Ein mikrofluidisches System zur Modellierung der endothelialen Dysfunktion unter kombinierter physiologischer pulsatiler Scherspannung und oszillatorischer Hyperglykämie

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein mikrofluidisches System herzustellen und zu betreiben, das Endothelzellen synchronisierter oszillatorischer Hyperglykämie und pulsatiler Scherspannung aussetzt. Dieser Ansatz bietet ein physiologisch relevantes In-vitro-Modell zur Untersuchung diabetischer Endotheldysfunktion. Dieses Protokoll ermöglicht die quantitative Messung von oxidativem Stress und den Antworten von Endothelzellen.

Abstract

Endotheliale Dysfunktion bei diabetischen Gefäßkomplikationen beinhaltet komplexe Wechselwirkungen zwischen metabolischen Störungen, insbesondere oszillatorischer Glukose (OG) und pulsatiler Scherbelastung (PSS). Obwohl diese Faktoren isoliert untersucht wurden, bleiben konventionelle Modelle auf statische Glukosewerte oder vereinfachte laminare Strömungen beschränkt und fehlen die Fähigkeit, die integrierte raumzeitliche Kopplung im diabetischen Gefäß nachzuahmen. Durch die Nutzung einer programmierbaren mikrofluidischen Plattform bietet dieses Protokoll eine wertvolle Plattform, um die integrierten Effekte synchronisierter oszillatorischer Hyperglykämie und physiologischer PSS auf Endothelzellen zu untersuchen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die endotheliale Dysfunktion unter physiologisch relevanten gekoppelten metabolischen und mechanischen Bedingungen zu modellieren. Der Einsatz eines Polydimethylsiloxan-(PDMS)-Chips in Kombination mit einem druckbetriebenen Steuersystem ermöglicht eine präzise, unabhängige Modulation von Strömungswellenformen und Glukosekonzentrationsprofilen. Die hämodynamische Fidelität des Systems wird durch Mikroteilchenbild-Velocimetrie (Micro-PIV) validiert, während die zelluläre Antwort quantitativ durch die Überwachung intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)-Spiegel und Zelllebensfähigkeit charakterisiert wird. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass physiologische PSS die durch OG induzierte oxidative Schädigung effektiv abschwächt. Dieser Effekt zeigt sich durch reduzierte intrazelluläre ROS-Spiegel und verbesserte Zellviabilität unter kombinierten Stimulationsbedingungen. Je nach Forschungsfrage können Parameter wie Schubspannungsmuster, Glukoseoszillationsfrequenzen und Kanalgeometrien angepasst werden. Diese Methode dient als vielseitiges Werkzeug für mechanistische Studien mechanobiologischer Signalwege und für das Medikamentenscreening therapeutischer Interventionen bei diabetischen Gefäßerkrankungen.

Introduction

Endotheliale Dysfunktion ist ein entscheidendes frühes Ereignis bei der Entwicklung diabetischer Gefäßkomplikationen, ausgelöst durch metabolische Störungen und abnormale hämodynamische Kräfte ^1,2. Die OG-Werte werden zunehmend als starke Auslöser von oxidativem Stress und entzündlichen Signalen in Endothelzellen anerkannt, was zu Gefäßverletzungen und beeinträchtigter Homöostase^führt. Gleichzeitig ist der hämodynamische Scherstress ein wesentlicher Faktor für den endothelialen Phänot....

Protocol

Ethik-Erklärung:

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien, Geräte und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Mikrofluidische Chipfertigung

1. Verwenden Sie computergestützte Konstruktionssoftware (CAD), um die Struktur des Mikrofluidikchips zu entwerfen (W x L x H = 2 mm x 30 mm x 0,1 mm, Abbildung 1A) und fertigen die SU-8-Masterform über eine kommerzielle Firma an.
2. Mische PDMS-Härtemittel und Prepolymer im Verhältnis 10:1 nach Gewicht in einem sauberen Rührbecher und ....

Results

Mikro-PIV-Validierung des Strömungsfeldes im mikrofluidischen Kanal
Abbildung 1D gibt einen Überblick über die mikrofluidische Plattform, die zur Untersuchung endothelialer Antworten auf gekoppelte metabolische und mechanische Stimulation verwendet wird. Das System integriert einen Geradekanal-PDMS-Mikrofluidikchip mit einem druckgesteuerten Durchflusskontrollmodul, das die Anwendung von OG-Bedingungen zusammen mit physiologischem PSS er.......

Discussion

Das hier beschriebene mikrofluidische System bietet eine robuste und physiologisch relevante Plattform, um die integrierten Effekte von OG und PSS auf die Funktion der Endothelzellen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt in ihrer Fähigkeit, mechanische und biochemische Reize innerhalb einer definierten Mikroumgebung präzise zu steuern und zu entkoppeln. Im Gegensatz zu herkömmlichen statischen Kulturen, die keine hämodynamischen Kräfte besitzen, oder Tiermodellen, die

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % Trypsin-EDTA	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211052	Zelldissoziation
1-mL-Spritze	Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.	1 ml	Flüssigkeit einspritzen
60 mm Kulturschale	NEST Biotechnology Co., Ltd.	705001	Zellkultur
90 Grad; schräger Edelstahlverbinder	Luoyang Mayer Trading Co., Ltd.	1,3 mm	Adapterdichtungsvorrichtung
AutoCAD-Software	Autodesk	RRID:SCR_014981	Computergestützte Entwurfssoftware
Boronisierte Glasflasche	Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.	Doppelpass 100 mL	Stausee
Calcein-AM/PI-Kit	Beyotime	BYT-c2015	Flecken
Zellinkubator	ESCO	Esco CelMate	Zellkultur
CellROX Deep Red	Invitrogen	C10422	Flecken
D-Glukose	Sigma Aldrich	47249	Glukose
D-Mannitol	Macklin	M813423	Gleichgewicht des osmotischen Drucks
DynamicStudio	Dantec-Dynamik	V8.6	PIV-Analyse-Software
Fetales Rinderserum (FBS)	Gibco	14190-094	Medium
Fibronectin	Sigma Aldrich	F-2006	Zelladhäsion
Fluoreszierende Mikropartikel	Thermowissenschaftlich	G0100	Mikro-PIV
Glasabdeckfolie	Citotest Scientific Co., Ltd.	#1	Mikrofluidischer Chip
DMEM mit hohem Blutzucker	Solarbio	12100	Medium
Hochgeschwindigkeitskamera	Dantec-Dynamik	FlowSense EO	Mikro-PIV
ImageJ	NIH	RRID:SCR_003070	Bildverarbeitungssoftware
Invertiertes Fluoreszenzmikroskop	Olympus	IX73	Zelllebensfähigkeit
Invertiertes Fluoreszenzmikroskop	Olympus	IX83	Beobachtung und Erwerb
Niedrige Glukose-DMEM	Solarbio	31600	Medium
Ursprung	OriginLab	RRID:SCR_014212	Datenanalyse- und Grafiksoftware
PDMS	Dow Inc.	184	Mikrofluidischer Chip
Penicillin/Streptomycin (P/S)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211092	Medium
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211031	Zellkultur
Plasmareiniger	Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.	PC-6D	Mikrofluidischer Chip
Programmierbares Druckregelungssystem	Elvesys	OB1 MK4	Durchflussregelung
Silikonröhre	Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.	96410	1mm*3mm
SU-8 Masterform	Boao Biology Group Co. Ltd.	N/A	Mikrofluidischer Chip
Ventilsteuerung	Elvesys	MUX Wire V3	Durchflussregelung