Methodenartikel

Echtzeit-Label-freie Bildgebung und quantitative Analyse der Makrophagenmorphodynamik mittels optischer Beugungstomographie

DOI:

10.3791/71209

⸱

9. Juni 2026

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1Sichuan Provincial Key Laboratory of Innovation and Efficient Utilization of Chinese Medicine Germplasm Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Yangtze Delta Institute of Optoelectronics, Peking University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt einen labelfreien optischen Beugungstomographie-basierten Workflow für Echtzeitbildgebung und quantitative Analyse der Makrophagenmorphodynamik. Die Methode ermöglicht eine kontinuierliche Verfolgung der Einzelzell-Morphologie und -Migration und liefert zeitaufgelöste Messungen der projizierten Fläche, des Umfangs und der durchschnittlichen Migrationsgeschwindigkeit während der Langzeitbildgebung von lebenden Zellen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie etabliert einen labelfreien optischen Beugungstomographie (ODT)-basierten Workflow für Live-Zell-Bildgebung und -analyse, um zeitabhängige morphologische Veränderungen in Makrophagen zu beobachten. Die Methode ermöglicht eine kontinuierliche Aufzeichnung der Morphologie und Bewegung einzelner Zellen über längere Zeiträume unter stabilen Umweltbedingungen und ermöglicht die Extraktion quantitativer Parameter, einschließlich projizierter Fläche, Umfang und durchschnittlicher Migrationsgeschwindigkeit. Dieser Workflow bietet einen praktischen Ansatz zur Erfassung dynamischer zellulärer Verhaltensweisen auf Einzelzellebene ohne exogene Markierung. Unter Verwendung von RAW264.7-Makrophagen als Modell wurde Zeitrafferbildgebung unter Lipopolysaccharidstimulation mit Baicalin-Vorbehandlung durchgeführt, um dynamische zelluläre Veränderungen unter verschiedenen Bedingungen zu erfassen. Repräsentative Zellen wurden für die Nachverfolgung und quantitative Analyse ausgewählt. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser Workflow stabile langfristige Einzelzellverfolgung unterstützt und zeitliche Veränderungen in Zellmorphologie und -beweglichkeit widerspiegelt. Dieser Ansatz bietet eine labelfreie Methode zur Beobachtung dynamischer zellulärer Verhaltensweisen als Reaktion auf verschiedene Reize und kann als nützliche Ergänzung zu herkömmlichen, endpunktbasierten Assays dienen. Sie kann auch auf andere adhärente Zelltypen für Studien zur Zellmorphodynamik anwendbar sein.

Einleitung

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Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei angeborenen Immunantworten und der Gewebehomöostase, und ihre funktionellen Zustände können sich dynamisch als Reaktion auf mikroumweltliche Reize verändern. Traditionell wurden Makrophagen als annehmend von pro-inflammatorischen oder entzündungshemmenden/reparaturassoziierten Phänotypenbeschrieben 1,2. Allerdings deuten zunehmende Belege darauf hin, dass die Aktivierung der Makrophagen ein kontinuierlicher und plastischer Prozess ist und kein diskreter binärer Zustand3,4. Unter verschiedenen Reizen durchlaufen Makrophagen im Laufe der Zeit allmähliche Veränderungen, begleitet von Veränderungen in der Zellmorphologie und im Wanderverhalten5. Daher bietet zeitaufgelöste Charakterisierung morphologischer und migratorischer Veränderungen auf Einzelzellebene einen wichtigen Ansatz zur Untersuchung dynamischer zellulärer Reaktionen.

Aktuelle Ansätze zur Untersuchung von Makrophagenzuständen basieren hauptsächlich auf Immunfärbung, Durchflusszytometrie sowie transkriptomischen oder proteomischen Analysen6. Diese Methoden basieren typischerweise auf festen Stichproben oder diskreten Zeitpunkten, was ihre Fähigkeit einschränkt, kontinuierliche Veränderungen in derselben Zelle unter lebenden Bedingungenzu verfolgen. Die fluoreszenzbasierte Live-Cell-Bildgebung ermöglicht eine dynamische Beobachtung, kann jedoch während Langzeitexperimenten durch Phototoxizität und Photobleaching beeinflusst werden. 8,9. Die optische Beugungstomographie (ODT) ist eine labelfreie Bildgebungstechnik, die die dreidimensionale Brechungsindexverteilung von Zellen rekonstruiert, um quantitative strukturelle Informationenbereitzustellen. Da es keine exogene Markierung benötigt, eignet sich ODT für die Langzeitbildgebung lebender Zellen und reduziert Störungen des zellulären Verhaltens. In den letzten Jahren wurde ODT auf dynamische Studien in verschiedenen Zellmodellen11 angewendet, wobei sich frühere Studien hauptsächlich auf Bildgebungsfähigkeit und strukturelle Charakterisierung konzentrierten. Im Gegensatz dazu etabliert die vorliegende Studie einen standardisierten, labelfreien Workflow für eine langfristige, zeitaufgelöste Einzelzellanalyse der Makrophagenmorphodynamik unter einer definierten In-vitro-Stimulationsbedingung.

Der Arbeitsablauf wird mit einem in-vitro RAW264.7-Makrophagenmodell mit Lipopolysaccharid-(LPS)-Stimulation und Baicalin-(BAI)-Vorbehandlung demonstriert. BAI wurde als repräsentativer experimenteller Modulator verwendet, um eine definierte Bedingung zur Demonstration des Arbeitsablaufs festzulegen. Kontinuierliche Bildgebung ermöglicht die Extraktion quantitativer Einzelzellparameter, einschließlich projizierter Fläche, Umfang und durchschnittlicher Migrationsgeschwindigkeit, was zeitaufgelöste Charakterisierung morphologischer und verhaltensbezogener Veränderungen ermöglicht. Dieser Ansatz soll eine deskriptive Analyse dynamischer phänotypischer Veränderungen liefern, anstatt funktionale Zustände oder Polarisation zu definieren, und kann als ergänzende Methode zu endpunktbasierten Tests dienen, indem zeitliche Informationen bereitgestellt werden. Der Workflow wird in diesem Modellsystem validiert und ist potenziell auf andere adhärente Zelltypen anwendbar.

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Protokoll

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1. Makrophagenkultur

VORSICHT: Führen Sie alle Verfahren in einem Biosicherheitsschrank mit Laborhandschuhen und Laborkittel durch.

  1. Bereite ein vollständiges Kulturmedium vor (hochglukosehaltiges Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)) ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin–Streptomycin).
  2. Tauen Sie ein Fläschchen mit RAW264.7-Makrophagenzellen in einem 37 °C Wasserbad für weniger als 1 Minute auf.
  3. Transferiert die Zellsuspension auf ein hochglukosehaltiges DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin.
  4. Zentrifugiere bei 300 × g für 5 Minuten.
  5. Entsorge das Supernatant.
  6. Die Zellen in einem frischen, vollständigen Medium wieder suspendieren.
  7. Saatzelle in 60 mm große Schalen mit 2–5 × 105 Zellen pro Schüssel.
  8. Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
  9. Wechseln Sie das Medium nicht innerhalb von 12–24 Stunden nach dem Auftauen.
  10. Ersetzen Sie das Medium alle 2–3 Tage.
  11. Überwachen Sie die Zellmorphologie mit einem invertierten Mikroskop.
  12. Passagezellen bei 80–90 % Zusammenfluss durch sanftes Pipetieren.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Verwendung von Trypsin. Verwenden Sie Zellen an den Passagen 6–18. Wählen Sie Zellen mit einheitlicher Morphologie und ohne Vakuolisierung für Experimente aus. Die Zelllinie wurde durch STR-Profilierung authentifiziert und einer Qualitätskontrollprüfung unterzogen. Detaillierte Berichte und eine englische Zusammenfassung sind in den Supplementary Files bereitgestellt.

2. Zellbehandlung

  1. Sammeln Sie Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase durch sanftes Pipetteren.
  2. Cellen in einem vollständigen Medium wieder suspendieren.
  3. Messen Sie die Zelldichte mit einem Zellzähler.
  4. Stelle die Zelldichte auf 4 × 104 Zellen /mL an.
  5. Säen Sie 2 ml Zellsuspension in jede 35-mm-Schale.
  6. Richten Sie Gerichte zwei Gruppen zu: (i) LPS-Gruppe, (ii) BAI + LPS-Gruppe.
  7. Zellen bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 12–16 Stunden inkubieren.
  8. Bereite eine 50 mM BAI-Stocklösung in DMSO vor. Lagern Sie die BAI-Stocklösung bei −20 °C.
  9. Fügen Sie BAI zur BAI + LPS-Gruppe hinzu, um eine Endkonzentration von 100 μM zu erreichen. Verdünnen Sie die BAI-Lagerlösung direkt im Kulturmedium, um die endgültige Arbeitskonzentration zu erreichen.
  10. Fügen Sie der LPS-Gruppe ein gleiches Volumen DMSO hinzu.
  11. Bereiten Sie eine LPS-Lagerlösung (1 mg/mL) im vollständigen Medium vor.
  12. Fügen Sie LPS zu beiden Gruppen hinzu, sodass eine Endkonzentration von 1 μg/mL erreicht wird. Verdünnen Sie die LPS-Lagerlösung direkt in einem Kulturmedium, um die endgültige Arbeitskonzentration zu erreichen.
  13. Beginnen Sie sofort mit der Bildaufnahme und wechseln Sie das Medium während der Bildnahme nicht.

3. Optische Beugungstomographie

  1. Schalten Sie das ODT-Bildgebungssystem ein und starten Sie das Umweltkontrollmodul.
  2. Stellen Sie die Bühnentemperatur auf 37 °C ein.
  3. Stellen Sie die CO₂-Konzentration auf 5 % ein.
  4. Lass das System mindestens 20 Minuten im Gleichgewicht bleiben.
  5. Öffnen Sie die Akquisitionssoftware.
  6. Stellen Sie die Kulturschale auf die Bildgebungsbühne.
  7. Verwenden Sie ein 60x-Objektiv (NA = 1,42), um Zellen zu lokalisieren.
  8. Wählen Sie isolierte Zellen mit klaren Grenzen für die Bildgebung aus.
  9. Stellen Sie das Bildgebungsintervall auf 8 Minuten ein.
  10. Stellen Sie die Gesamtzahl der Frames auf 181 ein.
  11. Aktivieren Sie die Autofokusfunktion, um während der Zeitrafferaufnahme den Fokus zu halten.
  12. Beginne mit der Zeitraffer-Erfassung.
  13. Überwachen Sie die Systemstabilität während der Erfassung.
    HINWEIS: Während des gesamten Experiments wurde eine Autofokus-Stabilisierung angewendet, um Brennstoffdrift zu minimieren.

4. Bildrekonstruktion und quantitative Analyse

  1. Nach der Bildaufnahme führt die Software automatisch eine Bildrekonstruktion durch.
  2. Mit dem eingebauten Standardalgorithmus.
  3. Warte, bis die Fortschrittsleiste abgeschlossen ist.
  4. Öffnen Sie die Analysesoftware (Intellyseg, v2.1.0).
  5. Importiere den Rohdatensatz, indem du Rohdaten importierst.
  6. Ich suche im Zielordner.
  7. Wählen Sie die Zieldatei und importieren Sie den Datensatz.
  8. Klicken Sie auf "Zelle", um eine automatische Segmentierung mit konsistenten Einstellungen über Datensätze13 durchzuführen.
  9. Wählen Sie Zellen nach folgenden Kriterien aus: (i) keine Überlappung mit benachbarten Zellen, (ii) nicht in Kontakt mit Bildgrenzen, (iii) kontinuierlich nachvollziehbar über die gesamte Zeitreihe.
  10. Wählen Sie eine feste Anzahl von Zellen (n = 8) pro Sichtfeld aus, um eine konsistente Analyse über Datensätze hinweg durchzuführen.
  11. Öffnen Sie das Modul "Long-term Tracking".
  12. Hier kommen Start- und Endframes.
  13. Klicken Sie auf "Track", um das Tracking zu starten, das auf der Konsistenz der Zellposition zwischen aufeinanderfolgendenFrames 14 basiert.
  14. Korrigieren Sie Nachverfolgungsfehler bei Bedarf manuell, um die Trajektorienkontinuität zu gewährleisten: (i) Rechtsklick auf falsche Masken und wählen Sie "Löschen von Element", (ii) Öffnen Sie "Manuelle Segmentierung", (iii) Wählen Sie "Zelle" und klicken Sie auf "Hinzufügen", (iv) Verwenden Sie "Klicken" oder "Box", um korrekte Masken hinzuzufügen.
  15. Klicke auf "Export" und dann auf "Datenexport".
  16. Wählen Sie "Video Export" und wählen Sie Ausgabeelemente aus.
  17. Hier kommen die Start- und Endframes ins Spiel.
  18. Wählen Sie den Speicherpfad und das Dateiformat aus.
  19. Klicken Sie auf "OK", um das Video zu exportieren.
  20. Klicken Sie auf "Export" und wählen Sie dann "Chart-System".
  21. Wählen Sie "Track Chart".
  22. Wählen Sie "Zelle" als Segmentierungskategorie.
  23. Hier kommt der Tracking-Frame-Bereich ins Spiel.
  24. Wählen Sie die Ausgangsparameter aus (z. B. Fläche, Umfang).
  25. Klicken Sie auf "Bild oder Excel exportieren" und speichern Sie die Datei.
  26. Berechnen Sie die durchschnittliche Migrationsgeschwindigkeit (μm/h) für jede Zelle basierend auf der Schwerpunktverschiebung über die gesamte Zeitreihe.

5. Datenpräsentation

  1. Quantitative Messungen werden beschreibend präsentiert. Es wurde keine statistische Schlussfolgerung vorgenommen. Jede Behandlungsgruppe umfasste fünf unabhängige Stichproben.
    Ein Überblick über den experimentellen Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt. Wichtige Reagenzien, Instrumente und Software sind in der Materialtabelle aufgeführt. Bildgebende Bedingungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

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Ergebnisse

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Um die Leistung des ODT-basierten Arbeitsablaufs zu bewerten, wurde für zwei Behandlungsgruppen (LPS und BAI + LPS) eine Zeitrafferbildgebung mit jeweils fünf unabhängigen Proben pro Gruppe durchgeführt. Alle Proben wurden unter identischen Bildaufnahmebedingungen entnommen. Aufgrund der hohen Arbeitsbelastung, die mit langfristiger Einzelzellverfolgung und quantitativer Analyse verbunden ist, wurde aus jeder Gruppe eine repräsentative Stichprobe für die Einzelzellanalyse und -visualisierung ausgewählt. Die Ergebnisse we...

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Diskussion

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Diese Studie etabliert einen labelfreien, ODT-basierten Workflow für kontinuierliche Bildgebung und quantitative Analyse der Makrophagenmorphodynamik auf Einzelzellebene. Der Ansatz ermöglicht zeitaufgelöste Messungen der projizierten Fläche, des Umfangs und der durchschnittlichen Migrationsgeschwindigkeit während der Langzeitbildgebung von lebenden Zellen. Die Zellsamendichte ist ein entscheidender Faktor, der die Segmentierung und die Verfolgungsleistung beeinflusst. Eine hohe Dichte f...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass Jie-jie Zhu und Yan-qing Yang mit Pellucid Optics (Nantong) Co., Ltd. verbunden sind. Das in dieser Studie verwendete ODT-Bildgebungssystem steht in Verbindung mit diesem Unternehmen. Diese Zugehörigkeit hatte jedoch keinen Einfluss auf das experimentelle Design, die Datenerhebung, Analyse oder Interpretation der Ergebnisse. Die übrigen Autoren geben keine konkurrierenden Interessen an.

Danksagungen

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Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (U24A20790), dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie (2022YFF0712500 und 2023YFF0722600) sowie dem Provinzministerium für Wissenschaft und Technologie Jiangsu (BK20250540) unterstützt.

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Materialien

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Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ODT-BildgebungssystemPellucid OpticsMH-PanoViewVerwendet für labelfreie Live-Zell-Bildgebung
ErfassungssoftwarePellucid Optics Lucida-Pano v2.1.0Verwendet für Bilderfassung
AnalysesoftwarePellucid Optics Intellyseg v2.1.0Verwendet für Bildrekonstruktion, Segmentierung und Tracking
RAW264.7Wuhan Zishan Biotechnology STCC20020PMurina Makrophagen-Zellinie, verwendet für In-vitro-Polarisations- und Bildgebungsexperimente.
Baicalin (BAI)Shanghai Yuanye JB246114Verwendet für Zellvorbehandlung
Lipopolysaccharid (LPS)SolarbioL8880Verwendet zur Stimulation von Makrophagen
DMEM-MediumGibcoC11995500BTZellkulturmedium
Fötales RinderserumProcell164210Zusatz für Zellkultur
Penicillin–Streptomycin (100x)ProcellPB180120Antibiotika für Zellkultur
60 mm KulturschaleCorningCLS430166Verwendet für Zellkultur
35 mm GlasbodenschaleCellvisD35-10-1.5-NVerwendet für ODT-Bildgebung
Invertiertes MikroskopOLYMPUSCKX53Verwendet für routinemäßige Zellbeobachtung und Überwachung während der Kultur.
ZellzählerRWD Life ScienceC100Verwendet für Zelldichtenbestimmung
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Schlagwörter

Live Cell ImagingEinzelzell TrackingZeitraffer ImagingZellmorphologieZellmotilit tRAW264 7 Makrophagen
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