Method Article

Ein mikrofluidisches System zur Modellierung der endothelialen Dysfunktion unter kombinierter physiologischer pulsatiler Scherspannung und oszillatorischer Hyperglykämie

DOI:

10.3791/71037

⸱

May 12th, 2026

 ,  ,  , 
1Institute of Cardio-Cerebrovascular Medicine, Central Hospital of Dalian University of Technology, 2School of Mechanical Engineering, Dalian University of Technology, 3School of Biomedical Engineering, Faculty of Medicine, Dalian University of Technology, 4Key Laboratory of Integrated Circuit and Biomedical Electronic System, Dalian University of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein mikrofluidisches System herzustellen und zu betreiben, das Endothelzellen synchronisierter oszillatorischer Hyperglykämie und pulsatiler Scherspannung aussetzt. Dieser Ansatz bietet ein physiologisch relevantes In-vitro-Modell zur Untersuchung diabetischer Endotheldysfunktion. Dieses Protokoll ermöglicht die quantitative Messung von oxidativem Stress und den Antworten von Endothelzellen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endotheliale Dysfunktion bei diabetischen Gefäßkomplikationen beinhaltet komplexe Wechselwirkungen zwischen metabolischen Störungen, insbesondere oszillatorischer Glukose (OG) und pulsatiler Scherbelastung (PSS). Obwohl diese Faktoren isoliert untersucht wurden, bleiben konventionelle Modelle auf statische Glukosewerte oder vereinfachte laminare Strömungen beschränkt und fehlen die Fähigkeit, die integrierte raumzeitliche Kopplung im diabetischen Gefäß nachzuahmen. Durch die Nutzung einer programmierbaren mikrofluidischen Plattform bietet dieses Protokoll eine wertvolle Plattform, um die integrierten Effekte synchronisierter oszillatorischer Hyperglykämie und physiologischer PSS auf Endothelzellen zu untersuchen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die endotheliale Dysfunktion unter physiologisch relevanten gekoppelten metabolischen und mechanischen Bedingungen zu modellieren. Der Einsatz eines Polydimethylsiloxan-(PDMS)-Chips in Kombination mit einem druckbetriebenen Steuersystem ermöglicht eine präzise, unabhängige Modulation von Strömungswellenformen und Glukosekonzentrationsprofilen. Die hämodynamische Fidelität des Systems wird durch Mikroteilchenbild-Velocimetrie (Micro-PIV) validiert, während die zelluläre Antwort quantitativ durch die Überwachung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)-Spiegel und Zelllebensfähigkeit charakterisiert wird. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass physiologische PSS die durch OG induzierte oxidative Schädigung effektiv abschwächt. Dieser Effekt zeigt sich durch reduzierte intrazelluläre ROS-Spiegel und verbesserte Zellviabilität unter kombinierten Stimulationsbedingungen. Je nach Forschungsfrage können Parameter wie Schubspannungsmuster, Glukoseoszillationsfrequenzen und Kanalgeometrien angepasst werden. Diese Methode dient als vielseitiges Werkzeug für mechanistische Studien mechanobiologischer Signalwege und für das Medikamentenscreening therapeutischer Interventionen bei diabetischen Gefäßerkrankungen.

Introduction

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Endotheliale Dysfunktion ist ein entscheidendes frühes Ereignis bei der Entwicklung diabetischer Gefäßkomplikationen, ausgelöst durch metabolische Störungen und abnormale hämodynamische Kräfte 1,2. Die OG-Werte werden zunehmend als starke Auslöser von oxidativem Stress und entzündlichen Signalen in Endothelzellen anerkannt, was zu Gefäßverletzungen und beeinträchtigter Homöostaseführt. Gleichzeitig ist der hämodynamische Scherstress ein wesentlicher Faktor für den endothelialen Phänotyp, wobei PSS unter physiologischen Belastungsbedingungen die Produktion von Stickstoffmonoxid, die Antioxidabwehr und den Gefäßschutzfördert 6,7,8. Daher ist das Verständnis der integrierten Effekte oszillatorischer Hyperglykämie und hämodynamischer Stimulation unerlässlich, um die Mechanismen der endothelialen Dysfunktion zu klären.

Konventionelle In-vitro-Modelle, die oft auf statischen hohen Glukosebedingungen oder vereinfachtem laminarem Fluss basieren, können das komplexe, dynamische Zusammenspiel zwischen metabolischen und mechanischen Signalen in vivo 9,10,11 nicht replizieren. Obwohl Tiermodelle systemische Aspekte von Diabetes erfassen, fehlt ihnen die zelluläre Auflösung, die erforderlich ist, um Signale unter kontrollierten Mikroumgebungsbedingungen zu analysieren12. Die mikrofluidische Technologie bietet eine effektive Alternative, indem sie eine präzise räumlich-zeitliche Steuerung biochemischer und biomechanischer Reize in physiologisch relevanten Geometrien13 ermöglicht und bedeutende jüngste Fortschritte in verschiedenen innovativen biomedizinischenAnwendungen vorangetrieben hat. Beispielsweise entwarfen Chen et al.16 ein mikrofluidisches Gerät mit räumlicher und temporaler Wandscherspannung sowie ATP-Signalgebung zur Untersuchung der intrazellulären Ca2+-Dynamik der Endohelzellen. Yu et al.11 entwickelten ein hämodynamisches mikrofluidisches Chipsystem zur Erkennung der zellulären Antworten unter verschiedenen Kombinationen physiologischer PSS und hoher Glukosekonzentration. Obwohl diese Systeme zur Untersuchung der Endothelreaktionen auf Scherstress oder Einzelfaktor-Stoffwechselstörungen verwendet wurden, haben nur wenige erfolgreich sowohl Glukoseoszillationen als auch PSS in einem einzigen System integriert. Daher fehlt ein standardisiertes, reproduzierbares Protokoll, das beide Faktoren in einem kontrollierten mikrofluidischen Setting synchronisiert.

Diese Methode schließt diese Lücke, indem ein reproduzierbares mikrofluidisches System etabliert wird, das in der Lage ist, gekoppelte OG und PSS zu liefern. Das Hauptziel dieses Ansatzes ist es, oxidativen Stress, eine beeinträchtigte Zelllebensfähigkeit und mechanobiologische Reaktionen, die der endothelialen Dysfunktion zugrunde liegen, physiologisch relevant zu modellieren. Im Gegensatz zu statischer Kultur oder herkömmlichen Perfusionskammern verbessert dieser Ansatz bestehende Modelle, indem er eine gleichzeitige und kontrollierte Modulation sowohl metabolischer als auch mechanischer Reize ermöglicht und so die diabetische Gefäßmikroumgebung näherkommt. Darüber hinaus ist das System kompatibel mit Live-Zell-Bildgebung, Echtzeitüberwachung und molekularer Analyse, was es für eine Vielzahl von Anwendungen geeignet macht, darunter mechanistische Studien, Krankheitsmodellierung und Arzneimittelscreening auf Endothelfunktion und -verletzung.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ethik-Erklärung:

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien, Geräte und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Mikrofluidische Chipfertigung

  1. Verwenden Sie computergestützte Konstruktionssoftware (CAD), um die Struktur des Mikrofluidikchips zu entwerfen (W x L x H = 2 mm x 30 mm x 0,1 mm, Abbildung 1A) und fertigen die SU-8-Masterform über eine kommerzielle Firma an.
  2. Mische PDMS-Härtemittel und Prepolymer im Verhältnis 10:1 nach Gewicht in einem sauberen Rührbecher und rühre 5 Minuten lang kräftig um.
  3. Stellen Sie den Behälter mindestens 15 Minuten in eine Vakuumkammer unter -0,08 MPa, um Luftblasen zu entfernen, die beim Mischprozess eingeschlossen wurden.
    HINWEIS: Um die Blasenentfernung zu beschleunigen und Überlauf zu verhindern, lassen Sie die Kammer vorübergehend auf atmosphärischen Druck entlüften, damit die großen Blasen platzen, und wenden Sie dann sofort das Vakuum wieder an. Wiederholen Sie diesen Entlüftungszyklus 2–3 Mal, bis das Volumengemisch vollständig transparent und frei von makroskopischen Blasen ist.
  4. Gießen Sie das PDMS auf die Wafer, die in eine Glaspetrischale gelegt wird.
  5. Degas das PDMS goss für weitere 15 Minuten in einem Desiccator auf den Wafer, um eventuelle Blasen zu entfernen, die sich beim Gießen gebildet haben könnten.
    HINWEIS: Sollten hartnäckige Mikroblasen in der Nähe oder innerhalb der SU-8-Masterformstrukturen eingeschlossen bleiben, blasen Sie sie vorsichtig bis zum Rand oder sprengen Sie sie mit einem manuellen Gummilüfter. Die vollständige Entfernung von Luftblasen ist entscheidend, um strukturelle Defekte in den Mikrokanälen zu vermeiden.
  6. Stellen Sie die Petrischale mit Schimmel und Polymer für 2 Stunden in einen heißen Ofen mit 80 °C eingestellt.
    VORSICHT: Verwenden Sie hitzebeständige Handschuhe beim Umgang mit heißen Materialien
  7. Ziehen Sie die verfestigte Polymerplatte vorsichtig mit einem Skalpell aus der Hauptform.
  8. Verwenden Sie ein Kernstanzwerkzeug (z. B. 1,2 mm Durchmesser), um Ein- und Auslassöffnungen an den vorgesehenen Kanalenden der Polymerplatte zu schaffen.
  9. Reinigen Sie den Glasdeckmantel und die gemusterte Oberfläche der Polymerplatte mit Klebeband.
    PAUSENPUNKT: Die ausgehärteten und gestanzten PDMS-Platten können mehrere Wochen bei Raumtemperatur in einem sauberen Behälter (z. B. einer versiegelten Petrischale) vor der Plasmabehandlung und Bindung aufbewahrt werden.
  10. Behandle sowohl die Polymerplatte als auch die Glasabdeckung mit einem Plasmareiniger mit 65W Leistung unter Raumluft für 60 Sekunden.
  11. Richten Sie die Polymerkanalfläche sofort auf die behandelte Seite des Glasdeckels aus.
  12. Drücken Sie sanft, um einen dauerhaften, geschlossenen mikrofluidischen Kanal zu schaffen.

2. Endothelzellpräparation und Aussaat

  1. Setzen Sie den gebundenen Mikrofluidik-Chip in eine boronisierte Glasflasche, gefüllt mit deionisiertem Wasser, und sterilisieren Sie sie durch Autoklavierung bei 121 °C und 15 psi für 20 Minuten.
    HINWEIS: Tauchen Sie den Chip während des Autoklavierens in Wasser ein, um den Druck auszugleichen und eine Verformung der PDMS-Mikrokanäle zu verhindern. Dies hilft auch, eingeschlossene Luftblasen zu entfernen und bereitet die Kanäle für die spätere Flüssigkeitseinführung vor.
    PAUSENPUNKT: Die sterilisierten mikrofluidischen Chips können sicher in der versiegelten Glasflasche bei Zimmertemperatur bis zu mehreren Wochen gelagert werden, bis sie für die Zellaussaat benötigt werden.
  2. Geben Sie den sterilisierten Chip in eine 60-mm-Kulturschale, die mit einer 1:1-Mischung aus Phosphatpuffersalzlösung (PBS) und Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) mit niedriger Glukose gefüllt ist.
  3. Führen Sie 100 μg·mL-1 Fibronektin mit einer 1-mL-Spritze in den Kanal ein und inkubieren Sie bei 37 °C für 4 Stunden.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Mikrofluidikchip unterhalb des Flüssigkeitsniveaus platziert ist. Schließen Sie den Adapterschlauch an die Spritznadel an, füllen Sie den Schlauch mit Flüssigkeit und führen Sie ihn unter den Flüssigkeitsstand ein, schließen Sie den Einlass an und injizieren Sie dann, um sicherzustellen, dass keine Blasen eindringen.
  4. Füge 24,5 mM D-Mannitol zu niedriger Glukose-DMEM (5,5 mM Glukose) hinzu, um den osmotischen Druck zu erhöhen. Füge 5 mM D-Glukose zu hochglukosehaltigem DMEM (25 mM Glukose) zu einer endgültigen 30 mM Glukose hinzu. Machen Sie ein normales Glukose-(NG)-Kulturmedium und ein hochglukosehaltiges (HG)-Kulturmedium, ergänzt mit 20 % fetalem Rinderserum (FBS) bzw. 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S).
  5. Warmes 1× PBS, Trypsin, NG und HG-Kulturmedium in einem Wasserbad bei 37 °C. Entnehmen Sie die menschlichen Nabelvenendothelzellen (HUVECs) bei 90 % Konfluenz aus der Kulturschale. Trennen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung ab und inkubieren Sie bei 37 °C 30 Sekunden. Zähle die entnommenen Zellen und passe die Konzentration auf 1 x 106 Zellen /mL im NG-Medium bzw. HG-Medium an.
  6. Injizieren Sie 100 μL der Zellsuspension mit einer 1-mL-Spritze in den Einlassport eines mikrofluidischen Chips, wobei NG-Medium für die Kontrollgruppe und HG-Medium für die Versuchsgruppe verwendet werden. Platziere mikrofluidische Chips in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2für 48 Stunden.
    HINWEIS: Lassen Sie die Zellen mindestens 4 Stunden haften, bevor Sie weiterverarbeitet werden. Wechseln Sie die beiden Kulturmedien manuell alle 2 Stunden ab, um während der statischen Kulturphase die oszillatorische Hyperglykämie zu stimulieren. Halten Sie die Zellen über Nacht bei 5,5 mM Glukose, um die In-vivo-Situation nachzuahmen (Abbildung 1B).

3. Dynamisches Stimulationssystem

  1. Füllen Sie zwei 100-ml-Reservoirs mit NG- bzw. HG-Kulturmedien und verbinden Sie sie mit den entsprechenden Kanälen des programmierbaren Druckregelungssystems.
  2. Verbinden Sie die Reservoirs, das zweipositionige Dreiweg-Magnetventil und den mikrofluidischen Chip mit Silikonrohren.
  3. Verwenden Sie 1,3 mm Durchmesser und 90° geneigte Edelstahlstecker, um die Ein- und Auslassanschlüsse des PDMS-Chips am Rohr zu befestigen.
    HINWEIS: Sterilisieren Sie die 100-ml-Reservoirs, Silikonrohre und Edelstahlverbinder vorher in einem Hochdruck- und Hochtemperaturautoklaven.
  4. Berechnen Sie die erforderliche Durchflussrate (Q), um das Ziel-PSS (τ) zu erreichen. Verwenden Sie die Formel τ = (6μQ)/(wh2), wobei μ der Viskosität w die Kanalbreite und h die Kanalhöhe ist.
  5. Setzen Sie ein physiologisches Ziel-PSS (τ = 10 ± 2 dyn·cm-2, 1 Hz), das einer berechneten Durchflussrate von 200 ± 40 μL·min-1 entspricht.
  6. Programmieren Sie die programmierbare Luftpumpe so, dass sie eine Sinuswellenfunktion erzeugt, um das PSS aufrechtzuerhalten. Programmieren Sie den Ventilregler so, dass er alle 5 Minuten die Kanäle wechselt, um während der dynamischen Stimulation eine Rechteckwellen-Glukoseoszillation zu erzeugen.
  7. Starte das programmierbare Pumpensystem, um die kombinierte OG und PSS für insgesamt 30 Minuten zu liefern.

4. Mikro-PIV zur Flussfeldverifikation

  1. Bereiten Sie die NG- und HG-Medien vor, die eine Volumenkonzentration von 0,05 % an fluoreszierenden Mikropartikeln (1 μm) enthalten. Stellen Sie sicher, dass die Partikel gleichmäßig verteilt und frei von Aggregation sind.
  2. Setzen Sie einen sauberen, zellfreien Mikrofluidikchip (identisch mit dem, der in den Zellexperimenten verwendet wurde) auf die Stufe des invertierten Fluoreszenzmikroskops.
  3. Verbinden Sie alle Komponenten im System (Abbildung 1C).
    1. Verbinde die Druckquelle mit dem Druckregler.
    2. Verbinden Sie den Druckregler mit dem Ventilregler, der mit dem Computer verbunden ist, um die Druckwellenformen automatisiert zu steuern.
    3. Verbinden Sie die Druckreglerausgänge über getrennte Rohrleitungen mit den HG- und NG-Reservoirs.
    4. Beide Reservoirs werden an das 3/2-Druckventil angeschlossen, das gemäß dem programmierten oszillatorischen Glukoseprotokoll zwischen HG- und NG-Medien wechselt.
    5. Verbinden Sie den Auslass des 3/2-Ventils mit dem Einlass des mikrofluidischen Chips über einen Schlauch.
    6. Verbinden Sie den Ausgang des Mikrofluidikchips mit dem Abfallreservoir.
    7. Platzieren Sie den Mikrofluidikchip auf der Mikroskop-Bühne für Live-Zell-Bildgebung während des gesamten Experiments.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Rohrverbindungen sicher und undicht sind, bevor Sie den Fluss einleiten.
  4. Lösen Sie die Hochgeschwindigkeitskamera (die im Doppelbildmodus mit 15 Hz arbeitet) aus, nachdem der Strom konstant ist, um sequentielle Bildpaare der fließenden Mikroteilchen aufzunehmen. Stellen Sie die genaue Zeitverzögerung (Δt) zwischen den beiden Frames jedes Paares auf 80 μs ein.
  5. Erfassen Sie Bilder für Region of Interest (ROI) innerhalb des Kanals. Wählen Sie den ROI in der Mitte des geraden Kanalabschnitts (Abbildung 2A), gleichmäßig weit vom Ein- und Auslass entfernt, um Endeffekte zu vermeiden und repräsentative Durchflussmessungen sicherzustellen.
  6. Verarbeiten Sie die aufgenommenen Bildpaare mit einer PIV-Analysesoftware. Verwenden Sie einen adaptiven Mehrfachdurchlauf-Kreuzkorrelationsalgorithmus, der mit einem anfänglichen Abfragebereich von 64 × 64 Pixel beginnt und zu einem Endbereich von 16 × 16 Pixel mit einer Rasterschrittgröße von 8 × 8 Pixeln ausbaut, um den Verschiebungsvektor (Δx) der Partikel zwischen den beiden Bildern zu bestimmen.
  7. Berechnen Sie den Geschwindigkeitsvektor (v) für jede Abfragefläche mit der Formel v = Δx / Δt.

5. Datenerfassung

HINWEIS: Quantifizieren Sie die Lebensfähigkeit und Funktion der Zellen mit dem Calcein-AM/Propidiumiodid (PI) Kit und der lebenden Zell-Fluoreszenzsonde für oxidatives Stress, um den durch Glukoseschwankungen verursachten Schaden zu überprüfen und die Wirkung der Kostimulation zu bewerten.

  1. Zelllebensfähigkeit
    1. Bereiten Sie die Calcein-AM/PI-Arbeitslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers am experimentellen Endpunkt vor.
      VORSICHT: PI ist ein bekanntes Mutagen und ein vermutetes Karziogen, das in die DNA einfließt. Behandle sie mit äußerster Vorsicht. Tragen Sie Handschuhe und Handling innerhalb eines festgelegten, sicheren Arbeitsbereichs.
    2. Den Kanal einmal mit PBS ausspülen und die Calcein-AM/PI-Arbeitslösung in den Kanal einführen. Inkubieren Sie das Gerät bei 37 °C mit 5 %CO2 für 30 Minuten im Dunkeln.
    3. Sofort werden fluoreszierende Bilder der gefärbten Zellen mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop mit einer 10×-Objektivlinse aufgenommen. Verwenden Sie den FITC (Grün) Filter für Calcein-AM und den TRITC oder Rhodamine (Rot) Filter für PI.
  2. Intrazelluläre ROS messen
    1. Bereite die lebende Zelle der Oxidations-Stress-Fluoreszenz-Sonde (siehe Materialtabelle) bei der vom Hersteller angegebenen Konzentration (5 μM) in PBS vor.
      VORSICHT: Fluoreszierende Sonden und ihre gängigen Lösungsmittel (wie DMSO) können giftig sein und die Aufnahme gefährlicher Stoffe über die Haut erleichtern. Tragen Sie Handschuhe und Handling innerhalb eines festgelegten, sicheren Arbeitsbereichs.
    2. Spülen Sie den Kanal dreimal mit PBS und führen Sie die Live-Zell-Lösung der oxidativen Stress-Fluoreszenzsonde in den Kanal ein. Inkubiere den Chip bei 37 °C mit 5 % CO2 für 30 Minuten im Dunkeln.
    3. Spülen Sie den Kanal dreimal mit PBS, um die ungebundene Sonde zu entfernen. Nehmen Sie sofort fluoreszierende Bilder mit dem Far-Red-Filtersatz (Anregung 640 nm, Emission 665 nm) durch ein 20×-Objektiv auf, wobei die exakt gleichen Belichtungsparameter für alle Gruppen beibehalten werden.
      HINWEIS: Eine erhöhte Fluoreszenzintensität deutet auf höhere ROS-Werte hin.

6. Datenanalyse

PAUSENPUNKT: Sobald alle rohen fluoreszierenden Bilder und Hochgeschwindigkeitskameraaufnahmen aufgenommen und sicher auf einer Festplatte gespeichert sind, können die anschließende Bildverarbeitung, quantitative Analyse und statistische Vergleiche jederzeit pausiert und durchgeführt werden.

  1. Zellviabilität quantifizieren
    1. Öffnen Sie die aufgenommenen Calcein-AM (grün) und PI (rot) Bilder in ImageJ (siehe Materialtabelle). Stellen Sie den Schwellenwert für jeden Kanal manuell an, um fluoreszierende Signale vom Hintergrund zu unterscheiden. Verwenden Sie die Zellzählerfunktion, um fluoreszierende Zellen zu zählen, die minimale Zellgröße entsprechend der beobachteten Zellgröße anzupassen und die Anzahl der lebenden (Nlebenden) und toten (Ntoten) Zellen in mehreren Sichtfeldern zu zählen.
      HINWEIS: NLive bezeichnet die Anzahl der Calcein-AM-positiven (grünen) Zellen, NDead die Anzahl der PI-positiven (roten) Zellen.
    2. Berechnen Sie den Prozentsatz der lebenden Zellen (NLive / (NLive + NTote) x 100 %) für jede experimentelle Bedingung mit Tabellenkalkulationssoftware. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung über mehrere Sichtfelder hinweg mit statistischer Analysesoftware zum Vergleich zwischen den Gruppen.
  2. Quantifizieren Sie intrazelluläres ROS
    1. Ziehen Sie das gewünschte Bild in ImageJ. Stellen Sie die Skala ein, indem Sie die Pixelgröße anhand der Metadaten des Mikroskops (oder eines bekannten Referenzrasters) kalibrieren: Analysieren | Setze die Skala.
    2. Entfernen Sie ein unspezifisches, einheitliches Hintergrundsignal aus dem gesamten Bild mit der Hintergrundsubtraktionsfunktion: Prozess | Hintergrund abziehen.
    3. Manuell den Schwellenschieber anpassen, um das intrazelluläre ROS-Signal zu segmentieren und zu definieren: Bild | Anpassen | Schwelle. Sobald die Schwelle gesetzt ist, verwenden Sie Analyze | Stellen Sie Maße ein , um den Flächen- und Mittelwert-Grauwert zu wählen. Stellen Sie die minimale Zellgröße entsprechend der beobachteten Zellgröße ein und messen Sie die mittlere Intensität des segmentierten Signals innerhalb der Zellmonoschicht-ROI: Analysieren | Analysiere Teilchen.
    4. Berichte das ROS-Level für jede experimentelle Bedingung als Mittelwert der gemessenen Werte (z. B. mittlere Intensität), die aus mindestens drei zufällig ausgewählten Sichtfeldern pro Chip abgeleitet sind.
  3. Durchführung statistischer Vergleiche
    1. Geben Sie die quantitativen Ergebnisse (Viabilitätsprozentsatz und ROS-Mittelintensität) in Datenanalyse- und Grafiksoftware ein (siehe Materialtabelle).
    2. Bestimmen Sie die statistische Signifikans, indem Sie die experimentellen Gruppen mit der Kontrollgruppe mittels einer zweiseitigen Varianzanalyse (ANOVA) vergleichen, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test mit einem Signifikanzniveau von p = 0,05. Verwenden Sie die Software, um die Analyse durchzuführen und Diagramme mit Fehlerbalken zu erstellen, die die Standardabweichung (SD) darstellen.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikro-PIV-Validierung des Strömungsfeldes im mikrofluidischen Kanal
Abbildung 1D gibt einen Überblick über die mikrofluidische Plattform, die zur Untersuchung endothelialer Antworten auf gekoppelte metabolische und mechanische Stimulation verwendet wird. Das System integriert einen Geradekanal-PDMS-Mikrofluidikchip mit einem druckgesteuerten Durchflusskontrollmodul, das die Anwendung von OG-Bedingungen zusammen mit physiologischem PSS er...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das hier beschriebene mikrofluidische System bietet eine robuste und physiologisch relevante Plattform, um die integrierten Effekte von OG und PSS auf die Funktion der Endothelzellen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt in ihrer Fähigkeit, mechanische und biochemische Reize innerhalb einer definierten Mikroumgebung präzise zu steuern und zu entkoppeln. Im Gegensatz zu herkömmlichen statischen Kulturen, die keine hämodynamischen Kräfte besitzen, oder Tiermodellen, die

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung Chinas (Fördermittelnummern 12372304, 12172081) und den Grundlagenforschungsfonds für die Zentraluniversitäten (DUT25YG272) unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% Trypsin-EDTANEST Biotechnology Co., Ltd.211052Zelldissoziation
1 mL SpritzeShanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.1mLFlüssigkeit injizieren
60 mm KulturschaleNEST Biotechnology Co., Ltd.705001Zellkultur
90° gewinkelter EdelstahlverbinderLuoyang Mayer Trading Co.,Ltd.1,3 mmAdapter-Dichtungsvorrichtung
AutoCAD-SoftwareAutodeskRRID:SCR_014981Computergestütztes Design-Software
Borisiertes GlasgefäßHunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.Doppelter Durchgang 100mLReservoir
Calcein-AM/PI KitBeyotimebyt-c2015Färbung
ZellinkubatorESCOEsco CelMateZellkultur
CellROX Deep RedInvitrogenC10422Färbung
D-GlukoseSigma Aldrich47249Glukose
D-MannitolMacklinM813423Osmotischen Druck ausgleichen
DynamicStudioDantec DynamicsV8.6PIV-Analysesoftware
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco14190-094Medium
FibronektinSigma AldrichF-2006Zelladhäsion
Fluoreszierende MikropartikelThermo ScientificG0100Mikro-PIV
GlasobjektträgerCitotest Scientific Co.,Ltd.#1Mikrofluidischer Chip
High glucose DMEMSolarbio12100Medium
HochgeschwindigkeitskameraDantec DynamicsFlowSense EOMikro-PIV
ImageJNIHRRID:SCR_003070Bildverarbeitungssoftware
Invertierter FluoreszenzmikroskopOlympusIX73Zelllebensfähigkeit
Invertierter FluoreszenzmikroskopOlympusIX83Beobachtung und Erfassung
Low glucose DMEMSolarbio31600Medium
OriginOriginLabRRID:SCR_014212Datenanalyse- und Grafiksoftware
PDMSDow lnc.184Mikrofluidischer Chip
Penicillin/Streptomycin (P/S)NEST Biotechnology Co., Ltd.211092Medium
Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)NEST Biotechnology Co., Ltd.211031Zellkultur
PlasmareinigerJiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.PC-6DMikrofluidischer Chip
Programmierbares DruckkontrollsystemElvesysOB1 MK4Strömungsregelung
SilikonschlauchNanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.964101mm*3mm
SU-8 MasterformBoao Biology Group Co. Ltd.N/AMikrofluidischer Chip
VentilsteuerungElvesysMUX Wire V3Strömungsregelung

References

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