Ein Formanalyse-Algorithmus quantifiziert die räumliche Morphologie und den Kontext von 2D- zu 3D-Zellkulturen für eine neuartige Quantifizierung von Phänotypen

Summary

Dieser Artikel erklärt, wie neuartige morphologische Merkmale in Zellen und Organoiden mithilfe der linearisierten komprimierten Polarkoordinaten-(LCPC)-Transformation quantifiziert werden können, einem räumlichen Algorithmus, der Eigenschaften erfasst, die traditionelle Metriken wie Fläche, Volumen und Oberfläche nicht erfassen können. Best Practices für Formorientierung und -ausrichtung werden diskutiert.

Abstract

Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass der morphologische Phänotyp einer Zelle oder eines Organoids mit seiner Anfälligkeit für Krebshemmer korreliert. Traditionelle Methoden zur Messung des Phänotyps basieren jedoch auf räumlichen Metriken wie Fläche, Volumen, Umfang und Signalintensität, die zwar funktionieren, aber begrenzt sind. Diese Ansätze können viele entscheidende Merkmale des räumlichen Kontexts nicht messen, wie zum Beispiel Chiralität, eine Eigenschaft der Links- und Rechtshändigkeit. Das Volumen kann nicht zur Erfassung der Chiralität verwendet werden, da der linke und der rechte Schuh dasselbe Volumen haben. Obwohl der räumliche Kontext in Form von Chiralität, Gravitationsrichtung und Polaritätsachse für Menschen intuitiv ist, können die traditionellen Metriken, die von Zellbiologen, Pathologen, Radiologen und Praktikern des maschinellen Lernens bisher verwendet werden, diese grundlegenden Vorstellungen nicht erfassen. Die linearisierte komprimierte polare Koordinaten-Transformation (LCPC) ist ein neuartiger Algorithmus, der räumlichen Kontext erfassen kann, wie keine andere Metrik. Die LCPC-Transformation übersetzt eine zweidimensionale (2D) Kontur in eine diskrete Sinuswelle, indem ein Gittersystem überlagert wird, das die Schnittpunkte zwischen Kontur und Gitterlinie verfolgt. Er verwandelt die Kontur in eine Folge von Paaren diskreter Koordinaten, wobei die unabhängige Koordinate (x-Koordinate) aufeinanderfolgenden Positionen im zweidimensionalen Raum entspricht. Jede abhängige Koordinate (y-Koordinate) besteht aus dem Abstand zwischen einem Schnittpunkt der Kontur und der Gitterlinie zum Ursprung oder zur Basislinie des Gittersystems. In Form einer diskreten Sinuswelle wird dann die schnelle Fourier-Transformation auf die Daten angewendet. Auf diese Weise werden die Formen der Zellen in 2D- und 3D-Zellkulturen systematisch und multidimensional dargestellt, was eine robuste quantitative Schichtung ermöglicht, die Einblicke in die Therapieresistenz liefert.

Introduction

Die dreidimensionale (3D) Organoidkultur hat sich als überlegen gegenüber der zweidimensionalen (2D) Zellkultur erwiesen, um die Biologie in vivo nachzuahmen ^1,2. Organoide sind in der Krebsforschung unverzichtbar geworden, um wirksame Behandlungen zu screenen und Einblicke in den Krankheitsverlauf zu gewinnen 3,4,5,6. Obwohl in der Krebsbiologie bekannt ist, dass Unterschiede in der Morphologie mit unterschiedlichen biologischen Verhaltensweisen von Zellen und Geweben korrelieren, stützt sich das Fachgebiet auf traditionelle, begrenzte Formmetriken. Diese Studie beschreibt einen neuartigen räumlichen Algorithmus, der subtile morphologische Merkmale objektiv mit beispielloser Präzision quantifiziert und traditionelle Ansätze wie Fläche, Volumen und Oberfläche übertrifft.

Die linearisierte Transform der komprimierten polaren Koordinaten (LCPC) wurde erfunden, um objektiv und quantitativ komplexe Morphologien in der Gewebehistopathologie zu beschreiben, mit dem Ziel, die Graduierung von Darmpolypen⁷ zu verbessern. Der Wunsch, diesen Ansatz dann auszuweiten, um makroskopische MRT-basierte räumliche Merkmale in Gehirnpathologien wie bipolarer Störung und Alzheimer zu erfassen, führte zu Augmentationen, die ihn noch weiter verbesserten. Diese Studie beschreibt das Schritt-für-Schritt-Protokoll und Best Practices zur Anwendung zweier Versionen der LCPC-Transformation: das Parallelgittersystem und das radiale Gittersystem, die beide Open-Source-Skripte und Tutorial-Videos enthalten.

Neben traditionellen geometrischen Methoden gibt es mehrere Abstraktionen, die sich als wirksam zur Messung der komplexen Formen von Zellen und Organen erwiesen haben. Dazu gehören die Messung von Exzentrizität, Verrägung, Kontrast und Kurtosis sowie Zernike-Momente zur Erfassung von Kreisform, Asymmetrie, Kantenunregelmäßigkeit und globaler Konturstruktur ^8,9,10. Die Fraktalanalyse war auch nützlich, um komplexe Konturen in skalare Werte zu reduzieren, wie zum Beispiel die Fraktaldimension, die misst, wie unregelmäßig die Kontur ist, und die Lacunärität, die misst, wie heterogen unregelmäßige Lücken in der Kontur^11,12 auftreten. Zur Messung der Textur ist die Gray Level Co-occurrence Matrix (GLCM)-Methode beliebt, um Kontrast, Energie, Homogenität, Korrelation und Entropie^13,14 zu messen. Obwohl alle diese Methoden vorteilhaft sind, wurden keine davon darauf ausgelegt, räumlichen Kontext zu erfassen, wie etwa die Richtung der Schwerkraft, Links- vs. Rechtshändigkeit oder die Lage der zentralen Stützstruktur, die die Richtung der Formänderung beeinflusst. Außerdem erzeugen viele von ihnen einen einzelnen skalaren Wert oder nur eine Handvoll skalare Werte, um räumliche Informationen darzustellen, weshalb die zitierten Studien sie oft in Kombination verwenden, um komplexe Formen zu bewerten.

Die LCPC-Transformation wurde entwickelt, um viele Merkmale aus einer Messung zu erzeugen und das Hinzufügen räumlicher Markierungen zu ermöglichen, die den räumlichen Kontext in die Form kodieren, wie etwa die Richtung der Schwerkraft. Die Methode, die der LCPC-Transformation⁷ am nächsten kommt, wurde ein Jahr später¹⁵ veröffentlicht und teilt dieselbe Kernidee als Ausgangspunkt: Die Fourier-Transformation auf Zellkonturen anzuwenden, um die Form in Form eines Frequenzspektrums zu messen. Die LCPC-Transformation wurde jedoch unabhängig entwickelt, um über verschiedene Gittersysteme angewendet zu werden, die in Verbindung mit Kenntnis des räumlichen Kontexts außerhalb der zu messenden Form verwendet werden sollten. Darüber hinaus erklärt der Erfinder der LCPC-Transformation in diesem Manuskript, dass das resultierende Frequenzspektrum enorme Mengen verborgener räumlicher Informationen enthält. Supplementary File 1 enthält eine ausführliche Diskussion räumlicher Kontexte in der Biologie, die bei der Verwendung der zitierten Methoden oft übersehen werden, und wie die LCPC-Transformation angewendet werden kann, um diesen Kontext zu erfassen. Für Leser, deren Formdaten keinen Unterschied zwischen Kontroll- und Experimentgruppen zeigen, ob ihre Augen einen Unterschied in den Formen erkennen oder deren Formdaten nur sehr geringe Unterschiede zeigen, obwohl sie vermuten, dass es einen größeren Unterschied geben sollte, sollten sie die LCPC-Transformation ausprobieren.

Die LCPC-Transformation bietet ein beispielloses Maß an Präzision bei der Messung räumlicher Informationen, da sie Formen in mehreren Dimensionen darstellt. Im Gegensatz zu traditionellen Methoden wie Fläche und Volumen, die pro Form nur einen skalaren Wert liefern (z. B. 25 cm^²), können die Ergebnisse der LCPC-Transformation mehrere Indizes liefern, die jeweils mit einem anderen morphologischen Aspekt einer Form korrelieren (z. B. Rundheit vs. Schärfe der Ecken, Glätte vs. Zackigkeit der Kanten). Die LCPC-Transformation beschreibt eine 2D-Form, indem sie ein Raster gerader Linien überlagert, die ihre Kontur schneiden. Jedes Gittersystem hat einen Ursprung (Abbildung 1) oder eine Basislinie (Abbildung 2), von der aus lineare Entfernungen gemessen werden kann. Siehe die Abbildungen 1B und 2B für vereinfachte Flussdiagramme, die den Algorithmus beschreiben. Jeder Schnittpunkt zwischen den Gitterlinien und der Kontur der Form wird erkannt. Die Entfernung jeder Schnittmenge wird dann relativ zu einer Basislinie oder einem Ursprung berechnet. Auf diese Weise wandelt die LCPC-Transformation 2D-Formen in eine Reihe aufeinanderfolgender x-y-Koordinatenpaare um. Die x-Koordinate stellt die Position der Gitterlinie von null bis unendlich dar, während die y-Koordinate die Entfernung des Schnittpunkts zur Basislinie oder zum Ursprung darstellt. In dieser Form, die eine diskrete Sinuswelle ist, wird dann die Fast-Fourier-Transformation (FFT) angewendet, um die Daten vom "Positionsbereich" in den Frequenzbereich umzuwandeln. Wenn die x-Koordinate die Zeit darstellt, wäre der "Positionsbereich" in den Standardanwendungen des FFT äquivalent zum "Zeitbereich".

Während das radiale Gittersystem den Abstand jeder Schnittmenge vom Ursprung des radialen Gitters misst (Abbildung 1A), misst das parallele Gittersystem stets die Entfernung der Schnittpunkte mit Bezug auf eine imaginäre Linie links in der Form (Abbildung 2A). Das Open-Source-Skript bestimmt die Position dieser imaginären Linie, indem es den linkesten Pixel der Kontur findet und dann 10 Pixel nach links dieser Position verschiebt. Hier wird die x-Koordinate dieser Position zur Referenzlinie, von der aus alle Schnitte berechnet werden. Diese 10-Pixel-Regel ist willkürlich, aber deshalb müssen alle vom Open-Source-Skript für das Parallelgittersystem analysierten Konturen mindestens 15 Pixel Weißraum auf allen vier Seiten haben.

Bei 2D-Formen mit Falten oder mehreren Schichten können Gitterlinien die Kontur mehrmals schneiden. In diesem Fall werden die Entfernungen aller Schnittpunkte entlang eines Gitters zu einem einzigen Wert addiert. Daher hat jede Gitterlinie nur eine x-Koordinate und eine y-Koordinate. Diese Summe wird durch den Begriff "komprimiert" im Namen LCPC-Transformation dargestellt. Die Darstellung einer nichtlinearen 2D-Form in eine diskrete Sinuswelle wird durch den Begriff "linearisiert" im Namen des Algorithmus dargestellt. Schließlich ist der Begriff "Polarkoordinaten" im Namen des Algorithmus, weil das erste konzeptuale Gittersystem ein 180-Grad-Radialgitter mit Polarkoordinaten⁷ war. Selbst nachdem erkannt wurde, dass polare und kartesische Koordinaten austauschbar sind, blieb der Name des Algorithmus unverändert. Der Abschnitt Danksagungen beschreibt die persönlichen Gründe, die die Erfindung und Erweiterung der LCPC-Transformation motiviert haben.

Protokoll 1 war die Sequenz zur Erfassung der in Abbildung 3B gezeigten Daten, während Protokoll 2 die Sequenz zur Erfassung der in Abbildung 3C–D dargestellten Daten war. Die Schritte in diesen Protokollen werden in einzelnen Python-Skripten implementiert, die im GitHub-Repository "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform" verfügbar ^sind16. Protokoll 1 ist ein Beispiel für die Vorverarbeitungsschritte zur Ableitung der "reinen Form" zur Vorbereitung der LCPC-Transformation. Protokoll 2 ist ein Beispiel für Vorverarbeitungsschritte, um Formen "im Maßstab" zu messen, also auf ihren ursprünglichen Maßstäben relativ zueinander.

Die Segmentierung kann manuell in Bildverarbeitungssoftware wie Macs Vorschau oder Microsofts Paint oder mit Schwellenwert-basierten Methoden durchgeführt werden. Bei manueller Ausführung sollte eine der folgenden vier Farben gewählt werden: Blau, Grün, Rosa/Magenta oder Rot. Das GitHub-Repository namens "Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform"¹⁶ enthält einen Ordner namens "color extraction scripts". Dieser Ordner enthält vier Jupyter Notebook-Dateien mit Python-Code, die die vier genannten Farben extrahieren und in blaue Masken auf weißem Hintergrund umwandeln. Dieser Prozess kann auch durchgeführt werden, indem die Farbumrissfarbe in einer Bildverarbeitungssoftware wie Fiji/ImageJ geschwellenwert wird. Für Bilder, die Konturen mit berührenden Rändern oder überlappenden Kanten enthalten (z. B. ein Venn-Diagramm), müssen sie mit Bildverarbeitungssoftware getrennt werden, sodass sie unabhängige Objekte im zusammengesetzten Maskenbild mit mehreren organoiden Konturen werden. Dies gilt nicht für Bilder, die nur ein Organoid oder mehrere Organoide enthalten, die sich nicht berühren.

Protocol

Primäre menschliche Zellen, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden unter Ethikgenehmigungen und zuvor berichteten Verfahren zur informierten Einwilligung gewonnen und kultiviert¹⁷. Die hier präsentierten Bilder wurden aus diesen genehmigten Zellkulturen generiert und erstmals veröffentlicht. Gewebeproben wurden am Brigham and Women's Hospital und an der University of California, San Francisco, im Rahmen von der Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokollen von Patienten entnommen, die eine informierte Einwilligung für die Forschungsnutzung ihres Gewebes gegeben hatten, wie zuvor beschrieben¹⁷. Für diese Studie wurde keine zusätzliche menschliche Probenentnahme durchgeführt.

1. Extraktion der reinen Form von 2D-Organoidkonturen für die LCPC-Transformation

1. Segmentieren Sie die äußere Kante jedes Organoids mit beliebiger Bildverarbeitungssoftware, wie z. B. Microsofts Paint, MacOS' Vorschau oder Fiji/ImageJ.
2. Extrahiere die Konturen der Organoide als offene Masken, die blaue Linien auf weißem Hintergrund sind.
3. Isoliere jede blaue Kontur auf einer eigenen weißen Leinwand.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist nur notwendig, wenn ein Bild mehr als eine Kontur enthält.
4. Schneide jede Kontur so zu, dass auf allen vier Seiten des blauen Objekts ein Pixelrand entsteht.
5. Füge 100 Pixel Weißraum auf allen vier Seiten hinzu, um neue Ränder zu schaffen.
6. Drehen Sie die Objekte so, dass die längste innere Länge horizontal ist.
   HINWEIS: Dieser Schritt wandelt die längste innere Linie innerhalb jedes Objekts in die Breite des Objekts um. Für diesen Zweck stehen zwei Skripte zur Verfügung. Für geschlossene Formen verwenden Sie das Jupyter Notebook namens "Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb". Für offene Formen oder Formen mit mehreren Komponenten verwenden Sie das Jupyter Notebook namens "Rotate Green Line_v3.ipynb". Das Tool Grüne Linie drehen hat ein Videotutorial, das in der ReadMe-Datei im selben Ordner wie die .ipynb-Datei verlinkt ist.
7. Schneide jedes Bild so zu, dass auf allen vier Seiten des blauen Objekts ein Pixelrand vorhanden ist.
   HINWEIS: Dies ist dasselbe wie Schritt 1.4. Der Zweck des Trimmens dieses Mal ist jedoch, dass der nächste Schritt zur Größenanpassung die gesamte Leinwand vergrößert, nicht nur das blaue Objekt darin. Indem das blaue Objekt also nahezu die gleiche Breite und Höhe wie die Leinwand selbst ist, wird die Größe der Leinwand auf 400 Pixel Breite auch auf fast 400 Pixel Größe verkürzt. Es gibt ein Jupyter Notebook namens "Trim margin to 1-pixel border.ipynb".
8. Die Leinwandbreite jedes Bildes auf 400 Pixel anpassen und gleichzeitig das Seitenverhältnis einschränken.
   HINWEIS: Dieser Schritt sorgt dafür, dass jedes Objekt die gleiche Breite hat. Das Einschränken des Seitenverhältnisses verhindert, dass das Objekt während der Größenänderung verzerrt wird. Es gibt ein Jupyter Notebook namens "Resize width to 400 pixel, but constrain aspect ratio.ipynb".
9. Füge 100 Pixel Weißraum auf allen vier Seiten hinzu, um neue Ränder zu schaffen.
10. Drehen Sie jedes Bild entweder um 90 Grad im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn, um die längste innere vertikale Länge zu erhalten, was mit der Wahl aller Bilder übereinstimmt.
    HINWEIS: In der obigen Sequenz wird die reine Form durch sequentielle Umsetzung der Schritte 1.6, 1.7, 1.8 und 1.9 erhalten. Das Hinzufügen von Margin-Raum in Schritt 1.9 ist erforderlich, um Fehler in den LCPC-Transformationsskripten zu vermeiden, die als nächstes ausgeführt werden, aber nicht an der Extraktion der reinen Form beteiligt sind. Nutzer, die Formen "im Maßstabsgetreuen" messen möchten, müssen die Schritte 1.6, 1.7 und 1.8 in der obigen Sequenz nicht durchführen, sollten jedoch ihre Maskenbilder vorverarbeiten, um eine optimale Ausrichtung zu erreichen, bevor sie die LCPC-Transformation anwenden.
11. Führen Sie die LCPC-Transformation auf jeder Kontur durch. Verwenden Sie Python-Skripte, die für die radiale Gittermethode¹⁸ oder die parallele Gittermethode¹⁹ bereitgestellt werden.

2. Extraktion der maßstabsgetreuen Form von 2D-Organoidkonturen für die LCPC-Transformation

HINWEIS: Die Schritt-für-Schritt-Methode zur Extraktion der maßstabsgetreuen Form von Objekten ähnelt der zur Extraktion reiner Form in Protokoll 1 oben. Die Schritte sind in beiden Protokollen identisch benannt, um das Matching zu erleichtern. Bitte beachten Sie die Anmerkungen in Protokoll 1 für jeden Schritt. Der Hauptunterschied zwischen reiner Form und maßstabsgetreuer Form besteht darin, dass die maßstabsgetreue Form die Schritte 1.6, 1.7 und 1.8 nicht benötigt, die die Schritte, die Größe der Größe sind.

1. Segmentiere die äußere Kante jedes Organoids. Verwenden Sie einen rechnergestützten Ansatz oder machen Sie dies manuell über eine einfache Bildbearbeitungssoftware wie Microsofts Paint, MacOS Preview oder Fiji/ImageJ.
2. Extrahiere die Konturen der Organoide als offene Masken, die blaue Linien auf einer weißen Leinwand sind. Verwenden Sie Fiji/ImageJ, um Masken zu extrahieren, oder das bereitgestellte Python-Skript¹⁶.
3. Isoliere jede blaue Kontur auf einer eigenen weißen Leinwand. Verwenden Sie Fiji/ImageJ, um Masken zu extrahieren, oder das bereitgestellte Python-Skript¹⁶.
4. Schneide jede Kontur so zu, dass auf allen vier Seiten des blauen Objekts ein Pixelrand entsteht. Verwenden Sie Fiji/ImageJ oder das bereitgestellte^{Python-Skript 16}.
5. Füge 100 Pixel Weißraum auf allen vier Seiten hinzu, um neue Ränder zu schaffen. Verwenden Sie Fiji/ImageJ oder das bereitgestellte^{Python-Skript 16}.
6. Drehen Sie jede Kontur so, dass ihre längste innere Linie vertikal ist. Verwenden Sie Fiji/ImageJ oder das bereitgestellte^{Python-Skript 16}.
7. Führen Sie die LCPC-Transformation auf jeder Kontur durch. Verwenden Sie Python-Skripte, die für die radiale Gittermethode¹⁸ oder die parallele Gittermethode¹⁹ bereitgestellt werden.

Results

Die radiale LCPC-Transformation angewendet auf Brustkrebsorganoide

3D-Organoide und Tumore können verschiedene Formen annehmen, von denen einige für das menschliche Auge offensichtlich anders sind, obwohl traditionelle Metriken statistisch unsignifikante Unterschiede liefern. Organoide hingegen können auch Formen aufweisen, die für das menschliche Auge heterogen und daher unbedeutend erscheinen und wiederkehrende subtile Morphologien verbergen, die unterschiedliche Untertypen repräsentieren. Humane primäre Brustorganoide wurden von Patienten extrahiert und in 3D kultiviert, basierend auf einem zuvor veröffentlichten Protokoll 17,20,21. Abbildung 3A zeigt drei morphologische Kategorien, die auf der visuellen Inspektion zugänglich sind: einen zystischen Phänotyp, einen polyzystischen Phänotyp und einen dichten polyzystischen Phänotyp. Abbildung 3B zeigt, dass die äußeren Konturen dieser Organoide manuell segmentiert und ihre reine Form extrahiert wurden, wodurch der Einfluss der Größe auf ihre Form entfällt. Da die Konturen kreisförmig waren, wurde die radiale Gitter-LCPC-Transformation auf die reinen Formen angewendet, gefolgt von PCA. Beachten Sie, dass die auf Abbildung 3B überlagerten Konturen so gedreht wurden, dass die längste innere Linie vertikal ist, was bedeutet, dass ihre Orientierung nicht mit der in den Quellbildern übereinstimmt. Abbildung 3B zeigt ein Punktdiagramm der ersten beiden Hauptkomponenten (PCs), und K-Means-Clustering identifizierte drei Cluster: 0, 1 und 2. Silhouette Scores (SS) bestätigten die wahrscheinliche Existenz von zwei separaten Clustern zwischen Clustern 0 vs. 1 (SS = 0,68) und Clustern 1 vs. 2 (SS = 0,69), während sie eine schwache Trennung zwischen Clustern 0 und 2 (SS = 0,27) anzeigen. Trotz des schwachen Silhouettenwerts zwischen Cluster 0 und 2 rechtfertigt die Beschriftung der Datenpunkte mit der reinen Form jedes Datenpunkts, dass Cluster 2 den deutlichsten Phänotyp darstellt: stark asymmetrische, nicht-kreisförmige Konturen (die Dicke der Konturen spielt in diesem Fall keine Rolle).

Während die reine Form den Einfluss der Größe auf die Form beseitigt, was bei der Messung von Fläche und Volumen unmöglich ist, liefert die Messung der organoiden Konturen im Maßstab auch interessante Erkenntnisse. Abbildung 3C zeigt ein 3D-Punktdiagramm der ersten drei PCs, das aus der radialen Gitter-LCPC-Transformation auf Konturen resultiert, da diese ohne Größenänderung aus den Bildern segmentiert wurden. Dieser Ansatz bedeutet, dass die LCPC-Transformation sowohl die Form als auch die Größe der Organoide gleichzeitig misst. Abbildung 3C zeigt, dass die polyzystischen und dichten polyzystischen Organoide im Vergleich zu den zystischen Organoiden weniger dicht gepackt sind. Um diese Erweiterung zu quantifizieren, zeigt Abbildung 3D die Streuung jedes Phänotyps in seinem gemeinsamen PCA-Raum. Für jeden Phänotyp wird der durchschnittliche K-nächste Nachbarabstand (KNND) berechnet, was die visuelle Einschätzung der abnehmenden Dichte der Punkte von zystischen Organoiden (KNND = 1,061) zu polyzystischen Organoiden (KNND = 1,575) bis zu dichten polyzystischen Organoiden (KNND = 2,247) unterstützt; Diese verringerte Dichte der Punkte kann auch als verstärkte morphologische Heterogenität der äußeren Konturen interpretiert werden. Abschließend zeigt Abbildung 3E zum Vergleich der LCPC-Transformation mit der traditionellen Flächenmetrik, dass es zwar eine statistische Signifikanz zwischen der Fläche zystischer Organoide und dichten polyzystischen Organoiden gibt (p = 0,016, Wilcoxon-Rangsummentest), es jedoch keinen Hinweis auf die Fläche gibt, dass es drei verschiedene morphologische Gruppen über die Phänotypen hinweg gibt, wie sie durch K-means Clustering nach der reinen Form-LCPC-Analyse identifiziert wurden (Abbildung 3B) oder dass eine zunehmende morphologische Heterogenität besteht, wie durch die LCPC-Analyse im Maßstab gezeigt wird (Abbildung 3C–D). Abbildung 3E zeigt eine abnehmende Streuung der Datenpunkte von zystischen zu polyzystischen bis zu dichten polyzystischen Organoiden, was das Gegenteil dessen ist, was bei der LCPC-Analyse im Maßstab beobachtet wird (Abbildung 3C), wobei hervorgehoben wird, dass die vom LCPC-Transform erfassten räumlichen Informationen sich von der erfassten Fläche unterscheiden.

Der gleiche Ansatz gilt für einzelne 2D-Formen in Abbildung 3, und ergänzende Abbildung 1 gilt auch für die Kontur von Zellen in 2D-Zellkultur: Einzelzellen (wie rote Blutkörperchen) oder Zellcluster (wie bei zervikalen Pap-Abstrichen). Pilotstudien zu jedem dieser Fälle werden in Videos beschrieben: Formanalyse von Gehirnorganoiden, die unterschiedliche Grade von Faltung in ihrer äußeren Kontur^{zeigen 22}; Formanalyse von Lungenalveolen in situ, dieselben Prinzipien können auf die Analyse der 2D-Zellkultur²³ angewendet werden; Formanalyse von Zervikalgewebe aus Pap-Abstrichen, bei denen sowohl die Kontur des Zellkerns als auch der Zellmembran gleichzeitig mittels der radialen Gitter-LCPC-Transformation²⁴ quantifiziert werden; Formanalyse von roten Blutkörperchen, die mit Malaria infiziert sind, und Zellen, die an infizierte Zellen angrenzen, aber selbst nicht infiziert sind²⁵; Formanalyse roter Blutkörperchen, die von Sichelzellenanämie betroffen^{sind 26}.

Das parallele Gittersystem zur Messung von Dichte oder Textur als Index räumlicher Informationen

Räumliche Informationen umfassen mehr als die üblichen Begriffe von Form, wie etwa Rechteckigkeit, Rundung und Krümmung, da sie Konzepte wie Textur und Dichte umfasst. Komplexe röhrenförmige Netzwerke wie Blutgefäße oder verzweigte Netzwerke wie zytoskelettale Filamente passen nicht in den Begriff Form im gleichen Sinne wie unsere geometriebasierte Intuition von Formen, wie Kreise und Polygone. Dichte und Textur sind jedoch sehr nützliche Begriffe räumlicher Information, um die Struktur und Funktion von Zellen, Organoiden und Tumoren zu verstehen. Bei der Quantifizierung komplexer Netzwerke in der Fluoreszenzbildgebung messen Zellbiologen Merkmale wie die durchschnittliche Signalintensität innerhalb eines Bildes oder den Prozentsatz der Gesamtfläche eines Bildes, der ein Signal enthält. Diese Ansätze erkennen an, dass räumliche Informationen mehr zu bieten haben als das, was in Form von geometrischen Motiven beschrieben wird.

Das Muster der Gefäßnetzwerke in Geweben, Tumoren und Organen auf einem Chip lässt sich nicht leicht durch traditionelle geometrische Motive definieren, profitiert jedoch von der Interpretation als Textur und Dichte. Die vaskuläre Remodellierung bei der Tumorentwicklung und Behandlungsresistenz ist ein gut etabliertes Merkmal von Krebs (Übersicht in²⁷). Histopathologische Schnitte von 458 primären neuroblastischen Tumoren wurden analysiert,^wobei die Dichte, Größe und Form aller Blutgefäße und Gefäßsegmente charakterisiert wurden. Sie stellten fest, dass Blutgefäße größer, zahlreicher und unregelmäßiger geformt waren bei Tumoren von Patienten mit schlechten prognostischen Faktoren im Vergleich zu den Tumore der günstigen Kohorte. Interessanterweise wurde ein Begriff namens "Gefäße, die Tumorcluster einkapseln" (VETC)²⁹ geprägt, um ein Muster von Blutgefäßen zu beschreiben, die Cluster kleiner Tumoren innerhalb eines größeren hepatozellulären Karzinoms umgeben und mit höheren Metastasen und Rückfällen assoziiert sind. Die gleiche Gruppe, die den Begriff später prägte, stellte fest, dass VETC-positives hepatozelluläres Karzinom mit einer positiven Reaktion auf die Behandlung mit dem Kinase-Inhibitor Sorafenib³⁰ korreliert. Daher ist die Fähigkeit, Gefäßmuster zu quantifizieren, entscheidend für die Prognose und das Verständnis von Resistenzmechanismen.

Zur Quantifizierung dichter Netzwerke von Röhren, Inseln und Ästen ist das parallele Gittersystem der LCPC-Transformation nützlich, um das zu messen, was als Texturdichte statt Form bezeichnet werden kann. Als Beispiel dafür, wie die parallele Gitter-LCPC-Transformation dies bewirken kann, zeigt Abbildung 4A Muster kardialer Mikrovaskulaturmuster aus einer Untersuchung der Herzgefäße³¹: Für das bloße Auge ist es sehr schwierig, objektiv und quantitativ die Muster zwischen den infarkierten Bereichen und den Bereichen in einem vom Verletzungsort entfernten Bereich zu unterscheiden. Durch das Entfernen der Maske der Blutgefäße (Abbildung 4A Schritt 1) und Anwendung der parallelen LCPC-Transformation können quantitative Unterschiede beobachtet werden. Zunächst wurde zur Verbesserung der Sauberkeit der Daten jedes Bild mit einem Kreis mit gleichmäßigem Durchmesser beschnitten, der in der Mitte des quadratischen Bildes zentriert ist (Abbildung 4A Schritt 2), was sicherstellt, dass jedes Bild unabhängig von Drehungen die gleiche Höhe und Breite hat. Als nächstes werden die beschnittenen Bilder so gedreht, dass die Hauptachse der Gefäße (rote Doppelpfeile in Abbildung 4A Schritt 1) vertikal ist (Abbildung 4A Schritt 3). Anschließend wird eine blaue Linie auf den Bildumfang gelegt, um sicherzustellen, dass selbst Bilder mit spärlichen Gefäßmustern den gleichen Durchmesser in Bezug auf blaue Pixel haben (Abbildung 4A, Schritt 4). Die Schritte 3 und 4 wurden mit der Fiji/ImageJ-Software (v2.14.0) durchgeführt. Schließlich wird die parallele Gitter-LCPC-Transformation angewendet (Abbildung 4A Schritt 5). Die Analyse der Ergebnisse mittels PCA und das Plotten der ersten drei PCs zeigt, dass die infarcierten Regionen sich getrennt von den abgelegenen Regionen gruppieren (Abbildung 4B). Berechnungen des Chamfer-Abstands (CD) quantifizieren die visuellen Muster, die in den Graphen gezeigt werden. Einen Tag nach der Verletzung zeigt die infarkte Stelle ein Gefäßmuster, das weiter vom basalen Zustand entfernt ist (Basal vs. 1Day_infarct: CD = 83,89) als die nicht verletzte Stelle (Basal vs. 1Day_remote: CD = 53,95). Einen Tag nach der Verletzung liegt die nicht verletzte entfernte Stelle näher am verletzten Ort (1Day_remote vs. 1Day_infarcxt: CD = 34,48) als am Basalzustand. Drei Tage nach der Verletzung zeigen die Gefäßmuster der verletzten Stelle und des zugehörigen nicht verletzten entfernten Ortes eine drastische Abweichung vom Basalzustand und voneinander (Basal vs. 3Days_Infarct: CD = 240,63; Basal vs. 3Days_Remote: CD = 67,28; 3Days_Remote gegen 3Days_Infarct: CD = 168,35). Sehr interessant ist, dass 7 Tage nach der Verletzung die Gefäßmuster der verletzten Stelle und der nicht verletzten entfernten Stelle einen 3D-Raum einnehmen, der ungefähr orthogonal zur Basalerkrankung ist und in einer Entfernung ausgerichtet ist, die näher ist als 1 Tag nach der Verletzung (CD = 24,76 für Tag 7 im Vergleich zu 34,48 für Tag 1). Die Daten deuten auf zwei Dinge hin: (1) Im Verlauf der Heilung nimmt das Gefäßmuster der verletzten Stelle und des nicht verletzten entfernten Ortes Muster an, die sich vom Basalzustand unterscheiden; (2) Das an der verletzten Stelle aktivierte Rekonstruktionsprogramm löst ebenfalls ähnliche morphologische Veränderungen an den zugehörigen nicht verletzten entfernten Orten aus.

Als Referenz für die Vielseitigkeit der LCPC-Transformation wurden die traditionellen Metriken von Flächenprozent (Abbildung 5A) und Gesamtumfang (Abbildung 5B) der Blutgefäße berechnet. Obwohl Fläche und Umfang Veränderungen zwischen Punkten im Zeitverlauf zeigen, liefern sie keine kohärente Quantifizierung unterschiedlicher räumlicher Anordnungen von Schiffen. Fläche und Umfang sind Abstraktionen, die viele verschiedene Gefäßanordnungen repräsentieren können und daher keine Aufschluss darüber geben, wie sich die räumliche Anordnung der Gefäße über die Behandlungsbedingungen und den Zeitverlauf hinweg verändert. Mit einem n = 3 für jede Gruppe sind der t-Test und der Wilcoxon-Test unzuverlässig. Cliffs Delta ist nichtparametrisch und funktioniert gut, um eine Verschiebung der Effektgröße zu zeigen. Der Hauptunterschied, der durch die Messung der Flächenanteil der Blutgefäße festgestellt wird, liegt zwischen dem Basalzustand und den 7-Tage-Zeitpunkten; Für den gesamten Umfang der Blutgefäße liegen die Unterschiede zwischen der Basalerkrankung im Vergleich zu der 1-Tages-Erkrankung und der Basalerkrankung im Vergleich zur 7-Tage-Erkrankung. Fläche und Umfang zeigen jedoch keinen Hinweis darauf, dass es Unterschiede zwischen den infarktierten Standorten und ihren nicht verletzten abgelegenen Standorten gibt, was sehr überraschend ist, da die infarkierte Stelle absichtlich verletzt wurde. Hier zeigt sich die Vielseitigkeit der LCPC-Transformation im Vergleich zu traditionellen Kennzahlen. Für jede Probe erzeugen die Ergebnisse der FFT als Teil der LCPC-Transformation eine Menge von Größen, die mit einer Menge von Frequenzen verbunden sind. Die Größen jedes Frequenzbins können gemittelt und dann über die Behandlungsgruppen hinweg verglichen werden (ergänzende Abbildung 1). Dies ermöglicht eine einfache Einschätzung, welche Frequenzbins die größten Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen aufweisen. Abbildung 5C zeigt sechs Bins, die deutliche Unterschiede in der Effektgröße zwischen verschiedenen Behandlungsgruppen aufweisen, insbesondere zwischen den infarkierten Standorten und den zugehörigen nicht verletzten entfernten Standorten, deren Fläche und Umfang keinen Unterschied zeigten. Die unabhängigen Werte in diesen sechs Bins liefern mehrere Indizes, die quantitative Unterschiede zwischen den Behandlungszuständen zeigen. Interessanterweise ähnelt das Muster zwischen den Gruppen für Bin 1 der LCPC-Transformationsergebnisse dem Ergebnis der Messung des Gesamtumfangs. Die anderen Indizes zeigen jedoch quantitative Unterschiede, die sowohl in der Fläche als auch im Umfang verborgen sind. Indizes einzigartig für die Basalerkrankung: Bin 49, Bin 56, Bin 21. Indizes, die zwischen den Tag-1-Gruppen einzigartig sind: Bin 1, Bin 6, Bin 49. Indices, die einzigartig für die Tag-3-Gruppen sind: Bin 6, Bin 112, Bin 49. Indizes einzigartig für die Gruppen von Tag 7: Bin 6, Bin 49, Bin 112. Diese Daten unterstreichen die Vielseitigkeit und Präzision der LCPC-Transformation gegenüber den traditionellen Ansätzen von Fläche und Perimeter.

Abbildung 1: Beschreibung des radialen Gittersystems der LCPC-Transformation. (A) Schritt 1: Die interessante Form wird segmentiert und als blaue Maske extrahiert. Schritt 2: Eine Begrenzungsbox (auch das kleinste Rechteck genannt, das das Objekt auf allen vier Seiten umschließt und berührt) wird für die Maske bestimmt. Ein System radialer Gitterlinien, die vom Zentrum der Begrenzungsbox ausgehen, wird auf die Maske gelegt. Die Entscheidung, das Zentrum der Begrenzungsbox statt des Schwerpunkts des Objekts als Ursprung zu wählen, war willkürlich. Schritt 3: Der Abstand jeder Schnittlinie zwischen einer Gitterlinie und der Form wird relativ zum Ursprung berechnet. Gitterlinien, die mehr als einen Schnitt haben, summieren all diese Schnittabstände zu einem Wert für diese Gitterlinie. Schritt 4: Die FFT wird angewendet, um die Daten aus Schritt 3 in ein Frequenzdiagramm umzuwandeln, eine statische mehrdimensionale Darstellung (Schritt 5) der Form in Schritt 1. Schritt 6: Ein skalarer Wert kann aus Schritt 5 über einen Index erstellt werden. Siehe Abbildung 10 für eine Diskussion über Arten von Indizes zu berechnen. (B) Ein Flussdiagramm, das eine vereinfachte Beschreibung der Schritte der LCPC-Transformation für das radiale Gittersystem zeigt. (C) Beispielformthemen, für die das radiale Gittersystem optimal ist. Die Formen wurden in Microsoft PowerPoint gezeichnet. Diese Bilder wurden von Autoren erstellt und erfordern keine Veröffentlichungslizenz oder Urheberrechtserlaubnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Beschreibung des parallelen Gittersystems der LCPC-Transformation. (A) Schritt 1: Die interessierende Form wird manuell segmentiert und als binäre Maske extrahiert. Schritt 2: Ein paralleles Gittersystem wird auf die Form gelegt, die so gedreht wird, dass die Basis horizontal ist. Schritt 3: Der Abstand jeder Schnittlinie zwischen einem Gitter und der Form wird relativ zur Basislinie berechnet. Gitterlinien, die mehr als einen Schnitt haben, summieren all diese Schnittabstände zu einem Wert für diese Gitterlinie. Schritt 4: Die FFT wird angewendet, um die Daten aus Schritt 3 in ein Frequenzdiagramm umzuwandeln, eine statische mehrdimensionale Darstellung der Form in Schritt 1. Schritt 6: Ein skalarer Wert kann aus Schritt 5 über einen Index erstellt werden. Siehe Abbildung 10 für eine Diskussion über Arten von Indizes zu berechnen. (B) Ein Flussdiagramm, das eine vereinfachte Beschreibung der LCPC-Transformationsschritte für das Parallelgittersystem liefert. (C) Beispiele formen Themen, für die das parallele Gittersystem optimal ist. Die Formen wurden in Microsoft PowerPoint gezeichnet. Diese Bilder wurden von Autoren erstellt und erfordern keine Veröffentlichungslizenz oder Urheberrechtserlaubnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Die LCPC-Transformation identifiziert morphologische Subtypen von Brustkrebsorganoiden objektiv. (A) Primäre menschliche Brustorganoide wurden wie zuvor berichtet 17,20,21 und wie in Supplementary File 1 beschrieben, abgeleitet. Drei Phänotypen konnten beobachtet und anhand der visuellen Inspektion klassifiziert werden: zystisch, polyzystisch und dicht polyzystisch. Skalenleiste = 50 μm. (B) Die äußeren Konturen der Organoide wurden manuell segmentiert (Ergänzende Abbildung 2; Kriterien beschrieben in Ergänzungsakte 1), und die reine Form dieser Konturen wurde ermittelt. Beachten Sie, dass alle Konturen im Diagramm so gedreht sind, dass die längste innere Linie vertikal ist; daher entsprechen sie nicht ihrer ursprünglichen Ausrichtung. Anschließend wurde die radiale Gitter-LCPC-Transformation angewendet und die Ergebnisse über PCA analysiert. K-means Clustering identifizierte drei Cluster (0, 1 und 2), und Silhouette Scores (SS) wurden berechnet, um ihre Existenz zu bestätigen. Cluster 0 vs 1, SS: 0,68; Cluster 0 vs 2, SS: 0,27; Cluster 1 vs 2, SS: 0,69. (C) Die äußeren Konturen der Organoide wurden ebenfalls mittels der radialen LCPC-Gitter-Transformation auf ihren maßstabsgetreuen Formen gemessen, also den Formen, wie sie in den Bildern relativ zueinander erscheinen, ohne jegliche Größenänderung. Die Einlage ist vergrößert, um die lockerere Packung polyzystischer und dichter polyzystischer Organoide im Vergleich zu den zystischen Organoiden zu zeigen. Für B und C: Grün = zystisch, Lila = polyzystisch, Gelb = dichte polyzystisch. (D) Die ersten drei PC-Werte werden für jeden Phänotyp separat dargestellt, und der durchschnittliche KNND wird berechnet, um zu zeigen, dass der zystische Phänotyp am dichtesten gepackt ist, während die polyzystische und dichte polyzystische Phänotypen eine geringere Dichte aufweisen (also mehr Heterogenität). Obwohl sie separat geplott werden, teilen sich alle drei Phänotypen denselben PCA-Raum. Für den zystischen Phänotyp wurde der durchschnittliche KNND aus dem Inset berechnet, da Ausreißer, die nur in diesem Phänotyp vorhanden sind, die Berechnung verzerren. Durchschnittliche KNNDs: Zystisch, 1,061; Polyzystisch, 1,575; Dichte polyzystische Variante, 2,247. (E) Box-Diagramme der Fläche der Organoide zeigen eine abnehmende Streuung der Datenpunkte von zystischen zu polyzystischen bis zu dichten polyzystischen Organoiden, was das Gegenteil von dem ist, was in der LCPC-Analyse im Maßstab beobachtet wird (Abbildung 3C), was hervorhebt, dass die räumlichen Informationen, die von der LCPC-Transformation erfasst werden, von denen abweichen, die der Bereich erfasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Messung der Texturdichte mit der parallelen Gitter-LCPC-Transformation. (A) Photomikrographographien der Mikrovaskulatur im Herzgewebe wurden zuvor in einer anderen Studie^31,32 erstellt. Die Bilder stammen aus diesen Studien nicht als solche; vielmehr stellen sie neue Ansichten dar, die aus demselben ursprünglichen 3D-Bilddatensatz stammen, der³¹ gemeldet und von Gkontra bereitgestellt wurde. Obwohl der Datensatz bereits veröffentlicht wurde, werden die hier gezeigten spezifischen Bilder erstmals veröffentlicht. Bilder von den abgelegenen Orten, die zu jedem Zeitpunkt nicht verletzt waren, werden nicht gezeigt. Schritt 1: Eine 2D-Maske wird erzeugt und die allgemeine Ausrichtungsachse der Gefäße bestimmt (roter Doppelpfeil). Schritt 2: Ein kreisförmiger Bereich im Mittelpunkt des Bildes wird erzeugt, um jedes Bild nach der Rotation der Bilder im nächsten Schritt auf die gleiche Höhe zu bringen (das Drehen des quadratischen Bildes in unterschiedlichem Maße verändert je nach Rotationsgrad die Bildhöhe). Schritt 3: Jedes Bild wird so gedreht, dass die in Schritt 1 bestimmte allgemeine Ausrichtungsachse vertikal ist. Schritt 4: Um jedes Bild wird ein einheitlicher blauer Rand angebracht, um sicherzustellen, dass jedes Bild denselben Durchmesser hat, da Bilder mit dünneren Dichten kürzer sein können (Beispiel: siehe "7 Tage nach dem Myokardfarkt" in Schritt 3). Schritt 5: Die parallele Gitter-LCPC-Transformation wird angewendet. (B) Punktdiagramme der ersten drei PCs der Ausgabe der parallelen Gitter-LCPC-Transformation (Lila: Basalzustand, Grün: infarkierte Stelle, Gelb: nicht verletzte Stelle weit entfernt von der infarkierten Stelle). Siehe den Ergebnisabschnitt für die Berechnungen der Fassdistanz zu jedem Zeitpunkt zwischen den drei Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Die LCPC-Transformation misst Merkmale, die im Bereich und am Umfang verborgen sind. Zum Vergleich mit traditionellen Formmetriken wurden (A) die prozentuale Fläche und (B) der gesamte Umfang der Gefäßnetze gemessen. (C) Um die Genauigkeit zu zeigen, die aus dem Ergebnis der LCPC-Transformation erzielt werden kann, wurde der Wert der einzelnen Frequenzbins, die aus der FFT resultieren, verglichen (ergänzende Abbildung 1). Sechs Frequenzbins wurden als Indizes ausgewählt, um Unterschiede zwischen Behandlungsgruppen objektiv quantifizieren zu können. Für alle Panels wurde aufgrund der begrenzten Stichprobengröße jeder Gruppe (n = 3) das nichtparametrische Cliff-Delta für die Effektgröße berechnet, anstelle eines p-Werts aus dem Wilcoxon-Rangsummentest. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Die Bedeutung, Formen systematisch zu orientieren, um saubere Daten zu extrahieren. (A) Ein Beispiel identischer Formen, die Spiegelbilder voneinander sind, und wie das parallele Gittersystem ihre unterschiedliche Ausrichtung bestimmt und somit unterschiedliche Ergebnisse liefert. (B) Ein Beispiel dafür, wie Form 2 horizontal umgedreht werden kann, sodass ihre Orientierung nun mit Form 1 übereinstimmt und ein fairerer Vergleich zu Form 1 wird. In dieser Konfiguration liefert die parallele Gitter-LCPC-Transformation für Shape 1 und Shape 2 die gleichen Ergebnisse. Diese Änderung der Orientierung sollte nur erfolgen, wenn kein räumlicher Kontext vorliegt, der darauf hindeutet, dass Form 2 nicht verändert werden sollte. (C) Ein Beispiel für vier Varianten von Objekten, die wie die Zahl "3" aussehen, wobei einige in die falsche Richtung zeigen. (D) Ein Beispiel, wie jedes Objekt so ausgerichtet werden kann, dass die Sauberkeit der Daten, die durch die parallele Gitter-LCPC-Transformation entstehen, maximiert werden können. (E) Ein Beispiel für die Messung der breiteren Wölbung der Elemente in Panel C basierend auf denselben Ausrichtungsregeln wie bei Panel D. (F) Ein Beispiel für die Messung der großen Glühbirnen der Elemente in Panel C, wobei deren Ausrichtungskontext wie in Panel D beibehalten wird. Die Motivation, die Ausrichtungsregeln in Panel D beizubehalten, besteht darin, den Beitrag der räumlichen Informationen in der breiteren Ausbuchtung relativ zum Beitrag der schmaleren Ausbuchtung innerhalb dieser Regeln zu analysieren. Siehe ergänzende Abbildung 3 für die FFT-Spektren, die mit C–F assoziiert sind. Die Bilder in A–B sind Symbole aus Microsoft PowerPoint. Die Formen in C-F wurden in Microsoft PowerPoint gezeichnet. Diese Bilder wurden von Autoren erstellt und erfordern keine Veröffentlichungslizenz oder Urheberrechtserlaubnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Die Unfähigkeit traditioneller Formmetriken, offensichtlichen Kontext zu registrieren. (A) Die Reihe der Häkchen hat die gleiche Form, nimmt aber von links nach rechts zu. In dieser Serie ist der Bereich jedes Häkchens unterschiedlich, während das Formkonzept gleich bleibt: Das heißt, sie behalten den gleichen Typ der Häkchen. (B) Ein Quadrat wird um sein Zentrum um 45 Grad gedreht, bis sein Formkonzept zu dem wird, was Menschen einen Diamanten nennen. Während das Formkonzept eines Quadrats sich stark von dem eines Diamanten unterscheidet, werden die Zwischenrotationen subjektiv als "geneigte Quadrate" oder "geneigte Diamanten" interpretiert. Die LCPC-Transformation kann den Unterschied in jedem Schritt dieser Reihe objektiv und präzise messen. Die Formen wurden in Microsoft PowerPoint gezeichnet. Diese Bilder wurden von Autoren erstellt und erfordern keine Veröffentlichungslizenz oder Urheberrechtserlaubnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8: Erklärung von reiner Form vs. maßstabsgetreuer Form. Objekte "im Maßstab" zu messen bedeutet, die Form von Objekten entsprechend ihrer ursprünglichen Größe zueinander zu messen. "Reine Form" hingegen bedeutet, die Form verschiedener Objekte in einem ähnlichen Maßstab zu messen, wodurch der Einfluss der Größe auf die Form entfällt. Es ist wichtig, eine objektive Methode zu finden, um die zu vergleichenden Objekte zu dimensionieren. Die längste interne Leitung ist oft eine optimale Wahl (Schritt 1). Beide Objekte werden so gedreht, dass die längste innere Linie horizontal ist (Schritt 2). In diesem Fall werden die beiden Objekte ebenfalls so gedreht, dass die eingedrückte Seite nach unten zeigt. Als Nächstes wird die Breite jedes Objekts, die nun die gleiche Größe wie die längste innere Linie jedes Objekts hat, auf 400 Pixel verkleinert, wobei das Seitenverhältnis begrenzt wird, um eine Verschiebung der Objekte zu verhindern (Schritt 3). Schließlich ist es optional, die neu dimensionierten Objekte um 90 Grad (Schritt 4) (in diesem Fall gegen den Uhrzeigersinn) zu drehen, bevor die LCPC-Transformation angewendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 9: Beispiel für räumliche Marker für die Krebsforschung. (A) Ein hypothetisches Beispiel für Zellen, die in 2D-Kultur wandern, indem sie ihre Lamellipodien in Richtung Migration ausdehnen. Im Kontext der migratorischen Morphologie von Epithelzellen ist es am sinnvollsten, die Kontur jeder Zelle so auszurichten, dass die längste innere Linie, die mit der Migrationsachse ausgerichtet ist, vertikal ist, um den räumlichen Kontext zu erfassen. (B) Hypothetische Beispiele von Tumoren oder präkanzerösen Läsionen, die in einem Gehäuse wachsen, das seine Form nicht verändert. Die Läsion wächst aus einem Stängel, der die zentrale Stützstruktur bildet. Wenn die Läsion wächst oder schrumpft, bewegt sich ihre Kontur zur inneren Wand des Gehäuses hin oder weg von ihm. Die gestrichelten Linien stellen eine rationale und objektive Methode dar, um zu definieren, wie viel der Einhülle nachgezeichnet werden sollte (orange Linie), sodass nicht zu wenig oder zu viel zusätzliche Informationen hinzugefügt werden. (C) Option 1 zeigt die parallele Gitter-LCPC-Transformation, angewandt auf die Kontur der Läsionen ohne Kontext darüber, wo sich das Umschloss befindet. Option 2 zeigt dasselbe, aber einschließlich des räumlichen Kontexts, an dem sich die Einhülle befindet. Als Beispiel stellen die roten Punkte die Schnittpunkte zwischen der Gitterlinie (schwarzer Pfeil, grüne Linie) und der Kontur dar. Option 2 führt dazu, dass jede Gitterlinie eine vierte Schnittlinie bildet, die in Option 1 nicht existiert, was dem Ergebnis in Option 2 quantitativ einen räumlichen Kontext hinzufügt, der in Option 1 völlig fehlt. Die Formen wurden in Microsoft PowerPoint gezeichnet. Diese Bilder wurden von Autoren erstellt und erfordern keine Veröffentlichungslizenz oder Urheberrechtserlaubnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 10: Hypothetische FFT-Ergebnisse und daraus abgeleitete gemeinsame Indizes. (A) Das Frequenzdiagramm, das aus der FFT zweier hypothetischer Formen resultiert, wird angezeigt. Da die Größen in Bin 3 und Bin 4 den entgegengesetzten Trend zeigen, ist ein Verhältnis zwischen diesen beiden Bins ein guter Index, der einen Unterschied zwischen diesen beiden Formen darstellt. Die roten und grünen gestrichelten Linien stellen andere Frequenzbins dar, die zur Ableitung guter Indizes verwendet werden könnten. (B) Ein Histogramm zweier hypothetischer Formen, deren FFT-Profile einen schrittweise abnehmenden Trend als Darstellung ihrer morphologischen Unterschiede zeigen. (C) Ein Histogramm zweier hypothetischer Formen, deren FFT-Profile sich im zentralen Bereich entlang der Frequenzbins am meisten unterscheiden. (D) Beispiele für hypothetische morphologische Merkmale, die Indizes liefern können, die mit ihrem Vorhandensein korrelieren. Die Formen wurden in Microsoft PowerPoint gezeichnet. Diese Bilder wurden von Autoren erstellt und erfordern keine Veröffentlichungslizenz oder Urheberrechtserlaubnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Abbildung 1: Box-Whisker-Diagramme, die die Größen verschiedener Frequenzbins über die LCPC-Transformationsergebnisse von Gefäßnetzen vergleichen. Die LCPC-Transformation der in den Abbildungen 4 und 5 dargestellten Gefäßnetze liefert eine Menge von Frequenzbins und deren Größen, die jedes Bild repräsentieren. Box-Whisker-Diagramme der Beträge in jedem Bin werden verwendet, um alle Behandlungsgruppen zu vergleichen und zu bestimmen, welcher Bin am besten als Index zur Stäterung der Texturdichte dient, gemessen durch die LCPC-Transformation. Jede Box-Whisker-Grafik besteht aus n = 3 unabhängigen Bildern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Beispiel für segmentierte Brusttumororganoide. Organoide wurden manuell von einem Experten segmentiert, der sie routinemäßig kultiviert und unter Mikroskopie betrachtet. Diese Abbildung zeigt Beispiele segmentierter organoider Konturen. Der Maßstab für alle mikroskopischen Bilder beträgt 50 μm. Primäre menschliche Zellen, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden unter ethischen Genehmigungen und informierten Einwilligungsverfahren gewonnen und kultiviert, berichtet²¹. Die hier präsentierten Bilder stammen aus diesen zugelassenen Zellkulturen und werden erstmals veröffentlicht. Es wurde keine weitere menschliche Probenentnahme durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: FFT-Spektren für Formen in Abbildung 6. Die Ergebnisse der FFTs für die Formen in Abbildung 6 werden hier dargestellt, damit die Leser die Auswirkungen einer Änderung der Formorientierung auf ihre räumlichen Informationen verstehen können. Die linke Spalte der Graphen hat unveränderte y-Achsen, während die rechte Spalte abgeschnittene Achsen besitzt, sodass die kleineren Bin-Werte sichtbar werden können. (A) Spektren aus der parallelen LCPC-Transformation der vier Formen in Abbildung 6C , wie sie dargestellt werden, was bedeutet, dass keine Neuorientierung erforderlich ist. (B) Spektren der parallelen Gitter-LCPC-Transformation der in Abbildung 6D beschriebenen Formen, die wie im Text beschrieben neu ausgerichtet wurden. (C) Spektren der parallelen Gitter-LCPC-Transformation von Formen in Abbildung 6E. (D) Spektren aus der parallelen Gitter-LCPC-Transformation von Formen in Abbildung 6F zum Vergleich mit denen in Abbildung 6E. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Akte 1: Umfassende Details zu Best Practices für die LCPC-Transformation. Diese ergänzende Akte bietet ausführliche Diskussionen zu Best Practices und weitere methodische Hinweise. Die Gliederung des Dokuments ist wie folgt: Abschnitt 1 – Räumlicher Kontext, den Fläche, Volumen, Umfang und Rauheit nicht erfassen können. Abschnitt 2 – Best Practices für die Verwendung der LCPC-Transformation und Interpretation von Ergebnissen. Abschnitt 3 – Verstehen Sie die inhärente Polarität der Natur, um die LCPC-Transformation zu maximieren. Abschnitt 4 – Interpretation von FFT-Spektren, die aus der LCPC-Transformation resultieren. Abschnitt 5 – Wie man Formen vor der Messung mit der LCPC-Transformation orientiert. Abschnitt 6 – Was ist "Reine Form" vs. "In Scale Shape"? Abschnitt 7 – Methodologische Anmerkungen zu statistischen Methoden. Abschnitt 8 - Methodologische Hinweise zur Zellkultur und Segmentierung von Organoiden. Abschnitt 9 – Parameter der FFT für diejenigen, die ihre eigene LCPC-Transformation programmieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Wie bei jedem rechnergestützten Werkzeug hängt die Qualität des Outputs davon ab, ob die Eingaben den erwarteten Regeln entsprechen, um die das Werkzeug entwickelt wurde. Die folgenden Regeln sollten befolgt und als Qualitätskontrollprüfungen verwendet werden, wenn die bereitgestellten Python-Skripte verwendet werden. Stelle zuerst sicher, dass die offenen Masken blaue Linien auf weißem Hintergrund sind. Blau war eine willkürliche Entscheidung und hat keine Bedeutung, aber die Skripte, die die LCPC-Transformation durchführen, wurden so geschrieben, dass sie nach blauen Pixeln auf weißem Hintergrund suchen. Zweitens: Führen Sie die LCPC-Transformationsskripte nicht auf Bildern aus, die auf allen vier Seiten weniger als 10 Pixel Weißraum haben. Siehe dieses Video für eine Erklärung warum: "The Margin Thickness Parameter – How to Prepare Shape Lines" ³³. Drittens geht dieses Skript davon aus, dass die Umrisse Ihres Objekts blaue Pixel auf weißem Hintergrund sind. Die Dicke der Linie sollte zwischen 5 und 10 Pixel liegen. Sieh dir dieses Video für eine Erklärung dazu an: "The Line Thickness Parameter – How to Prepare Shape Outlines"³⁴. Viertens: Führe die LCPC-Transformationsskripte nicht auf leeren Bildern aus. Das führt zu einem Fehler im Skript. Fünftens: Führen Sie die LCPC-Transformationsskripte nicht auf Bildern aus, die nur aus einem Staubfleck bestehen. Dies führt zu einem Fehler, weil das Gittersystem den Fleck möglicherweise nicht erkennt und daher versucht, ein leeres Bild zu analysieren. Sechstens: Führen Sie die LCPC-Transformationsskripte nicht auf Bildern aus, die unerwünschte Schmutzflecken enthalten. Die Trümmer verändern Höhe und Breite des offenen Maskenobjekts und führen dadurch zu ungenauen Ergebnissen. Siebtens: Sieh dir dieses Video an, um zu verstehen, warum es wichtig ist, die Maßstäbe deiner Objekte zu verstehen, bevor du sie mit der LCPC-Transformation analysierst: "The Scale Parameter – How to Prepare Shape Outlines"³⁵.

Einer der erstaunlichsten Aspekte der LCPC-Transformation ist ihre Fähigkeit, räumlichen Kontext zu erfassen. Die Biologie ist voller räumlicher Kontexte, die entscheidend für das Verständnis der Natur ist. Zum Beispiel haben Epithelzellen die apikal-basale Polarität 36,37,38,39. Darüber hinaus hat die Richtung der Schwerkraft, die unter Mikrogravitationsbedingungen verändert wird, erhebliche Auswirkungen sowohl auf die Physiologie der Astronauten^40,41 als auch auf die Krebszellmorphologie 42,43,44. Schließlich können in situ Präneoplasie und Neoplasien über einen Stängel, der als zentrale Stützstruktur dient und Zugang zur Blutversorgung bietet, zu Lumen heranwachsen. Wenn diese Läsionen also zurückgehen, regressieren sie sowohl weg von der Luminalhöhle als auch zum Stängel^45,46. Da sie dafür entwickelt wurde, ist die LCPC-Transformation sehr empfindlich gegenüber räumlichem Kontext und kann daher zusätzliche Heterogenität verursachen, wenn der Benutzer nicht vorsichtig ist. Abbildung 6 beschreibt, wie man Formen systematisch orientiert, bevor die LCPC-Transformation angewendet wird. Abbildung 7 beschreibt, wie traditionelle Geometrie Formkonzepte nicht messen kann, die für Menschen offensichtlich sind. Abbildung 8 zeigt ein Diagramm, das den Unterschied zwischen der Messung reiner Form und maßstabsgetreuer Form visualisiert. Abbildung 9 beschreibt, dass der räumliche Kontext oft übersehen wird, wenn Formen in 2D-Kultur, Histologie und 2D-Schnitten aus 3D-Bildgebung quantifiziert werden. Beachten Sie, dass Ergänzungsakte 1 aufgrund von Platzbeschränkungen eine ausführliche Diskussion von Abbildung 6 und Abbildung 7 in Abschnitt 5 sowie Abbildung 8 und Abbildung 9 in Abschnitt 6 enthält.

Da die FFT multidimensionale spektrale Daten erzeugt, ist es wichtig, dass der Nutzer sich daran gewöhnt, Indizes aus wiederkehrenden Mustern in den Spektren abzuleiten. Obwohl dieses Manuskript die LCPC-Transformation als den Schritt der Anwendung der FFT bezeichnet, findet die eigentliche LCPC-Transformation vor dem FFT-Schritt statt (Abbildung 1A–B Schritt 4, Abbildung 2A–B Schritt 3). Die Anwendung der FFT liefert jedoch objektive, systematische Erkenntnisse aus dem Frequenzbereich der Ausgabe der LCPC-Transformation. Daher wäre die LCPC-Transformation ohne die FFT als letzten Schritt nicht so effektiv. Bei der LCPC-Transformation ergibt sich die FFT zu einer Reihe von Bins und deren Beträgen, die alle eine statische multidimensionale Darstellung der Kontureingabe in Schritt 1 darstellen. Eine Analogie für eine statische multidimensionale Darstellung von Informationen ist die neunstellige Telefonnummer, die den Telefonkommunikationskanal einer Person in den Vereinigten Staaten repräsentiert. Obwohl sie im Vergleich zu skalaren Wertdarstellungen von Formen (wie 85 cm Länge, 56 Grad breit usw.) umständlich sind, enthalten multidimensionale Daten deutlich mehr Informationen zur Gewinnung von Erkenntnissen. Abbildung 10 zeigt mehrere spektrale Muster, die bei der Anwendung der LCPC-Transformation beobachtet wurden, und wie Indizes daraus abgeleitet werden. Abschnitt 4 der ergänzenden Akte 1 behandelt Abbildung 10 ausführlicher.

Der Frequenzbereich der LCPC-Transformation offenbart objektive und quantitative Merkmale einer 2D-Form, die mit bloßem Auge nicht leicht wahrgenommen werden können. Sehr subtile Unterschiede in Krümmung, Zackigkeit und Tortuosität lassen sich robust quantifizieren. Sobald morphologische Subtypen jedoch mit dieser Methode identifiziert wurden, können visuell unterschiedliche Themen beobachtet werden, die mit den quantitativen Unterschieden korrelieren. Diese Eigenschaft macht die LCPC-Transformation als Methode zur Extraktion räumlicher Informationen für Machine-Learning-(ML)-Modelle interpretierbar und macht die resultierenden ML-Modelle selbst interpretierbarer. Obwohl neuronale Netze eine leistungsfähige ML-Methode sind, sind ihre Ergebnisse oft für Menschen nicht interpretierbar, was ein erhebliches Problem im Bereich der medizinischen künstlichen Intelligenz (KI) darstellt. Ärzte zögern, ein ML-Modell für klinische Entscheidungen zu verwenden, wenn sie nicht verstehen, warum das Modell schlechte Entscheidungen trifft. Außerdem, wenn kein Mensch versteht, warum oder wie ein Modell eine voreingenommene Entscheidung getroffen hat, wird das Problem unlösbar.

Es lohnt sich, zur Diskussion über die Messung der Texturdichte (Abbildungen 4 und 5) hinzuzufügen, dass das menschliche Auge leicht durch optische Täuschungen oder ungeordnete Muster verwechselt wird. Die zufällige Anordnung komplexer Muster wird oft als zufällig, nicht messbar oder nicht messenswert interpretiert. Die LCPC-Transformation kann reproduzierbare, objektive, quantitative Unterschiede in scheinbar zufälligen Mustern messen. Es sei denn, der Nutzer wird darauf trainiert, sich nicht von chaotischen, ungeordneten Mustern in der Natur in die Irre führen zu lassen, die sich als Zufälligkeit tarnen, wird kein Versuch unternommen werden, die Unordnung zu messen, um vorhersehbare Muster zu entdecken. Vorhersehbare Muster sind ein klares Zeichen dafür, dass das System nicht völlig zufällig ist. Die LCPC-Transformation wurde erfunden, um Formen zu messen, die mit bloßem Auge subtil oder unvorstellbar unterschiedlich sind. Da viele Morphologien in der Natur geringfügige Unterschiede aufweisen, die eher wie bedeutungslose chaotische Heterogenität erscheinen als wie vorhersehbare Subtypen von Unordnung – die jeweils mit unterschiedlichen biologischen Funktionen korrelieren – wurde der folgende "Vier-Schritte"-Konzeptrahmen entwickelt, der in Verbindung mit der LCPC-Transformation verwendet wird. Erstens: Widerstehe der Vorstellung, dass ein kompliziert wirkendes System zufällig ist. Zweitens nennen Sie die chaotische Heterogenität "Unordnung" und finden Sie dann eine Art von Ordnung, die als rationale Referenzbedingung dienen kann. Hypothese, dass die Störung von der Referenz abweicht. Drittens finden Sie eine Möglichkeit, das Muster, das die Referenz ist, objektiv zu messen, wie zum Beispiel die LCPC-Transformation. Viertens: Wende dieselbe objektive Methode darauf an, was als Unordnung im System gilt.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Verwendete die NearestNeighbors-Funktion innerhalb des sklearn.neighbors-Pakets
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Verwendete cKDTree-Funktion innerhalb des scipy.spatial-Pakets
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Erstellte eine Implementierung von Cliff's Delta in der Python-Sprache
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Als potenziell nützliches Tool für manuelle Segmentierung erwähnt, aber in dieser Studie nicht verwendet
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Verwendete die PCA-Funktion mit dem sklearn.decomposition-Paket
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python-Skript in einem Jupyter Notebook