Ein Bandmontageprotokoll für hochauflösende Z-Stack-Bildgebung von Drosophila-Compoundaugen

Summary

Das Hauptziel dieses Protokolls ist es, zerstörungsfreie Bildgebung und quantitative Analyse von Drosophila-Compound-Augen zu ermöglichen. Es kombiniert eine Bandmontage-Strategie mit stereomikroskopischer Z-Stack-Aufnahme und Extended Depth of Focus Rekonstruktion, um hochauflösende, artefakfreie Bilder zu erzeugen.

Abstract

Hier präsentieren wir ein zerstörungsfreies Montage- und Bildgebungsprotokoll für die hochauflösende phänotypische Analyse des Drosophila-Verbindungsauges. Die genaue Phänotypisierung des Drosophila-Compound-Auges ist oft durch seine konvexe Geometrie und mechanische Zerbrechlichkeit während der Handhabung begrenzt. Um dies zu adressieren, stellen wir einen vielseitigen, nicht-invasiven Bildablauf vor, der eine hochauflösende Visualisierung aus mehreren Perspektiven ermöglicht. Das Protokoll verwendet eine maßgeschneiderte Klebebefestigungsmethode auf einer umgekehrten Tape-Plattform, die Fliegen am Körper und an den Flügeln sichert, während der Kopf vollständig unberührt bleibt. Entscheidend ist, dass diese flexible Konfiguration unterschiedliche Montageorientierungen unterstützt: eine seitliche Position, um die volle Konvexität einzelner Augen einzufangen, und eine frontale Position zur Beurteilung der Ganzkopfsymmetrie. Diese Methode erleichtert auch die Anordnung von hochdichten Arrays, was eine schnelle Verarbeitung von 20–30 Samples pro Sitzung ermöglicht. Durch die Integration von reflektiertem Licht-Stereomikroskopie mit Z-Stack-Erfassung und Extended Depth of Focus (EDF)-Rekonstruktion erzeugt der Workflow einheitlich scharfe, quasi-3D-Composite-Bilder. Dieser Ansatz bewahrt die natürliche Pigmentierung und erzeugt hochauflösende, kontrastreiche Bilder, die sich für quantitative organbezogene phänotypische Analysen eignen.

Introduction

Das Drosophila melanogaster Compound-Auge ist ein klassisches und leistungsstarkes Modell zur Untersuchung des Organwachstums, der Musterung und der Robustheit während der Entwicklung. Das Fliegenauge besteht aus etwa 800 hochgeordneten Ommatidien und liefert eine sensible und quantifizierbare Anzeige genetischer Störungen, die Proliferation, Differenzierung und Gewebeorganisation^{beeinflussen 1,2,3}. Die genetische Manipulation der Augenentwicklung hat historisch grundlegende Erkenntnisse über konservierte Signalwege geliefert. Bahnbr....

Protocol

1. Probenentnahme und Synchronisation

HINWEIS: Um die experimentelle Vergleichbarkeit zu gewährleisten, ist eine strenge Kontrolle der Eklusionszeit erforderlich. Unter Standardkulturbedingungen bei 25 °C erfolgt die Eklusion typischerweise 10 bis 12 Tage nach der Eiablage. Die Puppen sollten in diesem Zeitfenster genau überwacht werden, da die Verdunkelung des Puppengehäuses auf eine bevorstehende Schließung hinweist.

1. Direktes Tapping-Verfahren (Standardmethode)
   1. Klopfen Sie vorsichtig auf das Standard-24 x 95 mm Drosophila-Kulturfläschchen aus Kunststoff (mit....

Results

Die vollständige experimentelle Pipeline, von der Probenentnahme bis zur Bildaufnahme, ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Die Effizienz des modifizierten Protokolls wird durch die Erstellung von Hochdichte-Probenarrays demonstriert. Wie in Abbildung 2A gezeigt, können 20–30 anästhesierte Fliegen in einem gitterartigen Muster auf einer einzigen invertierten Bandplattform angeordnet werden. Orientierungsmarker, die an den nicht k.......

Discussion

Das Drosophila-Compound-Auge dient als leistungsstarker phänotypischer Indikator für das genetische Screening, bei dem beobachtbare Veränderungen in Augengröße, Rauheit oder Pigmentierung ^2,3,8 oft auf Störungen fundamentaler Signalwege wie Hippo ^5,6 oder Hedgehog⁷ hinweisen. Die Effizienz solcher Bildsch.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kohlendioxid-Gaszylinder (CO2)	Lokaler Lieferant	N/A
CO2 Anästhesie-Blasrohr	T& L	DG-08
Digitale Mikroskopkamera	Leica	DMC6200
Feine Pinzette	VETUS	MOS-167B
Schaumstoffplugs	Dongpeng	N/A
Bildaufnahmesoftware (LAS X)	Leica	3.7.1
Bildverarbeitungssoftware (FIJI/ImageJ)	NIH	Open Source
LED-Kuppelbeleuchtung	Leica	LED5000 HDI
LED-Schwanenhals-Beleuchtung	Cossim	LG-10
Motorisiertes Stereomikroskop	Leica	M205 FCA
Objektivlinse	Leica	1.0x PlanApo NA0.2
Druckpneumatisches Fußpedalventil	DELIXI	FV-320
Standardphiolen der Drosophila-Kultur	LAIBOER	2424951
Standard-Drosophila-Futtermedium	N/A	Maismehl-Agar-Melasse
Standard-Glasmikroskop-Objektträger	Citotest	10127101P-G
Standard-Stereomikroskop	Nikon	SMZ745
Weißes Papier-Maskierband	UBWIN	25 mm Breite