammertemperatur: 121,11 °C (250 °F), Sterilisationszeit: 15 min).
      HINWEIS: Mehrere Silikongussformen können autoklaviert und gleichzeitig zur schnelleren Erzeugung von Agarose-Mikroformen verwendet werden.
   2. Gib 1 ml PBS mit 1 % PS in jede Bohrung einer 24-Wellen-Gewebekulturplatte zur Lagerung der Agarose-Mikroformen hinzu.
   3. Lösen Sie 1,5 % (w/v) sterile Agarose in PBS auf, indem Sie sie in der Mikrowelle, in einem Warmwasserbad oder auf einer Heizplatte erhitzen.
      HINWEIS: Das Auflösen der Agarose durch Mikrowellen in einem 50-mL-konischen Rohr, das in einem 100-ml-Becher mit Wasser gefüllt ist, funktioniert gut (Abbildung 4Ai). Neben dem kontrollierten Kochen verlangsamt das im Becher erzeugte heiße Wasserbad auch die Erhärtung der Agarose.
   4. Lassen Sie die flüssige Agarose auf etwa 50 °C abkühlen, bis das Rohr bequem bedient werden kann.
   5. Pipettiere langsam 300–350 μL 1,5 % Agarose in den Silikonguss, wobei du darauf achtest, den Guss nicht zu über- oder unterzufüllen und Blasen zu vermeiden (Abbildung 4Aii). Achte darauf, dass die Agarose eine flache Schicht am oberen Rand des Gusses bildet, statt einer konkaven oder konvexen Kante (Abbildung 4Aiii,iv). Blasen platzen mit einer sterilen P10-Pipettenspitze, bevor die Agarose zu erstarren beginnt (Abbildung 4Bi–iii).
   6. Lassen Sie die Agarose im Silikonguss 2–3 Minuten bei Zimmertemperatur festigen (Abbildung 4Biv).
   7. Sobald das Silikon fest ist, wenden Sie das Silikon über einem Brunnen der 24-Wellen-Gewebekulturplatte mit PBS + 1 % PS um. Biegen Sie das Silikon vorsichtig um, um die Agarose-Mikroform in die Platte freizugeben (Abbildung 4Ci).
      HINWEIS: Agarose-Mikroformen, die in PBS +1 % PS in einer 24-Wellen-Gewebekulturplatte, die mit Parafilm umwickelt sind, eingetaucht sind, können bis zu einem Monat vor der Anwendung bei 4 °C gelagert werden (Abbildung 4Cii). Agarose-Mikroformen sollten mindestens 16 Stunden vor der Verwendung vorbereitet werden, da Mikrobohrungen oft Luftblasen unmittelbar nach dem Gießen und dem Eintauchen in PBS + 1 % PS enthalten (Abbildung 4Ciii). Diese Luftblasen lösen sich jedoch während der Speicherung auf (Abbildung 4Civ). Vor der Verwendung für die Organoidkultur sollten Agarose-Mikrowell-Einsätze sorgfältig unter dem Mikroskop untersucht werden, um sicherzustellen, dass Mikrowells während des Gusses nicht verschmolzen oder gestört wurden (Abbildung 4Di–iv). Defekte Mikroformen werden für die Erzeugung und Kultur von Organoiden nicht empfohlen. Es wird empfohlen, einen Überschuss an Agarose-Mikroformen vorzubereiten, um ~25 % mit Defekten auszugleichen
2. Herstellung von ovarialen organoiden Medien
   1. In einem Biosicherheitsschrank fügen Sie Organoid-Wachstumsmedium (Maus) Ergänzungen 1 und 2 sowie 1 % PS gemäß den Anweisungen des Herstellers zum Basalmedium hinzu. Lagern Sie das vorbereitete organoide Ovarialmedium bis zu 2 Wochen vor der Anwendung bei 4 °C.
      HINWEIS: Die Ergänzungen 1 und 2 können aliquotiert und bei -20 °C gelagert werden.

Abbildung 4: Schaltplan zur Darstellung der Herstellung von Agarose-Mikroformen. (A) Repräsentative Bilder von (i) 1,5 % Agarose-Präparation, (ii) Pipetieren in Silikongusse, (iii) richtig gefüllte und (iv) überfüllte Silikonabgüsse. Gestrichelte Linien in Aiii und Aiv zeigen flache bzw. konvexe Unterseiten von Agarose-Mikroformen. (B) Repräsentative Bilder von (i,ii) gefüllten Silikonabgüssen mit Blasen in der Agarose, (iii) dem Platzen von Blasen mit einer Pipettenspitze vor der Agarose-Erstarrung und (iv) einer verfestigten Agarose-Mikroform im Silikonguss. (C) Repräsentative Bilder von (i) der Entfernung verfestigter Agarose-Mikroformen aus Silikonabgüssen, (ii) der Lagerung von Agarose-Mikroformen in 24-Wellen-Platten mit PBS + 1 % PS, (iii) Blasen in Mikrobrunnen unmittelbar nach dem Gießen und (iv) blasenfreier, richtig gegossener Agarose-Mikroform nach 16 Stunden Lagerung. (D) Repräsentative Bilder von Mikroformen mit (i,ii) kombinierten Bohrungen, (iii) gestörten Bohrlöchern oder (iv) Schäden. Abkürzungen: PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PS = Penicillin-Streptomycin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Entstehung und Kultur von Organoiden

HINWEIS: Nach einer über Nacht 2D-Kultur werden primäre ovariale somatische Zellen aus der 2D-Kultur entnommen und in Agarose-Mikroformen eingesät, um Organoide zu erzeugen. Die folgenden Schritte sollten mit aseptischer Technik in einem sterilisierten biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt werden.

1. Erhitze PM und Organoid-Medien auf 37 °C in einem Wasserbad und erwärme 0,05 % Trypsin auf Zimmertemperatur.
2. Mit einer Graefe-Pinzette werden die Mikroformen vorsichtig in die Mulden einer neuen 24-Well-Platte übertragen (Abbildung 5Ai).
3. Fügen Sie 500 μL Ovarial-Organoidmedium zu jedem Bohrloch der 24-Well-Platte hinzu, die eine Agarose-Mikroform enthält (Abbildung 5Aii). Achten Sie darauf, dass Mikroformen vollständig in ein Medium eingetaucht sind, und bringen Sie die Mikroformen und Medien mindestens 30 Minuten in einem Inkubator (befeuchtete Umgebung, 37 °C mit 5 %_CO2) in Gleichgewicht.
4. Entfernen Sie PM aus den adhärenten ovarialen somatischen Zellen durch Aspiration und Waschen Sie die Zellen mit Mg/Ca-freiem PBS.
5. Fügen Sie 0,05 % Trypsin hinzu (1–2 ml Trypsin für eine 6-Well-Platte oder 60-mm-Schelle), um die Zellen aus der 2D-Kultur zu entnehmen. Inkubieren Sie die Zellen mit Trypsin für 2–3 Minuten bei 37 °C in einem Inkubator.
6. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, dass sich die Zellen gelöst haben, und deaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie für jedes verwendete Volumen Trypsin zwei Bände erwärmtes PM hinzufügen.
7. Die Zellsuspension wird in ein 15-ml-konisches Rohr übertragen und die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur gepelletiert.
8. Die Zellen in 1 ml erwärmtem PM wieder suspendieren, einen Aliquot von Zellen mit Trypanblau färben, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen, und die Zellen mit einem Hämozytometer zählen.
   HINWEIS: Siehe Tabelle 1 für die erwartete Anzahl primärer ovarialer somatischer Zellen, abhängig von Mausstamm und Alter, nach 2D-Kultur über Nacht und anschließender Trypsinisierung. Die Lebensfähigkeit trypsinisierter Zellen liegt typischerweise bei über 90%.
9. Die Zellen werden durch Zentrifugation (300 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur) gepelletiert und das Zellpellet in ovarialen organoiden Medien auf eine Dichte von 3,33 × 10^{6 lebenden} Zellen pro 1 ml Medien, also 2,5 × 10⁵ lebende Zellen pro 75 μL Medien, resuspendiert.
   HINWEIS: Hier werden 2,5 × 105^{Zellen pro} Agarose-Mikroschimmel ausgesaat. Daher hängt die Gesamtzahl der erzeugten Mikroformen von der Gesamtzellanzahl ab. Organoide können mit weniger als 2,5 × 10⁵ Zellen pro Agarose-Mikroschimmel erzeugt werden, aber Organoidgröße, Aggregationskinetik, relative zelluläre Zusammensetzung und Funktionen, einschließlich Hormonproduktion, können beeinflusst sein.
10. Entfernen Sie die ausgeglichenen Agarose-Mikroformen aus dem Inkubator, stellen Sie sicher, dass die Mikroformen so ausgerichtet sind, dass die Zell-Saatkammer nach oben zeigt, und entfernen Sie das organoide Ovarialmedium aus den Zell-Saatkammern (Abbildung 5Aiii).
    1. Entfernen Sie das Medium aus den Zellsäkammern der Mikroformen durch Graefe-Pinzette, um die Mikroformen anzuheben und zu kippen, oder durch Pipettern. Um Medien durch Pipettieren aus den Zellsäkammern zu entfernen, halten Sie die Pipettenspitze vorsichtig über die Ecke der Zellsäkammer, während Sie das Material aufziehen. Nehmen Sie keinen direkten Kontakt mit dem Agarose-Mikroschimmel auf, um die Mikrowellen nicht zu stören.
       HINWEIS: Zell-Saatkammern sollten so trocken wie möglich sein, sodass Mikrobrunnen mit dem Auge sichtbar sind, aber die Außenseite der Mikroformen weiterhin von ovarialen organoiden Medien umgeben sein sollte (Abbildung 5Aiii).
11. Geben Sie 75 μL der Zellsuspension (d. h. 2,5 × 10⁵ Zellen) direkt in die Zellsäkammer jeder Agarose-Mikroform ab und vermeiden Sie die Bildung von Blasen (Abbildung 5Bi). Bringen Sie die 24-Brunnen-Platte zurück in den Inkubator.
12. Ein bis zwei Stunden nach der Zellaussaatung fügen Sie zusätzlich 250 μL erwärmtes organoides Ovarialmedium um die Außenseite der Agarose-Mikroschimmel hinzu, wobei Sie darauf achten, die Zellsäkammern nicht zu stören (Abbildung 5Bii).
    HINWEIS: Primäre ovariale somatische Zellen sollten innerhalb von 1–24 Stunden nach der Aussaat in Agarose-Mikroschimmeln beginnen zu aggregieren (Abbildung 5Biii).
13. Ersetzen Sie das Medium um die Agarose-Mikroformen am Tag nach der Zellzusammensetzung durch 750 μL frisches ovariales organoides Material und anschließend alle zwei Tage während der gesamten Kultur.
    1. Um das Medium zu wechseln, halten Sie die Platte leicht schräg, um das verbrauchte Medium um die Agarose-Mikroformen herum zu entfernen. Entfernen Sie kein Medium aus den Zellsäkammern. Frisches Medium vorsichtig in Richtung Wand des Brunnens pipetten, um die Zellsäkammern nicht zu stören.
       HINWEIS: Konditionierte Medien aus Medienwechseln können gespeichert und bei -80 °C für die Analyse organoid-sekretierter Faktoren gespeichert werden. Sobald Organoide gebildet sind (1–3 Tage nach der Zellaussaatung), können Medien durch Medien ersetzt werden, die rekombinante Proteine, Inhibitoren usw. enthalten, um die Auswirkungen verschiedener Behandlungen auf die Funktion der Organoiden zu untersuchen oder für das Wirkstoffscreening.

Abbildung 5: Schaltplan der ovarialen somatischen Organoidbildung. (A) Repräsentative Bilder von (i) dem Transfer von Agarose-Mikroformen auf die Kulturplatte mit der Graefe-Pinzette, (ii) der Gleichgewicht der Agarose-Mikroformen in ovarialen organoiden Medien und (iii) der Entfernung von Medien aus den Zellsäkammern. Pfeil in Aiii zeigt eine leere Zell-Säkammer an. (B) Repräsentative Bilder von (i,ii) der Aussäung von Zellen in Agarose-Mikroformen und (iii) einem durchgelassenen Lichtscan eines Agarose-Mikroschimmels mit aggregierenden ovarialen somatischen Zellen. Maßstabsleiste (Biii): 2500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

5. Nutzung von Organoiden für nachgelagerte Anwendungen

HINWEIS: Organoide können für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen eingesetzt werden, darunter Histologie, molekularbiologische Anwendungen (z. B. RNA/Protein-Analysen), Konditionierungsmedienanalyse und Kokultur.

1. Histologie
   HINWEIS: Organoide können für histologische Endpunkte verarbeitet werden, ohne aus den Agarose-Mikroformen entfernt zu werden. Tatsächlich verhalten sich Organoide in Agarose-Mikroformen ähnlich wie Gewebe-Mikroarrays, was eine hochdurchlaufende histologische Bewertung mehrerer gleichzeitig verteilter Organoide ermöglicht.
   1. 1,5 % (w/v) sterile Agarose in PBS durch Kochen auflösen.
   2. Nach der Kultur der ovarialen somatischen Organoide halten Sie die Platte schräg und entfernen Sie das Medien, das die Agarose-Mikroformen umgibt.
   3. Unter einem Seziermikroskop wird das Medium aus den Zellsäkammern entnommen, indem man vorsichtig eine Pipettenspitze über die Ecke jeder Zellkammer schweben lässt und das Medium vorsichtig aufzieht, ohne die Organoide zu stören oder den Mikroschimmel selbst zu stören.
   4. Sorgfältig pipettieren Sie 100–125 μL flüssige 1,5%ige Agarose, die auf etwa 50 °C abgekühlt wird, in die Ecke jeder Zell-Saatkammer, um die Zellsäkammern zu füllen und zu versiegeln, wobei darauf geachtet wird, die Organoide nicht zu stören (Abbildung 6Ai).
   5. Lassen Sie die Agarose bei Raumtemperatur 2–3 Minuten fest werden.
   6. Fügen Sie jedem Bohrloch 750 μL modifiziertes Davidson's oder 4%-Paraformaldehyd hinzu und fixieren Sie die Organoide über Nacht in den versiegelten Agarose-Mikroformen bei 4 °C.
   7. Nach der Fixierung entfern Sie das Fixierungsmittel und waschen Sie die Agarose-Mikroformen mit 70 % Ethanol.
      HINWEIS: Mikroformen können in 70 % Ethanol bei 4 °C gelagert werden, bis zur Gewebeverarbeitung (Trocknung, Klärung und Wachsinfiltration). Während der Gewebeverarbeitung sollten Sie die Orientierung der Agarose-Mikroformen im Blick behalten.
   8. Nach der Gewebeverarbeitung werden die Agarose-Mikroformen in Paraffin eingebettet, sodass die Mikroformen flach innerhalb der Paraffinblöcke sind und die Unterseiten der Mikroformen als erste durchgeschnitten werden (Abbildung 6Aii).
   9. Paraffinblocks bei 5 μm und platzieren die Gewebeschnitte auf geladene Objektträger.
      HINWEIS: Das Vorhandensein von Mikrobohrlöchern kann sowohl bei Gewebeschnitten als auch in Paraffinblöcken mit dem Auge sichtbar werden (Abbildung 6Aiii,iv). Das Vorhandensein von Organoiden in Mikroformschnitten kann durch die Untersuchung von Schnittobjektträgern unter einem Mikroskop bestätigt werden (Abbildung 6Av). Anstatt 2–3 aufeinanderfolgende Schnitte auf derselben Folie zu platzieren, erhöht das Platzieren von 2–3 Sektionen, die jeweils 50 μm auseinander liegen (d. h. alle 10^{. Sektion),} auf einer einzelnen Folie die Wahrscheinlichkeit, dass die meisten Organoide in mindestens einem Abschnitt auf jeder Folie dargestellt werden. Organoide sind konsequent innerhalb von Gewebeschnitten verteilt, was die Bildgebung nach der histologischen Färbung erleichtert (Abbildung 6Avi).
   10. Lassen Sie die Folien über Nacht im Ofen bei 37 °C trocknen.
   11. Führen Sie eine histologische oder immunhistochemische Färbung durch oder bewahren Sie Objektträger bei^{Raumtemperatur 19} auf.
2. Organoide für molekulare Anwendungen entnehmen
   HINWEIS: Nach der Kultur können Organoide aus den Agarose-Mikroformen entfernt und für verschiedene nachgelagerte molekularbiologische Anwendungen verarbeitet werden, einschließlich RNA- oder Proteinextraktion zur Bewertung der Gen- oder Proteinexpression.
   1. Halten Sie die Platte mit den Agarose-Mikroformen leicht schräg und entfernen Sie das Medium um die Agarose-Mikroformen durch Pipetteren.
   2. Fügen Sie 750 μL PBS bei Raumtemperatur zu den Brunnen mit den Agarose-Mikroformen hinzu.
   3. Verwenden Sie Graefe-Pinzette, um die Agarose-Mikroformen umzukehren und zu bewegen, um die Organoide in das umgebende PBS freizusetzen. Bestätigen Sie die Freisetzung der Organoide aus den Agarose-Mikroformen unter dem Mikroskop.
   4. Entfernen Sie die leeren Agarose-Mikroformen mit einer Graefe-Pinzette und übertragen Sie das PBS mit den Organoiden durch Pipette in Mikrozentrifugenröhren.
   5. Pelletiere die Organoide durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
   6. Entfernen Sie den Supernatant durch Aspiration und gehen Sie mit der RNA- oder Proteinextraktion über. Alternativ können Sie das Zellpellet kurz einfrieren und bei -80 °C¹⁹ lagern.
3. Speichern organoid-konditionierter Medien für die Analyse
   HINWEIS: Konditionierte Medien von Organoiden können während der gesamten Kultur für die Analyse von organoid ausgeschiedenen Faktoren wie Hormonen, Zytokinen und Wachstumsfaktoren aufbewahrt werden. Repräsentative Ergebnisse aus der Analyse von Zytokinen in organoid konditionierten Medien sind in Abbildung 7A dargestellt.
   1. Halte die Platte mit den Agarose-Mikroformen leicht schräg und entferne das konditionierte Medium, das die Mikroformen umgibt, durch Pipetten. Entfernen Sie kein Medium aus den Zellsäkammern, um Organoide nicht zu stören.
   2. Übertragen Sie das konditionierte Medium in Mikrozentrifugenröhren und gehen Sie zur Medienanalyse oder zum Schnelleinfrieren und Lagerung bei -80 °C^19,22.
      HINWEIS: Optional zentrifugieren Sie das konditionierte Medium bei 10.000 g × g für 5 Minuten, um tote Zellen oder Ablagerungen zu pelletieren. Übertragen Sie das Supernatant vor der Medienanalyse oder -lagerung in neue Mikrozentrifugenröhren.
4. Organoid-Kokultur
   HINWEIS: Ovarialsomatische Organoide können mit anderen Zellen und Geweben auf verschiedene Weise kokultiviert werden. Repräsentative Ergebnisse aus der organoiden Kokultur mit Eierstockkrebszellen und -follikeln mit den in den Schritten 5.4.1 bzw. 5.4.3 beschriebenen Methoden sind in Abbildung 7B,C.
   1. Um Organoide mithilfe einer Kombination primärer maus-ovarialer somatischer Zellen und anderer Zelltypen zu erzeugen, um die Auswirkungen direkter Zell-Cell-Interaktionen zu untersuchen, folgen Sie den Schritten 5.4.1.1–5.4.1.4.
      1. Folgen Sie den Schritten 4.1–4.9, um die primären somatischen Ovarialzellen nach einer 2D-Kultur über Nacht zu reinigen, die Zellen aus der 2D-Kultur mit 0,05 % Trypsin zu entnehmen, zu pelletieren, zu zählen und die Zellen in ovarialen organoiden Medien mit einer Dichte von 2,5 × 10^{5 lebenden} Zellen pro 75 μL Medium wieder aufzuhängen.
      2. Wenn der andere Zelltyp von Interesse haftend ist, entnehmen Sie die Zellen aus einer 2D-Kultur. Zähle die Zellen, pelletiere sie durch Zentrifugation und suspendiere sie in ovarialen organoiden Medien mit einer Dichte von 2,5 × 105^lebenden Zellen pro 75 μL Medien.
      3. Kombinieren Sie die Suspension primärer ovarialer somatischer Zellen mit der Suspension des anderen Zelltyps von Interesse in einem bekannten Verhältnis.
      4. Folgen Sie den Schritten 4.10–4.13, um die resultierende Zellsuspension in Agarose-Mikroschimmel einzusetzen und Organoide zu kultivieren.
   2. Um Agarose-Mikroformen mit gebildeten Organoiden auf 24-Well-Platten mit anderen Zellen oder Organoiden zu übertragen, folgen die Schritte 5.4.2.1–5.4.2.4.
      HINWEIS: Um die Auswirkungen organoid-abgeleiteter sekretierter Faktoren auf andere Zelltypen und umgekehrt zu bewerten, können gebildete Organoide in den Agarose-Mikroformen verbleiben, und ganze Agarose-Mikroformen können auf eine 24-Well-Platte mit anderen Zellen oder Organoiden übertragen werden. Diese Kokulturmethoden können genutzt werden, wenn ovariale organoide Medien zur Kultivierung beider Zell- und Gewebetypen verwendet werden können.
      1. Erwärmen Sie organoide Medien des Eierstocks auf 37 °C in einem Wasserbad.
      2. Halten Sie die Platte mit den Agarose-Mikroformen schräg und entfernen Sie das Material um die Agarose-Mikroformen durch Pipettern.
      3. Mit einer Graefe-Zange werden die Mikroformen vorsichtig in 24-Well-Platten mit anderen Zellen oder Organoiden übertragen.
      4. Fügen Sie 750 μL frisches organoides Ovarialmedium hinzu, um die Agarose-Mikroformen zu umgeben.
   3. Um gebildete Organoide aus den Agarose-Mikroformen zu entfernen und in neue Agarose-Mikroformen zu übertragen, folgen Sie den Schritten 5.4.3.1–5.4.3.13.
      HINWEIS: Wenn ovariale organoide Medien nicht das gewünschte Medium für Kokultur-Experimente sind, stellt das in Schritt 5.4.2 beschriebene Paradigma die Herausforderung einer signifikanten Medienübertragung dar, da Agarose-Mikroformen mit ovarialen organoiden Medien gesättigt sind. Geformte Organoide (1–3 Tage nach der ersten Zellsäung) können aus ihren Agarose-Mikroformen in neue Agarose-Mikroformen für zusätzliche Kultur oder Kokultur übertragen werden, um das Übertragen des Mediums zu verhindern.
      1. Erwärmen Sie das gewünschte Medium für die Kokultur auf 37 °C in einem Wasserbad.
         HINWEIS: DMEM-, αMEM- und F12-basierte Medien wurden erfolgreich für Kokultur-Experimente mit ovarialen somatischen Organoiden eingesetzt.
      2. Mit einer Graefe-Zange werden die neuen Agarose-Mikroformen aus PBS +1 % PS vorsichtig in Brunnen einer 24-Well-Platte mit anderen Zellen oder Organoiden für Kokulturen übertragen.
      3. Stellen Sie sicher, dass Mikroformen vollständig in ein Medium eingetaucht sind, fügen Sie bei Bedarf zusätzliche gewünschte Medien für die Kokultur hinzu und bringen Sie die Mikroformen und Medien mindestens 30 Minuten lang in einem Inkubator (befeuchtete Umgebung, 37 °C mit 5 %_CO2) in Gleichgewicht.
      4. Halten Sie die Platte mit den Agarose-Mikroformen mit gebildeten Organoiden in einem leichten Winkel und entfernen Sie das Material um die Agarose-Mikroformen durch Pipetten.
      5. Fügen Sie das gewünschte Medienmaterial für die Kokultur um die Agarose-Mikroformen mit den gebildeten Organoiden hinzu.
      6. Verwenden Sie Graefe-Pinzetten, um die Agarose-Mikroformen umzukehren und zu bewegen, um die Organoide in das umgebende Medium freizusetzen. Bestätigen Sie die Freisetzung der Organoide aus den Agarose-Mikroformen unter dem Mikroskop.
         HINWEIS: Wenn primäre ovariale somatische Zellen nicht ausreichend aggregiert haben, bleiben Organoide möglicherweise nicht intakt, wenn sie aus Agarose-Mikroformen entfernt werden. Die Organoid-Assemblierung kann je nach Stamm und Alter der Mäuse, aus denen die ovarialen somatischen Zellen isoliert wurden, 1–3 Tage dauern.
      7. Entfernen Sie die leeren Agarose-Mikroformen mit einer Graefe-Pinzette und übertragen Sie das Material mit den Organoiden durch Pipette in Mikrozentrifugenröhren.
      8. Zentrifugiere die Organoide bei 300 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
      9. Unter einem Seziermikroskop wird das Überstandsmittel durch Pipettern entfernt, sodass 50–75 μL Medium mit den Organoiden übrig bleiben.
      10. Entferne die ausgeglichenen Mikroformen aus dem Inkubator und stelle sicher, dass sie so ausgerichtet sind, dass die Zellsäkammer nach oben zeigt.
      11. Entfernen Sie das Medium aus den Zellsäkammern mit einer Graefe-Zange oder durch Pipetten.
          HINWEIS: Bohrungen sollten nicht mehr als 500 μL Medien enthalten, damit die Zellsäkammern der Mikroformen entleert werden können.
      12. Übertragen Sie die Organoide direkt in die Zell-Saatkammer jedes neuen Agarose-Mikroschimmels durch Pipetten. Bringen Sie die 24-Brunnen-Platte zurück in den Inkubator.
      13. Nach 1–2 Stunden wird zusätzlich 250 μL des gewünschten Mediums außen um Agarose-Mikroformen gegeben, wobei man darauf achtet, die Zellsäkammern nicht zu stören.

Abbildung 6: Wichtige Ovarialzelltypen sind in ovarialen somatischen Organoiden erhalten. (A) Repräsentative Bilder von (i) dem Abdichten eines Mikroschimmels mit Agarose am Ende der Kultur, (ii) einem unbeschnittenen Mikroschimmel und (iii) einem geschnittenen Mikroschimmel, der in einen Paraffinblock eingebettet ist. Mikrobrunnen können in (iv) montierten Abschnitten visualisiert werden, und das Vorhandensein von Organoiden in geschnittenen Mikroformen kann (v) unter dem Mikroskop vor (vi) der histologischen Färbung bestätigt werden. (B) Repräsentative Bilder von Maus-Ovarialgewebeschnitten und ovarialen somatischen organoiden Schnitten nach immunhistochemischer Färbung mit Antikörpern gegen Vimentin, F4/80, Foxl2 und 3β-HSD. Skalenbalken = 20 μm. Abkürzungen: H&E = Hämatoxylin und Eosin. Diese Abbildung wurde mit Genehmigung von Dipali et ^al.19 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Kokultur von ovarialen somatischen Organoiden mit Follikeln und Ovarialkrebszellen. (A) Die Sekretion organoider Zytokine wurde per Agarose-Mikroschimmelpilz am 5. Kulturtag gemessen und auf konditionierte Medien aus Agarose-Mikroschimmeln ohne Organoide normalisiert. N = 4 Agarose-Mikroformen. (B) Repräsentative Lichtbilder von Ovarialfollikeln an den Tagen 0, 4 und 8 der Kultur mit oder ohne (Kontroll-)Organoide und (i) ein Schema des Kokultur-Paradigmas. Skalenbalken = 400 μm. Quantifizierung von (ii) Follikelüberleben und (iii) Wachstum über 8 Tage Kultur mit oder ohne (Kontroll-)Organoide. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt. Einige Fehlerbalken sind zu klein, um sichtbar zu sein. N = 56 Follikel pro Gruppe. **P < 0,01. (C) Repräsentative durchgeblasenes Licht (oben) und fluoreszierende (unten) Bilder primärer ovarialer somatischer Zellen, die im Verhältnis 10:1 mit rot fluoreszierenden, protein-markierten Ovarialkrebszellen (OVCAR8-RFP) in Organoiden an den Tagen 1, 3 und 5 der Kultur kultiviert wurden. Skalenbalken = 400 μm. Abkürzung: RFP = rotes fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

6. Tipps zur Fehlerbehebung

1. Problem 1: Die Anzahl der isolierten primären Ovarialzellen ist niedriger als erwartet.
   HINWEIS: Wenn Ovarialgewebefragmente nach der enzymatischen Verdauung konsequent kleiner als 1 mm sind oder für das Auge nicht sichtbar sind, kann die isolierte Zellanzahl aufgrund einer verminderten Lebensfähigkeit durch Überverdauung niedrig sein. Wenn Eierstockgewebefragmente nach der enzymatischen Verdauung größer als 1 mm sind, kann die isolierte Zellanzahl aufgrund unzureichender Verdauung des Eierstockgewebes gering sein.
   1. Wenn Eierstockgewebefragmente nach der enzymatischen Verdauung größer als 1 mm sind, folgen Sie den Schritten 6.1.1.1–6.1.1.2.
      1. Bestätigen Sie, dass Kollagenase IV und DNase I innerhalb ihrer empfohlenen Haltbarkeit liegen und aufgrund unsacheller Speicherung oder, im Fall von DNase I, wiederholter Frost-Tau-Zyklen keine enzymatische Aktivität verloren haben.
      2. Erhöhen Sie die Menge des wiederholten Pipetterns des Eierstockgewebes, verringern Sie die Bohrungsgröße der P1000-Spitze, wenn sie geschnitten wurde, um die Öffnung zu verbreitern, und/oder erhöhen Sie die Inkubationszeit bei EM.
   2. Wenn Ovarialgewebefragmente nach der enzymatischen Verdauung konsequent deutlich kleiner als 1 mm sind, verringern Sie die Menge wiederholter Pipettierung des Eierstockgewebes, erhöhen Sie die Bohrungsgröße der p1000-Spitze durch Schneiden, um die Öffnung zu verbreitern, und/oder verringern Sie die gesamte Inkubation in EM.
2. Problem 2: Mehr als ~25 % der gegossenen Agarose-Mikroformen weisen Defekte auf
   1. Bestätigen Sie, dass der Silikonguss frei von Agarose und Rückständen ist. Waschen Sie bei Bedarf die Silikonabgüsse in PBS und sterilisieren Sie sie erneut durch Autoklavierung. Falls nötig, erhitze das 1%ige Agarose, das zum Gießen verwendet wird, erneut, da Agarose, das erstarrt, den Silikonguss nicht gleichmäßig füllt und/oder zu Blasen führt.
   2. Nach dem Pipettieren in den Silikonguss kann Agarose vollständig fest werden, da eine vorzeitige Entfernung der Agarose-Mikroform aus dem Guss zu gestörten Mikrowellen führen kann.
   3. Überprüfen Sie, dass Silikongussteile nicht untergefüllt sind, da dies die strukturelle Integrität der Agarose-Mikroform verringern kann, was zu Schäden führen kann, wenn das Silikon gebogen wird, um die Agarose-Mikroform zu entfernen.
   4. Außerdem empfiehlt der Hersteller der Silikongusse, sie nicht mehr als 12 Mal zu autoklavieren. Wenn der Silikonguss übermäßig sterilisiert wurde, ersetzen Sie ihn.
3. Problem 3: Organoide bilden sich in mehr als 10 % der Mikrowellen nicht
   1. Überprüfen Sie, dass die Silikongussteile beim Gießen der Agarose-Mikroformen nicht überfüllt sind, da dies zu einer unregelmäßigen Verteilung der Zellen in die Mikrowellen führen kann, was die zentralen Mikrowellen der Agarose-Mikroform gegenüber den äußeren Mikrowellen bevorzugt.
   2. Vermeiden Sie es, Blasen zu erzeugen, wenn Sie die Zellsuspension in die Zellsäkammer der Agarose-Mikroformen dosieren, da Blasen die Verteilung der Zellen in Mikrowellen stören können.
   3. Bei Bedarf beginnen Sie mit mehr als 75 μL Zellsuspension (bei einer Dichte von 3,33 × 10⁶ lebenden Zellen pro 1 ml) pro Mikroform, um sicherzustellen, dass keine Blasen durch unzureichendes Volumen in der Pipettenspitze entstehen.
   4. Erhöhen Sie das Abstand zwischen der Zellaussaatung und der Zugabe von ovarialen organoiden Medien an die Außenseite des Agarose-Mikroschimmels, um genügend Zeit zu gewährleisten, damit sich die Zellen in Mikrowellen einlagern können.

Ergebnisse

Um die zelluläre Zusammensetzung somatischer Organoide der Ovarialen zu bestimmen, führten wir nach 6 Tagen Kultur eine Immunhistochemie organoider Gewebeschnitte mit Antikörpern gegen wichtige Ovarialzelltypen durch. Organoide enthielten Vimentin-positive Fibroblasten, F4/80-positive Makrophagen sowie steroidogene Zellpopulationen (Abbildung 6B)¹⁹. Wir verwendeten einen Antikörper gegen Foxl2, um Granulosa- und Granulosa-Luteinzellen...

Diskussion

Dieses Papier beschreibt Methoden, um primäre somatische Zellen der Maus aus einem stromaangereicherten Anteil des Eierstocks zu isolieren, um die Heterogenität des ovarialen somatischen Kompartments zu erhalten. Primäre mause-ovariale somatische Zellen können in einer 2D-Monoschicht kultiviert oder zur Erzeugung ovarialer somatischer Organoide mit gerüstfreien, agarose-Mikroformen genutzt werden. Agarose-Mikroformen enthalten 96 Mikrowellen zur Organoidbildung und passen in einen einzig...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,2 µm, Polyethersulfon-Spritzfilter	Corning	431229
1,5 mL Mikrozentrifugen-Röhrchen	MIDSCI	PR-MCT15
100 mL Glasbecher	Fisherbrand	FB100100
100 mm Petrischalen	Corning	351029
15 mL Konusrohre	ThermoFisher Scientific	339651
24-Well-Platten (TC-behandelt)	Corning	353047
28-Gauge Insulin-Nadeln	Exel International	26027
35 mm Petrischalen	Corning	351008
3β-HSD Antikörper	Cosmo Bio	K0607	1:1000
4% Paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	1574100
40 µm Zellsieb	Corning	431750
45 mm Uhrglas	Electron Microscopy Sciences	7054345
50 mL Konusrohre	ThermoFisher Scientific	339652
60 mL sterile Spritze	Air-Tite	ML60
60 mm TC-behandelte Platten	Corning	353037
6-Well-Platten (TC-behandelt)	Corning	353046
Agarose	Hoefer	GR140-500	Gelstärke >1200 g/cm2; Geltemperatur 36 °C
Autoklav-Sterilisationsbeutel	Fisherbrand	01-812-55
Biotinyliertes Ziegen-Anti-Maus-IgG	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
Biotinyliertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
Biotinyliertes Ziegen-Anti-Ratten-IgG	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
Blaufärbemittel	Fisherbrand	23-245681
Zentrifuge mit Schwingkorbrotor für 50 mL Konusrohre	ThermoFisher Scientific	Sorvall X1R Pro-MD
Klasse II Biosicherheitsschrank	The Baker Company	SG403A
Gespaltenes Caspase-3 (CC3) Antikörper	Cell Signaling Technology	9579T	1:250
CO2-Inkubator	ThermoFisher Scientific	Heracell VIOS 160i CO2 Inkubator
Collagenase, Typ IV, Pulver	Gibco, Fisher Scientific	17-104-019
C-Series Mouse Cytokine Antibody Array 3 Kit	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
Desoxyribonuklease I aus Rinderpankreas	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
Dissektionsmikrozange	World Precision Instruments	WPI-14003
Dissektionsscheren	World Precision Instruments	WPI-15922
Dissektionsmikroskop	Leica	MZ9.5, S9 series
DPBS, kein Calcium, kein Magnesium	Gibco, Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
Eosin	Fisherbrand	23-314631
F4/80 Antikörper	Bio-Rad	MCA497G	1:50
Fötales bovines Serum, zertifiziert, hitzeinaktiviert, USA	Gibco, ThermoFisher Scientific	10082147
Feinspitzen-Dissektionszange	World Precision Instruments	WPI-14098
FOXL2 Antikörper	Abcam	ab246511	1:200
Graefe-Pinzette	Fine Science Tools	1105010
Hämatoxylin	EK Industries	EKI 47971GL
Hämozytometer	MedOne	DHCN015
Bildgebungssystem	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult Organoid Growth Medium (Maus)	STEMCELL Technologies	06005	Basismedium, Supplements 1 und 2
Laminar-Flow-Haube	IVFtech	IVFtech sterile Workstation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco, Fisher Scientific	11415114
Mikroskop-Objektträger	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D Petrischalen Mikroformen für Sphäroide	Millipore Sigma	Z764043-6EA	Silikonformen für Agarose-Mikroformen
Modifiziertes Davidson's Fixativ	Electron Microscopy Sciences	6413350
OVCAR8-RFP-Zellen			Geschenk von Joanna Burdette PhD, University of Illinois Chicago
Penicillin-Streptomycin	Millipore Sigma	P4333-100ML
Picrosirius Rot Färbelösung	StatLab	STPSRPT
RPMI 1640 Medium (ATCC-Modifikation)	Gibco, Fisher Scientific	A1049101
Tischzentrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
Trypanblau	ThermoFisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot	Gibco, ThermoFisher Scientific	25300054
Vimentin Antikörper	Cell Signaling Technology	5741S	1:100
αMEM, GlutaMAX-Supplement, keine Nukleoside	Gibco, Fisher Scientific	32561102