Multizentrische Durchflusszytometrie für akute myeloide Leukämie messbare Resterkrankung mit LAIP/DfN und CD34+CD38 – leukämische Stammzellanreicherte Populationen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen multizentrischen Flowzytometrie-Workflow für die messbare Quantifizierung der akuten myeloiden Leukämie mit Restkrankheit mittels leukämieassoziierter Immunophenotyp/Anders-van-Normal-(LAIP/DfN)-Analyse und phenotypisch definierter CD34⁺CD38⁻ leukämischer Stammzellanreicherungspopulationen.

Zusammenfassung

Die Nachbeobachtung der messbaren Resterkrankung (MRD) wird für die Behandlungs-Response-Bewertung in klinischen Studien zur akuten myeloiden Leukämie (AML) gemäß den ELN 2025-Richtlinien empfohlen. Ziel dieser Studie war es, eine standardisierte Nachbeobachtung der Patienten mit einem harmonisierten MRD-Flussansatz in 30 französischen Hämatologielaboren durchzuführen, die an AML-Klinischen Studien teilnahmen. Um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen, erstellte das Netzwerk Empfehlungen von Nasslaborverfahren bis hin zu klinischen Berichten. Wir entwarfen ein 3-Röhren-Panel mit obligatorischen 8-farbigen gemeinsamen Markern pro Röhre, gemäß den ELN-Empfehlungen, um leukämieassoziierte Immunophenotyp-/Abweichungsmuster (LAIP/DfN) in Bulkzellen und leukämischen Stammzellpopulationen (LSC)-angereicherten Populationen in der CD34⁺CD38⁻ -Fraktion zu identifizieren. Ein Rückgrat aus CD34/CD38/CD45/CD117 wurde verwendet, ergänzt durch Linienmarker für das erste Rohr, LSC-assoziierte Marker für das zweite sowie monozytische und Differenzierungsmarker für das dritte Rohr. Dieses Panel kann in 8-, 10- und 12-Farben-Formaten verwendet und auf mehreren herkömmlichen Durchflusszytometer-Plattformen implementiert werden. Wir schlagen Durchflusszytometer-Einstellungen vor, die an jede Plattform angepasst werden.

Die Harmonisierung der Empfindlichkeit zwischen den vier Plattformen erfolgte mit 8-Spitzen-Regenbogenperlen. Die Immunfärbung erfolgte nach der Massenlyse. Um Verzerrungen zwischen den Plattformen zu erkennen, wurde der Färbungsindex mit frischen, gesunden Knochenmarkproben parallel auf den vier Plattformen getestet. Regelmäßige Knochenmarkqualitätskontrollproben wurden zwischen Laboren zur Nass-Außenqualitätsbewertung (EQA) geteilt, um alle Schritte des Protokolls zu verifizieren. Schließlich wurde die Standardisierung der in den Zentren gewonnenen Datenanalysestrategie mittels trockener EQA durch das Teilen von MRD-FCS-Datendateien evaluiert. Die Machbarkeit dieses multizentrischen Ansatzes erfordert die Harmonisierung der Instrumentenempfindlichkeit und Probenvorbereitung sowie die Ausbildung und systematische Ausbildung analytischer Bediener.

Einleitung

Messbare Resterkrankung (MRD) bezeichnet die geringe Anzahl leukämischer Zellen, die während oder nach der Behandlung erhalten bleiben und morphologisch nicht nachweisbar sind, insbesondere bei vollständiger Remission mit weniger als 5 % Blasten im Knochenmark. Die MRD-Überwachung wird für die Behandlungs-Response-Bewertung in klinischen Studien zur akuten myeloiden Leukämie (AML) gemäß ELN 2025 Guidelines¹ empfohlen. Neben molekularbiologischen Methoden, einschließlich Reverse-Transkriptase-PCR (RT-qPCR) und Next-Generation-Sequencing (NGS), ist multiparametrische Flusszytometrie (MFC) ein häufig verwendeter Ansatz².

Um konsistente MRD-Ergebnisse zu erzielen, insbesondere in klinischen Studien, sind zwei Strategien möglich: die Zentralisierung der MRD-Messung in einem einzigen Labor oder die Implementierung eines Protokolls, das die Reproduzierbarkeit zwischen den verschiedenen an der MRD-Bestimmung beteiligten Laboren sicherstellt. Die Anzahl der Proben, die Größe der Studie und die Kapazität der Labore, größere oder kleinere Probenmengen zu verarbeiten, können die Wahl zwischen diesen Strategien bestimmen. Wenn eine Multicenter-Strategie gewählt wird, müssen Unterschiede zwischen Zytometerplattformen und der Bedarf an vergleichbarer Analyse über Standorte hinweg berücksichtigt werden.

Zu diesem Zweck beschreiben wir einen standardisierten Multicenter- und Multiplatform-MRD-Flussansatz, der leukämieassoziierte Immunophenotyp-/Anders-von-Normal-(LAIP/DfN)-Analyse und phenotypisch definierte CD34⁺CD38⁻ leukämische Stammzellen-(LSC)-angereicherte Detektion kombiniert, implementiert in 30 französischen Hämatologielaboren basierend auf ELN-Empfehlungen und früheren Berichten ^3,4.

Die Flowzytometrie ermöglicht die Definition der Leukämie-"Signatur" bei der Diagnose, die die spezifische Expression von Markern auf den Blastblasten des Patienten einbezieht: LAIP. Nach der Behandlung ermöglicht der MRD-Fluss die Überwachung der bei der Diagnose identifizierten LAIPs. Da leukämische Blasten sich entwickeln und ihren Immunophenotyp unter therapeutischem Druck verändern können, muss eine zweite Strategie systematisch umgesetzt werden: der DfN-Ansatz, der darauf basiert, Zellen mit Eigenschaften zu identifizieren, die sie von der normalen Hämatopoiese unterscheiden. Diese Technik kann auch das Auftreten neuer Marker auf Blasten während des Krankheitsverlaufs und ihrer Behandlung nachweisen.

In der französischen AML-Flussgruppe basierte das Paneldesign auf der zuvor veröffentlichten HOVON-Studie zur Definition leukämischer Zellmuster. Es gibt keinen universellen LSC- oder LAIP-Marker, daher haben wir ein 3-Röhren-Panel entworfen, das die gleichzeitige Identifikation von LAIP-, DfN- und CD34⁺CD38⁻ -LSC-angereicherten Populationen ermöglicht. Ein Rückgrat auf Basis von CD34/CD38/CD45/CD117 wurde in allen Röhren verwendet, ergänzt durch Linienmarker im ersten Röhrchen, LSC-assoziierte Marker im zweiten Röhrchen und monozytische Linien- oder Differenzierungsmarker im dritten Rohr, um die LAIP-Definition in AML mit monozytischen Blasten zu vervollständigen. Alle drei Röhrchen werden bei der Diagnose und in Nachbeobachtungsproben aufgenommen.

Angesichts der Pathophysiologie der Leukemogenese hat sich die Aufmerksamkeit von der Untersuchung des Blast-Masses hin zur Identifizierung des unreifsten Anteils als leukämische Stammzellenpopulationen verlagert. Dick und Kollegen zeigten die Heterogenität der Leukämie, indem sie CD34⁺CD38⁻ LSCs beschrieben, die das Potenzial haben, Leukämie bei immundefizienten Mäusen zu verursachen ^5,6. Bei der LSC-Quantifizierung bei Diagnose und Nachbeobachtung werden Anstrengungen unternommen, Antikörperpanels und Analysestrategien innerhalb der ELN DAVID Arbeitsgruppe ^1,7 zu standardisieren. Derzeit verwenden zwei Panels, HOVON und ALFA, dichotomische LSC-Marker, um LSC-angereicherte Populationen von normalen hämatopoietischen Stammzellen im CD34⁺CD38⁻-Raum ^8,9 zu unterscheiden.

Die hier beschriebene Methode kombiniert standardisierte Probenvorbereitung, gemeinsames Antikörperpanel-Design, plattformangepasste Sensitivitätseinstellungen, LAIP/DfN und CD34⁺CD38⁻ LSC-angereicherte Analysen, externe Qualitätsbewertung und harmonisierte klinische Berichterstattung für multizentrische AML-MRD-Flussüberwachung.

Protokoll

Das Protokoll folgt den Empfehlungen und Richtlinien der Ethikkomitees der französischen Universitätskrankenhauszentren. Alle Patienten unterzeichneten gemäß französischer Gesetzgebung eine informierte Einwilligung. Das Studienprotokoll wurde vom Ethikausschuss der CHU Lyon und dem Ethikausschuss des Institutionellen Überprüfungsausschusses der CHU Lille gemäß der Erklärung von Helsinki (HDF-AML-Observatorium, CNIL 2214454v0) genehmigt. Für Allograft wurden Spender in die europäische internetbasierte ProMISE-Datenbank aufgenommen und gaben eine informierte Zustimmung zur Sammlung ihrer persönlichen Daten. Die Extraktion und Analyse der Daten erfolgte gemäß dem örtlichen Ethikausschuss (CNIL2093819). Alle FCS-Flow-Dateien, die für die Netzwerkprüfung verwendet wurden, wurden vollständig mit einem Python-Skript anonymisiert.

1. Zytometereinstellung

1. Bestimmen Sie Zielwerte, die an jedes Zytometer angepasst werden, mithilfe von 8-Peak-Regenbogenperlen.
2. Stellen Sie jede Maschine nach den in Tabelle 1 angegebenen Zielwerten ein. Stellen Sie sicher, dass jeder Kanal den Zielwert ± 5 % erreicht. Überprüfen Sie diese Einstellung systematisch, um die Längssensitivität jeder Plattform aufrechtzuerhalten.
3. Stellen Sie die Kompensationsmatrix mit einzeln gefärbten Röhrchen für jeden Antikörper her, wobei Kompensationsperlen und/oder Zellen je nach Plattform verwendet werden.
4. Speichere die Einstellung und Kompensationsmatrix als Assay oder Protokoll, das als MRD LAIP/DfN, LSC und MonoGran (T1, T2, T3) identifiziert ist. Verwenden Sie diesen Test oder dieses Protokoll zur Erfassung zur Quantifizierung des AML-MRD-Durchflusses.

2. Nasslaborverfahren

1. Knochenmarkaspiration
   1. Entnehmen Sie 1–2 ml EDTA-Knochenmark bei der Diagnose und zu den Überwachungszeitpunkten, einschließlich MRD1, MRD2, MRD3, MRD4 und Rückfall.
   2. Senden Sie die Röhren innerhalb von 24 bis 48 Stunden an das Referenzflusslabor.
2. Knochenmarkabstrich zur morphologischen Untersuchung
   1. Geben Sie einen Tropfen Knochenmarkaspiration auf einen Glasobjekt. Verteile die Probe vorsichtig mit einem Deckdeckel oder einem anderen Objektträger.
   2. Nach 30 Minuten Trocknen wird der Fleck mit May-Grünwald-Giemsa gefärbt (Ergänzungsakte 1).
3. Massenlyse
   1. Gib 15 ml NH 4-Cl-Lyslösung zu 1–2 ml Knochenmarkprobe hinzu. Vorsichtig mischen und 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
   2. Zentrifugiere bei 450 × g bei Raumtemperatur für 5 Minuten und entsorge den Überstandsmittel.
   3. Das Zellpellet in 10 mL PBS/0,1 % BSA neu suspendieren. Zentrifugiere bei 450 × g bei Raumtemperatur für 5 Minuten und entsorge das Supernatant.
   4. Setzen Sie das Zellpellet bei einer Konzentration von 30 × 10⁶ WBC/mL in PBS wieder auf.
4. Immunfärbung der Zellsuspension
   1. Verteilung der monoklonalen Antikörper in den Röhrchen T1, T2 und T3 entsprechend der Plattform (Tabelle 2). Geben Sie Klon, Volumen, Katalogreferenz und Lieferanten für jeden Antikörper in einer Antikörpertabelle an.
      HINWEIS: Für jede Tube mit Brilliant Violet Farbstoffen verwenden Sie vor dem Zufügen der Antikörper einen Brilliant Stain-Puffer.
   2. Fügen Sie 2–3 ×10^{6 lysierte} Zellen pro Röhre in 100 μL Zellsuspension hinzu. Inkubiere die Zellen 15 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit Antikörpern.
   3. Waschen Sie die Zellen mit 3 ml PBS. Zentrifugiere für 5 Minuten bei 450 × g und entsorge das Supernatant.
   4. Die gefärbten Zellen in 300 μL PBS wieder suspendieren.
      HINWEIS: Vorgemischte Antikörpercocktails oder validierte trockene Antikörperröhrchen können verwendet werden.

3. Erwerbung des Durchflusszytometers

1. Öffnen Sie den MRD-Assay oder das Aufnahmeprotokoll mit der angepassten Einstellungs- und Kompensationsmatrix für MRD LAIP/DfN und LSC-Messungen.
2. Aufnehmen Sie bei der Diagnose und in MRD-Nachproben mindestens 500.000 bis 1.000.000 weiße Blutkörperchen pro Tube, um die Clusterbildung der MRD-Zellen zu verbessern und das Vertrauen in Low-Level-MRD zu verbessern.
   HINWEIS: Für die LSC-Messung werden mindestens 1.000.000 WBC in Röhre 2 aufgenommen, um eine ausreichende Sensitivität für die LSC-Quantifizierung (LOQ 0,002 % und LOD 0,001 %) zu ^erreichen.
3. Speichere die FCS-Datendateien aus Diagnose- und MRD-Proben. Erfassen Sie das Aufnahmedatum und die Patientenidentifikation, um die Nachuntersuchung von MRD und LSC zu erleichtern.

4. Analysestrategie

1. Verwenden Sie eine gemeinsame Vorlage und eine gemeinsame Punktdiagramm-Sequenz, die eine vordefinierte harmonisierte Gating-Strategie integriert, die an die Analysesoftware jedes Zentrums angepasst ist.
2. Wenden Sie die Gating-Strategie an, um leukämische Zellen mit drei Ansätzen zu identifizieren: LAIP, DfN und LSC-Analyse im CD34⁺CD38-Fraktion.
3. Identifizieren und ausschließen Sie potenzielle nichtspezifische Ereignisse und normale physiologische Populationen, einschließlich Basophilen, plasmazytoide dendritische Zellen, Hämatogene, Plasmazellen, Erythroblasten, Blutplättchenklumpen, Ablagerungen und unlysierte Erythrozyten.

5. Definition von LAIP/DfN und physiologischen Populationen

1. Um LAIP in Massenexplosionen einzufangen, zeichnen Sie ein Einzelzellgatter basierend auf FSC-W versus FSC-H.
2. Zeichnen Sie ein Live-Cell-Gate basierend auf FSC versus SSC.
3. Zeichne ein Blast-Gate auf CD45^dim/SSC.
4. Zeichne das primitive Marker-Gate mit CD34/CD117.
5. Verwenden Sie feste biparametrische Punktdiagramme, um die relevanten LAIP-Gatter zu zeichnen, darunter LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 und LAIP8.
6. Physiologische Populationen
   1. Gate-Hämatogen mit folgender Sequenz: Live-Zellen, MNC auf dem FSC/SSC-Punktdiagramm, CD19/SSC-Punktdiagramm und CD34/CD38-Punktdiagramm. Backgate mit CD45/SSC.
   2. Gate-Basophilen mit folgender Sequenz: lebende Zellen, MNC im FSC/SSC-Punktdiagramm, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA-^), ohne CD19⁺ Hämatogene. Backgate mit CD45/SSC.
   3. Gate-Plasmazytoid dendritische Zellen mit folgender Sequenz: lebende Zellen, MNC im FSC/SSC-Punktdiagramm, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA⁺), ohne CD19⁺ Hämatogene. Backgate mit CD45/SSC.
   4. Identifizieren Sie Erythroblasten, Blutplättchenklumpen, Trümmer und unlysierte Erythrozyten mit dem CD36/CD45-Punktdiagramm. Backgate mit CD45/SSC und FSC/SSC.
7. LAIP-Ansatz
   1. Definieren Sie MRD in CD34⁺ ODER CD117⁺ primitiven AML mit Boolesche Operatoren wie folgt: LAIP1 UND LAIP2 UND LAIP3 UND LAIP4 UND LAIP5 UND LAIP6 UND LAIP7 UND LAIP8 UND NICHT saubere CD36^hell+/CD45 UND einzelne Zellen UND lebende Zellen UND CD34^+/CD117^+/ primitive Marker UND (CD45/SSC Blastgate ODER MNC CD34⁺) (Abbildung 1).
   2. Definieren Sie MRD in CD34-CD117^- AML mit Boolesche Operatoren wie folgt: LAIP1 UND LAIP2 UND LAIP3 UND LAIP4 UND LAIP5 UND LAIP6 UND LAIP7 UND LAIP8 UND NICHT sauber CD36^hell+/CD45 UND einzelne Zellen UND lebende Zellen UND CD34CD117 UND CD45/SSC-Blast-Gate (Abbildung 2).
8. DfN-Ansatz
   1. Verwenden Sie dieselbe Vorlage wie der LAIP-Ansatz und wenden Sie den auf Referenz-Knochenmarkproben definierten leeren Speicher an (Tabelle 3).
   2. Definieren Sie abnormale Populationen, wenn der Cluster abnormaler Zellen um 0,5 Jahrzehnte auf der logaritmischen^{Skala 12} von normalen Zellen getrennt ist.
   3. Um DfN in Massenexplosionen zu erfassen, entnehmen Sie lebende Zellen mit FSC/SSC.
   4. Zeichnen Sie einzelne Zellen, indem Sie Doublets basierend auf FSC-Peak/SSC-Fläche entfernen.
   5. Zeichne das MNC-Gate mit FSC/SSC.
   6. Verwenden Sie ein Reinigungstor, um Lymphozyten mit CD45/CD36/SSC zu entfernen.
   7. Setzen Sie ein Reinigungstor an, um Erythroblasten und Ablagerungen mit CD45/CD36 zu entfernen.
   8. Verwenden Sie zwei Eingangsgates, CD34⁺/CD45/SSC und CD117⁺/CD45/SSC, um die leeren Boxen gemäß früheren^{Veröffentlichungen 12,13} zu definieren.
   9. Zeichnen Sie jedes leere DfN-Feld basierend auf internen Kontrollpopulationen, einschließlich Lymphozyten für Crosslineage-Marker und normale myeloide Vorläufer für Verlust-, Abnahme- oder Überexpressionsmarker.
   10. Vergleichen Sie die leeren Boxen mit Referenzproben aus dem Knochenmark, einschließlich regenerierendes, entzündungsförderndes und gesundes Spenderknochenmark.

6. Definition der LSC CD34⁺CD38^- Population

1. Identifizieren Sie LSC-angereicherte Zellen bei der Diagnose im CD34⁺CD38-Raum basierend auf LSC-Markern mit dichotomer Expression und fehlender Expression in normalen hämatopoietischen Stammzellen aus gesundem Knochenmark.
2. Definieren Sie das LSC-Eingangsgatter als MNC34⁺ mit folgender Gating-Sequenz: Live-Zellen, Einzelzellen, MNC und CD34⁺ im CD45/CD34-Punktdiagramm.
3. Definieren Sie den CD34⁺CD38-Anteil (P6) mit einem strengen Schwellenwert, der auf dem CD38-Fluoreszenz-minus-eins (FMO)-Niveau basiert.
4. Definieren Sie LSC-angereicherte Zellen in Röhre 1 im P6-Anteil mit Boolesche Operatoren wie folgt: P6CD7⁺ ODER P6CD33⁺ ODER P6CD19⁺ ODER P6CD56⁺ UND NICHT saubere CD36^bright+ UND Einzelzellen UND lebende Zellen SOWIE MNC UND MNC CD34⁺.
5. Definieren Sie LSC-angereicherte Zellen in Röhre 2 im P6-Anteil mit Boolesche Operatoren wie folgt: P6CD45RA⁺ ODER P6MIX⁺ ODER P6CD123⁺ UND NICHT saubere CD36^bright+ UND Einzelzellen UND lebende Zellen SOWIE MNC UND MNC CD34⁺.
6. Verwenden Sie CD36, um unspezifische Ereignisse im finalen MRD LSC-Gate zu bereinigen (Abbildung 3).

7. Definition der CD38-Schwelle in der CD34^+-Population

1. Stellen Sie den CD38-Kanal hoch genug, um CD38-Populationen von CD38^+/Populationen mit guter Auflösung zu unterscheiden.
2. Definieren Sie P6 als CD34⁺CD38^-, P7 als CD34⁺CD38^niedrig und P8 als CD34⁺CD38^hoch.
3. Basieren Sie die CD38-Kanaleinstellung auf CD38-hellen Populationen, wobei Plasmazellen als hellste Population und Hämatogene entsprechend dem Messbereich jeder Plattform identifiziert werden.
4. Definieren Sie die CD34⁺CD38-Population (P6) mit dem CD38 FMO-Ansatz, der von einer isoklonischen CD38-Kontrolle validiert wird.
5. Definieren Sie die CD34⁺CD38^niedrige Population (P7) anhand des hämatogenen negativen Niveaus.
6. Definieren Sie die CD34⁺CD38-Highpopulation (P8) anhand des hämatogenen Positivitätsniveaus und des Plasmazell-Negativwerts (Abbildung 4).
7. Verwenden Sie denselben ^{CD38-Schwellenwert} in der harmonisierten Gruppe mit robusten Methoden wie CD38-FMO oder isoklonischer CD38-Kontrolle.
8. Verwenden Sie mindestens einen aberranten Immunophenotyp im CD34⁺CD38-Anteil zur Definition von LSC-angereicherten Zellen. Beziehen Sie LSC-Marker wie CLL1/TIM3/CD97/CD45RA/CD123 oder Linienmarker wie CD7/CD19/CD56/CD33 ein.
9. Anwendung der folgenden Schwellenwerte: Assay-Empfindlichkeit LOQ ^10-4 und LOD ^10-5; Die LSC-Positivität bei der Diagnose ≥ 1 % der CD45/SSC-Blasten; und die LSC-Positivität bei der MRD-Nachbeobachtung ≥ 0,01 % der weißen Blutkörperchen.

8. Harmonisierter klinischer Flussbericht

1. Geben Sie bei jedem Ergebnis folgende Informationen an: Knochenmarkqualität, verwendete Strategie zur MRD-Identifikation, LAIP-Beschreibung, LOD und LOQ, Schwellenwerte und Interpretation der Ergebnisse.
2. Hämodilution und Knochenmarkrepräsentativität
   1. Bewerten Sie die Hämodilution für jeden klinischen MRD-Flussbericht, um die Robustheit des Ergebnisses zu bewerten.
   2. Verwenden Sie eine der zuvor beschriebenen Hämodilutionsmethoden, sofern anwendbar (Tabelle 4)7,14,15,16,17,18,19,20,21.
   3. Als ergänzenden Ansatz wird die Knochenmarkrepräsentativität anhand des beobachteten CD34/WBC45-Verhältnisses im Vergleich zum erwarteten Verhältnis in Referenzknochenmarkproben berechnet (Abbildung 5).
   4. Verwenden Sie folgende Formel:
      P: Reinheit % = 100 × (n/L - s) / (m - s)
      s: Anteil der MNC CD34^+- Zellen im normalen peripheren Blut: 0,0005
      m: Anteil der MNC CD34^+- Zellen im normalen Knochenmark: 0,035
      L: Anzahl der WBC45^+- Leukozyten in der MRD-Patientenprobe
      n: Anzahl der MNC CD34^+- Zellen in der MRD-Patientenprobe
   5. Berichte die Repräsentativität des Knochenmarks als Qualitätsbewertung der Stichprobe. Verwenden Sie diesen Wert nicht, um MRD-Ergebnisse zu normalisieren.
   6. Die Repräsentativität des Knochenmarks wird wie folgt interpretiert: 100 % bis 10 %, geringer Einfluss auf den Anteil der CD34^+- Zellen aus dem Knochenmark; 10 % bis 1 %, Warnung für die Interpretation der MRD-Ergebnisse; und < 1 %, nicht interpretierbares Ergebnis.
3. LSC-Quantifizierung bei der Diagnose
   1. Berichte das Profil, das zur Identifikation von LSC-angereicherten Zellen verwendet wird, zum Beispiel CD34⁺CD38-CD90-CD45RA^+MIX+(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Melde die LSC-Ergebnisse bei der Diagnose als beobachteten Prozentsatz aus CD45/SSC-Blasten.
   3. Verwenden Sie LSC ≥ 1 % der gesamten Blasten als Schwelle für eine schlechte Prognose.
4. Folge-MRD von LAIP/DfN
   1. Berichte das LAIP-Profil, das zur Identifikation von MRD verwendet wird, zum Beispiel CD34⁺CD38^dim+CD13^+/-CD33^++CD117+CD7⁺.
   2. Berichte die Sensitivität der Analyse als den am wenigsten sensiblen Wert zwischen dem technischen Schwellenwert und dem für das LAIP-Profil beobachteten Robustheitswert im Vergleich zu Referenz-Knochenmarkproben.
   3. Verwenden Sie einen Mindestcluster von 50 Zellen unter den erworbenen weißen Blutkörperchen-Ereignissen als Grenze der Quantifizierung. Zum Beispiel liegt bei 500.000 weißen Blutkörperzellen die LOQ bei 0,01 % (1 × ^10-4).
   4. Melden Sie LAIP/DfN-Ergebnisse als positiv, negativ, nachweisbar, aber unter der klinischen Schwelle oder nicht nachweisbar.
   5. Geben Sie die LAIP/DfN-Positivität mit ≥ 0,1 % an, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten CD45^+- Leukozyten.
   6. Berichte die LAIP/DfN-Negativität mit < 0,1 %.
   7. Für nachweisbare, aber untergrenzende Ergebnisse geben Sie den repräsentativen Wert und die Sensitivitätsschwelle an.
   8. Bei nicht nachweisbaren Ergebnissen wird gemeldet, dass das Ergebnis dem Sensitivitätsschwellenwert der Analyse unterlegen ist, und fügen Sie bei Bedarf einen Kommentar hinzu, wie zum Beispiel Hämodilution, niedrige LAIP-Spezifität oder unzureichende technische Schwelle.
5. Folge-MRD durch LSC
   1. Berichte das Profil, das zur Identifikation von LSC-angereicherten Zellen verwendet wird, zum Beispiel CD34⁺CD38-CD90-CD45RA^+MIX+(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Verwenden Sie einen Mindestcluster von 20 Zellen unter den erworbenen weißen Blutkörperchen-Ereignissen als Quantifizierungsgrenze. Zum Beispiel beträgt die LOQ bei 1.000.000 weißen Bluttrichterzellen 0,002 % (2 × ^10-5).
   3. Melden Sie die LSC-Ergebnisse als positiv, negativ, nachweisbar, aber unter der klinischen Schwelle oder nicht nachweisbar.
   4. Berichte die LSC-Positivität mit ≥ 0,01 %, ausgedrückt als Prozentsatz der gesamten CD45^+- Leukozyten.
   5. Melde die LSC-Negativität mit < 0,01 %.
   6. Für nachweisbare, aber untergrenzende Ergebnisse geben Sie den repräsentativen Wert und die Sensitivitätsschwelle an.
   7. Bei nicht nachweisbaren Ergebnissen melden Sie, dass das Ergebnis unter der Sensitivitätsschwelle der Analyse liegt, und fügen Sie bei Bedarf einen Kommentar hinzu, wie zum Beispiel Hämodilution, niedrige LSC-Spezifität oder unzureichende technische Schwelle.
6. Integration der MRD-Flussinterpretation mit vorherigen Überwachungszeitpunkten. Zeigen eine Modulation des phänotypischen Profils während der Behandlung und die Dynamik des MRD-Flusses, einschließlich Repositivität, Zunahme, Stabilität oder Abnahme.
7. Leiten Sie die Ergebnisse anfordernd an den anfordernden Kliniker und den Forscher anhand des klinischen Flussberichts gemäß dem Zeitrahmen des Referenzlabors weiter.
8. Fasse den harmonisierten klinischen Flussbericht anhand folgender Elemente zusammen: Knochenmarkqualität, MRD-Identifikationsstrategie, LAIP-Beschreibung, LOD und LOQ, Schwellenwerte und Interpretation als MRD-positiv, MRD-negativ mit LOD-Wert oder MRD nachweisbar, aber nicht quantifizierbar.

Ergebnisse

Plattformspiegelung

Für den anfänglichen Vergleich zwischen CANTO und NAVIOS wurden die Spannungseinstellungen durch unkompensierte 8-Peak-Rainbow-Beads angepasst, um vordefinierte Ziel-MFI-Werte zu erreichen. Zielwerte von der Referenz-CANTO-Plattform wurden mit folgender Umrechnung auf die zweite NAVIOS-Plattform übertragen: neues MFI-Ziel = Referenz-MFI-Ziel/256²². Um Verzerrungen zwischen den Plattformen zu erkennen, wurden 10 frische EDTA-regenerative Knochenmarkproben parallel getestet. Der Färbungsindex zwischen positiven und negativen Populationen wurde zwischen Proben und Plattformen verglichen und zeigte eine vergleichbare Trennung (Supplemental File – Abbildung S3).

Während der Studie wurden die Plattformen schrittweise von 8- und 10-Farben-Konfigurationen auf LYRIC- und DxFLEX-12- und 13-Farben-Konfigurationen aufgerüstet (Supplemental File 1). Die Verspiegelung wurde über vier Plattformen mit 8-Spitzen-Regenbogenperlen und gesundem Knochenmark gefärbt, das mit demselben Paneel aufgenommen wurde, verlängert. Die Spitzenüberlappung wurde überprüft, indem nur die logarithmischen Repräsentationsskalen angepasst wurden. Nach Anwendung der definierten Einstellungen überlappten sich die Zellfärbungsmuster, wobei der Hauptunterschied in der Translation der Zellwolken entlang der logarithmischen Skalen lag (Abbildung 6 und ergänzende Datei – Abbildung S4 und Abbildung S5).

Qualitätsbewertung und Reproduzierbarkeit über Flusslabore hinweg

Nach der Umsetzung des ursprünglichen Standardverfahrens und deren Aktualisierungen während der Plattform-Upgrades wurde regelmäßig eine nasse externe Qualitätsbewertung (EQA) unter Verwendung frischer Referenzproben aus dem Knochenmark durchgeführt, die zwischen den teilnehmenden Zentren geteilt wurden. Nass-EQA wurde verwendet, um das Nasslaborverfahren, die Plattformeinstellungen und die gemeinsame Gating-Analysestrategie zu überprüfen. Die berichteten Populationen umfassten MNC CD34^+- Zellen im WBC-CD45^+- Nenner und P6 CD34⁺CD38⁻ -Zellen im WBC CD45⁺ -Nenner. Die Ergebnisse wurden mittels Z-Score und/oder grafischer Darstellung analysiert (Abbildung 7).

Seit 2017 wurden fünf Nass-EQA-Runden durchgeführt, wobei jeweils 22, 15, 17, 26 und 25 Labore teilnahmen. Für %CD34⁺CD38⁻ Zellen in WBC CD45⁺ und %MNC CD34⁺ Zellen in WBC CD45⁺ waren die Ergebnisse wie folgt: EQA1, Mittelwerte 0,015 % und 1,01 % (SD 0,09 % und 0,24 %); EQA2, 0,09 % und 1,02 % (SD 0,046 % und 0,36 %); EQA3, 0,097 % und 1,46 % (SD 0,024 % und 0,32 %); EQA4, 0,024 % und 2,16 % (SD 0,015 % und 0,59 %); und EQA5, 0,027 % und 1,9 % (SD 0,008 % und 0,45 %).

Um die Standardisierung der MRD-Analysestrategie über mehrere Zentren hinweg zu erreichen, wurde die Nass-EQA durch trockene EQA ergänzt, wobei gemeinsame FCS-Dateien für Diagnose, MRD-Nachbeobachtung und Referenz-Knochenmark verwendet wurden. Mehr als 90 % der lokal analysierten Daten wurden in das zentralisierte Intervall basierend auf dem Serienmittelwert ± 2 SD einbezogen: 95,6 % und 91,3 % für DryEQA2017, mit 22 von 23 teilnehmenden Laboren und 100 % für DryEQA2024, mit 24 von 25 teilnehmenden Laboren (Abbildung 8). Zwei Runden trockener EQA wurden für %MRD LAIP in WBC CD45⁺ und %MRD LSC CD34⁺CD38⁻ in WBC CD45⁺ durchgeführt. DryEQA2017 zeigte einen durchschnittlichen LAIP-Wert von 11,9 % (SD 1,35 %) und einen mittleren LSC-Wert von 0,16 % (SD 0,05 %). DryEQA2024 zeigte einen durchschnittlichen MRD LAIP-Wert von 0,35 % (SD 0,26 %) und einen mittleren MRD LSC CD34⁺CD38⁻ -Wert von 0,18 % (SD 0,06 %).

Beispiel für multimodale AML-MRD-Durchflussmessung unter Verwendung von LAIP/DfN- und LSC-Strategien

Zur Quantifizierung von MRD wurden systematisch drei Ansätze eingesetzt. Der erste Ansatz etablierte die LAIP-Kartographie leukämischer Blasten bei der Diagnose mittels Boolescher Gating, und diese Kartographie wurde auf Nachuntersuchungen von Knochenmarkproben angewendet (Abbildung 9A). Der zweite Ansatz nutzte die DfN-Analyse, um abnormale Zellen mit atypischen Expressionsmustern zu identifizieren, die in "leeren Box"-Bereichen, definiert durch normale myeloide Differenzierung, nicht beobachtet wurden (Abbildung 9B). Der dritte Ansatz quantifizierte LSC-angereicherte Zellen in der CD34⁺CD38⁻ -Fraktion unter Verwendung dichotomischer LSC-Marker und Boolean-Gating (Abbildung 10).

Referenz-Knochenmarkproben

Insgesamt wurden 135 Referenzknochenmarkproben untersucht, darunter 25 gesunde Spenderknochenmarkproben, 34 entzündliche Knochenmarkproben und 76 regenerierende Knochenmarkproben. Gesundes Spender-Knochenmark wurde von gesunden Spendern gewonnen, mit einem Medianalter von 31 Jahren und einer Spanne von 21–49 Jahren. Das entzündliche Knochenmark wurde von Patienten gewonnen, die wegen Zytopenie überwiesen wurden, darunter Anämie, Neutropenie oder Thromboopenie, wobei Knochenmarkaspirationen keine hämatologische Malignität zeigten; Das mittlere Alter betrug 52 Jahre, mit einer Spanne von 25–82 Jahren. Regenerierendes Knochenmark wurde während der AML-Nachbeobachtung zu verschiedenen Chemotherapiezeitpunkten, einschließlich nach Einleitung oder Konsolidierung, mit der Negativität der molekularen MRD-Bewertung auf NPM1- oder CBF-Transkripte; Das Medianalter betrug 54 Jahre, mit einer Spanne von 18 bis 65 Jahren.

Die Qualität dieser Proben wurde durch mikroskopische Untersuchung validiert. Der erwartete theoretische Anteil an CD34^+- Zellen in unverdünnten Knochenmarkproben wurde ebenfalls mit der Brooimans-Formel berechnet, mit den Ergebnissen >90 % für alle Proben. Diese Proben wurden verwendet, um Schwellenwerte für LAIP/DfN- und LSC-Analysen festzulegen und die Hämodilutions- und Reinheitsformel zu berechnen. Die Marker-Expression MFI-Variation nach Knochenmarkstatus wurde für gesunde Spender-, entzündungs- und regenerierende Knochenmarkproben untersucht (Supplemental File-Abbildung S6). Referenzwerte wurden für die relevantesten Parameter bestimmt, darunter %MNC CD34⁺ aus WBC, %P6 CD34⁺CD38⁻ in MNC CD34⁺, %P7 CD34⁺CD38^dimm in MNC CD34⁺ und %P8 CD34⁺CD38^hoch in MNC CD34⁺ (Supplemental File-Figure S6).

Bewertung von Sensitivität und Linearität

Die Sensitivität wurde für LAIP/DfN- und LSC-spezifische Gates bewertet, indem die Anzahl abnormaler Ereignisse in einer Reihe von Referenz-Knochenmarkproben gemessen wurde, darunter regenerierendes, entzündliches und gesundes Spenderknochenmark. Die serielle Verdünnung einer bekannten Anzahl von Blasten im gesunden Knochenmark wurde verwendet, um die Quantifizierungsgrenze und Linearität der MRD-Messung zu überprüfen (Abbildung 11 und Abbildung 12).

Abbildung 1: Gating-Strategie für die MRD-LAIP-Analyse in AML mit primitiven Markern (CD34⁺/CD117⁺) in Röhre 1. Erste Reihe: sequentielle Zeitsteuerung, lebende Zellen basierend auf FSC versus SSC, einzelne Zellen basierend auf FSC-W versus FSC-H, WBC CD45⁺ Zellen auf CD45 versus SSC, Blasts auf CD45^dim/SSC, mononukleare Zellen (MNC) auf FSC-A/SSC-A, MNC CD34⁺ Zellen auf dem CD45 versus CD34 Plot und das primitive Markergatter auf dem CD34 versus CD117 Plot. Zweite und dritte Zeile: feste biparametrische Punktdiagramme, die zur Definition der relevantesten LAIP-Gatter verwendet werden (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP wurde mit folgender Boolescher Strategie definiert: Zeit UND lebende Zellen UND Einzelzellen UND (Blasts ODER MNC CD34⁺) UND primitive Marker (CD34^+/−CD117^+/−) UND LAIP1 UND LAIP2 UND LAIP3 UND LAIP4 UND LAIP5 UND LAIP6 UND LAIP7 UND LAIP8. Im illustrierten Fall betrug die MRD 6,8 % der WBC CD45⁺, verglichen mit 0,04 % ± 0,03 im gesunden Knochenmark. Rechts: Backgating des letzten MRD-Tors zur Quantifizierung, das die Reinigung unspezifischer Ereignisse, Erythroblasten und Trümmer ermöglicht. Abkürzungen: AML = akute myeloische Leukämie; MRD = messbare Resterkrankung; LAIP = leukämieassoziierter Immunophenotyp; FSC = Vorwärtsstreuung; SSC = Seitenstreuung; WBC = weiße Blutkörperchen; MNC = mononukleare Zellen; hBM = gesundes Knochenmark. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Gating-Strategie für die MRD-LAIP-Analyse in AML mit reifen Blasten (CD34⁻CD117⁻) in Röhre 3. Erste Reihe: sequentielle Zeitsteuerung, lebende Zellen basierend auf FSC versus SSC, Einzelzellen basierend auf FSC-W versus FSC-H, WBC CD45⁺ Zellen auf CD45 versus SSC, Blasts auf CD45^dim/SSC, mononukleare Zellen (MNC) auf FSC-A/SSC-A, MNC CD34⁺ Zellen auf dem CD45 versus CD34-Plot und das ausgereifte Blast-Gate auf dem CD34 versus CD117-Plot.
Zweite und dritte Zeile: feste biparametrische Punktdiagramme, die zur Definition der relevantesten LAIP-Gatter verwendet werden (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP wurde mit folgender Boolescher Strategie definiert: Zeit UND lebende Zellen UND Einzelzellen UND Blasten UND CD34⁻CD117⁻ Blasts UND LAIP1 UND LAIP2 UND LAIP3 UND LAIP4 UND LAIP5 UND LAIP6 UND LAIP7 UND LAIP8. Im abgebildeten Fall betrug die MRD 15 % der WBC CD45⁺, verglichen mit 0,09 % ± 0,02 im gesunden Knochenmark.
Rechts: Backgating des letzten MRD-Gates zur Quantifizierung, um die Bereinigung unspezifischer Ereignisse zu ermöglichen. Abkürzungen: AML = akute myeloische Leukämie; MRD = messbare Resterkrankung; LAIP = leukämieassoziierter Immunophenotyp; FSC = Vorwärtsstreuung; SSC = Seitenstreuung; WBC = weiße Blutkörperchen; MNC = mononukleare Zellen; hBM = gesundes Knochenmark. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Gating-Strategie für normale hämatopoietische Stammzellen (nHSCs) und leukämische Stammzellen (LSC)-angereicherte Zellen im CD34⁺CD38⁻ -Anteil (Röhre 2). (A) Normale hämatopoietische Stammzellen (nHSCs) und (B) leukämische Stammzellen (LSC)-angereicherte Zellen im CD34⁺CD38⁻ -Anteil (Röhre 2). Erste Reihe: sequentielle Zeitabgrenzung, lebende Zellen basierend auf FSC versus SSC, Einzelzellen basierend auf FSC-W versus FSC-H, WBC CD45⁺ Zellen auf CD45 versus SSC, Blasts auf CD45dim/SSC, mononukleare Zellen (MNC) auf FSC-A/SSC-A und MNC CD34⁺ Zellen auf dem CD45 versus CD34-Plot.
Zweite bis vierte Zeilen: feste biparametrische Punktdiagramme, die verwendet werden, um P6 (CD34⁺CD38⁻), P7 (CD34⁺CD38^niedrig) und P8 (CD34⁺CD38^hoch) zu definieren, zusammen mit den relevantesten dichotomischen LSC-Markern, darunter MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123 und CD45RA. MRD LSC wurde mit folgender Boolescher Strategie definiert: Zeit UND lebende Zellen UND Einzelzellen UND Blasten UND MNC UND MNC CD34+ UND P6 UND (P6 LSC MIX⁺ ODER P6 LSC CD123⁺ ODER P6 LSC CD45RA⁺).
Rechts: Backgating des letzten MRD LSC-Gates, das zur Quantifizierung verwendet wird, um unspezifische Ereignisse aufzuräumen.
(A) nHSCs in einer gesunden Knochenmarkprobe: nHSCs (violette Ereignisse) waren CD34⁺CD38⁻, MIX⁻ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁻, CD123⁻, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ und CD90⁺. Der nHSC CD34⁺CD38⁻ -Anteil machte 0,02 % der WBC-Zellen CD45⁺ aus, und die LSC CD34⁺CD38⁻ -Zellen waren negativ. Die gemeldeten Assay-Schwellenwerte waren LOQ 0,0001 % und LOD 0,001 %.
(B) LSC-angereicherte Zellen in einer AML-Probe: LSC-angereicherte Zellen (orangefarbene Ereignisse) waren CD34⁺CD38⁻, MIX⁺ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁺, CD123⁺, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ und CD90⁺. Der LSC-Anteil CD34⁺CD38⁻ machte 3,7 % der weißen Blutkörperchen CD45⁺ aus. Abkürzungen: nHSCs = normale hämatopoietische Stammzellen; LSC = leukämische Stammzelle; MNC = mononukleare Zellen; WBC = weiße Blutkörperchen; SSC = Seitenstreuung; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = humanes Leukozytenantigen-DR; LOQ = Grenze der Quantifizierung; LOD = Detektionsgrenze. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Definition des CD38⁻ -Schwellenwerts in der CD34^+- Population unter Verwendung des CD38-Fluoreszenz-minus-eins (FMO)-Kanals. Erste Reihe: Gating von Referenzpopulationen, einschließlich Blasten auf CD45/SSC, MNC CD19^+- Zellen und MNC CD34^+- Zellen.
Zweite Reihe: Signalpegel im CD38 FMO-Kanal. Die erste Linie zeigt Blastzellen, die zweite Linie zeigt MNC CD19⁺ Zellen und die dritte Linie zeigt MNC CD34⁺ Zellen. Die orange Linie zeigt die Schwelle an, die das P6 CD34⁺CD38⁻ -Gatter definiert.
Dritte Reihe: CD38 PE-Cy7 Signalpegel. Die erste Linie zeigt Blastzellen, die zweite Linie zeigt MNC CD19^+- Zellen mit dem CD38-Hämatogen-Spiegel, der zur Definition von P8 CD34⁺CD38^hoch verwendet wird, und die dritte Linie zeigt MNC CD34^+- Zellen, mit P6 CD34⁺CD38⁻ -Zellen in Orange, P7 CD34⁺CD38^niedrigen Zellen in Grün und P8 CD34⁺CD38^hoch Zellen in Blau. Abkürzungen: FMO = Fluoreszenz minus eins; MNC = mononukleare Zellen; SSC = Seitenstreuung; PE-Cy7 = Phycoerythrin-Cyanin 7; P6 = CD34+CD38− Bruch; P7 = CD34+CD38 niedriger Anteil; P8 = CD34+CD38 hoher Bruch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Bewertung der Repräsentativität der Knochenmarkproben basierend auf MNC CD34^+- Zellen. (A) Gating-Strategie für MNC CD34^+- Zellen und für die Formelberechnung verwendete Parameter: n, Anzahl der MNC CD34^+- Zellen; L, Anzahl der weißen Blutkörperchen CD45^+; s, Anteil der MNC CD34^+- Zellen im normalen peripheren Blut; und m., Anteil der MNC CD34^+- Zellen, die im Referenz-normalen Knochenmark beobachtet wurden. (B) Schematische Darstellung der Auswirkungen der Knochenmarkverdünnung (BM) durch peripheres Blut (PB) auf den Ursprung von CD34^+- Zellen in BM-Proben. (C) Kriterien zur Interpretation der Reinheit der BM. Abkürzungen: BM = Knochenmark; PB = peripheres Blut; MNC = mononukleare Zellen; WBC = weiße Blutkörperchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Vergleich von Expressionsmustern über vier Durchflusszytometer-Plattformen.
Eine normale Knochenmarkprobe (BM) wurde gleichzeitig auf vier Zytometerplattformen unter Verwendung der definierten Einstellungen für jede Plattform und Skalenanpassung getestet. Die erste Reihe zeigt MNC-Zellen auf dem CD45/CD33-Punktdiagramm; die zweite Reihe zeigt MNC-Zellen auf dem Punktdiagramm des primitiven Markers CD34/CD117; die dritte Reihe zeigt Blastzellen auf dem CD34/CD38-Punktdiagramm; und die vierte Reihe zeigt P6 CD34⁺CD38⁻ -Zellen im CD45RA/CD90-Punktdiagramm. Abkürzungen: BM = Knochenmark; MNC = mononukleare Zellen; P6 = CD34⁺CD38⁻ Bruch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Reproduzierbarkeit der EQA im Nasslabor über die teilnehmenden Flusslabore. (A) Violin-Diagramm, das die Verteilung von %P6 CD34⁺CD38⁻ Zellen in WBC CD45^+- Zellen über die fünf Nasslabor-EQA-Runden und die teilnehmenden Flow-Labore zeigt. (B) Violinplot, das die Verteilung der %MNC CD34^+- Zellen in WBC CD45^+- Zellen über die fünf Nasslabor-EQA-Runden und die beteiligten Flow-Labore zeigt. Abkürzungen: EQA = externe Qualitätsbewertung; P6 = CD34+CD38− Bruch; WBC = weiße Blutkörperchen; MNC = mononukleare Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8: Trockene EQA-Bewertung der LAIP/DfN- und LSC-MRD-Messung. (A) Trockene EQA2017 Übung für LAIP/DfN- und LSC-MRD-Messungen unter Verwendung von sechs gemeinsamen FCS-Dateien aus einer 8-Farb-Panelgruppe, einschließlich AML-Diagnose, AML-MRD und normalen Knochenmarkreferenzdateien für Tube 1 LAIP und Tube 2 LSC-Analysen. Die Übung wurde mit 23 teilnehmenden Laboren geteilt. (B) Dry EQA2024 Übung für LAIP/DfN und LSC MRD-Messungen mit sechs gemeinsamen FCS-Dateien aus einer 12-Farb-Panelgruppe, einschließlich AML-Diagnose, AML MRD und normalen Knochenmarkreferenzdateien für Tube 1 LAIP und Tube 2 LSC-Analyse. Die Übung wurde mit 24 teilnehmenden Laboren geteilt. (C) Interplattform-Vergleich von %MNC CD34⁺ Zellen und %nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ Zellen in WBC CD45⁺ Zellen, die während der Nass-EQA2025 gemessen wurden, geteilt mit 25 teilnehmenden Laboren. Die erwarteten Werte lagen bei 1,6 % für MNC CD34^+- Zellen und 0,02 % für nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ -Zellen. Abkürzungen: EQA = externe Qualitätsbewertung; LAIP = leukämieassoziierter Immunophenotyp; DfN = anders-als-normal; LSC = leukämische Stammzelle; MRD = messbare Resterkrankung; FCS = Durchflusszytometriestandard; AML = akute myeloide Leukämie; MNC = mononukleare Zellen; nHSC = normale hämatopoetische Stammzelle; WBC = weiße Blutkörperchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 9: Repräsentative MRD-Messung mit LAIP/DfN-Ansätzen. (A) Beispiel für MRD-Messung mit der LAIP/DfN-Methode. Die linke Seite zeigt die LAIP-Kartographie der leukämischen Zellen in der Diagnoseprobe, die rechte Seite zeigt die Anwendung derselben LAIP-Kartographie auf die Nachuntersuchungsprobe, wobei die MRD-Population schwarz dargestellt ist. (B) Beispiel für MRD-Messung mit der DfN-Methode. Jedes Paar von Punktdiagrammen vergleicht gesundes Knochenmark (hBM; normaler, linker Diagramm) mit einer MRD-Nachfolgeprobe (DfN, rechter Diagramm). Der Bereich der "leeren Box" wird auf normalem Knochenmark definiert, und das Vorhandensein leukämischer Zellen in dieser leeren Box wird in der Nachuntersuchungsprobe bewertet, wobei die abnormale Population in Schwarz dargestellt ist. Abkürzungen: MRD = messbare Resterkrankung; LAIP = leukämieassoziierter Immunophenotyp; DfN = anders-als-normal; hBM = gesundes Knochenmark. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 10: Repräsentative Messung von CD34⁺CD38⁻ LSC-angereicherten Zellen bei Diagnose und Nachbeobachtung. (A) Beispiel für LSC-angereicherte Zellmessung in einer AML-Diagnoseprobe. Die linke Seite zeigt das LSC-angereicherte Profil, wobei die orangefarbene Population MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123, CD45RA, CD117, HLA-DR und CD36 innerhalb des Bruchs CD34⁺CD38⁻ ausdrückt.
(B) Nachbeobachtungsprobe desselben Patienten mit Persistenz von MRD-LSC-angereicherten Zellen mit demselben immunophenotypischen Profil (orangefarbene Population). Abkürzungen: LSC = leukämische Stammzelle; AML = akute myeloide Leukämie; MRD = messbare Resterkrankung; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = humanes Leukozytenantigen-DR. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 11: Analytische Sensitivität der LSC-Erkennung. (A) Bewertung des Grenzwerts des Blanklings (LOB) für LSC-Erkennung. Die linke Seite zeigt die Quantifizierung von CD34⁺CD38⁻ -Ereignissen in einer Zusammenführung von fünf FCS-Dateien aus fünf gesunden Knochenmarkproben (5.148.000 WBC-Ereignisse erfasst). Die rechte Seite zeigt die Anzahl der Ereignisse, die zum LSC-Boolesche Gate gehören, die auf dem CD45/SSC-Punktdiagramm (14 Ereignisse) zurückgegat sind, was einem LOB von <0,0005 % (5 × ^10-6) entspricht. (B) Bewertung der Linearität zur LSC-Quantifizierung. Die linke Seite zeigt eine serielle Verdünnung durch Spike-in von LSC-angereicherten Zellen in einer gesunden Knochenmarkprobe. Die rechte Seite zeigt die Korrelation zwischen gemessenen MRD-Werten und theoretischen Werten, entsprechend einem Quantifizierungsgrenzwert (LOQ) von 2 × ^10-5 (0,002 %). Abkürzungen: LSC = leukämische Stammzelle; LOB = Grenze des Blanken; FCS = Durchflusszytometriestandard; WBC = weiße Blutkörperchen; MRD = messbare Resterkrankung; LOQ = Grenze der Quantifizierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 12: Linearität und Quantifizierungsbereich der MRD-LAIP-Messung. (A) Bewertung der Linearität zur MRD-LAIP-Quantifizierung durch serielle Verdünnung von Blasten mit verschiedenen LAIPs im gesunden Knochenmark, die die Korrelation zwischen den gemessenen MRD-Werten und theoretischen Werten zeigt, wobei variable LOQ entsprechend den verschiedenen LAIPs und LOQ <0,1 % (B) Quantifizierungsbereich entsprechend verschiedenen LAIPs. Die rote Linie zeigt die klinische Schwelle von 0,1 % an. Das LOQ erreichte die klinische Schwelle für alle getesteten LAIPs. Abkürzungen: MRD = messbare Resterkrankung; LAIP = leukämieassoziierter Immunophenotyp; LOQ = Grenze der Quantifizierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Fluoro Chrom	Gipfel	LYRIC12c	Gipfel	DxFlex13c	Gipfel	NAVIOS10c	Gipfel	CANTO8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
PE	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
ECD	x	x	P6	153011	P7	150	x	x
PerCPcy5,5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
APC	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	x	x
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	x	x	x	x
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	x	x	x	x
BV786	P8	17560	P6	3795	x	x	x	x

Tabelle 1: Zielwerte für jede Plattform mit 8-Spitzen-Regenbogenperlen. Spezifische Zielwerte werden für jede Zytometerplattform angezeigt (Canto, Lyric, Navios, DxFlex). Die erhaltenen Spitzen wurden so gewählt, dass sie nahe an der für Blastzellen beobachteten MFI liegen. Dies ist besonders wichtig für PMT-basierte Zytometer, bei denen die Signalintensität mit steigender PMT-Spannung nicht linear zunimmt. Im Gegensatz dazu nimmt bei APD-basierten Zytometern die Signalintensität linear mit der Verstärkung zu, sodass derselbe Peak für alle Detektoren verwendet werden kann, während bei PMT-basierten Zytometern für jeden Kanal unterschiedliche Peaks erforderlich sind. Abkürzungen: MFI = mediane Fluoreszenzintensität; PMT = Photomultiplikatorröhre; APD = Lawinen-Photodiode. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

GESANG 8C /NAVIOS 8c

FITC

PE

ECD

PerCPC y5,5

PECy7

APC

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Röhre 1 LAIP 8c

CD7 5μL /CD56 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

Röhre 2 LSC 8c

CD90 5μL

MIX3(2 0,5μL/AC)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Saugle mentaire Gran 8c

CD15 5μL

CD56 5μL

HLADR 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD11b 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Supplem Entaire - Monos 8c

CD36 5μL

CD64 5μL

CD14 10μL

HLADR 5μL

CD34 5μL

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

LYRIC 10-12c

FITC

PE

ECD

PerCPCy5,5

PECy7

APC

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Röhre 1LAIP 12c

CD7 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD56 5μL

CD10 2μL

CD36 2μL

Röhre 2 LSC 12c

CD90 5μL

MIX3(2. 5μL/AC)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD200 5μL

CD19 5μL

CD36 2μL

T3 Saugle mentaire 12c-Monos

CD15 5μL

CD64 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD14 5μL

CD11b 5μL

CD36 2μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

NAVIOS 10c

FITC

PE

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 Navios 10c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T2 Navios 10c

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Saugle mentaire 10c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD11b 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -12/13c

FITC

PE

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD36 5μL

CD10 2μL

/

T2 DxFLEX 12-13c

CD90 5μL

MIX3(2.5 μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

/

CD200 5μL

HLADR snv786 (3μL)

T3 Saugle mentaire 12c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD64 5μL

CD11b 5μL

/

Tabelle 2: Antikörperpanel-Konfigurationen für AML MRD, LAIP/DFN und LSC-Analysen. Die Tabelle fasst die 8-, 10-, 12- und 13-farbigen Panelkonfigurationen entsprechend der Zytometerplattform zusammen. Röhre 1 wird für die LAIP/DfN-Analyse verwendet, Röhre 2 für CD34⁺CD38⁻ LSC-angereicherte Zellanalyse und Röhre 3 für monozytische/granulocytäre Differenzierungsmarker. Antikörpervolumina und Fluorochromzuweisungen werden für jede Plattform angezeigt. MIX3 entspricht CD97, TIM3 und CLL1. Abkürzungen: AML = akute myeloische Leukämie; MRD = messbare Resterkrankung; LAIP = leukämieassoziierter Immunophenotyp; DfN = anders-als-normal; LSC = leukämische Stammzelle; MIX3 = CD97/TIM3/CLL1. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Vollständiger Verlust der normal exprimierten Marker auf myeloiden Vorläufern

CD13++CD33-/CD34+ oder CD117+

CD13-CD33++/CD34+ oder CD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

Kreuzlinien-Expression lymphoider Marker auf myeloiden Vorläufern

CD7+CD13+/CD34+ oder CD117+

CD7+CD33+/ CD34+ oder CD117+

CD56+CD13+/ CD34+ oder CD117+

CD56+CD33+/ CD34+ oder CD117+

CD19+CD117+/ oder CD13+ oder CD33+

Überexpression bei myeloiden Vorläufern

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

Verringerte Expression bei myeloiden Vorläufern

CD38loCD34+CD33+CD117+

Tabelle 3: LAIP-basierte DfN-Definitionen der "leeren Box". Die Tabelle listet vordefinierte, abweichende (DfN) "leere Box"-Muster auf, die zur Identifizierung abnormer myeloider Vorläuferpopulationen verwendet werden. Kategorien umfassen vollständigen Verlust der normal exprimierten Marker, Crosslineage-Expression lymphoider Marker, Überexpression von Markern und verminderte Markerexpression bei myeloiden Vorläufern. Abkürzungen: LAIP = leukämieassoziierter Immunophenotyp; DfN = anders-als-normal. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Holdrinet et al.17
Broolmans et al.15
Knochenmarkreinheit = (1 − (GRMO/GRSG) x (GBSG/GBMO)) x 100	>80 %
Björlund et al.19	Notendurchschnitt > 15 %
	CD3 < 20 %
Loken et al.18	CD16Höchstwert < 30 %
Theunissen et al.20; Dworzak et al.21
Fluss- oder Ctr-DIL-Zytologik: PNN < 40 %, Ebl > 5 %, Ly < 20 %	CD16++ CD11b++ < 40 %
	Notendurchschnitt > 5 %
	CD3 < 20 %
BM-Reinheit %: MNC 34+/WBC45+	Blutreinheit 100-10 %

Tabelle 4: Methoden zur Kontrolle der Knochenmarkverdünnung zur Berichterstattung über AML-MRD-Fluss. Die Tabelle fasst veröffentlichte Methoden zur Verdünnung von Knochenmark und Repräsentativität zusammen, die für klinische Berichte zum AML-MRD-Fluss verwendet werden können. Mindestens eine Verdünnungs-Kontrollmethode sollte angewandt werden, um die Interpretation der MRD-Ergebnisse zu unterstützen. Der CD34/WBC45^+- Ansatz der Knochenmarkreinheit ist als ergänzende Qualitätsbewertung enthalten. Abkürzungen: AML = akute myeloische Leukämie; MRD = messbare Resterkrankung; BM = Knochenmark; WBC = weiße Blutkörperchen; CD34/WBC45⁺ = CD34⁺ Zellen unter CD45⁺ weißen Blutkörperchen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzungsakte 1: Zusätzlicher Hintergrund, Plattformharmonisierung, Referenz auf Knochenmark und prognostische Unterstützungsmaterialien. Diese ergänzende Datei enthält unterstützende Figuren und Tabellen zu LSC-Identifikation, AML-phänotypischer Heterogenität, Interplattform-Spiegelung, plattformspezifischer Optimierung, Referenz-Knochenmarkmarker-Expressionsprofilen, Longitudinalpanel-Evolution und der prognostischen Schwelle für die LSC-Quantifizierung bei der Diagnose. Diese Materialien liefern zusätzlichen Kontext für den multizentrischen MRD-Flowzytometrie-Workflow, einschließlich der Begründung für die Bewertung von CD34⁺CD38⁻ LSC-angereicherten Zellen, der technischen Grundlage für die Plattformharmonisierung und unterstützenden Daten zur Interpretation von Referenzmark-Hintergrund, Panelmigration und klinischer Schwellenwertauswahl. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Kritische Schritte im Protokoll

Die Probenqualität ist entscheidend für eine genaue MRD- und LSC-Quantifizierung. Frische Knochenmarkproben sollten bei Raumtemperatur transportiert und idealerweise innerhalb von 24–48 Stunden sowie bei Bedarf innerhalb von 72 Stunden nach der^{Entnahme 23} Stunden verarbeitet werden. Die Hämodilution sollte zu jedem Zeitpunkt bewertet und in den klinischen Flussbericht aufgenommen werden. Der Kliniker sollte den Behandlungszeitpunkt angeben, zum Beispiel nach Einleitung, Konsolidierung, gezielter Immuntherapie, weniger intensiver Behandlung wie Azacitidin/Venetoclax oder Allograft. Die Differenzierungslandschaft steht in engem Zusammenhang mit Behandlung und Zeitpunkt und ist wichtig, sie in die MRD-Interpretation zu integrieren. Während der longitudinalen Nachbeobachtung sollten die gleiche Instrumentensensitivität und Analysezuverlässigkeit durch regelmäßige Kontrollen der Zielwerte mit Regenbogenkontrollkugeln, regelmäßige EQA und kollegiale Überprüfung der FCS-Dateien während der gesamten Studie aufrechterhalten werden.

Ein hohes Maß an Standardisierung und interzentraler Zuverlässigkeit der MRD-Flussquantifizierung wird durch regelmäßige webbasierte Schulungen in der Flussgruppe aufrechterhalten. Mindestens eine Web-Schulung pro Monat wurde durchgeführt, und in diesen Jahren wurden mehr als 100 Fälle von MRD LAIP/DfN, MRD LSC oder diagnostischer LSC-Quantifizierung diskutiert und überprüft. Diese Fortbildung ist wichtig, da die Interpretation von Flussdaten einen hochqualifizierten Biologen erfordert, insbesondere bei niedrigstufigen MRD, physiologischen Hintergrundpopulationen, regenerierendem Mark und phänotypischen Switches in Behandlung.

Die Quantifizierung von CD34⁺CD38⁻ LSC-angereicherten Populationen ist ein weiterer entscheidender Schritt. Es gibt keinen universellen Marker, der normale hämatopoietische Stammzellen oder LSCs erfasst. Die HODEN-Gruppe führte LSC-Überwachung in der AML-Diagnose und -Nachbeobachtung mit einem 8-Farben-Panel ein, das eine Reihe relevanter "dichotomischer" LSC-Marker^{umfasste 3}. Dichotome Marker sind definiert als Expression in normalen hämatopoietischen Stammzellen, aber positive Expression in LSC-angereicherten Populationen mit schwachen, intermediären, hohen, heterogenen oder bimodalen Mustern. Es besteht Interesse daran, eine Mischung spezifischer dochotomischer LSC-Marker wie CLL1, TIM3 und CD97 in einem einzigen Kanal zu integrieren, denn wenn nur eine positiv ist, können LSC-angereicherte Zellen dennoch nachgewiesen werden. Andere Marker sollten separat in bestimmten Kanälen verwendet werden, da ihre Expression je nach Zustand des Knochenmarks, einschließlich regenerierendem oder gestresstem Mark²⁴, mit der normaler hämatopoietischer Stammzelle überlappen kann. Die vollständige Definition von LSC-angereicherten Zellen basiert auf booleschen Operatoren, einschließlich aberranter Expression von Markern im CD34⁺CD38⁻ -Anteil. Da dies eine phänotypische Definition bleibt, sollte die Population als CD34⁺CD38⁻ LSC-angereicherte Zellen interpretiert werden und nicht als funktional bewiesene LSCs in jeder Probe. Dieses LSC-Panel ist auch bei Patienten mit MDS mit überschüssigen Blasten und AML MRC mit demselben Protokoll anwendbar.

Modifikationen und Fehlerbehebung der Methode

Während der Entwicklung von Plattform und Panels muss der Standardisierungs- und Harmonisierungsansatz innerhalb des Labornetzwerks beibehalten werden, insbesondere beim Übergang von 8- auf 10-Farben-Panels mit 12 bis 13 Farben. Mit der Entwicklung der Maschinen besteht die Notwendigkeit, ein gemeinsames Rückgrat an Antikörpern und die gleiche Sensibilität bei der Erkennung phänotypischer Anomalien während der gesamten klinischen Forschung aufrechtzuerhalten. Während der Plattformentwicklung bleiben die Fluorochrome der Antikörper im Rückgrat stabil und gemeinsam auf allen Maschinen (CD34/CD38/CD45/CD117). Für einige Kanäle ist jedoch ein Wechsel der Fluorochrome notwendig, da die maschinenspezifische optische Bank einen Harmonisierungsansatz erfordert. Beim Wechsel von einem PMT-Detektorzytometer zu einem APD-Detektorzytometer muss die hohe Empfindlichkeit von APD-Detektoren bei hohen Wellenlängen berücksichtigt werden. Daher muss in manchen Fällen die Wahl der Fluorochrome für bestimmte Antikörper so angepasst werden, dass derselbe Färbungsindex erhalten bleibt und eine übermäßige Ausbreitung zwischen den Kanälen vermieden wird, wodurch ein Optimierungsansatz gewählt wird. Aktuelle klinische Zytometer unterstützen 12- bis 13-Farb-Panels, was die Spezifität bei der Detektion von LAIP erhöht und die Interpretation durch die Hinzufügung von Markern verbessert, die kontaminierende Zellen im MRD-Gate eliminieren. Dies erhöht jedoch auch die Komplexität der Analyse²³.

Die Umrüstung von 8-Farben- auf 12-Farben-Panels verbesserte in einigen Fällen die Sensitivität und Spezifität der MRD-Bewertung (Supplemental File 1). In Röhre 1 wurden HLA-DR, CD36, CD10 und CD56 hinzugefügt, getrennt von CD7. In Röhre 2 wurden HLA-DR, CD36, CD200 und CD19 hinzugefügt. In Röhre 3 wurden CD4, CD64, CD38, CD36 und CD14 hinzugefügt. HLA-DR, nun systematisch in jeder Röhre mit CD38 kombiniert, liefert eine klarere Definition von LAIP und veränderten Differenzierungsmustern. CD36, das nun systematisch in jedem Röhrchen enthalten ist, ist ein Schlüsselmarker zur Identifizierung von Erythroblasten, roten Blutkörperchen, Blutplättchen und Trümmern sowie zur Verfeinerung des finalen MRD-Gates. CD19 im LSC-Röhrchen hilft ebenfalls bei der Identifizierung von Hämatogen. Die Kombination von Monozyten- und Granulozyt-Differenzierungsmarkern in einer Röhre ermöglicht eine bessere Abgrenzung monozytischer und granulocytärer Differenzierungsmuster und hilft, Abweichungen zur Identifikation von LAIP zu erkennen. Beim Übergang von 8-Farben- auf 10-Farben-Panels kam die Hauptverbesserung durch die LAIP-Detektion, insbesondere mit der Hinzufügung von HLA-DR und CD56, die von CD7 in Röhre 1 sowie HLA-DR und CD19 in Röhre 2 getrennt wurden. Beim Übergang von 10-Farben- auf 12-Farben-Panels resultierte die Verbesserung durch eine bessere Reinigung der Strahl- und LSC-Gates mit der Hinzufügung von CD36 in jeder Röhre, ergänzt durch CD10 in Röhre 1 und CD200 in Röhre 2. Dies war besonders nützlich für Patienten mit niedrigem MRD oberhalb der Nachweisgrenze, aber unter der Quantifizierungsgrenze. Insgesamt wurden die meisten Patienten mit MRD-Positivität bei der klinischen Schwelle ≥ 0,1 % bereits mit dem 8-Farben-Panel identifiziert; jedoch verbesserte der Einsatz von mehr Markern in den Röhren die Spezifität und Interpretation der MRD-Beurteilung, insbesondere für niedrigwertige MRD, wie in den ELN 2025-Richtlinien erwähnt.

Einschränkungen der Methode

Die Wahl eines Multicenter-Ansatzes kann eine Herausforderung sein. Die Machbarkeit dieses Konzepts erfordert verpflichtende Schritte vor der Implementierung des MRD-Flusses in AML-klinischen Studien: Harmonisierung der Instrumentenempfindlichkeit und Probenvorbereitung sowie Schulung und systematische Ausbildung für analytische Betreiber²⁵. Mit der Weiterentwicklung der Plattformen muss die Multicenter-Multiplattform-Strategie angepasst werden, um die Robustheit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aufrechtzuerhalten. Dazu gehört Standardisierung, wobei dasselbe Panel und dieselbe Einstellung für denselben Plattformtyp verwendet werden; Harmonisierung, bei der dasselbe Panel über mehrere Plattformen mit harmonisierten Einstellungen verwendet wird; und Optimierung mit einem Panel und spezifischen Einstellungen, die an jede Plattform angepasst sind.

Hämodilution ist einer der herausforderndsten und kritischsten Punkte für die Quantifizierung des MRD-Durchflusses. Die in diesem Protokoll beschriebene CD34/WBC-Repräsentativitätsformel sollte als ergänzende Qualitätskontrollmaßnahme für die Knochenmarkprobe verwendet werden und nicht zur Normalisierung von MRD-Ergebnissen verwendet werden. Seine Interpretation kann durch Knochenmarkregeneration, Behandlungseffekte, Resterkrankungen und weniger intensive Behandlungspläne beeinflusst werden. Ebenso sollten Marker wie CD56, CD123 und CD45RA nicht als eigenständige DfN- oder LSC-Marker interpretiert werden. Sie sollten innerhalb der vollständigen Sperrstrategie, der Cleanup-Gates, der Referenz auf Knochenmark-Hintergrund und des klinischen Kontexts interpretiert werden.

Bedeutung der Methode im Vergleich zu bestehenden oder alternativen Methoden

Laut den ELN 2025-Richtlinien ist MRD ein wichtiger prognostischer Marker bei Patienten mit AML, unabhängig von Technik oder Zeitpunkt der Untersuchung. Der Einsatz verschiedener MRD-Flusstechniken und -Marker ist äußerst komplementär. Multimodale MRD, einschließlich LAIP/DfN- und LSC-Analysen, ist nützlich, sofern die Analyse in einem standardisierten Netzwerk mit harmonisierter Ergebnisberichterstattung durchgeführt wird. Die MRD-Beurteilung ermöglicht eine bessere Definition der therapeutischen Reaktion und des Rückfalls. Der multizentrische und multimodale MRD-Fluss wird zusammen mit molekularer MRD eine strategische Rolle in zukünftigen klinischen Studien innerhalb einer zunehmend komplexen therapeutischen Landschaft spielen, die neue gezielte Therapien, Erst- und Zweitlinienbehandlungen, allogene Transplantationen und Therapien mit niedriger Intensität umfasst.

Bedeutung und potenzielle Anwendungen der Methode in spezifischen Forschungsbereichen

Die HOWON- und ALFA-Gruppen berichteten, dass die Quantifizierung von CD34⁺CD38^{− LSC-angereicherten} Populationen bei AML-Diagnose klinische Auswirkungen hat (Supplemental File 1). Es scheint entscheidend, klinisch signifikante Schwellenwerte für LSC anhand der Quantifizierungsmethode zu definieren. Wie zuvor mit der hier beschriebenen Methode berichtet, war ein LSC-Schwellenwert ≥1 % mit einem ungünstigen Ergebnis assoziiert (Supplemental File 1)²⁶. Im AML-Management kann eine differenzielle Integration von MRD, LSC-Überwachung und klonaler Hämatopoese helfen, die therapeutische Interpretation zu verfeinern. Die Hauptherausforderung besteht darin, MRD, das möglicherweise eine zusätzliche Behandlung erfordert, von stabilen präleukämischen Klonen zu unterscheiden, die möglicherweise^{nicht 27} sind. Ein integriertes Berichtssystem zur Berechnung des Prozentsatzes der Explosionen wurde kürzlich für die AML-Nachverfolgung in den EHA/ELN-Richtlinien²⁰²⁵ empfohlen. Sie integriert MRD-Ergebnisse mit morphologischem Vergleich für eine harmonisierte Bewertung der Blasten und sollte eine konsistente Berichterstattung in klinischen Studien erleichtern, um Antwortkategorien bei AML-Patienten zu definieren.

Sowohl die HOWON-Studie als auch die ALFA/FILO BIG1-Studie zeigen, dass ein Score, der LAIP/DfN- und LSC-Ansätze kombiniert, es ermöglichte, Patienten in vier Gruppen einzuteilen: LAIP⁻/LSC⁻, LAIP⁺/LSC⁻, LAIP⁻/LSC⁺ und LAIP⁺/LSC⁺, mit unterschiedlichen 3-Jahres-Überlebensraten ^3,26,29. Insgesamt verdeutlichen diese Ergebnisse die prognostische klinische Wirkung des kombinierten MRD LAIP/DfN- und LSC-Status. Im Zusammenhang mit allogener hämatopoietischer Stammzelltransplantation wurde das Vorhandensein von CD34⁺CD38⁻ LSC-angereicherten Zellen auch als Prädiktor für das Versagen nach der Transplantation berichtet, selbst wenn die Gesamtzahl der Blasten weniger als ^{5 %} beträgt. Diese klinischen Daten unterstützen die Relevanz kombinierter MRD-Flussstrategien, aber das aktuelle Protokoll konzentriert sich auf die Standardisierung des technischen Arbeitsablaufs und der Berichterstattung über die Zentren hinweg.

Als Perspektive könnte die spektrale Flusstechnologie das Panel der gleichzeitig getesteten Marker in einem multidimensionalen Flowzytometrieansatz erweitern, wodurch die Spezifität überwachter LAIPs erhöht und biologisches Hintergrundrauschen durch hämatopoetische Regeneration reduziert wird. Die Bewertung der spektralen Flussreproduzierbarkeit über Plattformen, Panels und Zentren hinweg, wie hier vorgeschlagen, wird für die klinische Implementierung eine Herausforderung sein. Neue unüberwachte Analysealgorithmen, darunter FlowSOM, t-SNE und UMAP, können die Unterscheidung zwischen normaler Hämatopoese und dem leukämischen Kompartiment vom CD34⁺CD38⁻ LSC-angereicherten Anteil bis zum Blastvolumen erleichtern. Eine tiefere Erfassung von LSC-Fraktionen könnte dazu beitragen, die Überwachung der Engraftment-Strukturen in patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen^{zu verbessern 31,32}. ELN-Arbeitsgruppen wurden eingerichtet, um diese neuen Ansätze zu validieren und zu harmonisieren^33,34.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antibodies (CANTO 8C-LYRIC12C)	Fluorochrom	Unternehmen	Katalognummer
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5,5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
CD64	PE	BD Pharmingen	558592
CD11b	BV711	BD Bioscience	740771
CD4	APCH7	BD Bioscience	641398
HLADR	APC-R700	BD Horizon	565127
CD56	BV605	BD Horizon	562780
CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
Antibodies (NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C)	Fluorochrom	Unternehmen	Katalognummer
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
CD19	AA750	BC iotest	A94681
CD45	KromeOrange	BC iotest	B36294
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PC5.5	BC iotest	B20022
HLADR	ECD	BC iotest	B92438
CD36	AA700	BC iotest	B46022
CD19	ECD	BC iotest	A07770
CD4	PE	BC iotest	A07751
CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
CD14	AA750	BC iotest	B92421
HLADR	SNV786	BC iotest	C78087
CD56	AA700	BC iotest	B92446
CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II  (8-color, blue/red/violet)		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 3-Laser 12-Color Instrument		BD Bioscience	662383
BC NAVIOSNavios 10 Colors, 3 Lasers, B5-R3-V2 Configuration		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13-Colors, 13 Detectors, 3 Laser,  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza Software v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite Software v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva software v 8.0.3 (Win 7 32 bit OS)		BD  Bioscience	659523
BD CST Beads		BD  Bioscience	656505
Multicolor COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks), 3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab Compensation Beads		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml10x conc		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG (May-Grünwald-Giemsa)		Sigma Aldrich	1014242500