Exogener mitochondrialer Transfer bei der Differenzierung von braunen Adipozyten und AGPAT2-defizienten Präadipozyten

Zusammenfassung

Exogene Mitochondrien menschlichen und murinen Ursprungs können durch Differenzierung von Präadipozyten internalisiert und während der adipogenen Differenzierung mittels bildgebender und genetischer Instrumente verfolgt werden. Obwohl diese Mitochondrien physikalisch mit dem endogenen mitochondrialen Netzwerk interagieren, erhöhen sie nicht die Expression der Marker, die mit reifen braunen Adipozyten assoziiert sind.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind wichtige Signalzentralen; Ob jedoch die Expansion der mitochondrialen Masse mechanistisch für die Differenzierung erforderlich ist, bleibt offen. AGPAT2 katalysiert die Umwandlung von Lysophosphatidinsäure in Phosphatidinsäure, und ihr Mangel führt zu Fettgewebemangel und einer gestörten Adipogenese, die mit einer verringerten mitochondrialen Masse verbunden sind. Der Einfluss der Expansion der mitochondrialen Masse auf die Adipogenese wurde bewertet, indem exogene Mitochondrien in differenzierende braune Adipozyten übertragen wurden. Ob mitochondrialer Transfer die beeinträchtigte Adipogenese von AGPAT2-defizienten Zellen retten könnte, wurde ebenfalls untersucht. Menschliche und murine Mitochondrien wurden erfolgreich übertragen und in das endogene mitochondriale Netzwerk differenzierender Mauspräadipozyten integriert und blieben während der Braunen Adipogenese bestehen. Eine adipogene Differenzierung war für die Retention der übertragenen Mitochondrien erforderlich. Der mitochondriale Transfer veränderte die Expression der molekularen Marker reifer brauner Adipozyten oder des Lipidtröpfcheninhalts nicht, beeinflusste jedoch die relative Verteilung der Lipidtröpfchengröße artabhängig. Bei Agpat2^-/- Präadipozyten konnte der mitochondriale Transfer die Adipogenese nicht retten, was darauf hindeutet, dass die Ausweitung der mitochondrialen Masse allein nicht ausreicht, um die Mechanismen zur Lipodystrophie in diesem Modell umzukehren. Diese Ergebnisse zeigen, dass zwar exogene menschliche und murine Mitochondrien in das mitochondriale Netzwerk differenzierender Adipozyten integriert werden können, sie aber nicht direkt das adipogene Programm beeinflussen.

Einleitung

Über ihre primären bioenergetischen Funktionen hinaus dienen Mitochondrien als Signalknotenpunkte in mehreren zellulären Prozessen, einschließlich Zelldifferenzierung ^1,2,3,4. Braunes Fettgewebe (BAT) besitzt eine bemerkenswert hohe mitochondriale Masse, die seine thermogene Aktivität unterstützt, was seine Rolle im Energiegleichgewicht des ganzen Körpers und in der Pathogenese der Fettleibigkeit^{unterstreicht}. Während die mitochondriale Masse durch das Gleichgewicht zwischen Biogenese und Mitophagie reguliert wird, bleibt unklar, ob die Expansion der mitochondrialen Masse während der Differenzierung der braunen Adipozyten funktional für die Adipogenese erforderlich ist oder lediglich eine Folge des Prozesses.

Der physiologische mitochondriale Transfer zwischen Zellen wurde sowohl in vitro als auch in vivo dokumentiert, wobei er zur Gewebeanpassung unter pathologischen Bedingungen beiträgt, einschließlich Fettgewebedysfunktion im Zusammenhang mit Fettleibigkeit und Insulinresistenz ^6,7. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass künstlicher mitochondrialer Transfer in vitro die Atemkapazität der Empfängerzellen⁸ verbessert. Diese Ergebnisse stützen zusammen das Konzept, dass mitochondrialer Transfer die zelluläre Stoffwechselfunktion verändern und zur Gewebeanpassung unter Bedingungen bioenergetischen Stresses^{beitragen kann.} Im Vergleich zu pharmakologischen oder genetischen Strategien, die endogene mitochondriale Biogenese durch Aktivierung nukleärer und mitochondrialer Transkriptionsprogramme stimulieren, liefert der mitochondriale Transfer Organellen direkt an die Empfängerzellen, was eine schnelle Modifikation der mitochondrialen Masse unabhängig von transkriptionellen Manipulationen ermöglicht^12,13. Dieser Ansatz ist entscheidend für die Korrektur von Defekten bei mitochondrialen Erkrankungen, ermöglicht aber auch, mitochondriale Wirkungen ohne potenzielle Off-Target-Effekte pharmakologischer oder genetischer Ansätze^{zu untersuchen 14}.

In der vorliegenden Studie untersuchten wir den Effekt einer künstlichen Erhöhung der mitochondrialen Masse durch exogenen mitochondrialen Transfer bei der differenzierenden braunen Adipozyten. Dieser Ansatz ermöglichte eine direkte Bewertung der Auswirkungen der mitochondrialen Masse auf das adipogene Programm. Um dies zu erreichen, wurden mitochondriale Transferprotokolle, die ursprünglich für mesenchymale Stammzellen entwickelt wurden^{, angepasst,} wobei sowohl menschliche Leberzellen als auch Mauspräadipozyten als mitochondriale Spender verwendet wurden. Eine Methode zur Verfolgung menschlicher Mitochondrien in differenzierenden Mauszellen wurde mit genetischen Werkzeugen in Kombination mit bildgebenden Techniken entwickelt, die zeigt, dass Mitochondrien beider Ursprünge in das endogene mitochondriale Netzwerk integriert werden und während der adipogenen Differenzierung bestehen.

Zur Modellierung der defekten Adipogenese, die mit niedriger mitochondrialer Masse assoziiert ist, wurden differenzierte braune Adipozyten verwendet, die von 1-Acylglycerol-3-phosphat-O-acyltransferase 2 (AGPAT2)-defizienten (Agpat2-/-)-defizienten (Agpat2^-/-)-Mäusen abgeleitet wurden. AGPAT2 wird im Fettgewebe hoch exprimiert, wo es die Bildung von Phosphatidsäure im Biosyntheseweg der Glycerolipide katalysiert. Der AGPAT2-Mangel verursacht eine schwere Lipodystrophie sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen und beeinträchtigt die Adipogenese in weißen und braunen Adipozytenmodellen in Verbindung mit einer verminderten mitochondrialen Masse 16,17,18. Die Einbeziehung exogener Mitochondrien in differenzierende Präadipozyten veränderte die Lipidtropfengröße leicht, erhöhte jedoch nicht die Expression der reifen braunen Adipozytenmarker und rettet die adipogene Beeinträchtigung der Agpat2^-/- Präadipozyten.

Protokoll

Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Pontificia Universidad Católica de Chile genehmigt, Protokoll 210609003. Wildtyp- und Agpat2^-/- P0.5-Neugeborenenmäuse beider Geschlechter, abgeleitet aus einem gemischten C57BL/6J- und 129J-genetischen Hintergrund, wurden in dieser Studie verwendet. Persönliche Schutzausrüstung (PSA): Tragen Sie einen Laborkittel, eine Schutzbrille und Nitrilhandschuhe. Siehe Supplemental File 1 für weitere Protokolldetails und Tabelle 1 für die für dieses Protokoll benötigten Puffer.

Alle toxischen chemischen Abfälle, die während der Elektronenmikroskopievorbereitung, Paraformaldehydfixierung und Nukleinsäureextraktion entstehen, müssen streng in ausgewiesene, klar gekennzeichnete Ströme gemäß den institutionellen Umweltschutzvorschriften (EHS) getrennt werden. Unter keinen Umständen darf eines dieser Reagenzien in die Laborspüle oder das öffentliche Abwassersystem abgegeben werden. Alle erzeugten gefährlichen chemischen Abfälle müssen gemäß den institutionellen EHS-Klassifikationen getrennt werden.

1. Zellkultur

1. Isolierung, Differenzierung und Erhaltung primärer Adipozyten (iBAT)
   HINWEIS: Siehe Ergänzungsakte 1 für eine kurze Beschreibung der Verfahren und Tabelle 1 für die Zusammensetzung der erforderlichen Lösungen. Eine vollständige und detaillierte Erklärung unseres in vitro braunen adipogenen Differenzierungsprotokolls findet sich in Figueroa et ^al.19.
   1. Isoliere Präadipozyten aus dem interskapulären braunen Fettgewebe (iBAT) von neonatalen (P0,5)-Mäusen nach den chirurgischen und enzymatischen Verdauungsverfahren, die von Figueroa et ^al.19 beschrieben wurden.
   2. Differenzieren und erhalten Sie die braune Adipozytenkultur gemäß dem Differenzierungscocktail- und Medienaustauschplan.
      HINWEIS: Für eine erfolgreiche adipogene Differenzierung ist es von entscheidender Bedeutung, dass Kulturen vor Beginn der adipogenen Induktion 90–100 % Konfluenz erreichen.
2. HepG2-Kultur
   1. Kultur von HepG2-Zellen in DMEM, ergänzt mit 10 % fetalem Rinderserum, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin und 0,25 μg/mL Amphotericin B. Halten Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %_CO2.
      HINWEIS: Diese Zellen wachsen in Clustern und können trotz hoher Dichte aufgrund des mehrschichtigen Wachstums subkonfluent erscheinen.

2. Mitochondriale Isolation und Übertragung

1. Mitochondriale Isolation
   HINWEIS: Führen Sie alle Schritte in einem Biosicherheitsschrank bei 4 °C oder auf Eis aus. Verwenden Sie die Zubereitung innerhalb von 2 Stunden.
   1. Samen 2 × 10^{6 Spenderzellen} (HepG2 oder Präadipozyten) in 100 mm Kulturschalen. Zellen wachsen lassen, bis sie eine Konfluenz von 80 % (HepG2) oder 100 % (Präadipozyten) erreichen.
   2. Färbe Spenderzellen mit 100 nM MitoTracker Deep Red FM in FBS-freiem Medium für 30 Minuten bei 37 °C in einem 5%igen CO2-Inkubator.
   3. Wasche die Zellen zweimal mit Wachstumsmedium, um überschüssige Farbe zu entfernen.
   4. Zellen mit Trypsin abtrennen, die Suspension aufsammeln und bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugieren.
   5. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml mitochondrialem Isolationspuffer (MIB), ergänzt mit BSA, Proteaseinhibitoren und Phosphataseinhibitoren. Stören Sie die Plasmamembran, indem Sie die Suspension fünfmal durch eine Tuberkulinspritze führen. Homogenisieren Sie die Suspension, indem Sie sie mindestens 10 Mal durch eine Insulinspritze führen, bis die Lösung hellbraun ist und keine sichtbaren Klumpen mehr aufweisen.
      HINWEIS: Für die Western-Blot-Analyse nehmen Sie 50 μL des gesamten Lysats ein und lagern Sie bei -20 °C.
2. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 900 × g für 11 Minuten bei 4 °C.
   HINWEIS: Wenn der Supernatant nach dem 900-×- g-Spin nicht trüb ist, ist die zelluläre Lyse wahrscheinlich unvollständig.
   1. Sammeln Sie das Supernatant und zentrifugieren Sie bei 10.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um die Mitochondrien zu pelletieren. Wasche das mitochondriale Pellet dreimal mit MIB und mit BSA ergänzt.
   2. Führen Sie eine letzte Wiederauffederung in 100 μL BSA-freiem MIB durch. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit einem BCA-Proteinassay.
3. Mitochondrialer Transfertest (MTA) in Präadipozyten
   1. Samenempfänger nimmt 24 Stunden vor dem Assay Preadipozyten bei 5 × 10⁵ Zellen/Brunnen in 12-Bohrloch-Platten (mit 18 mm Abdeckfolien für die Mikroskopie) auf.
   2. Fügen Sie isolierte Spendermitochondrien direkt zum Empfängermedium hinzu, mit einem Verhältnis von 10 μg mitochondriales Protein pro 10^{5 Zellen} . Schaukeln Sie die Platten sanft, um die Mitochondrien zu verteilen. Inkubieren Sie die Zellen 24–120 Stunden (entsprechend den Tagen 1, 3 und 5 der Differenzierung) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ vor der Analyse.

3. Mitochondrien-Sauerstoffverbrauch und MTA-Effizienz

1. Mitochondriale Respirometrie
   1. Stellen Sie das äußere zirkulierende Wasserbad auf 25 °C ein und sorgen Sie für ein stabiles thermisches Gleichgewicht in der Kammermantel, bevor Sie mit Messungen beginnen.
   2. Führen Sie eine Zweipunkt-Flüssigkeitsphasenkalibrierung mit der Erfassungssoftware des Instruments durch.
      1. Luftsättigungskalibrierung (High Point): Fügen Sie 500 μL luftgesättigtes, entmineralisiertes Wasser in die Kammer ein. Stellen Sie den magnetischen Rührer auf 60 U/min ein und nehmen Sie das Signal auf, bis es sich auf einem Plateau stabilisiert (>1.500 mV).
      2. Kalibrierung ohne Sauerstoff (Low Point): Geben Sie eine kleine (~3 mm Durchmesser) Menge Natriumsulfit in die Kammer, um die verbleibende Luft zu verdrängen. Zeichnen Sie auf, bis das Signal auf ein stabiles Basisplateau (~1 % des Basalsignals, ~20 mV) abfällt.
   3. Starten Sie die Echtzeitaufnahme (Gesamtlaufzeit: ~10 Min).
   4. Rekord für 3 Minuten, bis eine stabile lineare Messung erreicht ist.
   5. Resuspendiere isolierte Mitochondrien in 200 μL mitochondrialen Assay Buffer (MAS)²⁰, ergänzt mit 5 mM Glutamat und 2,5 mM Malat.
      HINWEIS: Für die vorliegende Arbeit wurde das Pellet der Gesamtmitochondrien aus zwei 100-mm-Zellplatten extrahiert.
   6. Übertragen Sie die Suspension in die Oxygraph-Kammer und schließen Sie den Kammerdichtungskolben fest, wobei keine Luftblasen mehr verbleiben.
   7. Rekord des Sauerstoffverbrauchs für 3 Minuten.
   8. Fügen Sie 150 μM ADP hinzu, um mitochondriale gekoppelte Atmung auszulösen, und messen Sie die ATP-Synthese-gekoppelte Atmung für 3 Minuten.
   9. Definieren Sie manuell die stabilen, linearen Segmente, die jeder Atemphase entsprechen. Extrahiere die automatisierten Steigungswerte, die von der Software berechnet werden, ausgedrückt als Sauerstoffverbrauchsraten in nmol∙^mL-1∙^min-1.
      HINWEIS: Für die Reinigung der Zwischenplattenkammer spülen Sie die Kammer zweimal mit 1 ml entmineralisiertem Wasser und stellen Sie sicher, dass das Innere vollständig trocken ist. Gib 100 μL PBS in die Kammer, bevor du zur nächsten Platte übergehst.
2. Durchflusszytometrie
   HINWEIS: Bewahren Sie während des gesamten Eingriffs alle Proben auf Eis, um die zelluläre und bioenergetische Integrität zu erhalten.
   1. Isolieren Sie Mitochondrien und führen Sie mitochondriale Transfertests (MTA) durch, wie in den Abschnitten 2.1 bzw. 2.2 beschrieben, in 35-mm-Kulturschalen unter Verwendung von Spenderzellen, die zuvor mit MitoTracker Deep Red FM markiert waren.
   2. Aspirieren Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellmonoschicht einmal mit 1 ml sterilem PBS.
   3. Fügen Sie 500 μL 0,25 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie die Schalen bei 37 °C, bis unter dem Mikroskop eine vollständige Zellablösung beobachtet wird.
   4. Neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie 1 ml vollständiges Wachstumsmedium (DMEM mit 10 % FBS) hinzufügen. Übertragen Sie das gesamte Volumen in ein 15 ml konisches Rohr und zentrifugieren Sie bei 300 × g für 5 Minuten bei 4 °C.
   5. Entsorgen Sie das Supernatant durch Aspiration und behalten Sie das Zellpellet zurück. Suspendieren Sie das Pellet in 500 μL eiskaltem PBS durch sanftes Pipettern wieder.
   6. Analysieren Sie die Proben mit einem Durchflusszytometer mit einem 640-nm-Laser (siehe Supplemental File 1 für Details zur Aufnahme und Analyse der Durchflusszytometrie).
      1. Definieren Sie die Zellpopulation mithilfe von Forward Scatter (FSC) vs. Side Scatter (SSC) Plots und wenden Sie eine Gating-Strategie an, um Trümmer und Zell-Doublets auszuschließen.
      2. Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität im fernroten Kanal (670/30 nm Emissionsfilter), um internalisierte, MitoTracker-markierte Mitochondrien zu detektieren.
      3. Führen Sie eine Analyse mit Floreada.io durch (siehe Supplemental File 1 für Details zum Gating-Protokoll).
         HINWEIS: Fügen Sie eine negative Kontrolle (Empfängerzellen ohne MTA) ein, um die Ausgangslinie für die Hintergrund-Autofluoreszenz festzulegen.
3. Konfokal- und Elektronenmikroskopie
   1. Lebendzellbildgebungstest
      1. Setze primäre Präadipozyten, die von P0,5-Neugeborenenmäusen gewonnen wurden, in 12-Brunnenplatten mit 18 mm großen Deckschichten, entsprechend den spezifischen Anforderungen an Zelldichte und Medien, die in Abschnitt 1 beschrieben sind.
      2. Isolieren Sie Mitochondrien und führen Sie den mitochondrialen Transfertest (MTA) mit zuvor mit MitoTracker Deep Red FM gekennzeichneten Spenderzellen durch, wie in Abschnitt 2 angegeben.
      3. Halten Sie die Empfängerkulturen 24_{Stunden lang in} einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2, um die mitochondriale Aufnahme zu ermöglichen.
      4. Bereiten Sie eine 70 nM MitoTracker Green Arbeitslösung vor, indem Sie den Bestand in einem FBS-freien Kulturmedium verdünnen.
      5. Aspiratiere das Wachstumsmedium aus den 12-Well-Platten und ersetze es durch die 70 nM MitoTracker Green-Lösung. Inkubieren Sie die Platten 25 Minuten lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2_{, um das} gesamte mitochondriale Netzwerk auszugleichen.
      6. Entferne die Färbelösung und wasche die Überdeckfolien zweimal mit 1 ml warmem, vollständigem Kulturmedium.
      7. Ersetzen Sie das Endvolumen durch ein phenolrotfreies vollständiges Medium, um die Hintergrund-Autofluoreszenz während der Aufnahme zu minimieren.
      8. Übertragen Sie die Deckschichten oder die Platte auf die Konfokalmikroskop-Stufe. Stellen Sie die Inkubationskammer des Mikroskops so ein, dass eine konstante Umgebung von 37 °C und 5 %_CO2 gewährleistet ist.
      9. Nehmen Sie sofort Bilder auf, indem Sie die entsprechenden Anregungs-/Emissionseinstellungen sowohl für den fernroten (MitoTracker Deep Red FM) als auch für den grünen (MitoTracker Green) Kanal verwenden. Weitere Details finden Sie in Supplemental File 1 .
         HINWEIS: Führen Sie alle Färbungs- und Handhabungsschritte unter wenig Licht durch, um eine Photobleachung der Fluorophore zu verhindern. Verwenden Sie ein Öl-Immersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur (NA) (60x oder 100x) für eine optimale Auflösung der mitochondrialen Morphologie.
   2. Konfokaler Immunfluoreszenz-Test mit fixierten Zellen
      HINWEIS: Nach der Zellfixierung werden toxische Paraformaldehyd- und Glutaraldehydlösungen als nichthalogenierte organische Stoffe klassifiziert. Nebenprodukte der Nukleinsäureextraktion erfordern eine strenge Trennung: Phenol/Chloroform-Mischungen müssen als halogenierte organische Stoffe entsorgt werden, während guanidiniumbasierte Puffer als korrosive organische Stoffe klassifiziert werden.
      1. Samen primäre Präadipozyten, abgeleitet von P0.5-Neugeborenenmäusen, in 12-Brunnenplatten mit 12 mm großen Deckschichten, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
      2. Isolieren Sie Mitochondrien und führen Sie den mitochondrialen Transfertest (MTA) nach den in Abschnitt 2 beschriebenen Verfahren durch.
      3. Inkubieren Sie die Kulturen 24 Stunden, um die mitochondriale Aufnahme zu ermöglichen.
      4. Induzieren Sie eine braune adipogene Differenzierung durch Befolgung des in Supplemental File 1 beschriebenen Protokolls und konsultieren Sie Tabelle 1 für die Zusammensetzung der erforderlichen Puffer.
      5. Fixieren Sie die Zellen am 7. Tag der Differenzierung (168 Stunden). Aspirieren Sie das Kulturmedium und fügen Sie 500 μL 4 % Paraformaldehyd (PFA) pro Bohrloch hinzu. Inkubieren Sie 20 Minuten bei Zimmertemperatur.
      6. Waschen Sie die Deckschichten zweimal, indem Sie pro Brunnen 1 ml eiskaltes PBS hinzufügen. Permeabilisieren und blockieren die Zellen, indem die Deckblätter in PBS mit 0,05 % Saponin und 0,2 % BSA für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert werden. Legen Sie die Platte unter sanfter Bewegung auf einen Orbitalshaker.
      7. Wasche die Zellen zweimal mit 1 ml PBS. Färbe die Kerne und Lipidtropfen gleichzeitig. Verwenden Sie 1 μg/mL Hoechst 33342 und 1 μg/mL BODIPY, die im Blockierungs-/Permeabilisierungspuffer vorbereitet werden. Inkubieren Sie 30 Minuten bei Zimmertemperatur, um sicherzustellen, dass der Teller vor Licht geschützt ist.
      8. Waschen Sie die Deckblätter zweimal mit 1 ml eiskalten PBS. Befestige die Deckfolien auf saubere Glasrutschen. Geben Sie 10 μL Montagemittel auf den Schlitten und legen Sie die Abdeckungszelle mit der Seite nach unten auf das Montagemedium. Lassen Sie die Proben vor der Bildgebung über Nacht in einer dunklen Umgebung bei Raumtemperatur trocknen.
      9. Nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop auf. Verwenden Sie zwei Fluoreszenzkanäle, die für die Emissionsspektren von Hoechst und BODIPY kalibriert sind. Siehe Supplemental File 1 für weitere Bildgebungsdetails.
      10. Führen Sie eine Lipidtröpfchenanalyse mit ImageJ v1.54s durch. Öffnen Sie den Lipidtröpfchenkanal, identifizieren Sie einzelne Tröpfchen manuell mit den Freihandauswahlen und den ROI-Manager-Tools und berechnen Sie die Tröpfchenfläche mit dem Analyze-| Messbefehl .
      11. Verarbeiten und analysieren Sie die resultierenden Daten mit den R-Skripten, die in Supplemental File 2 innerhalb der RStudio v4.5.2-Umgebung bereitgestellt werden.
          HINWEIS: Erwachen Sie genau fünf Bilder pro Cover mit 10-facher Vergrößerung, um eine repräsentative Stichprobe zu gewährleisten. Verwenden Sie Version R Version 4.5.2 oder höher für die Kompatibilität mit den bereitgestellten Skripten.
   3. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
      HINWEIS: Für Nebenprodukte der Elektronenmikroskopie müssen hochgiftige Osmiumtetroxid- und arsenhaltige Natriumkakodylpuffer als giftige Schwermetallabfälle gesammelt werden, während Uranylacetat separat als radioaktiver Schwermetallabfall im Rahmen institutioneller Strahlenschutzprotokolle behandelt wird.
      1. Zentrifugieren Sie die isolierten Mitochondrien aus Abschnitt 2 bei 10.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um ein kompaktes Pellet zu erhalten.
      2. Reparieren Sie das Pellet, indem Sie 2,5 % Glutaraldehyd in einen 0,1 M Natriumkakodyl-Puffer (pH 7,0) hinzufügen. 2 Stunden bei 4 °C inkubieren.
         HINWEIS: Verwenden Sie immer Glutaraldehyd-Lagerlösungen und führen Sie die ersten Fixierungsschritte in einer chemischen Abzugshaube durch. Trage Nitrilhandschuhe und Schutzbrillen zum Augenschutz. Vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit Heizquellen, da erhitztes Glutaraldehyd stark reizende Dämpfe freisetzt.
      3. Waschen Sie die mitochondriale Vorbereitung 3 × 10 Minuten mit 0,05 m Natriumkakodylatpuffer und zentrifugieren Sie kurz, um das Pellet zwischen den Pufferwechseln zu halten.
      4. Nachfixieren Sie die Probe durch Zugabe von 1 % wässrigem Osmiumtetroxid (OsO₄). Inkubiere 15 Minuten bei Zimmertemperatur.
         HINWEIS: Osmiumtetroxid darf nur in einer zertifizierten, voll funktionsfähigen chemischen Abzughaube geöffnet und behandelt werden. Tragen Sie einen Laborkittel, eine Schutzbrille oder einen Vollgesichtsschutz sowie dicke oder doppelte Nitrilhandschuhe (wechseln Sie sofort die Handschuhe, wenn ein Spritzer auftritt, da OsO₄ mit der Zeit dünnes Nitril durchdringen kann).
      5. Waschen Sie die Probe 3 × 5 Minuten mit doppelt destilliertem Wasser. Färben Sie das Pellet 15 Minuten lang mit 1 % wässrigem Uranylacetat.
         HINWEIS: Arbeit auf Einwegpapier mit Kunststoffrückseite. Widme einen bestimmten Bereich des Labors der radioaktiven Färbung. Trage doppelte Handschuhe, einen Laborkittel und eine Schutzbrille. Waschen Sie sich nach dem Eingriff gründlich die Hände.
      6. Dehydrieren Sie die Vorbereitung mit einer graduierten Ethanolserie. Inkubieren Sie das Pellet in 30 %, 50 %, 70 %, 95 % und 100 % Ethanol für jeweils 5 Minuten bei jeder Konzentration.
      7. Einbetten Sie die mitochondrialen Fraktionen. 30 Minuten in einer 1:1 Epon/Ethanol-Lösung inkubieren, gefolgt von reinem Epon-Harz für 1 Stunde.
      8. Die Proben werden in Einbettformen überführt und 48 Stunden in einem 60 °C-Ofen polymerisiert.
      9. Befestige die Harzblöcke am Ultramikrotom und schneide ultradünne Schnitte (80 nm).
      10. Sammle Abschnitte auf Raster. Färbe die Gitter 4 Minuten lang mit 1% wässrigem Uranylacetat. Spülen Sie mit doppelt destilliertem Wasser.
      11. Färbe mit Bleicitrat für 5 Minuten nach Reynolds' Methode²¹. Gründlich abspülen. Visualisieren Sie die Raster mit dem TEM. Siehe Supplemental File 1 für Details zur Reynolds-Methode und zur TEM-Bildaufnahme.

4. Molekulare Quantifizierung

1. Mitochondriale DNA-(mtDNA) Standardkurve
   1. Säe HepG2-Zellen in fünf 100-mm-Kulturschalen aus. Inkubieren Sie die Kulturen, bis sie 80 % des Zusammenflusses erreichen.
   2. Isolieren Sie die Mitochondrien aus den entnommenen Zellen, indem Sie dem in Abschnitt 2 beschriebenen technischen Verfahren folgen.
   3. Entfernen Sie die gesamte DNA aus dem resultierenden mitochondrialen Pellet mit der Säure-Guanidinium-Phenol-Chloroform-Methode, wie in Abschnitt 4.2.6 beschrieben. Messung der DNA-Konzentration und Bewertung der Reinheit (A₂₆₀/A₂₈₀ und (A₂₆₀/A₂₃₀ ) mit einem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer.
   4. Bereite eine serielle Verdünnungsserie mit nukleasefreiem Wasser als Verdünner vor. Verdünnen Sie den DNA-Bestand, um die endgültigen Mengen von 1, ^{10-1, 10-2}, ^10-3, ^10-4 und ^10-5 ng pro Reaktionsvolumen zu erreichen. Wirbel jede Verdünnung für 5 Sekunden, um vollständige Homogenität sicherzustellen, bevor sie zum nächsten Schritt der Reihe übergehen.
      HINWEIS: Passen Sie den Konzentrationsbereich der Standardkurve anhand der spezifischen Probenkonzentration und des endgültigen PCR-Reaktionsvolumens an.
2. Detektion menschlicher mtDNA in Empfängerzellen
   1. Säe primäre Präadipozyten, die von P0,5-Neugeborenenmäusen abgeleitet sind, in 60-mm-Kulturschalen, entsprechend den in Abschnitt 1 angegebenen Dichte- und Medienbedingungen.
   2. Isolieren Sie Mitochondrien aus Spenderzellen von HepG2 und führen Sie den mitochondrialen Transfertest (MTA) wie in Abschnitt 2 beschrieben durch.
   3. Inkubieren Sie die Kulturen 24 Stunden bei 37 °C und 5 %_CO2.
   4. Induzieren Sie die braune adipogene Differenzierung für 24–120 Stunden (an den Tagen 1, 3 und 5) durch Befolgung des in Abschnitt 1 beschriebenen Medienaustauschprotokolls.
   5. Aspirieren Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml eiskaltem PBS.
   6. Gesamte DNA wird mit der Säure-Guanidinium-Phenol-Chloroform-Methode extrahiert²².
      HINWEIS: Führen Sie immer Aliquot und führen Sie eine Phasentrennung im Zughaub durch, um das Einatmen giftiger Phenoldämpfe zu vermeiden. Verwenden Sie doppelte Nitrilhandschuhe oder robuste, chemikalienresistente Handschuhe.
   7. Führen Sie eine Phasentrennung durch und entsorgen Sie die gesamte wässrige Phase, die sich über der Interphase befindet.
      KRITISCHER SCHRITT: Entfernen Sie die wässrige Phase vollständig, um eine Kontamination zu verhindern und eine hohe DNA-Reinheit für nachgelagerte qPCR sicherzustellen.
   8. Fügen Sie 0,3 ml 100 % Ethanol pro 1 ml des ursprünglichen Extraktionsreagens hinzu. Decken Sie die Tube ab und mischen Sie kräftig durch Inversion.
   9. Lassen Sie es 3 Minuten bei Zimmertemperatur stehen und zentrifugieren Sie bei 2.000 × g 5 Minuten bei 4 °C, um die DNA zu pelletieren.
   10. Übertragen Sie den Phenol-Ethanol-Supernatant in ein separates Rohr zur möglichen Proteinisolierung. Das DNA-Pellet wird in 1 mL 0,1 M Natriumcitrat (in 10 % Ethanol, pH 8,5) pro 1 ml verwendetes Extraktionsreagenz erneut suspendiert.
   11. Lass es 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehen, wende es ein paar Mal sanft um und zentrifugiere es bei 2.000 × g 5 Minuten bei 4 °C. Entsorge das Supernatant.
   12. Wiederhole die Natriumcitrat-Waschschritte zweimal weiter.
   13. Waschen Sie das resultierende Pellet mit 2 ml 75 % Ethanol pro 1 ml des initialen Extraktionsreagens.
   14. Lass ihn 20 Minuten bei Zimmertemperatur stehen und zentrifugiere bei 2.000 × g 5 Minuten bei 4 °C.
   15. Entsorge das Überdachungsmittel und lasse das Pellet 10 Minuten an der Luft trocknen. Löslich die DNA durch Zugabe von 0,3–0,6 mL 8 mM NaOH und wiederholtes Pipettern auf und ab, bis das Pellet verschwindet.
   16. Zentrifugieren Sie bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um unlösliche Ablagerungen zu entfernen. Übertragen Sie den Überstandsstoff in ein steriles Rohr und stellen Sie den pH-Wert mit HEPES-Verfahren auf 7–8 ein.
   17. Messung der DNA-Konzentration und Reinheit ((A(260)/A(280) und (A(260)/A(230))-Verhältnisse) mit einem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer.
   18. Verdünnen Sie die Schablone auf eine endgültige Menge von 15 ng Gesamt-DNA in nukleasefreiem Wasser. Führen Sie quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) für menschliche mtDNA unter Verwendung optischer 96-Well-Platten wie in Abschnitt 4.3 festgelegt durch.
   19. Analysieren Sie die Amplifikationsergebnisse durch Anwendung eines logarithmischen Regressionsmodells.
       HINWEIS: Führen Sie die logarithmische Regressionsanalyse unter Verwendung der DNA-Konzentration und entsprechender Schwellenzykluswerte (Ct) als Variablen durch.
3. RT-qPCR für die Genexpression
   1. Zellvorbereitung und Differenzierung
      1. Primäre Preadipozyten stammen aus P0,5-Neugeborenenmäusen in 60-mm-Kulturschalen, wie in Abschnitt 1.1 beschrieben.
      2. Isolieren Sie Mitochondrien und führen Sie den mitochondrialen Transfertest (MTA) gemäß den Verfahren in Abschnitt 2 durch. Inkubieren Sie die Kulturen 24 Stunden.
      3. Verursachen Sie die braune Adipogenese für 24–120 Stunden (Probenahme an den Tagen 1, 3 und 5 der Differenzierung) gemäß dem Protokoll in Abschnitt 1.
   2. Totale RNA-Isolierung
      1. Entfernen Sie das Kulturmedium und geben Sie 1 ml Säure-Guanidinium-Phenol-Chloroform-Extraktionsreagenz pro 1 × 10 bis⁶ Zellen direkt in die Schale ein. Homogenisieren Sie die Proben durch wiederholtes Pipetten, bis das Lysat einheitlich ist.
         HINWEIS: Führen Sie immer Aliquot und führen Sie eine Phasentrennung im Zughaub durch, um das Einatmen giftiger Phenoldämpfe zu vermeiden. Verwenden Sie doppelte Nitrilhandschuhe oder robuste, chemikalienresistente Handschuhe.
      2. Fügen Sie 0,2 ml Chloroform pro 1 ml verwendetes Extraktionsreagenz hinzu. Schließen Sie die Schläuche fest ab und schütteln Sie kräftig von Hand 15 Sekunden lang. Lass es 3 Minuten bei Raumtemperatur stehen und zentrifugiere bei 12.000 × g 15 Minuten bei 4 °C.
      3. Übertragen Sie die obere wässrige Phase vorsichtig in ein neues, nukleasefreies Rohr. Vermeiden Sie Kontakt mit der Interphase. Lass die Proben auf Eis.
      4. Fügen Sie 0,5 ml Isopropanol pro 1 ml verwendetes Extraktionsreagenz hinzu. Sanft durch Inversion mischen und 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
      5. Zentrifugiere bei 12.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C, um die RNA zu pelletieren. Verwerfen Sie das Supernatant durch Inversion.
      6. Waschen Sie das RNA-Pellet mit 1 ml 75% Ethanol. Kurz vortexen und bei 7.500 × g für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugieren.
      7. Entsorgen Sie das Überdachungsmittel und lassen Sie das RNA-Pellet 10 Minuten bei Zimmertemperatur an der Luft trocknen. Setzen Sie das Pellet in 30 μL nukleasefreiem Wasser wieder auf. Inkubieren Sie die Proben bei 60 °C für 15 Minuten, um eine vollständige Löslichkeit sicherzustellen.
      8. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration und -Reinheit (A₂₆₀/A_{280-Verhältnisse} ) mit einem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektrophotometer.
      9. Überprüfen Sie die RNA-Integrität mittels Agarosegel-Elektrophorese.
   3. DNase-Behandlung
      1. Fügen Sie 0,1 Volumen 10× DNase-Puffer und 1 μL DNase-Enzym zu jeder RNA-Probe hinzu. Rühren Sie vorsichtig durch Pipetten. Die Reaktionen bei 37 °C 30 Minuten inkubieren.
      2. Suspendieren Sie das DNase-Inaktivierungsreagenz durch Flicken oder Vortexen, bis der Slurry homogen ist. Fügen Sie das Inaktivierungsreagenz hinzu (0,1 Volumen RNA-Probe oder 2 μL, je nachdem, was größer ist) und mischen Sie gründlich. Inkubiere 5 Minuten bei Zimmertemperatur. Schnippen Sie die Röhren während dieser Zeit dreimal, um das Reagenz in Suspension zu halten.
      3. Zentrifugiere bei 10.000 × g für 1,5 Minuten. Übertragen Sie den RNA-haltigen Supernatant in ein neues Röhrchen.
         KRITISCHER SCHRITT: Stellen Sie sicher, dass kein DNase-Inaktivierungsreagenz übernommen wird, da es die anschließende cDNA-Synthese hemmt.
   4. Umgekehrte Transkription (RT)
      1. Quantifizieren Sie die behandelte RNA und verdünnen Sie in nukleasefreiem Wasser, um bis zu 2 μg Gesamt-RNA pro 20-μL-Reaktion zu verwenden.
      2. Bereite die RT-Mastermischung auf Eis nach den Anweisungen des Herstellers vor. Gib die Mischung in Reaktionsröhrchen und gib die RNA-Proben dazu.
      3. Laden Sie in einen thermischen Zyklus ein und führen Sie das Reverse-Transkriptionsprogramm wie vom Hersteller des Kit angegeben aus.
   5. Quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR)
      1. Verwenden Sie die in Abschnitt 4.3.4 generierte cDNA als PCR-Vorlage. Verdünnen Sie die cDNA in nukleasefreiem Wasser auf eine Arbeitskonzentration von 20 ng pro 10 μL-Reaktion. Lassen Sie alle Reagenzien auf Eis.
      2. Bereiten Sie eine Mastermischung mit SYBR Green, Primern und nukleasefreiem Wasser vor. Beziehen Sie überschüssiges Volumen für den Pipettverlust ein. Geben Sie 10 μL des Reaktionsgemisch in jede Mulde einer optischen qPCR-Platte ein.
      3. Versiegeln Sie die Platte mit optischer Klebefolie und zentrifugieren Sie kurz, um die Flüssigkeit am Boden aufzufangen. Laden Sie die Platte in ein Echtzeit-PCR-Instrument und führen Sie die Verstärkung im Schnellzyklusmodus durch.
      4. Bestimmen Sie die Schwellenzykluswerte (Ct) und führen Sie eine relative Quantifizierung mit der ΔΔCt-Methode durch. Fügen Sie am Ende des Durchlaufs eine Analyse der Schmelzkurve hinzu, um die Verstärkungsspezifität zu überprüfen.
         HINWEIS: Normalisieren Sie die Ziel-mRNA-Häufigkeit auf 36B4-mRNA-Niveaus als endogenes Housekeeping-Gen. Führe die qPCR-Platten innerhalb von 2 Stunden nach der Einrichtung durch; ansonsten werden die versiegelten Teller bei 4 °C aufbewahrt.
4. Westlicher Blot
   1. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration aus ganzzelligen und mitochondrialen Extrakten (siehe Abschnitte 2.1.8 und 2.1.12) mittels eines BCA-Tests.
   2. Bereiten Sie pro Probe 30 μg Protein vor und fügen Sie das entsprechende Volumen des SDS-PAGE-Probenladepuffers hinzu (z. B. Laemmli-Puffer).
   3. Denaturieren Sie die Proben, indem Sie sie 5 Minuten bei 95 °C erhitzen (oder die spezifischen Temperaturanforderungen für Membranproteine entsprechen).
   4. Laden Sie die Proben in die Brunnen eines Polyacrylamidgels. Proteine werden durch Natriumdodecylsulfat–Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bei konstanter Spannung (z. B. 80–120 V) getrennt, bis die Farbstofffront den Boden des Gels erreicht.
   5. Aktivieren Sie eine PVDF-Membran, indem Sie sie 1 Minute lang in 100 % Methanol eintauchen, gefolgt von einer Gleichgewichtsanpassung im Transferpuffer.
   6. Setzen Sie das Transfersandwich zusammen und sorgen Sie dafür, dass zwischen Gel und Membran keine Luftblasen entstehen.
   7. Übertragen Sie die Proteine auf die PVDF-Membran durch Elektroblotting bei 400 mA für 2 Stunden. Halten Sie das System während des gesamten Vorgangs bei 4 °C.
   8. Blockieren Sie unspezifische Bindungsstellen, indem Sie die Membran in 5 % fettfreie Milch inkubieren, die in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (TBS-T) für 1 Stunde bei Raumtemperatur hergestellt wird.
   9. Inkubieren Sie die Membran über Nacht mit primären Antikörpern (verdünnt 1:1.000 in Blocklösung) bei 4 °C unter sanfter Bewegung.
   10. Wasche die Membran 3 × 15 Minuten mit TBS-T.
   11. Inkubieren Sie 2 Stunden lang mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten sekundären Antikörpern bei Raumtemperatur.
   12. Wasche die Membran dreimal mit TBS-T, gefolgt von einer abschließenden 5-minütigen Wasche mit 1× Essel.
   13. Visualisieren Sie die Proteinbänder mit einem verstärkten Chemilumineszenz-(ECL)-Substrat. Erfassen Sie das Signal mit einem digitalen Bildgebungssystem.
       HINWEIS: Passen Sie den Polyacrylamid-Gelprozentsatz (z. B. 8 %, 10 % oder 12 %) basierend auf dem Molekulargewicht der Zielproteine an. Wenn das Elektrotransfergerät kein aktives Kühlsystem hat, ersetzen Sie die Eisbehälter stündlich und lassen Sie die Kammer in einem Eisbad untertauchen. Lagere Membranen in 1 × TBS bei 4 °C, falls die Visualisierung verzögert ist.

Ergebnisse

Mitochondriale Extraktion sowie strukturelle sowie respiratorische Integrität

Um den Einfluss einer erhöhten mitochondrialen Masse auf die braune Adipogenese zu bewerten, wurde ein mitochondrialer Transfertest (MTA) in undifferenzierten Präadipozyten durchgeführt (Abbildung 1A). Mitochondrien wurden aus primären murinen Präadipozyten (mMito) und aus der humanen hepatischen HepG2-Zelllinie (hMito) isoliert. Die Wes...

Diskussion

Biologische Implikationen des mitochondrialen Transfers bei der Adipogenese

Unsere Ergebnisse zeigen, dass zwar exogene Mitochondrien sowohl aus menschlichen als auch aus Mausquellen in das endogene mitochondriale Netzwerk differenzierender Präadipozyten integriert werden können, eine künstliche Zunahme der mitochondrialen Masse jedoch nicht ausreicht, um das braune adipogene Programm anzutreiben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100 mm Platte	SPL Life Science	10101SPL
10x Tris/Glycin Puffer	BioRad	1610734
12 mm Glasdeckgläser	Marienfeld	111520
12-Well-Platte	SPL Life Science	30012SPL
16% wässrige Paraformaldehyd-Lösung	Invitrogen	28908
18 mm Glasdeckgläser	HART	-
24-Well-Platte	SPL Life Science	30024SPL
3,3',5-Triiod-L-thyronin-Natriumsalz (T3)	Sigma	T6397
3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)	Calbiochem	410957
30% Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5:1	BioRad	1610158
35 mm Platte	SPL Life Science	20035SPL
6-Well-Platte	SPL Life Science	30006SPL
60 mm Kulturschale	SPL Life Science	20060SPL	Verwendet für primäre Präadipozyten und DNA/qPCR-Experimente; Lieferant/Katalog nicht angegeben
AccuRuler RGB Plus vorgefärbte Proteinleiter	Maestrogen	02102-250
ACK Lysepuffer	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 IE/ml (Insulin)	Novo Nordisk	A10AB01
ADP	Merck	117105
Agarose	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	Verwendet für RNA-Integritätsverifizierung; Lieferant/Katalog nicht angegeben
Ammoniumpersulfat	BioRad	1610700
Anti-Kaninchen IgG, HRP-gekoppeltes Antikörper	Cell Signaling	7074
Anti-Ratte IgG, HRP-gekoppeltes Antikörper	Cell Signaling	7077
Antibiotika-Antimykotikum	Gibco	15240062
Axio Observer invertierter Mikroskopständer	Carl Zeiss	431007-9901-000	Hinzugefügt aus den ergänzenden Methoden
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	D49328
BD Cytometer Setup and Tracking beads	BD Biosciences	-	Hinzugefügt aus den ergänzenden Methoden; Katalog nicht angegeben
BD FACSDiva Software v8.0.3	BD Biosciences	-	Hinzugefügt aus den ergänzenden Methoden
BD LSRFortessa X-20 Zellanalysator	BD Biosciences	-	Bestehender Eintrag standardisiert, um mit der ergänzenden Datei übereinzustimmen
BioRender	BioRender	-	Verwendet, um den Arbeitsablauf von Abbildung 1 zu erstellen
Blotting-Grade Blocker	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
Bovines Serumalbumin (BSA)	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
cDNA Reverse Transkriptase Kit	Invitrogen	4374966
Zellsieb 100 µm, Nylon	Falcon	352360
Zellsieb 40 µm, Nylon	Falcon	352340
Kollagenase Typ II	Gibco	17101-015
Dexamethason	Sigma	D4902
DMEM Pulver, hohe Glukose, Pyruvat	Thermo Scientific	12800017
DMEM/F-12, kein Phenolrot	Thermo Scientific	21041025
DMEM/F-12, Pulver	Gibco	12500062
DMSO	Sigma	D8418	Lösungsmittel für Induktionsmedium; Lieferant/Katalog nicht angegeben
EMBed-812 EINBETTUNGSKIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Ethanol absolut	Merck	100983
Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure-Tetranatriumsalz (EGTA)	Merck	324626
FAST SYBR MASTER MIX	Thermo Scientific	4385612
FCCP	Sigma	C2920
Fötales Kalbsserum	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	Flow-Zytometrie-Analysesoftware
Fluoromount-G	Thermo Scientific	7984-25
GAPDH Antikörper	Santa Cruz	sc-32233
Glukose	Gibco	15023-021
Glutamat	Sigma	G1626
Glutaraldehyd 25% wässrige Lösung	Electron Microscopy Sciences	16210
Ziegen-Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper, HRP	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	Statistische/logarithmische Regressionsanalyse-Software
Halt Protease und Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78442
HEPES	Biological Industries	41-122-100
Histone H3 (1G1)	Santa Cruz	sc-517576
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
ImageJ v1.54s	NIH	-	Software zur Lipidtropfen-Bildanalyse
Immun-Blot PVDF Membran	BioRad	1620177
Indomethacin	Sigma	I7378
Insulinspritze	Cranberry	AAJECIN3	Verwendet für Zellhomogenisation; Lieferant/Katalog nicht angegeben
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO3	Sigma	60339
LAMP-1 Antikörper	Abcam	ab25245
Lane Marker Reduktions-Stichprobenpuff