Forschungsfortschritte zu Strategien zur Effizienzbeurteilung von DNA-Schäden

Xiao Liu; Yiwei Zhu; Ling Li; Siyu Hang; Sipei Wu; Song-Bai Liu

doi:10.3791/71031

Übersichtsartikel

Forschungsfortschritte zu Strategien zur Effizienzbeurteilung von DNA-Schäden

DOI:

10.3791/71031

⸱

23. Juni 2026

Xiao Liu^*¹^,² , Yiwei Zhu^*³ , Ling Li¹^,² , Siyu Hang¹ , Sipei Wu⁴ , Song-Bai Liu¹^,²

¹Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, ²School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, ³Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, ⁴Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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DNA-Schadensreparatur-Effizienz-Assays lassen sich grob in drei Gruppen einteilen: zellbasierte funktionelle Assays, in-vitro-biochemische Assays und molekulare Marker-Assays. Diese Ansätze ermöglichen eine qualitative oder quantitative Bewertung der Reparatureffizienz über mehrere DNA-Schadensreparaturwege hinweg.

Zusammenfassung

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Zelluläre genomische DNA ist kontinuierlich endogenen und exogenen Faktoren ausgesetzt, die verschiedene Formen von DNA-Schäden verursachen. In Säugetierzellen kann die tägliche Belastung durch DNA-Schäden 10,⁴–10⁵ Läsionen pro Zelle erreichen. DNA-Schäden, die bis in die S-Phase anhalten, können zu Mutationen führen. Wenn solche Mutationen in Onkogenen, Tumorsuppressorgenen oder Genen, die an der Zellproliferation beteiligt sind, auftreten, können sie die zelluläre Transformation und Karzinogenese fördern. Daher spielt die DNA-Schadensreparatur eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität und der Verhinderung der Krebsentwicklung. Die Bewertung der DNA-Reparaturkapazität wird am besten durch die Messung der funktionellen Aktivität von DNA-Reparatursystemen erreicht. DNA-Schadensreparaturwege und deren Reparatureffizienz sind von großer Bedeutung für die Entwicklung chemotherapeutischer Medikamente, die Validierung der Genfunktion und die Krebstherapie. Dementsprechend hat die Untersuchung der Reparatureffizienz einzelner DNA-Schadensreparaturwege eine wichtige theoretische und praktische Bedeutung. Diese Übersicht fasst die wichtigsten DNA-Schadensreparaturwege, Methoden zur Bewertung der Reparatureffizienz sowie die Vor- und Nachteile dieser Ansätze zusammen.

Einleitung

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Das DNA-Schadensreparatursystem ist ein kritischer zellulärer Abwehrmechanismus, der die genomische Stabilität aufrechterhält, indem es die Mutationshäufigkeit senkt und Karzinogenese¹ unterdrückt. Verschiedene Arten von DNA-Schäden werden durch unterschiedliche, aber miteinander verbundene Reparaturwege repariert². Beispielsweise werden Basenfehlanpassungen, die während der DNA-Replikation entstehen, durch Mismatch-Reparatur (MMR) korrigiert, während chemisch modifizierte Basen, wie alkylierte Basen, hauptsächlich durch Basenexzisions-Reparatur (BER)³ repariert werden. Ultraviolett (UV)-induzierte 6-4 Photoprodukte und voluminöse Nukleotidaddukte, die durch bestimmte chemische Substanzen erzeugt werden, werden durch Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) entfernt. Der Schäden durch Interstrang-Crosslink (ICL) werden durch koordinierte Aktivitäten von Proteinen, die mit dem Fanconi-Anämieweg⁴ assoziiert sind, repariert. Einsträngige Brüche (SSBs) werden über den Einstrangbruch-Reparaturweg (SSBR) repariert, während Doppelsträngbrüche (DSBs) hauptsächlich durch nichthomologe Endverbindungen (NHEJ) oder homologe Rekombination (HR) repariert werden. In den meisten Fällen werden komplexe DNA-Läsionen durch koordinierte Interaktionen zwischen mehreren DNA-Reparaturwege^aufgelöst.

Die Bewertung von DNA-Schäden und Reparatureffizienz in Zellen basiert typischerweise auf einer Kombination experimenteller Ansätze, darunter den Comet Assay, Immunfluoreszenz (IF), Western Blotting (WB), Reaktivierung der Wirtszellen (HCR) und plasmidbasierte Reparaturtests. Diese Methoden bewerten DNA-Schäden und -Reparaturen, indem sie DNA-Strängbrüche, DNA-Schädigungsmarker sowie die Expression oder Lokalisierung reparaturassoziierter Proteine^{erkennen 6}. Eine genaue Quantifizierung der zellulären Reparatureffizienz erfordert jedoch in der Regel dynamische, herausforderungsbasierte Tests. Bei diesen Ansätzen werden spezifische DNA-Läsionen experimentell induziert, und Zellen werden zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkten entnommen, um die Bildung und Beseitigung von Schadenssignalen zu überwachen. Der Vergleich der Restschadensniveaus im Zeitverlauf im Verhältnis zur anfänglichen Schadenslast ermöglicht eine quantitative Bewertung der Reparaturkinetik und der Funktionalität des Pfades.

Um systematisch die Eigenschaften und Anwendungen aktuell verfügbarer DNA-Schadensreparatur-Tests zu vergleichen, fasst diese Übersicht die wichtigsten Nachweismethoden anhand von fünf Parametern zusammen: Läsion/Substrat-Spezifität, analytische Auflösung, Sensitivität, quantitative Fähigkeit und Instrumentierungsanforderungen (Tabelle 1). Diese Übersichtsarbeit zielt darauf ab, einen praktischen methodischen Leitfaden für die Auswahl geeigneter Ansätze zur Untersuchung von DNA-Schadensreparaturwegen in der Basisforschung, translationaler und klinischer Forschung zu bieten.

Erkennungsmethode	Läsions-/Substratspezifität	Analytische Auflösung	Empfindlichkeits-/Detektionsschwelle	Quantitativer vs. qualitativer Output	Instrumentierungsanforderungen
Westlicher Blot	CPDs, 6-4PPs, Reparaturproteine (z. B. MGMT, RAD51)	Bevölkerung	Moderat	Halb-quantitativ	Proteinelektrophorese, Membrantransfer, chemilumineszenzbildgebendes System
Immunfluoreszenz	CPDs, DSB-Fokuspunkte (z. B. γ-H2AX, RAD51)	Einzelzelle	Moderat	Halb-quantitativ	Fluoreszenzmikroskop
HPLC-MS/MS	CPDs, 6-4PPs, oxidative und alkylative Basisschäden	Population/In vitro	Extrem hoch	Quantitativ	HPLC-MS/MS
MGMT-Enzymaktivitätstest	O⁶-meG-Alkylationsschaden	Population/In vitro	Hoch	Quantitativ	Mikroplatten-Leser
Kometen-Assay	SSBs, DSBs, oxidierte Basen (mit FPG/OGG-Vorbehandlung)	Einzelzelle	Hoch	Quantitativ	Fluoreszenzmikroskop-/Elektrophoresesystem
Schnitttest	AP-Stellen, NER-Schnitte, BER-Schnitte	Population/In vitro	Hoch	Quantitativ	Gelbildgebung, Radiolabeling/Fluoreszenzdetektion
Wiederhergestelltes Reparatursystem	Standortspezifische Basisschäden, AP-Standorte, Strangbrüche	In vitro	Hoch	Quantitativ	Gelelektrophorese, Fluoreszenz/MS-Detektion
Plasmidbasierter Reparaturtest	Ortsspezifische Schäden	Bevölkerung	Moderat	Quantitativ	Mikroplattenleser, Durchflusszytometer, Kolonienzählung
Reporter-Assay	Standortspezifische Schäden; BER, NER, HR, NHEJ, MMR	Bevölkerung	Hoch	Quantitativ	Mikroplattenleser, Durchflusszytometer, Fluoreszenzmikroskop
HCR/FM-HCR	UV-Schaden, Platin-Crosslinks, standortspezifische Schäden	Bevölkerung	Hoch	Quantitativ	Durchflusszytometer, Fluoreszenz-/Chemilumineszenzdetektor
RADD	Breitband-DNA-Schäden	Einzelzelle	Extrem hoch	Quantitativ	Einmolekül-Fluoreszenzmikroskop
qPCR	UV-Schäden, kettenblockierende Läsionen	Bevölkerung	Moderat	Quantitativ	Echtzeit-qPCR-Instrument
MSI-Erkennung	Instabilität durch MMR-Mangel assoziiert Mikrosatelliteninstabilität	Bevölkerung	Moderat	Qualitativ	PCR-Instrument/Kapillarelektrophorese
DR-GFP/EJ5-GFP	HR- und NHEJ-vermittelte DSB-Reparaturen	Bevölkerung	Hoch	Quantitativ	Durchflusszytometer/Fluoreszenzmikroskop
SEGN/GLÜCK	Genomweite DSB-Kartierung	Einzelzelle	Extrem hoch	Quantitativ	Hochdurchsatz-Sequenzer
iPOND	DDR-Proteine bei Replikationsgabeln/TLS-assoziierte Reparatur	Replikationsgabel/Proteom	Hoch	Halb-quantitativ	Massenspektrometrie-/Sequenzierungsplattform

Tabelle 1: Systematischer Vergleich von Methoden zur Erkennung der Effizienz der DNA-Schadensreparatur. Vergleich häufig verwendeter Methoden zur Bewertung der Effizienz der DNA-Schadensreparatur über mehrere Reparaturwege. Die Tabelle fasst die Spezifität von Läsionen oder Substraten, die analytische Auflösung, Sensitivität, quantitative Fähigkeit und die Instrumentierungsanforderungen für jeden Assay zusammen, einschließlich biochemischer, molekularer und zellbasierter Ansätze.

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Überprüfung und Perspektive

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1. Direkte Reparatur (DR)

Direkte Reparatur (DR) ist die einfachste Form der DNA-Reparatur und bezeichnet die direkte Wiederherstellung beschädigter DNA ohne Entfernung von Basen oder Nukleotiden⁷. DR repariert hauptsächlich zwei Haupttypen von DNA-Läsionen. Die erste ist die Schädigung durch Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer (CPD), verursacht durch ultraviolette (UV-)Strahlung. In vielen Organismen erkennt und bindet Photolyase Pyrimidin-Dimere. Bei sichtbarem Licht wird die Photolyase aktiviert, kehrt DNA-Schäden direkt um und dissoziiert dann vom DNA-Molekül. Dieser Photoreaktivierungsmechanismus ist besonders wichtig bei Pflanzen und niedrigeren Organismen. Allerdings fehlt Plazenta-Säugetieren, einschließlich Menschen, die funktionelle Photolyase und können daher keine Photoreaktivierung durchführen. Folglich wird der durch UV induzierte CPD-Schaden in menschlichen Zellen hauptsächlich durch Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER)⁸ repariert.

Die zweite Hauptart von Schaden, die durch DR repariert wird, ist der alkylationsinduzierte Basisschaden. Die Reparatur wird durch O6-Alkylguanin-DNA-Alkyltransferase (AGT), auch bekannt als^{O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase} (MGMT), vermittelt. Dieses Enzym überträgt Alkylgruppen von der^O6-Position der Guaninreste auf sich selbst und stellt so die beschädigte DNA-Basis direkt wieder her.

Methoden zur Erkennung der DR-Effizienz

Nachweis der Reparatureffizienz für CPD-Schäden, die durch ultraviolette (UV-)Strahlung verursacht werden
1. Westlicher Blot (WB)-Test zur Erkennung von Veränderungen im CPD-Inhalt
  Mit Antikörpern, die spezifisch für CPDs sind, können Forscher Veränderungen der CPD-Häufigkeit zu verschiedenen Zeitpunkten nach UV-Bestrahlung nachweisen und die Reparatureffizienz aus dem Restschaden ableiten. Eine höhere Reparatureffizienz entspricht einer schnelleren CPD-Entfernung. Die auf WB basierende CPD-Erkennung ist ein klassischer und effektiver Ansatz zur Bewertung der DNA-Reparaturaktivität; Es bestehen jedoch mehrere Einschränkungen. Erstens misst der Assay die durchschnittlichen Schadensniveaus über Zellpopulationen hinweg und weist daher keine Einzelzellauflösung auf. Zweitens, und noch wichtiger, kann der Test nicht zwischen Reparaturwegen unterscheiden. Da CPDs in menschlichen Zellen hauptsächlich durch NER repariert werden, kann die WB-Analyse allein nicht unterscheiden, ob die beobachtete Reparaturaktivität photolyase-vermittelte Reparatur oder NER-Aktivität ohne zusätzlichen experimentellen Kontext widerspiegelt.
2. Immunfluoreszenz (IF) positionierende dynamische Veränderungen des CPD-Fokus
  Zellen, die UV-Bestrahlung und Fotoreparaturbehandlung unterzogen werden, können mit CPD-spezifischen Antikörpern gefärbt werden, und Veränderungen der nuklearen CPD-Fokussen können durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Die quantitative Analyse der Bildung und Clearance von CPD-Foci ermöglicht die Beurteilung der DNA-Reparaturkapazität sowohl auf Populations- als auch auf Einzelzellebene. Die Rate des Verschwindens von CPD-Fokussen spiegelt direkt die Reparatureffizienz wider. IF bietet räumliche und zeitliche Visualisierung der Reparaturdynamik innerhalb einzelner Zellen und ermöglicht die Erkennung der Heterogenität von Zell zu Zell. Fluoreszenzsignale sind jedoch anfällig für Abschrecken, und quantitative Analysen basieren oft auf manuellem Zählen, was Subjektivität einführt. In Säugetierzellen ohne photoreaktivierung spiegelt diese Methode in erster Linie die NER-vermittelte Reparatureffizienz wider.
3. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) für quantitative CPD-Analyse
  Die extrahierte DNA wird enzymatisch zu Nukleosiden verdaut, woraufhin CPDs durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) von normalen Nukleosiden getrennt werden. Die quantitative Analyse wird anschließend mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) durchgeführt. Die Reparatureffizienz wird durch den Vergleich der CPD-Häufigkeit vor und nach der Reparatur^{bestimmt 9}. HPLC-MS/MS bietet eine extrem hohe Spezifität und eine Empfindlichkeit auf picomolarem Niveau; die Methode erfordert jedoch teure Instrumentierung, komplexe Probenvorbereitung und spiegelt nicht den in-situ-Reparaturzustand intakter Zellen wider. In menschlichen Zellproben spiegelt das gemessene Reparaturergebnis überwiegend die NER-Aktivität wider.
Wirksamkeit der durch alkylierende Substanzen induzierten DNA-Basenschaden
1. MGMT-Enzymaktivitätstest
  Die Reparatureffizienz von durch alkylierende Substanzen verursachten DNA-Schäden wird üblicherweise durch Messung der MGMT-Aktivität¹⁰ bewertet. Radioaktiv markierte methylierte DNA-Substrate werden verwendet, um die Übertragung von Methylgruppen von beschädigter DNA auf das MGMT-Protein zu überwachen und so eine quantitative Bewertung der Reparatureffizienz zu ermöglichen.
2. Berichterstattung von Gen-Assay zur Erkennung der O6-meG-Reparatureffizienz
  Reporterplasmide mit^{O-6-Methylguanin} (O^6-meG) Läsionen können konstruiert werden, um die Reparatureffizienz zu bewerten. Die eingeführte Läsion unterdrückt die Genexpression des Reporters, bis die MGMT-vermittelte Reparatur die Reporteraktivität wiederherstellt. Die Reparatureffizienz wird anschließend durch die Messung der Genexpression des Reporters quantifiziert. Reporter-Gen-Assays bieten eine intuitive und quantitative Bewertung der Reparaturaktivität in lebenden Zellen¹¹. Diese Assays erfordern jedoch die Konstruktion läsionsspezifischer Vektoren und umfassen relativ lange experimentelle Zyklen¹².
Effizienz der Schadensreparatur bei Entdeckung eines Kettenbruchs
1. Kometen-Assay
  Der Kometen-Assay, auch bekannt als Einzelzell-Gelelektrophorese (SCGE), ist eine sensible Methode zur Erkennung von DNA-Strängbrüchen auf Einzelzellebene. Beschädigte DNA-Fragmente wandern während der Elektrophorese aus dem Zellkern und bilden kometenartige Schwänze, während intakte DNA im Kernbereich konzentriert bleibt. Parameter wie Kometenschwanzlänge, Schwanz-DNA-Gehalt und Schwanzmoment können mit Fluoreszenzmikroskopie- und Bildanalysesoftware quantifiziert werden. Diese Kennzahlen ermöglichen eine quantitative Bewertung des DNA-Strangbruchs. Durch den Vergleich von Kometenprofilen unmittelbar nach der DNA-Schädeninduzierung mit denen nach der Reparatur kann die Reparatureffizienz^{mit 13} geschätzt werden.
  Der Comet-Test bietet mehrere Vorteile, darunter einfachen Betrieb, relativ geringe Kosten, hohe Empfindlichkeit und Einzelzellauflösung. Eine weitere Verfeinerung dieser Methode hat zur Entwicklung enzymmodifizierter Varianten und kometenbasierter DNA-Reparaturtests geführt, die zur Bewertung von BER- und NER-Aktivitäten verwendet werden können.

2. Basis-Exzisionsreparatur (BER)

Die Basenexzisionsreparatur (BER) ist ein hochgradig konservierter DNA-Reparaturweg, der hauptsächlich kleine Basenläsionen entfernt, die durch Oxidation, Alkylierung und Deamination¹⁴ entstehen. BER weist eine erhebliche mechanistische Überschneidung mit der Reparatur von Einzelsträngbruch (SSBR) auf, und bestimmte SSBR-Ereignisse gelten als Erweiterungen von BER. Je nach Reparaturpatchlänge wird BER in Short-Patch BER (SP-BER) und Longpatch BER (LP-BER) eingeteilt.

BER wird durch DNA-Glykosylasen ausgelöst, die beschädigte Basen erkennen und entfernen, indem sie die N-glykosidische Bindung zwischen Base und Desoxyribose spalten und so apurine/apyrimidinische (AP)-Stellen¹⁵ erzeugen. AP-Endonuklease 1 (APE1) spaltet anschließend das DNA-Rückgrat an der 5′-Seite der AP-Stelle und erzeugt 3′-OH- und 5′-Deoxyribosephosphat (dRP)-Enden. Während SP-BER wird die dRP-Gruppe entfernt, DNA-Polymerase β (Polβ) füllt die Einzelnukleotid-Lücke, und DNA-Ligase III (LigIII) vollendet die Ligation.

Die Reparatur von alkylationsinduzierten Einzelsträngbrüchen mit 3′-blockierten Terminen folgt einem ähnlichen Mechanismus, erfordert jedoch zusätzliche Endverarbeitung. Polynukleotid-Kinase 3′-Phosphatase (PNKP) entfernt zunächst abnormale 3′-Terminus, um eine geeignete 3′-OH-Gruppe zu bilden. Polβ füllt anschließend das fehlende Nukleotid, und LigIII versiegelt den Kerbe, um die Reparatur abzuschließen.

Methoden zur Erkennung der BER-Effizienz

Enzymmodifizierter Kometentest
Der enzymmodifizierte Komet-Test erweitert den Standard-Komet-Test durch die Einbindung läsionsspezifischer Reparaturenzyme. Diese Enzyme erkennen beschädigte Basen und spalten sie, indem sie sonst nicht nachweisbare Läsionen in nachweisbare Strangbrüche umwandeln. Die resultierende Kometenschwanzintensität spiegelt das Ausmaß des DNA-Schadens^{wider: 16}˒¹⁷.
Zur Bewertung der BER-Effizienz wird die Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase (FPG) oder ihr säugetieriges Homolog 8-Oxoguanin-DNA-Glycosylase (OGG1) verwendet, um oxidierte Basenläsionen in Einzelsträngbrüche umzuwandeln, die anschließend mit dem Kometen-Assay¹⁸ analysiert werden.
Schnitttest
Der Schnitttest ist ein zentraler In-vitro-Ansatz zur Bewertung der BER-Aktivität. DNA-Substrate, die AP-Stellen enthalten, werden mit gereinigten Enzymen oder zellulären Extrakten inkubiert, und der Anteil der gespaltenen DNA-Substrate wird quantifiziert. Dieser Test spiegelt direkt die APE1-vermittelte Schnittaktivität wider und bietet eine hohe Spezifität und Sensitivität, während er die Interferenz durch die intrazelluläre Umgebung minimiert¹⁹.
Der Schnitttest rekapituliert jedoch nicht vollständig die BER-Aktivität in lebenden Zellen, da er die dynamische Regulation des vollständigen Reparaturprozesses nicht beurteilen kann, einschließlich Läsionserkennung, Basenexzision, AP-Stellenspaltung, DNA-Synthese und Ligation²⁰.
Wiederhergestelltes Reparatursystem
Das rekonstituierte Reparatursystem ist eine in-vitro-experimentelle Plattform, die DNA-Reparaturwege mithilfe gereinigter Reparaturproteine rekonstruiert. Dieses System ermöglicht eine detaillierte Analyse der molekularen Funktionen und Interaktionen einzelner Reparaturproteine und wird häufig für mechanistische Studien und Arzneimittelscreenings eingesetzt.
Zur Bewertung der BER-Effizienz werden gereinigte Glykosylasen, AP-Endonukleasen, DNA-Polymerasen und Ligasen sequentiell mit beschädigten DNA-Substraten inkubiert, um Läsionenerkennung, Exzision, Synthese und Ligation wiederherzustellen. Reparaturprodukte werden mittels Gelelektrophorese, Fluoreszenzkennzeichnung oder Massenspektrometrie²¹ analysiert. Obwohl dieser Ansatz hochkontrollierte mechanistische Studien ermöglicht, berücksichtigt er weder die Chromatinstruktur noch die globale zelluläre Regulation der Reparaturaktivität²².
Plasmidbasierter Reparaturtest
Plasmidbasierte Reparaturassays beinhalten die Einführung von Plasmiden mit definierten DNA-Läsionen in Wirtszellen oder die Inkubation mit zellulären Extrakten mit Reparaturenzymen, gefolgt von der Bewertung der Reparatureffizienz mittels Reporter-Assays, Durchflusszytometrie oder Koloniebildungsanalyse²³.
Zur Bewertung der BER-Effizienz werden Plasmide, die oxidative DNA-Schäden enthalten, mit zellulären Extrakten inkubiert und anschließend in reparaturdefiziente Bakterienstämme wie Escherichia coli umgewandelt. Die Reparatureffizienz wird dann anhand der Koloniebildungsraten geschätzt.
Reporter-Gen-Assay
Reporter-Gen-Assays bewerten indirekt die Effizienz der DNA-Reparatur oder die Genregulationsaktivität, indem sie die Wiederherstellung der Genexpression des Reporters messen²⁴. In diesen Tests werden DNA-Läsionen oder regulatorische Elemente in die Berichterkonstrukte eingebaut, und die Reparatureffizienz wird durch Veränderungen in der Berichterstattungsaktivität nach der Reparatur quantifiziert.
Für die BER-Analyse kann eine 8-oxoG-Läsion in den codierenden Bereich eines Luciferase-Reporter-Gens eingefügt werden. Wenn die Läsion nicht repariert bleibt, wird die Übersetzung gestört; Eine erfolgreiche Reparatur stellt die vollständige Proteinexpression des Reporters wieder her. Unbeschädigte Plasmide, wie pRL-TK Renilla-Luciferasevektoren, werden häufig als interne Kontrollmechanismen verwendet.
Reaktivierung der Wirtszellen (HCR)
Die Reaktivierung von Wirtszellen (HCR) ist ein klassischer Test, der indirekt die Effizienz der DNA-Reparatur bewertet, indem er die Fähigkeit der Wirtszellen misst, die Expression aus beschädigten Reporter-Plasmiden wiederherzustellen²⁵. Plasmide, die definierte Läsionen tragen, wie UV-induzierte Pyrimidindimere oder chemisch induzierte Querverbindungen, werden in Wirtszellen transfektiert. Die Reparatureffizienz wird anschließend durch die Messung der Genexpression des Reporters quantifiziert.
HCR-Assays bieten eine hohe Sensitivität und ermöglichen die Bewertung der Reparaturaktivität gegenüber bestimmten Läsionstypen. Es ist jedoch eine effiziente Transfektion und Vorbereitung hochwertiger beschädigter Plasmide erforderlich. Eine wesentliche Einschränkung der konventionellen HCR besteht darin, dass die Behandlung von Plasmiden mit DNA-schädigenden Substanzen oft heterogene Läsionspopulationen im gesamten Plasmid erzeugt, was die mechanistische Interpretation²⁶ erschwert.
Um diese Einschränkungen zu beheben, wurden Flowzytometrie-basierte Wirtszellreaktivierungstests (FM-HCR) mit standortspezifischen Einzelläsionsplasmiden entwickelt. FM-HCR ermöglicht eine schnelle quantitative Analyse der Reparaturtätigkeit in lebenden Zellen, obwohl der Test spezialisierte Instrumentierung erfordert und Einschränkungen für die gleichzeitige mechanistische Analyse mehrerer BER-Signalwege^aufweist.
Plaque-Wirtszell-Reaktivierungstests (PL-HCR) auf Basis läsionspezifischer BER-Substrate wurden ebenfalls entwickelt, um BER-Mechanismen in lebenden Zellen zu untersuchen (Abbildung 1)²⁸. Bei diesem Ansatz werden Plasmide mit einer einzelnen 1,N 6-Ethenoadenin-(εA)-Läsion in Säugetierzellen eingeführt. Nach der Reparatur wird Plasmid-DNA gewonnen, mit Restriktionsenzymen verdaut, in E. coli umgewandelt und durch Plaque-Bildungsanalyse quantifiziert. Vollständig reparierte Plasmide werden nach der Restriktionsverdauung linearisiert und bilden keine Plaques, während unreparierte oder unvollständig reparierte Plasmide kreisförmig bleiben und Plaques bilden. Die BER-Effizienz wird daher durch Plaque-Quantifizierung bestimmt.
Reparaturunterstützte Schadenserkennung
Reparaturassistierte Schadenserkennung (RADD) ist eine Einzelmolekülmethode zur Erkennung und Quantifizierung von DNA-Schäden²⁹. Bei diesem Ansatz erkennen und entfernen läsionsspezifische Reparaturenzyme beschädigte Basen, woraufhin DNA-Polymerasen fluoreszierend markierte Nukleotide in die entstehenden Lücken integrieren. DNA-Moleküle werden anschließend mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisiert, was den direkten Nachweis und die Quantifizierung von DNA-Läsionen ermöglicht (Abbildung 2)³⁰.
RADD bietet eine hochsensible qualitative und quantitative Analyse von DNA-Schäden auf Einzelmolekülebene. Die Methode misst jedoch in erster Linie die DNA-Schadensbelastung, anstatt die Reparaturkinetik oder die Gesamteffizienz der Reparatur in Zellpopulationen direkt zu bewerten.

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Abbildung 1: Reaktivierung der Plaque-Wirtszellen (PL-HCR). M13mp18 kreisförmige einsträngige DNA mit einer definierten Läsion wird in kompetente Zellen transfektiert. Nach der Transfektion werden die Zellen auf Agarplatten kultiviert, um die Bildung der Plaque zu ermöglichen. Replikative M13-DNA wird anschließend aus Plaques isoliert, mit Restriktionsenzymen verdaut und mittels Gelelektrophorese analysiert, um mutante und Wildtypprodukte zu unterscheiden und festzustellen, ob eine Läsionenreparatur stattgefunden hat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Reparaturunterstützte Schadenserkennung (RADD). Einzelsträngige Lücken, die während der DNA-Reparatur entstehen, werden mit biotin-markierten Nukleotiden gefüllt. Fluoreszierend markiertes Avidin oder Streptavidin wird dann verwendet, um integrierte Nukleotide nachzuweisen, was eine quantitative Beurteilung der DNA-Schadenswerte durch Fluoreszenzanalyse ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

3. Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER)

Die Nukleotid-Exzisionsreparatur (NER) ist ein wichtiger DNA-Reparaturweg, der für die Entfernung voluminöser DNA-Läsionen verantwortlich ist, die die DNA-Doppelhelix³¹ verzerren. NER-Substrate umfassen UV-induzierte Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere (CPDs), 6-4 Pyrimidin-Pyrimidon-Photoprodukte (6-4 PPs), oxidative Purinläsionen, voluminöse chemische Addukte und cisplatin-induzierte Intrastrang-Querverbindungen³². Defekte bei NER stehen im Zusammenhang mit Erkrankungen wie Xeroderma pigmentosum, das durch extreme UV-Empfindlichkeit und erhöhte Krebsanfälligkeit gekennzeichnet ist.

NER besteht aus zwei Hauptsubwegen: dem globalen Genom NER (GG-NER)³³ und dem transkriptionsgekoppelten NER (TC-NER)³⁴. GG-NER untersucht das gesamte Genom auf helix-verzerrende Läsionen und unterdrückt so Mutagenese und Karzinogenese. Im Gegensatz dazu entfernt TC-NER selektiv transkriptionsblockierende Läsionen aus aktiv transkribierten Genen und ist wesentlich für die Aufrechterhaltung der transkriptionellen Integrität. Defekte im TC-NER tragen zu Erkrankungen wie dem Cockayne-Syndrom und dem UV-sensitiven Syndrom³⁵ bei.

Methoden zur Erkennung der NER-Effizienz

Schnitttest
Der Schnitttest bewertet die NER-Effizienz, indem er Strangschnitte erkennt, die an DNA-Schädigungsstellen durch Reparaturproteine eingeführt werden. In diesem Test werden beschädigte DNA-Substrate, wie UV-bestrahlte DNA mit CPDs, mit Reparaturproteinen oder zellulären Extrakten inkubiert, und anschließend werden Schnittprodukte^{nachgewiesen 36}.
Radiomarkierung oder Fluoreszenzkennzeichnung kann eingesetzt werden, um die Empfindlichkeit zu verbessern und eine präzise Überwachung der Schnittaktivität^{zu ermöglichen 37}. Der Test misst direkt die Aktivität wichtiger NER-Proteine, die für die Schadenserkennung und -exzision verantwortlich sind. Eine erfolgreiche Umsetzung erfordert jedoch die Herstellung hochwertiger beschädigter Substrate und aktiver Proteinextrakte.
Enzymreparatur-Kometen-Assay
Die NER-Effizienz kann auch mit enzymmodifizierten Kometen-Assays bewertet werden. Bei diesem Ansatz wird die T4-Endonuklease V mit beschädigten Zellen inkubiert, um Pyrimidindimere in nachweisbare Einzelsträngbrüche umzuwandeln, die anschließend mit dem Kometen-Assay³⁸ analysiert werden.
Echtzeit-Fluoreszenzquantitative PCR (qPCR)
Echtzeitquantitative PCR (qPCR) bewertet indirekt die Effizienz der DNA-Reparatur, indem die inhibitorischen Effekte von DNA-Läsionen auf die PCR-Amplifikation^{gemessen werden 39}. Während der NER-Analyse wird UV-Bestrahlung erstmals zur Induzierung von Pyrimidin-Dimeren eingesetzt. Diese Läsionen behindern die DNA-Polymeraseprogression und verringern die Amplifikationseffizienz, was zu erhöhten Zyklusschwellenwerten (Ct) führt. Nach der Reparatur durch den NER-Weg wird die DNA-Integrität wiederhergestellt und die Amplifikationseffizienz verbessert sich, was zu niedrigeren CT-Werten führt. Die Reparatureffizienz kann daher quantifiziert werden, indem die Verstärkung vor und nach der Reparatur im Vergleich zu einem unbeschädigten internen Kontrollbereich⁴⁰ verglichen wird.
Darüber hinaus kann qPCR verwendet werden, um die Expressionsniveaus von Genen zu bewerten, die an DNA-Schadenssignalwegen und -reparaturwegen, einschließlich ATM, ATR, BRCA1, CDKN1A und XPC, beteiligt sind, und spiegelt damit indirekt die DNA-Reparaturkapazität⁴¹ wider.
Flowzytometriebasierte Wirtszellreaktivierung (FM-HCR)
FM-HCR-Tests verwenden standortspezifische, läsionshaltige Plasmide, die in Wirtszellen transfectiert werden, und quantifizieren die Reparatureffizienz durch Flowzytometrie der Fluoreszenzintensität und des Anteils fluoreszierender Zellen (Abbildung 3)⁴²˒⁴³. Eine erhöhte Fluoreszenzintensität spiegelt im Allgemeinen eine größere DNA-Reparaturkapazität^{wider 44}˒⁴⁵.
Exzisionsreparatur-Sequenzierung (XR-seq)
Exzisionsreparatursequenzierung (XR-seq) ist eine genomweite Technik zur Kartierung der NER-Aktivität bei Einzelnukleotidauflösung. Diese Methode bereichert selektiv und sequenziert beschädigte Oligonukleotiden, die während NER entfernt werden, und erzeugt so hochauflösende Karten der Reparaturaktivität im gesamten Genom. XR-seq ermöglicht eine quantitative Analyse der Reparatureffizienz und der Verteilungsmuster, die sowohl mit GG-NER- als auch TC-NER-Pfaden verbunden sind, und stellt einen bedeutenden technologischen Fortschritt in der NER-Forschung dar.
Da NER aus zwei mechanistisch unterschiedlichen Unterwegen besteht und zahlreiche Reparaturproteine umfasst, sind für eine umfassende Bewertung der Reparaturaktivität⁴⁶˒⁴⁷ mehrere komplementäre Methoden erforderlich. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Methoden kann die NER-Effizienz auch mit Western Blotting, Immunfluoreszenz-Assays, plasmidbasierten Reparatur-Assays und Reporter-Gen-Assays bewertet werden.

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Abbildung 3: Nachweisprinzip der auf Durchflusszytometrie basierenden Wirtszellreaktivierung (FM-HCR). Plasmide, die vier verschiedene Arten von DNA-Schäden enthalten, werden ko-transfiziert in kultivierte Säugetierzellen übertragen. Die DNA-Reparaturkapazität (DRC) wird anschließend durch Flowzytometrie auf Basis der Fluoreszenzintensität des Reporters quantifiziert. DRC, DNA-Reparaturkapazität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

4. Mismatch-Reparatur (MMR)

Mismatch-Reparatur (MMR) ist ein postreplikativer Fehlerkorrekturweg, der für die Reparatur von Basen-Fehlanpassungen wie G-T- und A-C-Fehlkombinationen sowie für kleine Insertion-Deletion-Schleifen verantwortlich ist, die während der DNA-Replikation⁴⁸ entstehen. MMR wird eingeleitet, wenn MutS unpassende Basen erkennt, woraufhin MutL nachgelagerte Reparaturfaktoren und Exonukleasen rekrutiert, um den Reparaturprozess⁴⁹ zu aktivieren. Ein entscheidender Schritt bei der MMR ist die Unterscheidung zwischen dem elterlichen und dem neu synthetisierten DNA-Strang⁵⁰.

Bei Prokaryoten wird die Strang-Diskriminierung durch DNA-Methylierung erreicht, die den Elternstrang markiert. Bei Eukaryoten wird die Strangidentität durch vorübergehende Kerben in neu synthetisierter DNA und Interaktionen mit proliferierendem zellierendem Nuklearantigen (PCNA) bestimmt. MMR verbessert die Replikationstreue erheblich und spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität⁵¹. Defekte im MMR stehen in starkem Zusammenhang mit mehreren Krebsarten, einschließlich des Lynch-Syndroms.

Methoden zur Bewertung der Effizienz der MMR

Mikrosatelliten-Instabilitätstests
Fehlerhafte MMR führt dazu, dass Replikationsrutschfehler an Mikrosatellitenloci nicht korrigiert werden können, was zu Mikrosatelliteninstabilität (MSI) führt. MSI-Tests umfassen die PCR-Amplifikation repräsentativer Mikrosatellitenmarker, gefolgt von einer kapillarelektrophoresebasierten Fragmentanalyse. Instabilität an mehreren Loci weist auf eine beeinträchtigte MMR-Aktivität hin, während stabile Mikrosatellitenprofile auf intakte MMR-Funktion hinweisen. MSI-Tests bieten eine hohe Sensitivität und Spezifität zur Erkennung eines MMR-Defizits; es bleibt jedoch ein indirektes Maß für die MMR-Funktion und bewertet die Reparatureffizienz nicht quantitativ.
Reporter-Plasmide mit definierten Mismatches oder Insertion-Deletion-Schleifen können ebenfalls verwendet werden, um die MMR-Effizienz durch Reporter-Gen-Assays zu bewerten. Darüber hinaus können westliche Blotting- und Immunfluoreszenz-Assays, die auf MMR-assoziierte Proteine abzielen, eine indirekte Bewertung der Signalwegaktivität ermöglichen.

5. Reparatur des Doppelstrangbruchs (DSB)

Doppelsträngbrüche (DSBs) gehören zu den zytotoxischsten Formen von DNA-Schäden. Das Versäumnis, DSBs genau zu reparieren, kann zu Mutationen, chromosomalen Deletionen, Translokationen, genomischer Instabilität und Tumorentstehung führen. Die DSB-Reparatur erfolgt hauptsächlich durch homologe Rekombination (HR) und nichthomologe Endverbindung (NHEJ), die während unterschiedlicher Phasen des^{Zellzyklus 52} bevorzugt wirken.

Methoden zur Bewertung der Effizienz der DSB-Reparatur

Gamma-H2AX-Fokussassay
Der γ-H2AX-Fokussassay ist eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur indirekten Erkennung von DSBs. Nach der DSB-Bildung wird Histon H2AX bei Ser139 schnell phosphoryliert, um γ-H2AX-Brennpunkte zu erzeugen. Die Anzahl der γ-H2AX-Foci korreliert mit dem Ausmaß der DSB-Bildung, und die Reparatureffizienz kann durch Überwachung der Geschwindigkeit des Verschwindens von Foci über die Zeit mittels Immunfluoreszenzmikroskopie abgeleitet werden.
Dieser Test bietet mehrere Vorteile, darunter hohe Sensitivität, Einzelzellauflösung und etablierte experimentelle Protokolle, was ihn zu einer zentralen Methode in der DNA-Schadensreaktionsforschung (DDR) macht.
BLESS und BLISS
BLESS (Breaks Labeling, Enrichment on Streptavidin and Sequencing) und BLISS (Breaks Labeling In Situ and Sequencing) sind genomweite DSB-Kartierungsmethoden, die auf In-situ-Labeling und Hochdurchsatzsequenzierung basieren. Beide Ansätze identifizieren DSB-Stellen durch direkte Ligierung von Sequenzierungsadaptern an gebrochene DNA-Enden, was eine präzise, genomweite Lokalisierung und Quantifizierung der DSBs ermöglicht. Diese Methoden können auch verwendet werden, um die Gesamtkinetik der DSB-Reparatur zu bewerten.
Darüber hinaus können DSB-spezifische Reporter-Gen-Assays die Effizienz der DSB-Reparatur quantitativ bewerten und HR-vermittelte Reparatur von NHEJ-vermittelter Reparatur unterscheiden (Abbildung 4). Obwohl γ-H2AX-Assays, BLESS und BLISS die globale DSB-Belastung und Reparaturkinetik effektiv messen, können sie nicht feststellen, ob die Reparatur speziell über HR- oder NHEJ-Pfade erfolgte.

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Abbildung 4: Reporter-Genanalyse zur Reparatur eines Doppelsträngbruchs (DSB). DSB-Reporterplasmide werden in Zielzellen eingebracht. Nach einer angemessenen Reparaturphase nach der Transfektion wird die Fluoreszenz des Reportergens mittels Fluoreszenzmikroskopie überwacht, um die Effizienz der DSB-Reparatur zu bewerten. DSB, Doppelstrang-Bruch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

6. Homologe Rekombinationsreparatur (HR)

Die homologe Rekombination (HR) ist ein hochpräziser DNA-Reparaturweg, der hauptsächlich während der S- und G2-Phase des Zellzyklus funktioniert, wenn ein unbeschädigtes Schwesterchromatid als Reparaturvorlage⁵³ verfügbar ist. Nach der DSB-Bildung erkennt der MRE11-RAD50-NBS1 (MRN)-Komplex DNA-Enden und initiiert die DNA-Endresektion in Zusammenarbeit mit CtIP⁵⁴. Dieser Prozess erzeugt 3′ einzelsträngige DNA-(ssDNA)-Überhänge.

Die resultierende ssDNA wird zunächst von Replikationsprotein A (RPA) beschichtet, das die DNA vor Nukleaseabbau schützt und die Bildung sekundärer Strukturen^verhindert. Anschließend vermittelt BRCA2 den Ersatz von RPA durch RAD51-Rekombinase, was zur Bildung eines RAD51-Nukleoprotein-Filaments⁵⁶ führt. Dieses Filament sucht homologe DNA-Sequenzen auf dem Schwesterchromatid und fördert die Stranginvasion in die homologe Duplex-DNA-Vorlage, wodurch eine Displacement-Loop-(D-Loop-)Struktur⁵⁷˒⁵⁸ entsteht. Die DNA-Synthese und der Strangaustausch führen dann zur vollständigen Reparatur fort.

Die HR-Effizienz kann quantitativ mit DR-GFP-Reportersystemen in Reporter-Gen-Assays bewertet werden. Alternativ kann eine indirekte Untersuchung mit Western-Blotting oder Immunfluoreszenz-Assays durchgeführt werden, die auf HR-assoziierte Proteine abzielen.

7. Nicht-homologe DNA-Endverbindung (NHEJ)

Nichthomologe Endverbindungen (NHEJ) reparieren DSBs, ohne dass eine umfangreiche Sequenzhomologie zwischen DNA-Enden⁵⁹ erforderlich ist. Stattdessen werden gebrochene DNA-Enden direkt verarbeitet und ligiert, wodurch NHEJ ein von Natur aus fehleranfälliger Reparaturweg ist. Da DNA-Enden vor der Ligation abgebaut werden können und die Enden von nicht verwandten DSBs miteinander verbunden werden, kann NHEJ zu Mutationen, Deletionen und chromosomalen Umlagerungen^führen.

Es werden drei Hauptformen der nichthomologen Reparatur erkannt: klassische NHEJ, Einstrang-Annealing (SSA) und mikrohomologievermittelte Endverbindung (MMEJ).

Klassische NHEJ
Klassisches NHEJ wirkt während des gesamten Zellzyklus. Das Ku70/Ku80-Heterodimer erkennt und bindet zuerst DSB-Enden⁶¹. Dieser Komplex rekrutiert DNA-abhängige Proteinkinase-katalytische Untereinheit (DNA-PKcs), was zur Aktivierung der Kinase-Signalübertragung und zur Initiierung von NHEJ führt. Endverarbeitende Enzyme, darunter Nukleasen und Phosphatasen, verarbeiten anschließend beschädigte DNA-Enden, bevor der XRCC4-DNA-Ligase-IV-Komplex die Ligierung von DNA-Enden⁶² vermittelt. Da die terminale Verarbeitung häufig zu Nukleotidverlust oder ungenauer Wiedervereinigung führt, gilt NHEJ als mutagener Reparaturweg⁶³˒⁶⁴.
Einsträngige Glühung (SSA)
Das Einstrang-Annealing (SSA) repariert DSBs, die zwischen wiederholten homologen Sequenzen auftreten. Nach der DSB-Bildung resektieren Nukleasen die 5′-DNA-Enden und erzeugen ausgedehnte 3′-ssDNA-Überhänge. RAD52 vermittelt das Annealing zwischen komplementären homologen Wiederholungen⁶⁵. Anschließend entfernt der XPF-ERCC1-Endonukleasekomplex ungepaarte DNA-Lappen, und der SLX1-SLX4-Komplex kann ebenfalls an der Endverarbeitung teilnehmen. Die DNA-Ligase verschließt dann die verbleibenden Lücken. Da Sequenzen zwischen homologen Wiederholungen während der Reparatur gelöscht werden, gilt SSA als schneller, aber von Natur aus mutagener Reparaturmechanismus⁶⁶.
Mikrohomologie-vermittelte Endverbindung (MMEJ)
Mikrohomologie-vermittelter Endzusammenfügung (MMEJ), auch als alternative NHEJ (Alt-NHEJ) bezeichnet, ist ein weiterer fehleranfälliger DSB-Reparaturweg⁶⁷. Im MMEJ werden kurze mikrohomologe Sequenzen in der Nähe von DNA-Bruchenden verwendet, um gebrochene DNA-Termini vor der Reparatur auszurichten. Nach der Erkennung dieser mikrohomologen Regionen werden die DNA-Enden durch einen rekombinationsähnlichen Prozess⁶⁸ verbunden. Da MMEJ auf sehr kurzen homologen Sequenzen beruht, treten während der Reparatur häufig Deletionen und genomische Umlagerungen auf.
Die Effizienz von NHEJ kann quantitativ mit EJ5-GFP-Reportersystemen in Reporter-Genanalysen bewertet werden. Alternativ kann die Reparaturaktivität indirekt durch Western Blotting und Immunfluoreszenzanalyse von NHEJ-assoziierten Proteinen bewertet werden.

8. Interstring-Crosslink-Reparatur (ICL)

Interstrang-Crosslinks (ICLs) sind hochgiftige DNA-Läsionen, die die beiden Stränge der DNA-Doppelhelix kovalent verbinden und so die DNA-Replikation und -Transkription blockieren. ICL-Reparatur ist mechanistisch komplex und umfasst hauptsächlich den Fanconi-Anämie-(FA)-Weg und den NEIL3-Weg⁶⁹.

Im FA-Weg erkennt FANCM ICL-Läsionen und fördert die Monoubiquitination des FANCI-FANCD2-Komplexes, wodurch nachgeschaltete Reparaturproteine⁷⁰ aktiviert werden. Strukturspezifische Nukleasen schneiden anschließend DNA in der Nähe der Querverbindung ein, um die beiden DNA-Stränge zu trennen, und die resultierenden DSBs werden über HR- oder NHEJ-Signalwege repariert.

Im NEIL3-Weg spaltet die DNA-Glykosylase-NEIL3-Glycosyste die mit der ICL-Läsion assoziierten glykosidischen Bindungen und erzeugt AP-Stellen, die anschließend von Transläsionssynthese-(TLS)-Polymerasen⁷¹ umgangen werden. Da ICLs die Strangtrennung verhindern, die für Replikation und Transkription erforderlich ist, sind diese Läsionen hochgradig zytotoxisch und tragen zu Alterung, Neurodegeneration und Krebs^{bei 72}˒⁷³.

Die Effizienz der ICL-Reparatur kann mittels plasmidbasierten Reparaturassays, Reporter-Gen-Assays, Reaktivierungstests von Wirtszellen und in vitro rekonstituierten Reparatursystemen bewertet werden.

9. Transläsionssynthese (TLS)

Die Transläsionssynthese (TLS) ist ein DNA-Schadenstoleranzmechanismus, der es ermöglicht, die Replikation über nicht reparierte DNA-Läsionen^{fortzusetzen 74}. TLS umfasst hauptsächlich spezialisierte DNA-Polymerasen, darunter Polymerasen κ, η, ι und ζ. Wenn die DNA-Replikation an beschädigten Stellen stagniert, umgehen TLS-Polymerasen die Läsion und ermöglichen die Fortsetzung der Replikation, wodurch die Genomstabilität⁷⁵ erhalten bleibt.

Im Gegensatz zu BER, NER, MMR, HR und NHEJ, die DNA-Läsionen direkt entfernen oder reparieren, beseitigt TLS DNA-Schäden nicht. Stattdessen umgeht es unreparierte Läsionen während der DNA-Replikation und wird daher als Schadensminderungsmechanismus und nicht als kanonischer DNA-Reparaturweg⁷⁶ klassifiziert.

TLS lässt sich in fehlerfreie und fehleranfällige Bypass-Pfade unterteilen. Fehlerfreies TLS setzt das korrekte Nukleotid gegenüber der Läsion ein, während fehleranfälliges TLS häufig falsche Nukleotide einführt und zur Mutagenese beiträgt. Fehleranfälliges TLS gilt als ein Hauptmechanismus, durch den Umweltkrebserreger genomische Mutationen induzieren. Daher könnte die Modulation fehleranfälliger TLS-Signalwege eine potenzielle Strategie zur Krebsprävention und -therapie^{darstellen 77}.

Methoden zur Bewertung der Effizienz von TLS

Isolierung von Proteinen auf entstehender DNA (iPOND)
Die Isolierung von Proteinen auf entstehender DNA (iPOND) ist eine Technik, die verwendet wird, um Proteine zu analysieren, die mit neu synthetisierter DNA an blockierten Replikationsgabeln assoziiert sind. Da die TLS-Aktivität häufig an blockierten Forks stattfindet, ermöglicht iPOND eine dynamische Analyse der Rekrutierung und Assemblierung von TLS-Polymerasen und DNA-Schadensantwort-(DDR)-Proteinen während Replikationsstress. Diese Methode kann daher verwendet werden, um TLS-Aktivitäten und replikationsgekoppelte Reparaturprozesse zu evaluieren.
Die TLS-Effizienz kann auch mit Reporter-Plasmiden bewertet werden, die TLS-spezifische DNA-Läsionen in Reporter-Gen-Assays enthalten. Darüber hinaus können westliche Blotting- und Immunfluoreszenz-Assays, die auf TLS-assoziierte Proteine abzielen, eine indirekte Bewertung der Signalwegaktivität ermöglichen.

10. Qualitätskontrolle und Reproduzierbarkeit im experimentellen Design

Biologische Replikation und technische Replikation
Eine klare Unterscheidung zwischen biologischen und technischen Replikaten ist unerlässlich, um Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit in DNA-Reparaturstudien sicherzustellen. Im Allgemeinen sollten für jedes Experiment mindestens drei unabhängige biologische Replikate enthalten sein, während die Anzahl der technischen Replikate entsprechend der Variabilität der Detektionsplattform bestimmt werden sollte.
Für Einzelzell-Assays wie den Kometen-Test und immunfluoreszenzbasierte Foci-Analysen sollten mindestens 50–100 Zellen pro biologischer Replikat analysiert werden, um den Probeproben-Bias zu minimieren. Bei Flowzytometrie-basierten Reporter-Assays, einschließlich DR-GFP- und FM-HCR-Assays, sollten pro Probe mindestens 10.000 lebende Zell-Ereignisse gesammelt werden, um die statistische Robustheit sicherzustellen.
Standardisierungsstrategie
Ein genauer quantitativer Vergleich der Reparatureffizienz zwischen verschiedenen Proben oder experimentellen Chargen erfordert strenge Normalisierungsverfahren, um systematische Variationen zu minimieren, die durch Unterschiede in Transfektionseffizienz, Zellviabilität, Probenbelastung und Instrumentenleistung entstehen. Gängige Normalisierungsstrategien umfassen die folgenden:
1. Kotransfektion von Normalisierungsplasmiden
  In HCR-Assays, reporterbasierten Reparaturassays und plasmidbasierten Reparaturassays wird eine Kotransfektion mit einem Normalisierungsplasmid empfohlen, das nicht von DNA-Schäden betroffen ist. Häufig verwendete Kontrollen sind pRL-TK, Renilla-Luciferase-Plasmide oder konstitutiv exprimierte GFP-Vektoren. Die Reparatureffizienz wird normalisiert, indem das Verhältnis zwischen dem experimentellen Reportersignal und dem Kontrollreportersignal berechnet wird.
2. Normalisierung mit Haushaltsproteinen oder totaler Proteinfärbung
  Bei Western-Blot-Analysen zur Wiederherstellungsproteinexpression oder Rest-CPD-Werten sollte die Normalisierung mit Pflegeproteinen wie GAPDH, β-Actin oder Histon H3 oder durch Totalprotein-Färbungsmethoden, einschließlich Ponceau S- oder REVERT-Färbung, durchgeführt werden.
3. Unbeschädigte Steuerungen
  In qPCR-basierten Reparaturtests sollten unbeschädigte genomische Regionen als interne Kontrollmechanismen ko-amplifiziert werden, und relative Schadensniveaus sollten mit der ΔCt-Methode berechnet werden. Ebenso sollten HCR-Assays unbeschädigte Plasmidkontrollen enthalten, die die maximale Reporterexpression repräsentieren, sodass die Reparatureffizienz relativ zu unbeschädigten Referenzplasmiden ausgedrückt werden kann.
4. Zellzahlen-Normalisierung
  Bei Durchflusszytometrie-basierten Assays, einschließlich FM-HCR- und DR-GFP-Assays, sollten gleich viele lebensfähige Zellen über Proben hinweg analysiert werden. Die Reparatureffizienz sollte anschließend als Prozentsatz positiver Zellen oder relative Veränderungen der Fluoreszenzintensität angegeben werden.
Kinetische Dimension der Reparatureffizienzmessung
DNA-Reparatur ist ein dynamischer Prozess, und Messungen, die an einem einzigen Zeitpunkt gewonnen werden, können nicht zwischen verzögerter Reparatur und vollständigem Wegmangel unterscheiden. Daher werden zeitverlaufende experimentelle Designs dringend empfohlen.
Nach der Induktion von DNA-Schäden sollten Proben zu mehreren aufeinanderfolgenden Zeitpunkten entnommen werden, wie 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden, um die Ansammlung und Beseitigung von Schadensmarkern oder Reparaturprodukten zu überwachen. Die Kinetik des Signalverschwindens liefert wichtige Informationen über die Reparaturrate, die Integrität des Pfades und die allgemeine Reparatureffizienz.
Mehrfache Hypothesentestkorrektur:
Hochdurchsatz- und multiplexierte Ansätze beinhalten häufig die gleichzeitige Analyse mehrerer Reparaturwege oder experimenteller Zustände, wodurch das Risiko von falsch-positiven Befunden durch mehrere statistische Vergleiche erhöht wird. Beispiele sind die gleichzeitige Bewertung von BER-, NER-, HR- und NHEJ-Aktivitäten mittels FM-HCR-Assays; genomweite DSB-Analyse mit BLESS oder BLISS; und qPCR-basierte Analyse der DNA-Reparaturgenexpression.
Dementsprechend sollten statistische Korrekturmethoden für das Testen mehrerer Hypothesen bereits während des experimentellen Designs vordefiniert werden. Die ausgewählten Korrekturmethoden und angepassten Signifikanzschwellenwerte sollten in den Abschnitten Materialien und Methoden sowie statistischer Analyse klar angegeben werden.

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Schlussfolgerungen

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Eine genaue Detektion und quantitative Analyse von DNA-Schadensreparaturprozessen sind unerlässlich, um die molekularen Mechanismen der DNA-Reparatur zu verstehen, die biologischen Auswirkungen von Umweltexpositionen zu bewerten und therapeutische Reaktionen zu bewerten⁷⁸. Daher hat eine tiefgehende Untersuchung der DNA-Schadensreparaturwege und der Reparatureffizienz sowohl in der Basisforschung als auch in klinischen Anwendungen^{erhebliche Bedeu...}

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Offenlegungen

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Die Autoren geben an, keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder persönlichen Beziehungen zu haben, die die in dieser Studie berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom Engineering Research Center der Provinz Jiangsu für Entwicklung und Übersetzung von Schlüsseltechnologien zur Prävention und Kontrolle chronischer Krankheiten unterstützt; das innovative Forschungsteam für Wissenschaft und Technologie der Jiangsu Higher Education Institution (2021); das Programm des Jiangsu Vocational College Engineering Technology Research Center (2023); die Naturwissenschaftliche Schlüsselstiftung der Jiangsu Higher Education Institutions of China (Zuschuss Nr. 24KJA310008); das Schlüsselprogramm des Suzhou Vocational Health College (Zuschussnummer szwzy202406); und das State Key Laboratory für Strahlenmedizin und -schutz, Soochow University (Grant Nr. GZK1202506).

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DNA Reparaturwege Genomische Stabilit t Krebstherapie Entwicklung chemotherapeutischer Arzneimittel Bewertung der funktionellen Aktivit t Validierung der Genfunktion DNA Reparaturkapazit t Zellul re Transformation

Forschungsfortschritte zu Strategien zur Effizienzbeurteilung von DNA-Schäden

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