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Forschungsartikel
Diese Studie integriert Netzwerkpharmakologie und In-vivo-Experimente , um die potenziellen Effekte der Yougui-Pille bei der Behandlung der Prostatitis zu untersuchen. Die Analyse der Netzwerkpharmakologie und die Behandlung von YGP in einem Modell der Rattenprostatitis deuteten darauf hin, dass die therapeutischen Effekte von YGP mit der Regulation von Entzündungsreaktionen verbunden sein könnten, was darauf hindeutet, dass YGP entzündungshemmende Effekte bei Prostatitis hat.
Prostatitis ist eine häufige urologische Erkrankung mit begrenzten Behandlungsmöglichkeiten. Die Yougui-Pille (YGP) hat einen potenziellen therapeutischen Nutzen gezeigt, insbesondere bei entzündungsbedingten Erkrankungen. Diese Studie hatte zum Ziel, ihre Effekte zu bewerten und mögliche zugrunde liegende Mechanismen zu untersuchen. Aktive Komponenten von YGP wurden anhand TCMSP unter Verwendung der oralen Bioverfügbarkeit (OB ≥ 30 %) und der Arzneimittelähnlichkeit (DL ≥ 0,18) getestet, und entsprechende Ziele wurden erfasst. Prostatitis-bezogene Ziele wurden aus GeneCards gewonnen, und überlappende Ziele wurden mithilfe von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI) und der Kyoto-Enzyklopädie der Gen- und Genomanreicherung (KEGG) analysiert. Insgesamt wurden 126 Wirkstoffe und 208 potenzielle Ziele identifiziert, wobei 180 überlappende Ziele mit Prostatitis assoziiert sind. PPI-Analysen identifizierten TP53, IL6, AKT1, TNF und IL1B als Schlüsselhubgene. Die KEGG-Anreicherung deutet auf die Beteiligung entzündungsbedingter Signalwege hin, darunter IL-17, TNF, MAPK und PI3K-Akt. Ein Rattenmodell der Prostatitis wurde durch intraprostatale Injektion von Carrageenan etabliert. Es wurden histologische Untersuchungen und Messungen von Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und Interleukin-6 (IL-6) durchgeführt, um die therapeutischen Effekte zu bewerten. Die YGP-Behandlung verbesserte die Prostatahistopathologie und reduzierte die TNF-α- und IL-6-Spiegel sowohl auf Protein- als auch auf mRNA-Niveau. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass YGP entzündungshemmende Wirkungen bei Prostatitis hat, während die spezifischen molekularen Mechanismen noch weiter validiert werden müssen.
Prostatitis ist eine Erkrankung, bei der die Prostata mit Schwellungen und Reizungenentzündet wird. Sie macht etwa 25 % der weltweiten urologischen klinischen Begegnungenaus. Die National Institutes of Health (NIH) unterteilten Prostatitis in vier Kategorien: akute bakterielle, chronische bakterielle, chronische Prostatitis/chronisches Beckenschmerzsyndrom (CP/CPPS) und asymptomatische Prostatitis3. Unter diesen ist CP/CPPS die am häufigsten verbreitete Form und steht in engem Zusammenhang mit anhaltender Entzündung und Immundysregulation. Trotz Fortschritten im Verständnis der entzündlichen Natur der Prostatitis bleiben die aktuellen therapeutischen Strategien begrenzt, insbesondere für nicht-bakterielle Subtypen 4,5. Antibiotika werden häufig in der klinischen Praxis eingesetzt; Ihre Wirksamkeit bei nicht-bakterieller Prostatitis ist jedoch sehr umstritten6. Andere Behandlungen, von α-Blockern bis hin zu nichtsteroidalen entzündungshemmenden Medikamenten (NSAIDs), zielen hauptsächlich auf die Symptomlinderung ab, zeigen aber oft suboptimale Ergebnisse mit nicht vernachlässigbaren Risiken für Magen-Darm-Störungen, orthostatische Hypotonie usw. 7,8,9,10. Diese Einschränkungen unterstreichen die Notwendigkeit alternativer therapeutischer Ansätze, die die Entzündung der Prostatitis effektiv modulieren können.
Die traditionelle chinesische Medizin (TCM) kann ein breiteres Spektrum therapeutischer Vorteile mit einem günstigeren Sicherheits- und Verträglichkeitsprofilbieten 11. Die Yougui-Pille (YGP), eine klassische Formel, die in Jingyue Quanshu dokumentiert wurde, wird seit Jahrhunderten empirisch eingesetzt, um Nieren-Yang aufzufüllen undverwandte Erkrankungen zu lindern. Frühere Studien haben berichtet, dass einige ihrer Inhaltsstoffe entzündungshemmende Wirkungen besitzen 13,14,15,16. Klinische Evidenz legt nahe, dass YGP die Symptome der Prostatitis wirksam lindern kann, obwohl der zugrunde liegende Mechanismus weiterhin unklar bleibt17. Netzwerkpharmakologie dient als kraftvoller, integrativer Ansatz, der Systembiologie und Pharmakologie kombiniert, um die komplexen Mechanismen der traditionellen Medizin aufzudecken18. Es wurde vermutet, dass YGP entzündungshemmende Effekte haben kann, indem es mehrere Ziele und entzündungsbezogene Signalwege moduliert. Diese Vorhersagen wurden weiter mit einem in-vivo-Prostatitis-Modell bewertet, bei dem die Prostatitis durch Carragenan-Injektion induziert wurde. Nach der Etablierung des Modells wurden die Tiere mit YGP behandelt. Prostatagewebe wurde für histopathologische Untersuchungen mittels Hämatoxylin- und Eosin-(HE)-Färbung sowie zur quantitativen Beurteilung der Entzündungsmarker mittels enzymgebundener Immunsorbent-Assay (ELISA) und einer quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) entnommen.
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Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Beijing University of Chinese Medicine (BUCM-2024110107-4103) genehmigt.
Sammlung aktiver Bestandteile und Ziele
YGP besteht aus Rehmannia glutinosa, Aconitum carmichaelii, Cinnamomum cassia, Dioscorea opposita, Cornus officinalis, Cuscuta chinensis, Angelica sinensis, Eucommia ulmoides, Cervi cornus colla und Lycium barbarum. Diese Kräuternamen wurden in die traditionelle pharmakologische Datenbank und Analyseplattform (TCMSP) der traditionellen chinesischen Medizinsysteme eingegeben, um ihre Verbindungen abzurufen. Aktive Verbindungen wurden anhand der oralen Bioverfügbarkeit (OB ≥ 30 %) und der Arzneimittelähnlichkeit (DL ≥ 0,18) Kriterien 19,20,21 untersucht. Die entsprechenden Ziele jeder Verbindung wurden aus TCMSP gewonnen und mit Hilfe der UniProt-Datenbank auf Gensymbole standardisiert. Prostatitis-bezogene Ziele wurden aus der GeneCards-Datenbank unter Verwendung von "Prostatitis" als Schlüsselwort abgerufen, und Gene mit einem Relevanzwert über dem Durchschnitt wurden für die Aufnahme ausgewählt.
Aufbau des regulatorischen Netzwerks von YGP gegen Prostatitis
Die Schnittstelle zwischen YGP-bezogenen und prostatitisbezogenen Zielen wurde identifiziert und als eine Reihe potenzieller therapeutischer Ziele definiert. Diese Ziele wurden in Cytoscape (Version 3.9.1) importiert, um ein Verbindungsziel-Krankheitsnetzwerk zu erstellen. Die Netzwerktopologieanalyse wurde mit dem CytoHubba-Plugin durchgeführt, und Schlüsselkomponenten wurden anhand der maximalen Clique-Zentralitätswerte(MCC) 22 identifiziert.
Analyse des Protein-Protein-Interaktionsnetzwerks (PPI)
Die sich überlappenden Ziele wurden in die STRING-Datenbank (Version 11.5) importiert, wobei der Organismus auf Homo sapiens gesetzt wurde. Der minimale erforderliche Interaktionswert wurde auf ≥ 0,7 gesetzt, und getrennte Knoten wurdenmit 23 ausgeblendet. Die Interaktionsdaten wurden im TSV-Format exportiert und in Cytoscape visualisiert. Hub-Gene wurden mit dem CytoHubba-Plugin basierend auf Gradzentralität weiter identifiziert.
KEGG-Signalweg- und GO-Anreicherungsanalyse
Die gemeinsamen Ziele wurden auf die Metascape-Plattform für die Analyse der Kyoto-Enzyklopädie der Genen und Genome (KEGG) hochgeladen. Die Eingabe- und Analysearten wurden auf Homo sapiens gesetzt. Es wurde eine KEGG-Signalweganreicherungsanalyse durchgeführt. Die Wege wurden weiter nach ihrer Relevanz für Prostatitis gefiltert, wie sie durch veröffentlichte Literatur und Datenbankannotationen bestimmt wurde. Die übrigen Wege wurden nach ihren Log P-Werten gerankt. Die oben angereicherten KEGG-Signalwege wurden mithilfe von Blasendiagrammen visualisiert.
Molekulare Andockung
Die wichtigsten Ziele wurden aus dem PPI-Netzwerk basierend auf der Gradzentralität ausgewählt, und die aktiven Verbindungen wurden anhand des YGP-Prostatitis-Regulationsnetzwerks anhand von MCC-Werten für die anschließende Andockungsanalyse identifiziert. Proteinstrukturen wurden aus der AlphaFold Protein Structure Database im PDB-Format gewonnen, und Ligandenstrukturen wurden aus TCMSP im mol2-Format24 heruntergeladen. Das molekulare Andocken erfolgte über die CB-Dock2 Online-Plattform25. Vor dem Andocken wurden Proteinstrukturen automatisch vorbearbeitet, indem Wassermoleküle entfernt, Wasserstoffatome hinzugefügt und fehlende Reste vervollständigt wurden. Bindungsaffinitäten wurden aufgezeichnet, und Heatmaps wurden mit GraphPad Prism (Version 10.1.2) generiert. Die dreidimensionalen Strukturen von Liganden-Protein-Komplexen mit den niedrigsten Vina-Werten wurden mit ChimeraX visualisiert, und zweidimensionale Interaktionsdiagramme wurden mit LigPlus erstellt.
YGP wässrige Extraktzubereitung
Die pflanzlichen Komponenten von YGP wurden nach dem traditionellen Formulierungsverhältnis hergestellt, darunter 24 g der verarbeiteten Wurzel von Rehmannia glutinosa (Shudihuang), 6 g der verarbeiteten lateralen Wurzel von Aconitum carmichaelii (Fuzi), 6 g der Rinde von Cinnamomum cassia (Rougui), 12 g des Rhizoms von Dioscorea opposite (Shanyao), 9 g der Frucht von Cornus officinalis (Shanzhuyu), 12 g Samen von Cuscuta chinensis (Tusizi), 12 g der verarbeiteten Geweihgelatine von Cervi Cornus Colla (Lujiaojiao), 12 g der Frucht von Lycium barbarum (Gouqi), 9 g der Wurzel von Angelica sinensis (Danggui) und 12 g der Rinde von Eucommia ulmoides (Duzhong). Alle Kräuter außer Aconitum carmichaelii und Cervi Cornus Colla wurden 30 Minuten lang in dem 6-fachen ihres Gesamtgewichts destilliertes Wasser eingeweicht, während Aconitum carmichaelii separat in 6-fachem Gewicht des destillierten Wassers eingeweicht wurde. Aconitum carmichaelii wurde zunächst 1 Stunde lang mit einem elektrischen Heizgerät dekoktiert, danach wurden die restlichen Kräuter, mit Ausnahme von Cervi Cornus Colla, hinzugefügt und jeweils zweimal für 1 Stunde pro Zyklus dekoktiert. Cervi Cornus Colla wurde anschließend in einem Wasserbad bei 60–70 °C geschmolzen, bis es vollständig gelöst und in den Extrakt eingebaut war. Nach dem Abkühlen wurde der Sund durch doppelschichtige Gaze gefiltert, alicitiert, bei -20 °C 48 Stunden eingefroren und gelyophilisiert, um einen pulverisierten Extrakt zu erhalten.
Tiermodell und experimentelles Design
Männliche Sprague-Dawley-Ratten (8 Wochen alt, 200–220 g) wurden unter spezifischen, pathogenfreien Bedingungen mit einem 12-Stunden-Licht/Dunkel-Zyklus und freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht. Nach einer Woche der Akklimatisierung wurden die Ratten zufällig in drei Gruppen (n = 6 pro Gruppe) eingeteilt: Kontrollgruppe, Modell und YGP-Gruppe. Die chronische Prostatitis wurde durch intraprostatale Injektion von 3 % Carragenan-Lösung26 ausgelöst. Kurzzeitig wurden die Ratten mit Isofluran betäubt (3–4 % für die Einleitung und 1,5–2 % für die Erhaltung), und es wurde ein mittlerer Bauchschnitt gemacht, um die Prostata freizulegen. Insgesamt wurden 25 μL 3%ige Carragenan-Lösung in jeden ventralen Prostatalappen injiziert. Die Kontrollgruppe erhielt eine intraprostatale Injektion nur mit normaler Kochsalzlösung (physiologische Kochsalzlösung). Postoperatives Penicillin (2,5 × 105U /kg) wurde 3 Tage lang intramuskulär verabreicht.
YGP-Glyophilisiertes Extraktpulver wurde aus dem Abzug hergestellt und in 0,9 % steriler Normalsalzlösung rekonstituiert, um eine einheitliche Suspension für orale Gavage (10,54 g/kg/Tag) zu erhalten. Ratten der YGP-Gruppe erhielten orale Verabreichung von YGP-Extrakt (10 ml/kg), während Kontroll- und Modellgruppen ein äquivalentes Volumen von 0,9 % sterilem normalem Kochsalz erhielten. Nach 4 Wochen wurden die Ratten mit Pentobarbitalnatrium (50 mg/kg, intraperitoneale Injektion) betäubt, und nach dem Opfer wurden Prostatagewebe gemäß ethischen Richtlinien gesammelt.
Histopathologische Untersuchung
Prostatagewebe wurde 24 Stunden lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert, durch klassifiziertes Ethanol dehydriert (75 % Alkohol für 4 Stunden, 85 % Alkohol für 2 Stunden, 90 % Alkohol für 2 Stunden, 95 % Alkohol für 1 Stunden, absolutes Ethanol für 1 Stunden), in Xylol gereinigt und in Paraffin eingebettet. Die Schnitte (4–5 μm) wurden anschließend einer HE-Färbung gemäß Standardverfahren27 unterzogen. Kurz gesagt wurden die Schnitte deparaffinisiert, rehydriert, mit Hämatoxylin gefärbt, differenziert und mit Eosin gekonterfärbt. Nach der Dehydrierung und Montage wurden die Schnitte unter einem Lichtmikroskop zur histopathologischen Begutachtung beobachtet.
Die histopathologische Entzündung wurde mittels eines semi-quantitativen Bewertungssystems auf Basis der entzündlichen Zellinfiltration, Fibroblastproliferation, Acinarmorphologie und Sekretionsstatus bewertet. Die entzündliche Zellinfiltration wurde mit 0 (keine Infiltration), 2 (leichte Infiltration), 4 (moderate Infiltration) und 6 (schwere Infiltration) bewertet. Die Fibroblastproliferation wurde mit 0 (fehlend), 1 (mild), 2 (moderat) und 3 (schwer) bewertet. Die acinare Morphologie wurde mit 0 (großes acinäres Lumen), 1 (mäßig verringerte Lumengröße), 2 (deutlich reduzierte Lumengröße) und 3 (acinare Okklusion oder Verschwinden) bewertet. Der Sekretionsstatus wurde mit 0 (reichlich Sekretion), 1 (mittlere Sekretion), 2 (spärliche Sekretion) und 3 (fehlende Sekretion) bewertet. Der gesamte histopathologische Wert wurde als Summe aller vier Parameter berechnet, wobei höhere Werte auf schwerere Prostataverletzungen und Entzündungen28 hindeuten.
ELISA
Prostatagewebe (100 mg) wurde mit eiskaltem phosphatgepuffertem Kochsalzlösungsmittel (PBS) ausgespült und in einem Lysepuffer homogenisiert, der mit Proteaseinhibitoren ergänzt wurde. Die Homogenate wurden bei 4 °C für 30–120 Minuten inkubiert und bei 5000 × g für 15 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, um die Supernatanten zu sammeln. Die Proteinwerte von TNF-α und IL-6 wurden mit ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Standards und Proben wurden auf 96-Well-Platten hinzugefügt und bei 37 °C inkubiert, gefolgt von sequentieller Inkubation mit biotinylierten Antikörpern und Enzymkonjugaten. Nach dem Waschen wurde die Substratlösung zur Farbentwicklung hinzugefügt, und die Reaktion wurde mit der Stoplösung beendet. Die Absorption wurde mit 450 nm mittels eines Mikroplattenlesers gemessen. Die Zytokinkonzentrationen wurden anhand von Standardkurven berechnet.
qRT-PCR
Die Gesamt-RNA wurde aus Prostatageweben mittels einer säulenbasierten Methode extrahiert und durch Messung der Absorption bei 260 und 280 nm quantifiziert, um die Reinheit zu beurteilen. RNA-Proben wurden bei 42 °C für 15 Minuten mit einem Reverse-Transkriptions-Kit bei 42 °C in cDNA transkribiert. qRT-PCR wurde mit einem Thermocycler unter folgenden Bedingungen durchgeführt: erste Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 10 Sekunden und 60 °C für 30 Sekunden. Die in dieser Studie verwendeten Primer-Sequenzen sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt. Fluoreszenzsignale wurden während des Glüh-/Erweiterungsschritts gesammelt. Die Expressionsniveaus von TNF-α und IL-6 wurden auf das interne Referenzgen GAPDH normalisiert. Die relative Genexpression wurde mit der 2−ΔΔCt-Methode berechnet.
Statistische Analyse
Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) präsentiert. Statistische Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Software (Version 10.1.2) durchgeführt. Die Datenverteilung wurde vor der Analyse auf Normalität geprüft. Unterschiede zwischen mehreren Gruppen wurden mittels Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test für mehrere Vergleiche. Ein Wert von p < 0,05 galt als statistisch signifikant.
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Identifikation bioaktiver Komponenten und Zielgene
Insgesamt wurden 126 bioaktive Komponenten in YGP identifiziert, die die Kriterien erfüllten (OB ≥ 30 % und DL ≥ 0,18). entsprechend 208 vorhergesagten Zielgenen. Die GeneCards-Datenbank lieferte 9.845 Gene, die mit Prostatitis assoziiert sind. Die Analyse von Venn zeigte 180 sich überlappende Gene zwischen den vorhergesagten Zielgruppen von YGP und prostatitisbezogenen Genen, was darauf hindeutet, dass diese gemeinsa...
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Die Prostatitis ist pathologisch durch ein erhöhtes Vorkommen von entzündlichen Zellen im Prostataparenchym oder Mesenchym28,29 definiert. In einer Studie mit über 5 Millionen koreanischen Männern, die neun Jahre lang verfolgt wurde, bestätigten Kim et al. durch multivariate Analysen, dass Prostatitis das Risiko für die Entwicklung von Prostatakrebssignifikant erhöht. Die aktuelle klinische Behandlung blei...
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Die Autoren berichten von keinem Interessenkonflikt in dieser Arbeit.
Die Autoren danken dankbar für die finanzielle Unterstützung aus den Fundamental Research Funds für die Zentraluniversitäten (2022-JYB-JBZR-037).
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyd | Beyotime | P0099-3L | |
| AlphaFold Proteinstrukturdatenbank | AlphaFold Proteinstrukturdatenbank | https://alphafold.ebi.ac.uk/ | |
| BeyoFast SYBR Grüner qPCR-Mix (2X) | Beyotime | D7260 | |
| Online-Plattform für Bioinformatik | Online-Plattform für Bioinformatik | http://www.bioinformatics.com.cn/ | |
| Carrageenan | OriLeaf | S30559 | |
| CB-DOCK2 | CB-DOCK2 | http://183.56.231.194:8001/cb-dock2/php/blinddock.php | |
| Zytoscape | Zytoscape | https://cytoscape.org/ | |
| GeneCards | GeneCards | https://www.genecards.org/ | |
| Hämatoxylin und Eosin (H& E) Fleckenset | Beyotime | C0105S | |
| Metascape | Metascape | https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1 | |
| Neutraler Balsam | Servicebio | WG10004160 | |
| Paraffinwachs (zum Einbetten) | Servicebio | RP-15 | |
| Protease-Inhibitor-Cocktail (100X) | Epizym | GRF101 | |
| Rat IL-6 ELISA Kit | Beyotime | PI328 | |
| Ratte TNF-Α Trikot | Beijing 4A Biotech Co., Ltd | CRE0003 | |
| RNAeasy Animal Long RNA Isolations-Kit mit Spin-Säule | Beyotime | R0026 | |
| STRING | STRING | https://string-db.org/ | |
| TCMSP | TCMSP | https://www.tcmsp-e.com/#/database | |
| Uniprot | Uniprot | https://www.uniprot.org/ |