räumlich aufgelöste, integrierte einzelzellige multiomische Profilierung des Transkriptoms und epigenomischen Zielen in gefrorenen Gewebeschnitten

Summary

Diese Studie präsentiert ein räumliches Trekker–CUT&Tag-Multiom-Protokoll, das direkte räumliche Barcodierung eines Gewebeschnitts mit einer Einzelzell-Multiomanalyse kombiniert. Dieser Ansatz ermöglicht räumlich aufgelöste Einzelzellprofilierung der Genexpression und der Histon-H3K27ac-Modifikation gleichzeitig und bietet mechanistische Einblicke in die Genregulation im Kontext der Gewebemikroanatomie.

Abstract

Räumliche multiomische Technologien in Kombination mit Einzelzellprofilierung bieten beispiellose Möglichkeiten, die molekulare und zelluläre Architektur komplexer Gewebe zu erläutern. Die Kombination des räumlichen Barcodings von Kernen in einzelnen Kryosektionen, die aus Gewebeblöcken im optimalen Schneidetemperatur-(OCT)-Gefriermedium hergestellt werden, mit einzelzelligen multiomischen Assays zu einem einfachen und effizienten Arbeitsablauf kann die Annotation und räumlich aufgelöste molekulare Analyse von Zellen in Gewebetypen erleichtern. Diese Studie berichtet über einen räumlichen Spaltungsansatz unter Targets & Tagmentation (CUT&Tag)-Multiomen, der gleichzeitig Histon-H3K27ac-Modifikation und Genexpression in einem einzigen eingefrorenen Gehirnabschnitt profiliert. Nach räumlichem Barcoding werden einzelne Kerne isoliert und dem CUT&Tag unterzogen, kombinierter Erfassung von tagmentierten DNAs, RNAs und räumlichen Barcodes, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung. Der Workflow erzeugt räumlich annotierte epigenomische und transkriptomische Profile aus denselben Kernen, wodurch die Zuordnung der multiomischen Informationen zu anatomischen Koordinaten ermöglicht wird. Die Integration epigenomischer Informationen mit räumlichen transkriptomischen Daten erhöht die Genauigkeit der Zelltypidentifikation und offenbart räumlich organisierte Regulationsprogramme sowie Zell-Zell-Interaktionen in intakten Geweben.

Introduction

Die räumliche Biologie ist ein sich schnell entwickelndes Fachgebiet, das den Standort, die Organisation und die Interaktionen von Molekülen, Zellen und Geweben in ihren natürlichen Umgebungen kartiert ^1,2,3. Im Gegensatz zu Bulk- oder herkömmlichen Einzelzellmethoden, die eine Gewebedissoziation erfordern und zu einem Verlust von Positionsinformationen führen, bewahren räumliche Ansätze die physikalischen Koordinaten von Analyten oder Zellen/Kerne und ermöglichen so eine direkte Untersuchung davon, wie die Gewebearchitektur die zelluläre Identität, interzelluläre Kommunikation und biologische Funktion beeinflusst 4,5,6,7 . Während räumliche Transkriptomik und räumliche Proteomik derzeit die am weitesten verbreiteten Modalitäten sind, erweitert sich das Fachgebiet rasant hin zu räumlichem multi-omischen Profiling ^3,8,9. Das Co-Profiling von Genexpression und epigenomischen Zuständen innerhalb desselben Gewebes ist besonders wirkungsvoll, da es die transkriptionelle Ausgabe direkt mit regulatorischen Mechanismen – wie der Zugänglichkeit von Chromatinen und Histonmodifikationen – verknüpft, die die Genaktivität steuern und bekannt sind, dass sie sich zwischen räumlichen Domänen^{unterscheiden} 10,11,12 . Daher werden integrierte räumliche Epigenom- und Transkriptomanalysen entscheidende Einblicke liefern, wie regulatorische Programme die zelluläre Identität und Gewebeorganisation prägen.

Mehrere räumliche multiomische Strategien wurden entwickelt, um gleichzeitiges epigenomisches und transkriptomisches Profiling zu ermöglichen. Deterministische Barcodierung in der Gewebesequenzierung (DBiT-seq) verwendet mikrofluidische Kanäle, um räumliche Barcodes direkt oder indirekt per Stempel mit Gelplatten an Gewebeschnitte zu liefern, was die räumliche Annotation von Analyten ermöglicht. Dieser Ansatz erleichtert räumlich aufgelöste Koprofilierung epigenomischer und transkriptomischer Merkmale 12,13,14,15. Die Slide-Tag-Methode, die als Takara Trekker-Plattform kommerzialisiert wird, führt räumliche Barcodes direkt in intaktes Gewebe vor der Dissoziation ein, wodurch räumlich indexierte Kerne mit Standard-Einzelzell-Workflows verarbeitet und rechnerisch auf ihre ursprünglichen Gewebekoordinaten¹⁶ projiziert werden können. Im Gegensatz dazu verwendet der räumliche Test für zugängliches Chromatin, Zelllinien und Genexpression mit Sequenzierung (SPACE-seq) eine Target-Out-Strategie, bei der poly(A)-schwanzige epigenetische Ziele und mRNAs auf einer Poly-dT-Erfassungssequenz in räumlichen Transkriptomik-Kacheln¹⁷ eingefangen werden.

Cleavage under targets & tagmentation (CUT&Tag) ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Kartierung von Interaktionen zwischen DNA und Histon- oder Nicht-Histonproteinen aus extrem niedrigen Inputproben¹⁸. CUT&Tag basiert auf Tn5-Transposase-vermittelter Chromatinfragmentierung und DNA-Tagging (Tagmentation) und verwendet antikörpergeführtes, protein-A-konjugiertes Tn5 für locusspezifische Spaltung und molekulare Markierung. Während der herkömmliche CUT&Tag-Assay mehrere Inkubations- und Waschschritte umfasst, wurde ein vereinfachter und optimierter CUT&Tag-Workflow eingesetzt, um die CUT&Tag-Effizienz in nachgelagerten Einzelzell-Multiom-Anwendungen zu steigern¹⁹.

Abbildung 1: Überblick über Arbeitsablauf und Qualitätskontrolle des räumlichen Trekker–CUT&Tag-Multiom-Assays. (A) Schaltplan des räumlichen Trekker–CUT&Tag-Multiom-Workflows. Ein koronaler Abschnitt aus frisch gefrorenem Mäusehirngewebe wird auf eine Trekker-Raumkachel montiert und einem räumlichen Barcodierung unterzogen. Nach der Gewebelyse werden die Kerne isoliert und hinsichtlich Ausbeute und Qualität bewertet. Für H3K27ac CUT&Tag werden etwa 50.000 Kerne verwendet, und tagmentierte Kerne werden nach dem Zählen mit 10x Genomics Chromium Multiome Gelperlen einer Einzelzell-Barcodierung unterzogen. Die einzelzellige Barcode-DNA wird voramplifiziert und in zwei Fraktionen unterteilt. Die indexierte CUT&Tag-Bibliothek wird direkt vom Index PCR generiert. Für Genexpressions- und räumliche Barcodebibliotheken wird voramplifizierte DNA weiter amplifiziert und nach der Größe ausgewählt. Fragmente, die typischen cDNA-Größen entsprechen, werden zur Herstellung von Genexpressionsbibliotheken verwendet, während kürzere DNA-Fragmente zur Erzeugung der räumlichen Barcode-Bibliothek verwendet werden. Die Bibliotheken werden sequenziert und kartiert gemäß den Richtlinien von 10x Genomics und Curio Trekker. Der erwartete experimentelle Zeitplan ist links angegeben. (B) Wichtige Qualitätskontrollpunkte (QC) und kritische Überlegungen während des gesamten Arbeitsablaufs. Die Nuclei QC umfasst die Bewertung von Ertrag, Intaktität, Aggregation und Ablagerungsgehalt. Die Vorsequenzierung der QC umfasst die Bewertung der DNA-Größenverteilungen und der Primer-Dimerkontamination für alle Bibliotheken. Die Spezifität der CUT&Tag-Bibliothek wird durch quantitative PCR (qPCR) bewertet, die die Anreicherung der Zielgenomregionen über den Hintergrund misst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diese Studie präsentiert einen räumlichen Trekker CUT&Tag-Multiom-Assay, der gleichzeitig Histon-H3K27ac-Modifikation im Zusammenhang mit aktiven cis-regulatorischen Elementen und Genexpression in frisch gefrorenen Gewebeschnitten analysiert. Dieses Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Verfahren für Takara Trekker räumliches Barcoding, Gewebedissoziation und Kernisolierung, Kernzählung und Qualitätskontrolle, Low-Input CUT&Tag-Profilierung der H3K27ac-Modifikation, Erfassung molekularer Ziele auf 10x Genomics Einzelzell-Multiom-Gelperlen sowie Bibliotheksvorbereitung. Der Arbeitsablauf wurde anhand eines koronalen Schnitts des Maushirngewebes demonstriert. Im Gegensatz zum standardmäßigen 10x Genomics Multiome-Workflow, bei dem die Chromatin-Zugänglichkeit durch einen Assay für transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (ATAC-seq) gemessen wird, ersetzt dieses Protokoll CUT&Tag-abgeleitete DNA-Fragmente durch ATAC-Fragmente, was eine direkte Abfrage von Histonmodifikationslandschaften bei Einzelzellauflösung ermöglicht. Um Trekker-räumliche Barcodes mit 10x Genomics-Einzelzell-Barcodes zu verknüpfen, werden poly(A)-tailige räumliche Barcodes und mRNA-Transkripte von den Poly-dT-Sequenzen der Multiom-Gelperlen erfasst, während CUT&Tag-DNA-Fragmente von den Spacer-Sequenzen erfasst werden. Diese Dual-Capture-Strategie ermöglicht die gleichzeitige Rückgewinnung epigenomischer, transkriptomischer und räumlicher Informationen aus denselben einzelnen Kernen. Soweit wir wissen, ist dies der erste räumliche multiomische Workflow, der direkt die Barcode-in-Trekker-räumliche Annotation mit einem Einzelzell-Multiom-Assay integriert, um die genomweite Verteilung eines Histonmarks und das Transkriptom gemeinsam zu profilieren. Die resultierenden räumlich aufgelösten Multiomlandschaften, die H3K27ac-Besetzungs- und Genexpressionsdaten integrieren, ermöglichen die Projektion einzelner Zellprofile zurück zu ihren ursprünglichen Gewebekoordinaten und stellen eine direkte Verbindung zwischen epigenomischen Regulationsmechanismen und Transkriptionsprogrammen in Bezug auf die intakte Gewebearchitektur her.

Protocol

Erwachsene Mäuse wurden vor der Gewebeentnahme durch_{CO-2-Inhalation} (IACUC #: A48315-15-R24) eingeschläfert. Die Gehirne wurden nach der sagittalen Kraniotomie und der Entfernung der halbierten Calvaria vollständig entfernt. Die Reagenzien und die verwendeten Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Montage eines Gewebeabschnitts auf der Trekker-Barcode-Kachel zur räumlichen Barcode-Kodierung

1. Bereiten Sie Folgendes vor, bevor Sie beginnen.
   1. Gleichen Sie den optimalen Schnitttemperatur-(OCT)-eingebetteten Gewebeblock in einem Kryostat vor dem Schnitt aus. Bereiten Sie die Puffer für UV-Spaltung, Gewebedissoziation und Kernisolierung vor.
      HINWEIS: Die optimale Temperatur für das Schneiden kann je nach Gewebetyp variieren.
   2. Zur Kernisolierung wird die Zentrifuge mit Schwenkeimern für 1,5-mL-Röhren auf 4 °C vorgekühlt. Kühlen Sie eine 12-Well-Platte mit einem Trekker O-Ring auf Eis vor.
   3. Stelle das UV-Messgerät auf die maximale Strombegrenzung (1,2 A) und maximale Leistung ein.
2. Notieren Sie die räumliche Barcode-Kachel-ID (z. B. U0001_001) der zu verwendenden Trekker-Kachel.
   HINWEIS: Jede Trekker-Kachel enthält eindeutige Barcode-Koordinaten. Die Kachel-ID ist erforderlich, um die korrekte Datei für die räumliche Barcode-Abbildung der Sequenzierungsdaten abzurufen.
3. Schneiden Sie das Gewebe ab. Eine koronale Schnittung mit einer Dicke von 25 μm an der ungefähren Position von Bregma -1 mm wurde bei −18 °C durchgeführt (Abbildung 1A).
   HINWEIS: Die Dicke kann bei der Arbeit mit Geweben niedriger Zellularität auf 30 μm erhöht werden.
4. Positionieren Sie den Abschnitt (oder das Interessensbereich) auf der räumlichen Fliese und schmelzen Sie sie, indem Sie vorsichtig einen Finger auf den Boden des Glasscheibes legen.
   VORSICHT: Falls nötig, überprüfen Sie die Verfahren anhand der Qualitätskontrollmessungen der Kerne mit der Trekker-Trainingskachel.
5. Entfernen Sie die Fliese mit einer Pinzette vom klaren Kleber und legen Sie sie in einen Schacht einer 12-Loch-Gewebekulturplatte auf Eis auf dem Trekker O-Ring. Pipettieren Sie sofort 30 μL Trekker UV-Spaltpuffer auf die Fliese und achten Sie darauf, dass das gesamte Gewebe mit Puffer bedeckt ist.
6. Platziere die UV-Lampe (1,2 A-Einstellung) direkt über dem Brunnen auf die Platte. 1 Minute lang beleuchten, um die Barcodes zu lösen, während alles auf Eis bleibt.
   VORSICHT: Tragen Sie beim Arbeiten mit der UV-Lampe eine schützende UV-Brille.
7. Schalte die UV-Lampe aus und brüte die Fliese 7,5 Minuten lang auf Eis. Während der Inkubation nehmen Sie eine Trekker 10 x 10 Waschkammer heraus und füllen Sie die Kammern 1 und 2 mit 400 μL kaltem Trekker Nuclei-Waschpuffer für eine Probe auf Eis.
8. Nehmen Sie die Fliese vorsichtig mit einer Pinzette auf, ohne die Perlen zu berühren, und waschen Sie die Fliese in Kammer 1 für 5 Sekunden. Wasche die Fliesen in Kammer 2 für 5 Sekunden. Legen Sie die Fliesen vorsichtig in einen Schacht in der 12-Schacht-Platte auf Eis. Der Gewebeschnitt sollte blau gefärbt und gut sichtbar sein.

2. Gewebedissoziation und Kernisolierung

1. Dosieren Sie 175 μL Invent-Minute-Puffer A, der auf das Gewebe zielt. Wiederhole das noch dreimal, um insgesamt 700 μL zu erreichen. Bei jeder Verteilung zielen Sie auf verschiedene Teile der Fliese, um das gesamte Gewebe von der Fliese zu lösen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie eine Kontamination von Kugeln durch Kratzer an den Fliesen oder durch herunterfallende Perlen.
2. Trennen Sie weiterhin das Gewebe von der Fliese, indem Sie den Puffer von der Seite des Brunnens absaugen und auf die mit Gewebe bedeckten Bereiche der Fliese geben, wobei die Platte so weit wie möglich auf Eis bleibt. Wiederholen, bis kein Gewebe mehr auf der Fliese übrig ist. Sobald das gesamte Gewebe von der Fliese entfernt wurde, verwenden Sie vorsichtig eine Pinzette, um die Fliese in einen leeren Schacht zu bringen.
3. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um Kerne mechanisch mit wiederholter Trituration im selben Bohrloch zu dissoziieren. Wiederholen, bis keine sichtbaren Gewebebrocken mehr übrig sind.
4. Übertragen Sie die Kernsuspension vorsichtig auf eine Filterkartusche mit einem Sammelrohr aus dem Invent Minute Single-Nucleus-Isolationsset für neuronale Gewebe/Zellen. Inkubieren Sie das Rohr mit offenem Deckel bei –20 °C für 10 Minuten. Decken Sie die Filterpatrone ab und zentrifugieren Sie sofort bei 13.000 x g für 30 Sekunden in einer gekühlten Mikrozentrifuge.
5. Werfen Sie die Filterpatrone weg und suspendieren Sie das Pellet wieder, indem Sie 10–20 Mal sanft pipettieren. Drehen Sie das Rohr in der vorgekühlten Zentrifuge mit Schwenkeimern bei 600 x g für 5 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig das Überlagerungsmittel und suspendieren Sie das Pellet in 200 μL Trekker-Puffer C.
6. Fügen Sie 1 ml kalten Invent-Minute-Puffer B zu einem 1,5-mL niedrigbindenden Eppendorf-Rohr hinzu und legen Sie vorsichtig 200 μL Kernsuspension auf den Minute-Puffer B, indem Sie langsam gegen die Wand des Rohrs stoßen, um das Vermischen der Schichten zu vermeiden. Drehen Sie das Rohr in der vorgekühlten Zentrifuge mit Schwenkeimern bei 500 x g für 10 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig die milchige Schicht und das Supernatant.
7. Die Kerne werden vorsichtig mit 24 μL Trekker-Puffer C wieder suspendiert und die Qualitätskontrollmessungen der isolierten Kerne durchgeführt.

Abbildung 2: Qualitätskontrollbewertung isolierter Kerne. Repräsentative Brightfield-Bilder isolierter Kerne aus dem Gehirngewebe der Maus. Die Kerne wurden mit 0,4 % Trypanblau gefärbt und mit 40-facher Vergrößerung abgebildet, um die nukleare Integrität und das Vorhandensein von Trümmern zu beurteilen. Die links gezeigte Kernpräparation zeigt hochwertige, intakte Kerne, die für nachgelagerte Tests geeignet sind, während die rechts gezeigte Präparation minderwertige Kerne mit teilweise lysierten Gewebeaggregaten zeigt. Beschädigte oder geplatzte Kerne werden durch gefüllte Pfeilspitzen angezeigt. Der Maßstab beträgt 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Zähl- und Qualitätskontrollmessungen isolierter Kerne

1. Für die Kernzählung nehmen Sie 2 μL der Kernsuspension in 8 μL Trekker-Puffer C. Mischen Sie 10 μL der verdünnten Kernsuspension mit 10 μL AO/PI-Färbelösung. Zählen Sie die Kerne gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Um die Qualität der isolierten Kerne zu beurteilen, verdünnen Sie 2 μL der Kernsuspension in 8 μL 4%ige Trypanblau-Lösung. Untersuchen Sie die Kerne unter dem Fluoreszenzmikroskop mit 40-facher Vergrößerung und prüfen Sie die intakte Morphologie der Kernmembran und des nicht-nuklearen Trümmermaterials (Abbildung 2).
3. Fahren Sie sofort mit dem Einzelkern-CUT&Tag-Multiom (CUT&Tag auf H3K27ac + Genexpression) Assay fort.
   VORSICHT: Gehen Sie mit den nächsten Schritten fort, wenn mindestens 30.000 hochwertige Kerne geborgen werden.

4. CUT&Tag-Tagmentation an isolierten Kernen

1. Bereiten Sie den CUT&Tag-Inkubationspuffer I vor. Legen Sie ihn auf Eis.
2. Bereite primäre Antikörper und Transposase vor, aktiviert durch das Guidance (TAG)-Enzymkonjugat.
   1. Fügen Sie 46,23 μL CUT&Tag-Inkubationspuffer I und 1,33 μL TAG-Enzym zu einem PCR-Röhrchen auf Eis hinzu. Fügen Sie eine optimierte Menge primären Antikörpers in die Sonde ein. Langsam durch 10-faches Pipettern mischen.
      HINWEIS: 2,43 μL Anti-H3K27ac-Antikörper wurden der Reaktion zugesetzt. Die Antikörpercharge wurde für Bulk- und In-situ-CUT &Tag-Tests validiert. Optimieren Sie die Menge des Antikörpers für die TAG-Enzymkonjugation durch einen Massenassay. Der optimale Antikörper wurde als die niedrigste Konzentration definiert, die das maximale Signal-Rausch-Verhältnis erreichte, bestimmt durch qPCR an positiven und negativen Zielloci.
   2. Kurz drehen und den Schlauch auf einen 18-U/min-Rotator setzen. Inkubieren Sie 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Die resultierende Mischung kann vorgefertigt und bis zu 5 Stunden auf Eis gelegt werden.
      HINWEIS: Die Antikörper-TAG-Inkubation kann gleichzeitig mit oder vor der Kernisolierung durchgeführt werden.
3. Inkubation isolierter Kerne mit Antikörper-TAG-Enzymkonjugat.
   1. Drehen Sie das Rohr (Schritt 2.7) mit isolierten Kernen in der vorgekühlten Zentrifuge mit Schwenkbehältern bei 500 x g für 10 Minuten. Entfernen Sie das Überstandsmittel, ohne das Pellet zu stören, und lassen Sie ~5 μL Überstandsmittel zurück.
   2. Fügen Sie 25 μL CUT&Tag-Inkubationspuffer I (Schritt 4.1) hinzu und suspendieren Sie erneut durch vorsichtiges Pipetieren 10 Mal. Übertragen Sie die Kerne in das Rohr (Schritt 4.2.2), das Antikörper-TAG-Konjugat enthält, mit derselben Pipettenspitze. Mische vorsichtig, indem du zehnmal pipettieren und den Schlauch auf einen sanften Rotator setze.
   3. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
4. Am nächsten Tag (Tag 2) bereiten Sie einen 1-fachen CUT&Tag-Kernpuffer vor und legen Sie ihn auf Eis.
5. CUT&Tag-Tagmentation
   1. Holen Sie das Reaktionsrohr (Schritt 4.3.3) aus dem Rotator. Fügen Sie 5 μL CUT&Tag-Aktivator hinzu und übertragen Sie das Gemisch in ein neues 1,5-mL-Rohr. Inkubieren Sie 1 Stunde bei 37 °C auf dem ThermoMixer bei 550 U/min.
   2. Holen Sie das Rohr heraus, fügen Sie 20 μL CUT&Tag-Quenchpuffer hinzu und mischen Sie die Reaktion vorsichtig durch 10-faches Pipetten. Zentrifugieren Sie das Rohr in der vorgekühlten Zentrifuge mit Schwenkschaufeln bei 500 x g für 10 Minuten. Entfernen Sie das Überstandsmittel, ohne das Kernpellet zu stören, sodass am Boden des Röhrchens ~5 μL Überstandsmittel bleiben.
   3. Fügen Sie 100 μL 1x CUT&Tag-Kernpuffer hinzu und suspendieren Sie die Kerne durch vorsichtiges Pipettern 10 Mal wieder. Drehen Sie das Rohr in der vorgekühlten Zentrifuge mit Schwenkeimern bei 500 x g für 10 Minuten. Entfernen Sie 85 μL des Supernatans, sodass ~15 μL übrig bleiben. Die Kerne durch vorsichtiges und langsames Pipettern 10 Mal wieder aufhängen.
6. Zählung der markmentierten Kerne und Bestimmung der Zielanzahl
   1. Geben Sie 1 μL der tagmentierten Kernsuspension in 9 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung und mischen Sie sie mit 10 μL AO/PI-Färbelösung. Zähle die tagmentierten Kerne wie in Schritt 3.1 beschrieben.
   2. Verwenden Sie das 1,6-fache der Zielanzahl der Kerne für die Erzeugung von Einzelzell-GEM, um die gewünschte Anzahl eingefangener Kerne zu erhalten.
   3. Drehen Sie das Rohr in der vorgekühlten Zentrifuge mit Schwenkeimern bei 500 x g für 10 Minuten und entfernen Sie vorsichtig das Überlagerungsmittel, sodass ein Endvolumen von 8 μL bleibt.

5. Einzelzellbarcodierung tagmentierter Kerne und Voramplifikation von barcodedierten DNAs

1. Fügen Sie 7 μL ATAC-Puffer B zu 8 μL der tagmentierten Kerne mit der erwarteten Anzahl an Zielkernen für Ihr Experiment hinzu.
   HINWEIS: Weitere Details zu den Reaktionsaufbauten und dem Betrieb des Chromium X-Instruments finden Sie im "GEM Generation & Barcoding"-Protokoll des Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit User Guide (CG000338 Rev G).
2. GEM-Generierung und Barcode mit dem Chromium X-Instrument.
   1. Fügen Sie 60 μL GEM-Mastermischung in das Rohr mit tagmentierten Kerne hinzu. Sanft durch Pipetteren mischen und auf Reihe 1 des Chromium Next GEM Chip J legen.
   2. Bereite Einzelzell-Multiom-Gelperlen vor und lade 50 μL Gelperlen auf Reihe 2. Geben Sie 45 μL Partition-Öl in die Brunnen in Reihe 3 ab.
   3. Setzen Sie den zusammengebauten Chip J mit der Dichtung in die Schachtel des Chromium X-Instruments und laufen Sie das Instrument.
   4. Saugen Sie langsam 100 μL GEMs aus den tiefsten Punkten der Rückgewinnungsbohrungen in der oberen Reihe 3. Gib langsam GEMs in das neue PCR-Rohr auf Eis, mit den Pipettenspitzen an den Seitenwänden der Brunnen.
   5. Inkubieren Sie die gesammelten GEMs in einem thermischen Zyklus (Deckeltemperatur bei 50 °C) mit folgendem Protokoll: ein Zyklus von 37 °C für 45 Minuten, ein Zyklus von 25 °C für 30 Minuten und 4 °C für die Lagerung.
   6. Fügen Sie 5 μL Abschreckmittel hinzu und mischen Sie langsam durch 10-faches Pipetten.
3. Aufräumung der post-GEM-Inkubation und DNA-Reinigung
   HINWEIS: Weitere Details finden Sie im "Post GEM Incubation Cleanup"-Protokoll des Chromium Next GEM Single-Cell Multiome ATAC + Gene Expression Kit User Guide (CG000338 Rev G).
   1. Gib 125 μL rosafarbenes Rückgewinnungsmittel bei Raumtemperatur in das Rohr und drehe das Rohr vorsichtig 10 Mal um. Zentrifugiere kurz. Entferne und entsorge langsam 125 μL Rückgewinnungsmittel/Trennungsöl (rosa) vom Boden des Rohrs.
   2. Gib 200 μL Dynabeads Reinigungsmischung in die Röhre und mixe zehnmal durch Pipetten. Inkubiere 10 Minuten bei Zimmertemperatur. Stellen Sie das Rohr auf den Magnethalter, bis die Lösung frei ist. Entferne das Überwasser.
   3. Fügen Sie dem Pellet 300 μL frisch zubereitetes 80%iges Ethanol hinzu. Inkubiere 30 Sekunden und entferne das Supernatant. Fügen Sie 200 μL 80 % Ethanol zum Pellet hinzu, inkubieren Sie 30 Sekunden und entfernen Sie das Supernatant. Drehen Sie die Röhre kurz und legen Sie sie auf den Magneten. Entferne das verbleibende Supernatant.
   4. Nimm das Rohr vom Magneten ab. Fügen Sie sofort 50,5 μL Elutionslösung I. Mischen Sie durch Pipette und inkubieren Sie 1 Minute bei Raumtemperatur. Drehen Sie kurz und legen Sie das Rohr auf den Magneten, bis die Lösung klar ist. Übertragen Sie 50 μL gereinigte Lösung in ein neues Rohr.
   5. DNA-Reinigung durch paramagnetische Perlen
      1. Fügen Sie 90 μL paramagnetische Perlen (1,8X) zu jeder Probe hinzu und mischen Sie gründlich durch Pipetten. Inkubiere 5 Minuten bei Zimmertemperatur. Drehen Sie kurz und legen Sie das Rohr auf den Magneten, bis die Lösung klar ist. Entferne das Überwasser.
      2. Gib dem Pellet 200 μL 80 % Ethanol hinzu. Inkubiere 30 Sekunden. Entferne das Ethanol. Wiederhole das noch einmal.
      3. Kurz drehen und das Rohr auf den Magneten setzen. Entferne das verbleibende Supernatant.
      4. Nimm das Rohr vom Magneten ab. Fügen Sie 46,5 μL Puffer-EB hinzu und mischen Sie durch Pipetten. Inkubiere 2 Minuten bei Zimmertemperatur. Drehen Sie ihn und legen Sie ihn auf den Magneten, bis die Lösung klar ist.
      5. Übertragen Sie 46 μL gereinigter DNA in ein neues Röhrchen.
4. Voramplifikation von barcodedierten DNAs.
   1. Fügen Sie jeder Probe 54 μL Vorverstärkungsmischung hinzu. Pipetten mischen und kurz zentrifugieren.
   2. Inkubieren in einem thermischen Zyklus (Deckeltemperatur bei 105 °C) mit folgendem Protokoll: ein Zyklus von 72 °C für 5 Minuten; ein Zyklus mit 98 °C für 3 Minuten; insgesamt 7 Zyklen mit 98 °C für 20 Sekunden, 63 °C für 30 Sekunden, 72 °C für 1 Minute; ein Zyklus von 72 °C für 1 Minute; und einen Laderaum bei 4 °C. Über Nacht bei 4 °C aufbewahren.
   3. Am nächsten Tag (Tag 3) reinigen Sie voramplifizierte DNAs mit paramagnetischen Perlen (1,6X), wie in Schritt 5.3.5 beschrieben. Fügen Sie 80,5 μL Puffer-EB in die Röhre ein und mischen Sie durch Pipetteren. Inkubiere 2 Minuten bei 22 °C (Raumtemperatur). Drehen Sie kurz und legen Sie das Rohr auf den Magneten, bis die Lösung klar ist.
   4. Übertragen Sie 80 μL voramplifizierter DNA in ein neues Röhrchen. Verwenden Sie 40 μL, um die CUT&Tag-Bibliothek zu generieren. Die übrigen voramplifizierten DNAs werden bei 4 °C gelagert.
      HINWEIS: 40 μL der verbleibenden präamplifizierten DNAs werden später für Genexpression und räumliche Barcode-Bibliotheken verwendet.

6. Bibliotheksvorbereitung für CUT&Tag, Genexpression und räumliche Barcodes

1. Vorbereitung der scCUT&Tag-Bibliothek
   1. Übertragen Sie 40 μL voramplifizierte DNAs in ein neues Röhrchen und fügen Sie 60 μL Sample-Index-PCR-Mischung hinzu. Mischen Sie durch Pipetteren und kurzes Drehen.
   2. Inkubieren Sie in einem thermischen Zyklus (Deckeltemperatur bei 105 °C) mit folgendem Protokoll: ein Zyklus von 98 °C für 45 Sekunden; insgesamt 12 Zyklen mit 98 °C für 20 S, 67 °C für 30 S, 72 °C für 20 S; ein Zyklus von 72 °C für 1 Minute; 4 °C für den Halt).
      HINWEIS: Die optimale Zykluszahl hängt von der Startzahl der Kerne und der profilierten Histonmarkierung ab. Zwölf Verstärkungszyklen wurden für die H3K27ac-Marke im Experiment verwendet.
   3. Doppelte Größenauswahl und DNA-Reinigung durch paramagnetische Perlen (0,6X, 1,55X)
      1. Fügen Sie 60 μL paramagnetische Perlen (0,6X) zu jeder Probe hinzu und mischen Sie durch gründliches Pipetten. Inkubiere 5 Minuten bei Zimmertemperatur. Drehen Sie kurz und legen Sie das Rohr auf den Magneten, bis die Lösung klar ist.
      2. Übertragen Sie 150 μL Supernatant auf ein neues Rohr. Fügen Sie 95 μL paramagnetische Perlen (1,55X) zu jeder Probe (Supernatant) hinzu und mischen Sie durch Pipetten. Inkubiere 5 Minuten bei Zimmertemperatur. Setze das Rohr auf den Magneten, bis die Lösung klar ist. Entferne das Überwasser.
      3. Fügen Sie 300 μL 80 % Ethanol zum Pellet hinzu. Warte 30 Sekunden. Entferne das Ethanol. Wiederhole es noch einmal. Kurz drehen und das Rohr auf den Magneten setzen. Entferne das verbleibende Supernatant.
      4. Nimm das Rohr vom Magneten ab. Fügen Sie 20,5 μL Puffer-EB in die Röhre ein und mischen Sie durch Pipetten. Inkubiere 2 Minuten bei Zimmertemperatur. Drehen Sie ihn und legen Sie ihn auf den Magneten, bis die Lösung klar ist.
      5. Übertragen Sie 20 μL gereinigter und indexierter CUT&Tag-Bibliotheken auf neue Röhren.
2. Qualitätskontrolle für die CUT&Tag-Bibliothek
   1. Analyse der DNA-Größenverteilung in der Bibliothek
      1. Mische 1 μL gereinigte Bibliotheks-DNA mit 1 μL Low-TE-Puffer.
      2. Mischen Sie die verdünnte DNA mit dem Arbeitspuffer des Fragmentanalysators und führen Sie das Gerät mit dem Hochempfindlichkeits-HS NGS Fragment-Kit (1-6000bp) aus (Abbildung 3A).
   2. Bewerten Sie die Anreicherung eines H3K27ac-positiven genomischen Locus vor der Sequenzierung und Kartierung.
      1. Mische 1 μL gereinigte Bibliotheks-DNA mit 4 μL nukleasefreiem Wasser. Verwenden Sie 1 μL verdünnte Bibliotheks-DNA für qPCR-Messungen an drei genomischen Loci.
         HINWEIS: Für H3K27ac CUT&Tag wurde der positive Primer aus dem Actb-TSS-Locus entworfen, während Primer, die auf das T1-TSS und ein intergenes Locus abzielten, als negative^{Kontrolle 20} dienten (Tabelle 1). Mausgenomische DNA wurde als Eingabekontrolle verwendet, um die PCR-Effizienz zu normalisieren (Abbildung 3B).
      2. Bereiten Sie insgesamt 20 μL des Reaktionsgemisch wie folgt vor: 1 μL verdünnte Bibliotheks-DNA, 2 μL 10 μM Primermischung, 10 μL 2X SYBR Green Master Mix und 7 μL nukleasefreies Wasser.
      3. Führen Sie die vorbereitete qPCR-Platte auf dem CFX Opus Real-Time PCR System mit dem entsprechenden Zyklusprogramm für die SYBR Green-Erkennung aus.
3. Amplifikation von cDNAs und räumlichen Barcode-DNAs.
   1. Übertragen Sie 35 μL voramplifizierte DNAs (Schritt 5.4.4) in ein neues Röhrchen und fügen Sie 65 μL cDNA-Amplifikationsreaktionsmischung hinzu. Mischen Sie durch Pipetteren und kurzes Drehen. Der für cDNA- und räumliche Barcode-DNA-Amplifikation verwendete Primer ist Feature cDNA Primers 2.
   2. Inkubieren Sie in einem thermischen Zyklus (Deckeltemperatur bei 105 °C) mit folgendem Protokoll: ein Zyklus von 98 °C für 45 Sekunden; insgesamt 8 Zyklen mit 98 °C für 20 S, 63 °C für 30 S, 72 °C für 1 Minute; ein Zyklus von 72 °C für 1 Minute; 4 °C zum Halten.
      HINWEIS: Die optimale Zykluszahl muss anhand des Zelltyps, des RNA-Gehalts und der Startanzahl der Kerne bestimmt werden. In diesem Experiment wurden 8 Verstärkungszyklen durchgeführt.
   3. Reinigung amplifizierter cDNAs
      1. Doppelte Größenselektion und DNA-Reinigung durch paramagnetische Perlen (0,6X, 2,0X) wie in Schritt 6.1.3 beschrieben. Fügen Sie 60 μL paramagnetische Perlen (0,6X) zu jeder Probe hinzu und mischen Sie sie durch Pipetten. Inkubiere 5 Minuten bei Zimmertemperatur. Lege den Magneten auf die Lösung, bis sie frei ist.
      2. Übertrage und speichere 75 μL Supernatant in einem neuen Rohr, ohne das Pellet zu stören. Halten Sie Zimmertemperatur.
         VORSICHT: Werfen Sie den Supernatant nicht weg, da er DNA enthält, die für kürzere Fragmente angereichert ist und zur Erstellung der räumlichen Barcode-Bibliothek verwendet wird.
      3. Entferne das verbleibende Supernatant aus dem Pellet. Waschen Sie mit 80 % Ethanol zweimal, wie in Schritt 6.1.3 beschrieben.
      4. Gib 40,5 μL Puffer-EB in die Röhre und mische durch Pipetteren. Inkubiere 2 Minuten bei Zimmertemperatur. Kurz drehen und auf den Magneten legen, bis die Lösung klar ist.
      5. Übertragen Sie 40 μL amplifizierte cDNAs in eine neue Röhre. Speichern Sie es auf Eis, um eine indexierte Genexpressionsbibliothek vorzubereiten.
         HINWEIS: Dieser Anteil bereichert die DNAs für die typische Größe der cDNAs.
   4. Reinigung von amplifizierten räumlichen Barcode-DNAs
      1. Fügen Sie 70 μL paramagnetische Perlen (2,0X) zu 75 μL des zuvor gespeicherten Überstandsmittels hinzu (Schritt 6.3.3.2. Mischen Sie durch Pipetteren und kurzes Drehen. Inkubiere 5 Minuten bei Zimmertemperatur. Setze das Rohr auf den Magneten, bis die Lösung klar ist. Entferne das Überwasser.
      2. Waschen Sie mit 80 % Ethanol zweimal, wie in Schritt 6.1.3 beschrieben.
      3. Gib 40,5 μL Puffer-EB in die Röhre und mische durch Pipetteren. Inkubiere 2 Minuten bei Zimmertemperatur. Kurz drehen und auf den Magneten legen, bis die Lösung klar ist.
      4. Übertragen Sie 40 μL amplifizierte und gereinigte räumliche Barcode-DNA in ein neues Röhrchen. Speichere bei −20 °C für die anschließende Generierung der indizierten räumlichen Barcode-Bibliothek.
   5. Analyse der cDNA-Größen durch den Fragmentanalysator. Mischen Sie 1 μL amplifizierte cDNAs mit 1 μL Low-TE-Puffer. Führen Sie die verdünnten DNAs mit dem Fragmentanalysator aus, wie in Schritt 6.2.1 beschrieben.
   6. Vorbereitung der indexierten Genexpressionsbibliothek
      1. Übertragen Sie 10 μL amplifizierte cDNAs (Schritt 6.3.3.5) auf eine neue Röhre. Fügen Sie 25 μL Puffer EB und 15 μL Fragmentierungsgemisch hinzu. Mischen Sie durch Pipetten auf Eis. Kurz drehen und das Rohr bei 4 °C in den vorgekühlten Thermozyklus überführen.
      2. Inkubieren in einem thermischen Zyklus (Deckeltemperatur bei 65 °C) durch Initiierung des folgenden Protokolls: ein Zyklus von 32 °C für 5 Minuten; ein Zyklus mit 65 °C für 30 Minuten; 4 °C zum Halten.
      3. Doppelte Größenauswahl und DNA-Reinigung durch paramagnetische Perlen (0,6X, 0,8X) wie in Schritt 6.1.3 beschrieben. Fügen Sie 50,5 μL Puffer-EB hinzu und mischen Sie durch Pipetten. Inkubiere 2 Minuten bei Zimmertemperatur. Kurz drehen und auf den Magneten legen, bis die Lösung klar ist.
      4. Übertragen Sie 50 μL Probe in ein neues Röhrchen. Fügen Sie 50 μL Adapterligationsmischung hinzu und mischen Sie durch Pipetten. Dreh dich kurz. Inkubieren Sie in einem Thermozyklus (Deckeltemperatur bei 30 °C) mit folgendem Protokoll: ein Zyklus mit 20 °C für 15 Minuten und 4 °C zur Haltung.
      5. DNA-Reinigung durch paramagnetische Perlen (0,8X) wie in Schritt 5.3.5 beschrieben. Fügen Sie 30,5 μL Puffer-EB hinzu und mischen Sie durch Pipetten. Inkubiere 2 Minuten bei Zimmertemperatur. Kurz drehen und auf den Magneten legen, bis die Lösung klar ist. Übertragen Sie 30 μL der Probe in ein neues Röhrchen.
      6. Index-PCR der Genexpressionsbibliothek. Füge 50 μL Verstärkermix hinzu und 20 μL eines individuellen Dual-Index-TT-Sets A zu jeder Probe.
      7. Inkubieren Sie in einem thermischen Zyklus (Deckeltemperatur bei 105 °C) mit folgendem Protokoll: ein Zyklus von 98 °C für 45 Sekunden; insgesamt 11 Zyklen mit 98 °C für 20 S, 54 °C für 30 S, 72 °C für 20 S; ein Zyklus von 72 °C für 1 Minute; 4 °C zum Halten.
         HINWEIS: Die optimale Zykluszahl muss anhand des Zelltyps, des RNA-Gehalts und der Startzahl der Kerne bestimmt werden. In diesem Experiment wurden insgesamt 11 Verstärkungszyklen verwendet.
      8. Doppelte Größenauswahl und DNA-Reinigung durch paramagnetische Perlen (0,6X, 0,8X) wie in Schritt 6.1.3 beschrieben. Fügen Sie 35,5 μL Puffer-EB in die Röhre und mischen Sie durch Pipetten. Inkubiere 2 Minuten bei Zimmertemperatur. Kurz drehen und auf den Magneten legen, bis die Lösung klar ist.
      9. Übertragen Sie 35 μL der gereinigten und indexierten Genexpressionsbibliothek in ein neues Rohr.
4. Analyse der DNA-Größenverteilung in der Genexpressionsbibliothek. Mische 1 μL Bibliotheks-DNA mit 1 μL Low-TE-Puffer. Führen Sie die verdünnten DNAs wie in Schritt 6.2.1 beschrieben durch. (Abbildung 3A).
5. Erstellung einer indexierten räumlichen Barcode-Bibliothek
   1. Bereiten Sie insgesamt 100 μL des Sample-Index-PCR-Mixes wie folgt vor: 50 μL Amp-Mix (aus GEM-X Single-Cell 3' Feature Barcode Kit), 25 μL Buffer EB, 20 μL Primer aus Dual Index Plate TT Set A und 1 μL gereinigte räumliche Barcode-DNAs (Schritt 6.3.4.4), verdünnt in 4 μL EB-Puffer.
   2. Inkubieren Sie in einem thermischen Zyklus (Deckeltemperatur bei 105 °C) mit folgendem Protokoll: ein Zyklus von 98 °C für 45 Sekunden; insgesamt 7 Zyklen mit 98 °C für 20 S, 54 °C für 30 S, 72 °C für 20 S; 72 °C für 1 Minute; 4 °C zum Halten.
   3. DNA-Reinigung durch paramagnetische Perlen (1,2X) wie in Schritt 5.3.5 beschrieben. Fügen Sie 35,5 μL EB-Puffer in die Röhre ein und mischen Sie durch Pipetten. Inkubiere 2 Minuten bei Zimmertemperatur. Setze das Rohr auf den Magneten, bis die Lösung klar ist.
   4. Übertragen Sie 35 μL gereinigter und indexierter räumlicher Barcode-Bibliotheks-DNA auf ein neues Rohr. Lagern bei bis zu 72 Stunden bei 4 °C oder bei −20 °C zur Langzeitlagerung.
6. Überprüfen Sie die Verteilung der DNA-Größen in der indexierten räumlichen Barcode-Bibliothek. Mische 1 μL gereinigte Bibliotheks-DNA mit 1 μL Low-TE-Puffer. Führen Sie die verdünnten DNAs mit dem Fragmentanalysator aus, wie in Schritt 6.2.1 (Abbildung 3A) beschrieben.

Abbildung 3: Qualitätskontrollbewertungen indexierter Bibliotheken. (A) Größenprofile in amplifizierten DNAs und indexierten Bibliotheken. DNA wird von einem Fragmentanalysator analysiert, um die DNA-Qualität und Größenverteilung zu bewerten. Dargestellt werden repräsentative Profile für die indexierte CUT&Tag-Bibliothek, die verstärkte DNA, die für die Genexpression und die Vorbereitung räumlicher Barcode-Bibliotheken verwendet wird, die indexierte Genexpressionsbibliothek und die indexierte räumliche Barcode-Bibliothek. (B) Die CUT&Tag-Bibliothek wird von qPCR analysiert, um die Anreicherung einer H3K27ac-positiven genomischen Region (d. h. ACTB) über dem H3K27ac-negativen Hintergrundsignal (d. h. T1 und einem intergenen Locus) zu bewerten. Die Faltungsdifferenz zwischen positiven und negativen Regionen wird als Anreicherung²¹ berechnet. Eine Faltungsanreicherung größer als 10 gilt in diesem Assay²⁰ als ideal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

7. Reihenfolge der Bibliotheken

1. Sequenzieren Sie die räumliche Barcode-Bibliothek von Trekker in einer Tiefe von 5.000 Lesepaaren pro erfasstem Kern.
2. Sequenzieren Sie die H3K27ac CUT&Tag-Bibliothek in einer Tiefe von 25.000 Lesepaaren pro erfasstem Kern.
3. Sequenzieren Sie die Genexpressionsbibliothek in einer Tiefe von mindestens 20.000 Lesepaaren pro eingefangenem Kern.

8. Bioinformatik und Datenanalyse

1. Prozessgenexpression und CUT&Tag-Lesungen mit Cell Ranger ARC v2.0.2 mit --min-atac-count=100 und --min-gex-count=1000. Integriere Cell Ranger ARC-Ausgaben mit Trekker-Barcode-Informationen mithilfe der Trekker-Pipeline v1.3.0 mit Standardparametern, um räumliche Positionen zuzuweisen.
2. Führen Sie die Qualitätskontrolle mit Signac durch. Zellen, die eines der folgenden Kriterien erfüllten, wurden aus der nachgelagerten Analyse entfernt: Für CUT&Tag ≥ die Gesamtfragmentanzahl 1.000.000 oder ≤ 100 sowie die TSS-Anreicherung ≤ 2; für die Genexpression ≥ die Gesamtzahl der UMI 100.000 oder ≤ 1.000, und die Gesamtzahl der nachgewiesenen Gene ≥ 10.284 oder ≤ 200.
3. Entfernen Sie Doublets mit scDblFinder für die Genexpression und AMULET für CUT&Tag. Zellen, die eines der folgenden Kriterien erfüllten, wurden als Doublets klassifiziert: (1) scDblFinder-Wert ≥ 0,6; (2) scDblFinder-Wert ≥ 0,3 und AMULET ≤ 0,01; und (3) in Clustern mit einem hohen Prozentsatz an Dubletten.
4. Normalisieren Sie Genexpressionsdaten mit LogNormalize und CUT&Tag-Daten mit TF-IDF. Berechnen Sie RNA-PCA- und CUT&Tag-LSI-Einbettungen, wobei die LSI-Dimensionen 2–50 für die Chromatinmodalität verwendet werden. Einen gewichteten Nächsten-Nachbar-Graphen mit FindMultiModalNeighbors erstellen und UMAP-Einbettungen basierend auf dem multimodalen Nachbargraphen generieren.
5. Annotieren Sie Trekker-Daten nach der QC mithilfe von Seurat-Labeltransfer basierend auf FindTransferAnchors und einer PCA-Projektionsabbildungsstrategie mit Standardparametern. scRNA-seq-Daten aus dem ABC Atlas (Version 20230630) wurden als Referenz verwendet. Zelltypvorhersagen, die nicht mit der bekannten Gewebeanatomie übereinstimmen, wurden während der manuellen Kuratierung entfernt.
   HINWEIS: Die Skripte für bioinformatische Analyse sind auf GitHub verfügbar: https://github.com/Liuy12/Mouse_Brain_Trekker_Multiome_Cuttag

Results

Mit einem koronalen Schnitt (25 μm Dicke, etwa 70 % Abdeckung einer 10 × 10 mm großen räumlichen Kachel) frisch gefrorenen Mäusehirngewebes ergab der hier beschriebene Workflow durchgehend 50.100 hochwertige Kerne (SD = 12.200, n = 8), was für nachgelagerte einzelzellige multiomische Profilierung ausreichen (Abbildung 1). Nach der räumlichen Barcodierung des Gewebeschnitts durch Trekker wurden die Kerne mittels sanfter Gewebedissoziation isoliert und mit dem Invent-Einzelkern-Isolationskit weiter gereinigt. Dieses Verfahren führte zu minimalen Ablagerungen und niedrigen Konzentrationen der Kernaggregation, wodurch Kernpräparate für Einzelzell-Assays geeignet sind. Repräsentative Bilder der isolierten Kerne sind in Abbildung 2 dargestellt.

Für nachgelagerte Einzelkern-Assays, einschließlich CUT&Tag-Multiom-Profilierung (CUT&Tag + Genexpression), wurden hier typischerweise etwa 50.000 Kerne verarbeitet. Um die nukleare Rückgewinnung zu maximieren, wurde ein vereinfachtes, optimiertes Low-Input-CUT&Tag-Protokoll mit direkter Antikörper-pA/Tn5-Zielerfassung und Tagmentation implementiert, wodurch Inkubationszeiten und Waschschritte¹⁹ minimiert wurden. Mit diesem Ansatz wurden etwa 25.000 tagmentierte Kerne gewonnen, was einer durchschnittlichen Ausbeute von 48,3 % entspricht (SD = 6,1, n = 3). Diese Kerne wurden anschließend für Einzelzell-Barcoding mit den 10x Genomics Chromium Multiome Gelperlen verwendet. Für die GEM-Generierung wurden etwa 15.000 Kerne anvisiert, mit der Erwartung, nach Qualitätsfilterung ~10.000 räumlich indizierte Kerne wiederzugewinnen. Basierend auf der Trekker-räumlichen Barcode-Dekodierung konnten 81,3 % der Kerne (SD = 9, n = 3) aus dem Einzelzelldatensatz sicher räumlichen Positionen innerhalb der Kachel zugewiesen werden.

Der räumliche Trekker–CUT&Tag-Multiom-Workflow erzeugt drei indizierte Bibliotheken: CUT&Tag, Genexpressions- und räumliche Barcode-Bibliotheken. Die voramplifizierte barcoded-DNA wurde in zwei Fraktionen unterteilt, die jeweils für die Bibliotheksvorbereitung entsprechend der Fangchemie der Ziele auf den Gelperlen verwendet wurden. CUT&Tag-Bibliotheken wurden direkt aus voramplifizierter DNA amplifiziert und zeigten Fragmentgrößenverteilungen, die für die CUT&Tagmentation charakteristisch sind, entsprechend nukleosomfreier und nukleosomaler DNA (Abbildung 3A). Die Bibliothek zeigte eine gute Anreicherung des H3K27ac-positiven Actb-Locus gegenüber den H3K27ac-negativen genomischen Locus^20,21 (d. h. 68-fache Differenz, überschreitet die zuvor für die Chromatin-Immunpräzipitations-Sequenzierungsanalyse von H3K27ac²⁰ festgelegte 10-fache Grenze) (Abbildung 3B). Für Genexpressions- und räumliche Barcodebibliotheken wurde die präamplifizierte DNA zunächst nach dem 10x Genomics cDNA-Amplifikationsprotokoll amplifiziert und anschließend basierend auf der Fragmentgröße mittels paramagnetischer Perlenreinigung in zwei Fraktionen getrennt. Die indexierte räumliche Barcode-Bibliothek wurde aus dem angereicherten Anteil für kürzere Fragmente vorbereitet und zeigte bei der erwarteten Fragmentgröße einen scharfen Peak. Genexpressionsbibliotheken zeigten eine charakteristische Größenverteilung, die sich um amplifizierte cDNA-Fragmente konzentrierte (Abbildung 3A).

Abbildung 4: Einzelzellige und räumliche Darstellung des räumlichen Trekker–CUT&Tag-Multiom-Tests im Gehirngewebe der Maus. (A) Identifikation von Zelltypen durch Einzelzellanalyse. Einheitliche Mannigfaltigkeits-Approximations- und Projektionsdiagramme (UMAP) zeigen annotierte Zellpopulationen, die allein aus H3K27ac CUT&Tag, ausschließlich der Genexpression und dem integrierten Multiom-Datensatz (CUT&Tag + Genexpression) abgeleitet sind. (B) Räumliche Darstellung räumlicher Trekker–CUT&Tag-Multiomdaten. Kerne aus dem integrierten Multiom-Datensatz werden mit Trekker-Barcodes räumlichen Koordinaten zugeordnet, wodurch anatomisch organisierte Verteilungen der Zelltypen im Schnitt des Maus-Gehirngewebes sichtbar werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Die Sequenzierung und Kartierung von CUT&Tag- und Genexpressionsbibliotheken erfolgte unter Verwendung von Cell Ranger ARC v2.0.2 nach den 10x-Genomics-Richtlinien, während räumliche Barcode-Bibliotheken gemäß Takara Trekkers Empfehlungen mit Trekker v1.3.0 verarbeitet wurden. Die vorgeschlagenen Einzelzell-ATAC-seq-Mapping-Optionen wurden auf CUT&Tag-Bibliotheken angewandt. Single-Nuclei-Datensätze wurden ausschließlich für CUT&Tag, die Genexpression allein und das kombinierte Multiom (CUT&Tag + Genexpression) erstellt. Zellen mit Gesamt-UMIs für entweder CUT&Tag (≥ 1.000.000 oder ≤ 100) oder Genexpression (≥ 100.000 oder ≤ 1000) wurden mittels Signac²² herausgefiltert. Die Doublet-Vorhersage wurde durch eine Kombination aus scDblFinder²³ für die Genexpression und AMULET²⁴ für CUT&Tag durchgeführt. Zellen, die eines der folgenden Kriterien erfüllten, wurden entfernt: 1) scDblFinder.score > 0,6; 2) scDblFinder.score zwischen 0,3 und 0,6 und amulet.score < 0,01. Die Annotation des Zelltyps wurde mit Seurats FindTransferAnchors²⁵ auf Basis der Referenzdaten²⁶ aus dem Allen Brain Cell Atlas durchgeführt. Für die Genexpressionsbibliothek in dieser Studie betrug die mediane UMI-Anzahl pro Zelle 15.378 und die mediane Anzahl der Gene pro Zelle 4.378. In der CUT&Tag-Bibliothek wurden 11.860 Zellen nachgewiesen, mit einem Median von 6.631 hochwertigen Fragmenten pro Zelle und einem TSS-Anreicherungswert von 7,66. Für die Trekker-Bibliothek des räumlichen Barcodes wurden 92,43 % der Kerne räumliche Positionen zugewiesen, und 51,54 % der Kerne wurden einem einzigen räumlichen Ort zugeordnet. Rohsequenzierungsdaten und verarbeitete Daten aus Sekundäranalysen sind über GEO unter der Zugangsnummer GSE327406 verfügbar. Das letzte post-QC-annotierte Seurat-Objekt ist auf Zenodo unter der Zugangsnummer 19475899 verfügbar. Repräsentative UMAP-Einbettungen mit Zelltyp-Annotationen sind in Abbildung 4A dargestellt. Durch das Verknüpfen von Einzelzell-Barcodes mit räumlichen Barcodes wurden einzelne Kerne an ihre räumlichen Positionen im Gewebe zurückgegeben, um eine räumliche Karte zu erzeugen (Abbildung 4B). Diese Karte entspricht eng den anatomischen Merkmalen, die in benachbarten Abschnitten beobachtet wurden, und entspricht einem koronalen Gehirnschnitt im Allen Brain^{Atlas 27}, einer Standardreferenz für die Gehirnanatomie von Mausen. Eine gemeinsame Analyse räumlicher Genexpression und H3K27ac-Profile mit Einzelzellauflösung ermöglichte die Identifizierung wichtiger Hirnzelltypen und zeigte anatomisch organisierte Muster der zellulären Verteilung über den Gewebeabschnitt hinweg.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt einen räumlichen Trekker–CUT&Tag-Multiom-Workflow, der räumliches Barcoding, Low-Input-CUT&Tag-Profilierung von H3K27ac, gleichzeitiges Erfassen mehrerer molekularer Ziele auf den 10x Genomics-Einzelzell-Multiom-Gelperlen und die Vorbereitung einer nachgelagerten Bibliothek für die Illumina-Sequenzierung integriert. Durch die Verbindung räumlicher Indexierung mit einzelnen Zell-Epigenom- und Transkriptom-Messungen adressiert dieser Ansatz eine grundlegende Einschränkung konventioneller Einzelzell-Multiom-Analysen, die keinen nativen Gewebekontext haben. Diese Studie demonstriert erfolgreich die Machbarkeit räumlicher CUT&Tag-Multiomprofilierung (H3K27ac CUT&Tag + Genexpression) und legt eine Grundlage für räumliches Koprofiling von Genexpression und regulatorischen Zielen wie Histonmarkierungen und chromatinassoziierten Proteinen.

Eine strenge Qualitätskontrolle in mehreren Phasen des Workflows ist für die erfolgreiche Umsetzung dieses Workflows unerlässlich (Abbildung 1). Obwohl das hier beschriebene Verfahren mit den Nachschnittsschritten beginnt, ist die Qualität des Gewebeschnitts selbst entscheidend für optimale Ergebnisse. Die Schnittdicke sollte je nach Gewebetyp und erwarteter Zellularität angepasst werden. Während der Gewebedissoziation und der Kernisolierung ist die Maximierung der Kernausbeute bei gleichzeitiger Erhaltung der Kernintegrität entscheidend für die Gesamtleistung von Trekker-basierten Einzelzell-Multiom-Assays. Niedrige Kernausbeute kann durch suboptimale Gewebedissoziation, ineffiziente Kernisolierung oder unzureichende Schnittdicke entstehen. Schlechte nukleare Integrität kann durch übermäßige mechanische Störungen, verlängerte Verarbeitungszeiten oder Überlyse entstehen. Die Kernisolation stellt einen wichtigen Fehlerbehebungspunkt für die erfolgreiche Implementierung des Trekker-basierten Single-Cell-Multiom-Workflows dar. Daher wird eine gewebespezifische Optimierung des Kern-Isolationsprotokolls dringend empfohlen, bevor der Trekker-basierte Einzelzell-Multiom-Test gestartet wird. Isolierte Kerne sollten quantitativ und qualitativ bewertet werden. Die Zählung von Kernkernen mit Kernfarbstoffen liefert eine Schätzung des Ertrags, während mikroskopische Untersuchungen die Integrität, Aggregation und das Vorhandensein nicht-nuklearer Reste der Kernmembran bewerten. Nach der Vorbereitung der Bibliothek sollten alle Bibliotheken auf Fragmentgrößenverteilungen und das Fehlen von Adapter-Dimeren überprüft werden. Für CUT&Tag-Bibliotheken sollte die Anreicherung der Zielgenomregionen über den Hintergrund mittels quantitativer PCR bewertet werden, um vor der Sequenzierung eine frühzeitige Indikation der Assay-Spezifität und der Gesamtqualität der Bibliothek zu liefern. Die Qualitätskontrolle nach der Sequenzierung ist ebenso wichtig für eine genaue Interpretation räumlicher Multiomdaten. Metriken wie Kartierungsraten, Fragmentzählungen pro Kern, Anreicherung des Transkriptionsstartorts, Fragment-in-Peak-Werte für CUT&Tag, Genkomplexität und Lesetiefe pro Zelle sollten gemäß den empfohlenen Richtlinien von 10x Genomics und Takara Trekker bewertet werden. Die gemeinsame Bewertung dieser Metriken sowohl in epigenomischen als auch in transkriptomischen Modalitäten ermöglicht die Identifikation technischer Artefakte und gewährleistet eine zuverlässige Integration räumlicher, epigenomischer und transkriptioneller Informationen.

Während die Machbarkeit des Trekker-basierten Barcode-In-Ansatzes in Kombination mit einem Einzelzell-CUT&Tag-Multiom-Assay in dieser Studie nachgewiesen wird, weist der beschriebene Ansatz auch Einschränkungen auf. Beispielsweise ist die Methode derzeit auf frisch gefrorenes Gewebe beschränkt, und ihre Machbarkeit wurde bisher nur für das Profilieren einer einzelnen Histonmodifikation (H3K27ac) in einem einzelnen Gewebetyp (Maushirn) ohne biologische Replikationen nachgewiesen. Darüber hinaus basiert der Ansatz auf zwei proprietären kommerziellen Plattformen (Takara Trekker und 10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome). Weitere Untersuchungen verschiedener Gewebetypen und zusätzliche epigenetische Markierungen sind notwendig, um die breitere Anwendbarkeit, Leistung, Generalisierbarkeit und Reproduzierbarkeit dieser Technologie zu beurteilen.

Zusammenfassend zeigt das hier präsentierte räumliche Trekker–CUT&Tag-Multiom-Protokoll die Fähigkeit zur räumlich aufgelösten Einzelzell-Koprofilierung epigenomischer und transkriptomischer Merkmale. Durch die Kombination von räumlichem Barcoding mit etablierter Einzelzell-Multiomchemie ermöglicht es eine mechanistische Untersuchung der Genregulation innerhalb intakter Gewebearchitektur und bietet eine leistungsstarke Plattform für zukünftige Anwendungen in der räumlichen Biologie. Bemerkenswerte potenzielle Anwendungen sind die Bewertung des Einflusses verschiedener experimenteller und Umweltreize auf die epigenetische Kontrolle der Genexpression in bestimmten Zelltypen – zum Beispiel könnten die Auswirkungen von Nervenstimulationen in bestimmten Neuronentypen im zentralen und peripheren Nervensystem analysiert werden, oder die Auswirkungen von infiltrierenden pro- und entzündungshemmenden Immunzellen auf nahegelegene Zellen könnten bei entzündlichen Erkrankungen und Krebsarten aufgedeckt werden.