Ein kopfmontiertes optisch transparentes Schädelfenster (HOTS) für die tiefe transkranielle Bildgebung des Mauskortex

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein kopfmontiertes optisch transparentes Schädelfenster (HOTS), das auf einem optimierten zweistufigen Schädelreinigungsverfahren basiert. Dieser Ansatz ergibt einen hochtransparenten Schädel, der eine Zweiphotonenabbildung des erwachsenen Maushirnrindes bis zu ~800 μm ermöglicht.

Zusammenfassung

Die hochauflösende Zweiphotonenabbildung des erwachsenen Maus-Großhirnrindes wird durch Lichtstreuung vom Schädel stark eingeschränkt, was Signale abschwächt und die Bildtiefe in vivo einschränkt. Obwohl Schädelreinigungsmethoden entwickelt wurden, um einen optischen Zugang zum Kortex durch den intakten Schädel zu ermöglichen, ist ihre praktische Leistung durch begrenzte Clearing-Zeit und suboptimale Clearing-Cocktails eingeschränkt. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Implementierung eines kopfmontierten optisch transparenten Schädelfensters (HOTS) vor. Bei diesem Ansatz wurde eine kopfmontierte Kappe verwendet, um Reinigungslösungen über dem Schädel zu halten, wodurch längere Anästhesie oder körperliche Fesselung vermieden und eine längere Schädelreinigung (mehrere Stunden) in wachen, frei handelnden Mäusen ermöglicht wurde. Zusätzlich wurde ein zweistufiges Reinigungsverfahren mit Reagenzien durchgeführt (HOTS-S1: 10 % wt/v EDTA, 15 % wt/v D-mannose, 10 % wt/v sulfolan, 0,5 % wt/v Tween 20; HOTS-S2: 70 % Wt/v D-Mannose, 5 % Wt/v Sulfolan, 0,5 % Wt/v Tween 20) optimiert durch systematisches chemisches Screening. Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll an, das die Schädelexposition und -stabilisierung, die Erstellung und Montage der kopfmontierten Kappe, die Verabreichung und Auffrischung der Reinigungsreagenzien sowie die anschließende Bildvorbereitung umfasst. Bei sechs Wochen alten Mäusen (~20 g) erzeugt das HOTS-Protokoll routinemäßig einen hochtransparenten Schädel, der eine Zwei-Photonen-Bildgebung kortikaler Strukturen bis zu Tiefen von bis zu ~800 μm unter dem Pia unterstützt und so die Leistung von offenen Schädelfenstern erreicht. Das HOTS-Fenster ermöglicht strukturelle Bildgebung bei Thy1-GFP-M-Mäusen und funktionelle Kalziumbildgebung bei Thy1-GCaMP6s-Mäusen. Wir sind überzeugt, dass das HOTS-Fenster als bequemer und minimalinvasiver Ansatz die tiefe transkranielle Bildgebung sowie optogenetische, photopharmakologische und andere lichtbasierte Manipulationen in vivo erheblich erleichtern wird.

Einleitung

Die intravitale Überwachung kortikaler Neuronen ist unerlässlich, um die Gehirnstruktur und -funktion zu verstehen¹. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie (TPM) ist ein Schlüsselwerkzeug für solche In-vivo-Studien ^2,3. Allerdings sind seine Bildqualität und Tiefe stark eingeschränkt durch starke Lichtstreuung vom undurchsichtigen Schädel über dem Kortex ^4,5.

Die Fenster ^7,8 mit offenem Schädel⁶ und Thinned-Skull haben einen deutlich verbesserten optischen Zugang zum Kortex und werden weit verbreitet verwendet, doch beide Ansätze haben inhärente Einschränkungen. Offene Schädelfenster können akute Hirnverletzungen und entzündliche Reaktionen auslösen (^9,10), während Schädelverdünnung technisch anspruchsvoll ist und es schwierig ist, eine einheitliche^{Dicke zu} erreichen.

In vivo bieten optische Schädelreinigungstechniken eine minimalinvasive Alternative, die eine Zwei-Photonen-Bildgebung mit axonaler Auflösung bei erwachsenen Mäusen ermöglicht. Die erreichbare Bildtiefe bleibt jedoch begrenzt (typischerweise 150–400 μm unterhalb des Pia^). In der Praxis ist die Schädelreinigung meist auf eine kurze Phase unter Narkose mit starrer Kopffixierung beschränkt, und die systematische Optimierung der Reinigungscocktails für die Zusammensetzung von Schädelknochen ist bisher wenig erforscht 12,13,14,15.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir zuvor ein kopfmontiertes optisch transparentes Schädelfenster (HOTS) entwickelt, das langanhaltende, offline Schädelreinigung bei frei handelnden Mäusen unterstützt (Abbildung 1A)¹⁶. Dieser Ansatz verwendet ein zweistufiges Clearing-Verfahren mit Reagenzien (S1 und S2), die in unserer vorherigen Arbeit¹⁶ durch systematische chemische Screening optimiert wurden. Die systematische Optimierung der Clearing-Reagenzien sowie die Charakterisierung der Clearing-Wirksamkeit, Reversibilität, Biosicherheit und in-vivo-Bildgebungsleistung des HOTS-Fensters wurden in unseren vorherigen Arbeiten¹⁶ berichtet, die ebenfalls eine günstige astrogliale Reaktion nach der HOTS-Behandlung zeigten. Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Festlegung des HOTS-Fensters vor, um eine tiefe transkranielle Zweiphotonenbildgebung bei erwachsenen Mäusen zu ermöglichen. In repräsentativen Präparaten erreichen Bildabbildungstiefen ~800 μm unter dem Pia, fast so weit wie mit offenen Schädelfenstern erreichbar. Das HOTS-Fenster ermöglicht eine tiefe strukturelle Bildgebung bei Thy1-GFP-M-Mäusen und funktionelle Kalziumbildgebung bei wachen Thy1-GCaMP6s-Mäusen.

Protokoll

Alle Tierpflege- und Versuchsverfahren wurden vom Guangdong Provinzkomitee für Tierpflege und -nutzung genehmigt und gemäß den Richtlinien des Ethikausschusses für Tierversuche des Shenzhen Institute of Advanced Technology der Chinesischen Akademie der Wissenschaften durchgeführt. Die in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

HINWEIS: Dieses Protokoll ist für 6 Wochen alte Mäuse (Körpergewicht ~20 g) optimiert, die eine Schädeldicke von etwa 100 μm haben.

1. Herstellung von Schädelreinigungslösungen

1. Bereite eine Schädelreinigungslösung S1 vor (10 % Wt/v EDTA, 15% Wt/v D-Mannose, 10% Wt/V Sulfolan, 0,5% Wt/v Tween 20; RI: 1.38; endgültiger pH-Wert: 7,0–7,4)
   1. Wiege 0,35 g Natriumhydroxid (NaOH). Geben Sie es 20 ml deionisiertes Wasser in einem Becher und rühren, bis es vollständig gelöst ist. Dies erhöht den pH-Wert der Lösung und erleichtert die anschließende Auflösung von EDTA.
      HINWEIS: NaOH ist korrosiv. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Laborkittel, Augenschutz) und führen Sie sie mit einer chemischen Abzughaube.
   2. Gib 4 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zur NaOH-Lösung hinzu. Stellen Sie das Becherglas in ein 40 °C Wasserbad und rühren Sie kontinuierlich, bis das EDTA vollständig gelöst ist.
   3. Kühlen Sie die Mischung auf Zimmertemperatur ab. Fügen Sie 6 g D-Mannose, 4 g Sulfolan und 0,2 g Tween 20 zur Lösung hinzu. Rühren Sie bei Raumtemperatur, bis alle Komponenten vollständig gelöst sind.
   4. Fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, um das Endvolumen auf 40 mL zu bringen. Mische gründlich, um S1 zu erhalten.
      HINWEIS: S1 kann mehrere Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
2. Bereite eine Schädelreinigungslösung S2 vor (70 % Wt/v D-Mannose, 5 % Wt/v Sulfolan, 0,5 % Wt/v Tween 20; endgültiger RI: 1,44; endlicher pH: 7,0-7,4)
   1. Wäge 28 g D-Mannose, 2 g Sulfolan und 0,2 g Tween 20 und überfülle sie in einen sauberen Becher.
   2. Fügen Sie deionisiertes Wasser zu etwa 30 mL hinzu und rühren Sie bei Raumtemperatur, bis alle Komponenten vollständig gelöst sind.
   3. Fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, um das Endvolumen auf 40 mL zu bringen, und mischen Sie gründlich, um S2 zu erhalten.
      HINWEIS: Sanfte Erhitzung (25–30 °C) und kontinuierliches Rühren beschleunigen die Auflösung von D-Mannose. S2 kann mehrere Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.

2. Vorbereitung auf die Operation

1. Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und sterilisieren Sie den Arbeitsplatz gründlich mit 75 % Alkohol.
2. Betäuben Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von 1 % (w/v) Natriumpentobarbital (150–200 μL pro 20 g Körpergewicht).
   HINWEIS: Andere reversible Anästhetika können als Alternativen zu Natriumpentobarbital verwendet werden.
3. Überwachen Sie die Tiefe der Anästhesie mit dem Zehenknurfreflex und stellen Sie sicher, dass die Maus vor Beginn der Operation vollständig betäubt ist.
4. Platziere die Maus in einen stereotaxischen Rahmen und sichere den Kopf mit Ohrbügeln.
5. Halten Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen bei 37 °C.
6. Tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
   HINWEIS: Überwachen Sie Atmung und Reflexe genau, um eine Anästhesieüberdosis und Atemdepression zu vermeiden.

3. Operation und Montage der Kopfplatte

1. Schädelfreilegung und -reinigung (Abbildung 1Ba)
   1. Entfernen Sie die Kopfhaut über die gesamte dorsale Schädeloberfläche mit feinen Pinzetten und einer chirurgischen Schere. Schneiden Sie die Haut seitlich, um die Ränder der Schläfenmuskulatur freizulegen, und nach hinten zu den Nackenmuskeln.
   2. Entfernen Sie vorsichtig das Periost von der Schädeloberfläche mit feinen Pinzetten.
   3. Reinigen Sie die Schädeloberfläche mit einem feuchten Applikator mit Baumwollspitze und trocknen Sie den Schädel mit einem sanften Luftstrahl.
   4. Wenn eine präzise Lokalisierung der funktionellen Bereiche des Großhirnrindes erforderlich ist, markieren Sie mit einem stereotaktischen Gerät 1 mm Abstand angebrachte Referenzpunkte auf der Schädeloberfläche.
2. Anwendung von Zahnklement und Kopfplatte (Abbildung 1Bb)
   1. Bereiten Sie den Zahnklement gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Zahnklebemittel mit starker Haftung und guter Haltbarkeit, die sich für eine langfristige Fixierung eignen, werden empfohlen, um eine stabile Haftung zu gewährleisten.
   2. Tragen Sie eine dünne Schicht Zahnklement auf die freiliegende Schädeloberfläche und umliegendes Gewebe auf, um sie zu schützen, wobei der für das Freiungsfenster vorgesehene Bereich unbeschichtet bleibt.
      HINWEIS: Nachdem Sie das Pulver und die flüssigen Bestandteile des Zahnklements im Verhältnis 1:1 gemischt haben, warten Sie etwa 10 Sekunden, bis der Zement an der Spitze eines Zahnstochers haftet, bevor Sie ihn auftragen. Dies verringert die Flüssigkeit und verbessert das Handling. Während des Auftragens tragen Sie den Zement vom Rand in Richtung des vorgesehenen Lichtungsfensters auf und halten Sie den Bereich des Fensters vollständig zementfrei. Der geräumte Bereich wird durch die Grenze des Zahnversiegelungsmittels (Zahnzement und weiches Linermaterial) auf der Schädeloberfläche definiert. Daher kann die Größe angepasst werden, aber sie ist durch die Schädelnähte oder die Größe der Kappe begrenzt. Für die übliche Anwendung auf einer Hemisphäre beträgt der geräumte Bereich üblicherweise ~3–5 mm im Durchmesser.
   3. Befestigen Sie eine kleine Titan-Kopfplatte (für die Fixierung des Kopfes an einem individuellen Halter bei anschließender Bildgebung) mit Zahnkleber am Schädel.
      HINWEIS: Für die Kopffixierung können verschiedene Kopfplattendesigns verwendet werden. In dieser Studie wurden sowohl kommerziell erhältliche Kopfplatten als auch maßgeschneiderte Zweiloch-Titanplatten erfolgreich verwendet. Unabhängig vom Design sollte die Kopfplatte ausreichend mechanische Stabilität für die nachfolgende Bildgebung bieten und das vorgesehene Clearing-/Imaging-Fenster nicht behindern.

4. Erstellung eines HOTS-Fensters

1. Versiegeln Sie den Schädel mit selbsthärtendem Dental-Soft-Liner-Material (Abbildung 1Bc)
   1. Nachdem der Zahnklement etwa 5 Minuten vollständig ausgehärtet ist, wird die Zementschicht, mit Ausnahme des Bereichs des Clearing-Fensters, mit einer dünnen Schicht selbsthärtenden, weichen Zahnfolienmaterials bedeckt, um eine durchgehende Abdichtung über dem Schädel zu bilden.
      HINWEIS: Das weiche Liner-Material verbessert die Abdichtung und reduziert Leckage bei längerer Exposition gegenüber Reinigungsreagenzien.
   2. Forme das selbsthärtende, weiche Folienmaterial glatt um den geplanten Rand des Clearing-Fensters, um eine flache Dichtungsfläche für die Kappe zu schaffen.
2. Montage der Kappe (Abbildung 1Bd)
   1. Schneiden Sie den Kopf einer Einweg-Kunststoffpipette (Polyethylen, PE) ab, um eine kleine zylindrische Kappe mit geschlossenem oberen und offenen Boden zu schaffen. PE zeigt eine gute chemische Stabilität und zeigt während des Löschvorgangs keine sichtbare Degradierung oder Reaktion mit den S1- oder S2-Reinigungslösungen.
      HINWEIS: Die Kappe, die vom Kopf einer 1-ml-Transferpipetten-Bulb abgeschnitten wird, hat typischerweise einen Durchmesser von ~12 mm und eine Höhe von ~10–14 mm.
   2. Setzen Sie die Kappe über das vorgesehene Freiungsfenster und drücken Sie sie vorsichtig in das weiche Liner-Material.
      HINWEIS: Die Kappe ist größer als der geräumte Bereich, und ein Teil des Schädels unter der Kappe, der nicht für den freigegebenen Bereich verwendet wird, kann mit Zahndichtung aufgetragen werden, um den Schädel vor dem Entfernen zu schützen.
   3. Befestigen Sie die Kappe mit zusätzlichem weichem Futtermaterial um die Basis und stellen Sie sicher, dass die Verbindung zwischen Kappe und Schädel vollständig abgedichtet ist.
   4. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 26-G-Nadel, um ein oder mehrere kleine Löcher in der Kappenwand zu durchbohren, die als Kanäle für das Einspritzen und Abziehen von Reinigungsmitteln dienen.
   5. Lass das weiche Innenmaterial vollständig aushärten. Überprüfen Sie, dass die Kappe fest befestigt ist und keine sichtbaren Lücken an der Schnittstelle verbleiben.
   6. Nehmen Sie die Maus aus dem stereotaxischen Rahmen und setzen Sie sie in einen warmen Käfig, bis sie vollständig von der Narkose erholt ist.
      HINWEIS: Dies ist ein geeigneter Haltepunkt. Führen Sie das Schädelreinigungsverfahren durch, nachdem der Zahnklement und das weiche Linermaterial vollständig ausgehärtet sind. In unserer Praxis kann das HOTS-Fenster am Nachmittag installiert werden, gefolgt von einer Schädelreinigung am nächsten Morgen, sobald die Maus vollständig von der Operation genesen ist. Alternativ kann die Schädelreinigung etwa 15 Minuten nach der Installation des HOTS-Fensters begonnen werden. Während der Installation des HOTS-Fensters bleibt der Schädel strukturell intakt, obwohl das Periost entfernt wird.

5. Schädelreinigung bei wachen frei handelnden Mäusen

HINWEIS: Während der Clearing-Phase bleibt die Maus wach und verhält sich frei in ihrem Heimkäfig. Verwenden Sie eine kurze Isofluran-Anästhesie nur für die Injektion der Lösung und den Austausch durch die kopfmontierte Kappe.

1. Erstladung von S1
   1. Setzen Sie die Maus in eine Induktionskammer und leiten Sie eine kurze Anästhesie mit 3–4 % Isofluran in der Luft bei einer Durchflussrate von 300–500 mL/min ein, bis die Maus bewegungsunfähig wird. Es wurde keine Erhaltungsbetäubung verabreicht.
   2. Halte die Maus vorsichtig fest und stabilisiere die kopfmontierte Kappe von Hand.
   3. Verwenden Sie eine 1-mL-Spritze mit einer 26-G-Nadel, um langsam etwa 1 ml S1 in die kopfmontierte Kappe zu injizieren.
   4. Bring die Maus zurück in einen Stammkäfig und lass S1 zwei Stunden lang am Schädel wirken.
      HINWEIS: Während der Brutzeit in Staffel 1 und Staffel 2 sollte die Maus einzeln in einem Standardkäfig untergebracht werden.
2. Erfrischende Staffel 1
   1. 2 Stunden nach dem ersten S1-Laden betäuben Sie die Maus kurzzeitig erneut mit Isofluran.
   2. Aspiriere S1 aus der Kappe mit einer 1-mL-Spritze.
   3. Füllen Sie den Deckel mit frischem S1 mit einer 1-mL-Spritze nach.
   4. Bring die Maus zurück in den Käfig und lass S1 weitere 2 Stunden agieren.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.1–5.2.4 4 Stunden nach der Erstlade, um einen zweiten S1-Austausch durchzuführen.
   6. Nach dem zweiten Austausch lassen Sie S1 weiter wirken, bis eine Gesamtbelichtungszeit von 6 Stunden erreicht ist.
      HINWEIS: Dieses Protokoll (1 mL S1 für 6 H) ist für 6 Wochen alte Mäuse (~20 g) optimiert. Bei älteren Tieren mit dickeren Schädeln kann die S1-Brutzeit schrittweise verlängert werden. Jede Anpassung muss von einer engen Überwachung des Tierschutzes und der endgültigen Bildqualität begleitet werden, um eine übermäßige Schädelweichung zu vermeiden.
3. Anwendung von S2
   1. Nach 6 Stunden S1-Behandlung betäuben Sie die Maus kurzzeitig mit Isofluran.
   2. Aspiriere S1 aus der Kappe mit einer 1-mL-Spritze und ersetze sie durch 0,7 mL S2.
   3. Bringen Sie die Maus zurück in den Käfig und lassen Sie S2 1 Stunde lang auf den Schädel wirken, um die Transparenz weiter zu erhöhen und den Brechungsindex abzugleichen.
      HINWEIS: Unter diesen Bedingungen wird die kombinierte S1- und S2-Clearing-Phase typischerweise innerhalb von 7 Stunden abgeschlossen (6 h S1 + 1 h S2). Eine erfolgreiche Reinigung wird durch eine sichtbar transparente Schädeloberfläche ohne Blutung angezeigt. Der Schädel kann nach dem Entfernen leicht weicher werden; Wenn sie sanft mit einer feinen Pinzette berührt wird, sollte sie eine leichte Anpassung zeigen, aber strukturell intakt bleiben. Vermeiden Sie übermäßigen Druck auf die Schädeloberfläche.

6. Bildgebende Vorbereitung

1. Anästhesie und Kopffixierung zur Bildaufnahme
   1. Am Ende der S2-Inkubation wird die Maus durch intraperitoneale Injektion von 1 % (w/v) Natriumpentobarbital bei 150–200 μL pro 20 g Körpergewicht betäubt.
   2. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie mit dem Zehen-Knurfreflex-Test.
   3. Richten Sie den Mauskopf, indem Sie die Titan-Kopfplatte an einen speziell entwickelten Kopfhalter schrauben.
   4. Tragen Sie auf beide Augen eine Augensalbe auf, um das Austrocknen während der Bildgebung zu verhindern.
   5. Halten Sie die Körpertemperatur mit einem Heizkissen bei ~37 °C.
2. Die freigelegte Schädeloberfläche freilegen (Abbildung 1Be, Bf)
   1. Sauge die S2-Lösung mit einer Spritze vom Deckel ab.
   2. Schneiden Sie die Kunststoffkappe vorsichtig mit einer feinen Schere ab und entfernen Sie sie mit einer Pinzette, um übermäßige Belastung auf den Schädel zu vermeiden.
   3. Ziehe vorsichtig das weiche Folienmaterial um das Lichtungsfenster ab, um die geräumte Schädelregion vollständig freizulegen.
   4. Tragen Sie einen kleinen Tropfen S2-Lösung direkt auf den geklärten Schädel auf, um während der Bildgebung als Brechungsindex-passendes Immersionsmedium zu dienen.
      HINWEIS: In dieser Studie wurden Standard-Wasserimmersionsobjektive verwendet, darunter ein 16×/NA 0,8 Objektiv (N16XLWD-PF, Nikon) und ein 25×/NA 1,1 Objektiv (N25X-APO-MP, Nikon). Bei Verwendung von S2 als Immersionsmedium sollte das Korrekturhalsband des Objektivs, falls vorhanden, auf die passende Einstellung für den Brechungsindex von S2 angepasst werden, um sphärische Aberrationen zu reduzieren. In den hier gezeigten Experimenten behielt der geklärten Schädel eine ausreichende optische Klarheit für etwa 2 Stunden Zwei-Photonen-Bildgebung, ohne dass die Bildqualität während der dendritischen Wirbelsäulenbeobachtung sichtbar verschlechtert wurde. Nach etwa zwei Tagen war eine weitere Aufnahme erforderlich, und die Wiederaufnahmezeit war deutlich kürzer als die anfängliche, was eine effiziente, wiederholte Bildgebung desselben Tieres ermöglichte.
3. Wache, kopffixierte Bildgebung (optional)
   HINWEIS: Für die Wachaufnahme gewöhnen Sie die Maus vor dem Experiment an die Kopffixierung. Betäuben Sie die Maus kurzzeitig mit Isofluran, befestigen Sie dann die implantierte Kopfplatte für 15–30 Minuten pro Sitzung am Halter und wiederholen Sie dies 2–3 Tage lang.
   1. Verwenden Sie eine kurze Isoflurananästhesie zur Erleichterung der Handhabung. Befestigen Sie nur die implantierte Kopfplatte am Halter, sodass sich der Körper frei auf dem Laufrad oder der Plattform bewegen kann.
   2. Befolgen Sie die Schritte 6.2.1–6.2.4, um die freigeräumte Schädeloberfläche freizulegen und S2 vor der Bildgebung anzuwenden.

7. Genesung

1. Nach der Bildgebung werden Sie vorsichtig abgesaugt und eventuelle Rest-S2-Lösung von der Schädeloberfläche entfernt.
2. Spülen Sie den gereinigten Schädelbereich mehrmals mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um die allmähliche Wiederherstellung des natürlichen undurchsichtigen Zustands des Schädels zu fördern.
3. Trockene Restflüssigkeit aus dem Schädel und dem umliegenden Gewebe vorsichtig mit sterilen Wattestäbchen, um mechanische Schäden am Knochen zu vermeiden.
4. Wenn das Tier für weitere Experimente am Leben gehalten wird, tragen Sie eine Schicht des biokompatiblen Versiegelungsmittels Kwik-Cast (WPI) über das Schädelfenster auf, um den Knochen während der Überlebensphase zu schützen.
5. Lass die Schutzschicht vollständig aushärten.
6. Lösen Sie die Maus vom Kopfhalter und setzen Sie sie in einen warmen Käfig. Überwachen Sie das Tier, bis es sich vollständig von der Narkose erholt hat, und bringen Sie es dann zurück in seinen Stammkäfig.

Ergebnisse

Gemäß dem Protokoll ermöglicht das kopfmontierte optisch transparente Schädelfenster (HOTS) eine tiefe transkranielle Zweiphotonenbildgebung bei erwachsenen Mäusen und erhält dabei die Schädelintegrität. Eine erfolgreiche Vorbereitung wird durch zwei Schlüsselergebnisse angezeigt: (1) Die kortikale Gefäßstruktur wird nach der Reinigung durch den Schädel deutlich sichtbar (Abbildung 1Bf), und (2) der geklärte Schädel zeigt bei sanftem Druck e...

Diskussion

Die HOTS-Methode verwendet ein kopfmontiertes, optisch transparentes Schädelfenster (HOTS), das eine Kappe mit Clearing-Reagenzien mit einem zweistufigen Schädelreinigungsverfahren kombiniert, um die Schädeltransparenz bei erwachsenen Mäusen zu verbessern und gleichzeitig die Schädelintegrität zu erhalten. Nach dem Standardprotokoll (6 Stunden in S1 und 1 Stunde in S2 bei 6 Wochen alten Mäusen) unterstützte das resultierende Fenster zuverlässig eine tiefe transkranielle Zweiphotonen-Bild...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 ml Einwegpipette	Beijing Biotopped  Science   & Technologie  Co., Ltd.	N/A
Zahnbeton	Shanghai Rongxiang Dental Materials Co., Ltd.	N/A
D-mannose	Macklin	D813082
EDTA	Aladdin	El 16428
Isoflurane	Heckantrieb	N/A
Kwik-Cast	WPI	N/A	Ein biokompatibles Dichtmittel
NaOH	Macklin	S832169
Selbsthärtend        dental          Weiches Linermaterial	Yangmahu Biotechnology (Hebi) Co., Ltd.	N/A
Natriumpentobarbital	Biopike	N/A
Stereotaktische Apparatur	Heckantrieb	N/A
Sterile Einwegspritze	Minank	N/A	1 mL; 26-G-Nadel
Sulfolan	Macklin	S817950
Thy1-GFP-M-Mäuse		N/A	Bereitgestellt  von Prof. Yang Zhan
Thyl-GCaMP6s  Mäuse	Jackson-Labor
Tween 20	Sigma-Vetec	V900548
Wasser-Immersionsziel	Nikon	N25X-APO-MP	25&mal;/NA 1.1 Ziel
Wasser-Immersionsziel	Nikon	N16XLWD-PF	16×/NA 0.8 objective