Echtzeit-Zwei-Photonen-Bildgebung des endothelialen NAD+ -Stoffwechsels im Gehirn bei Mäusen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll ermöglicht eine Echtzeitüberwachung des endothelialen Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Stoffwechsels im Gehirn in lebenden Mäusen mittels endothelgezielter Biosensorexpression, Schädelfenstervorbereitung und Zwei-Photonen-Bildgebung.

Zusammenfassung

Wir präsentieren einen reproduzierbaren Workflow für die Echtzeitvisualisierung der Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-(NAD⁺)-Biosensor-Kanalantworten in mikrovaskulären Endothelzellen im Gehirn bei lebenden Mäusen mittels Schädelfenster-Zwei-Photonen-Mikroskopie und eines endothelial-gezielten fluoreszenten NAD⁺ -Sensors. Das Protokoll beinhaltet (1) eine adeno-assoziierte Virus-(AAV)-vermittelte Expression des NAD^+- Sensors selektiv im zerebrovaskulären Endothel unter Verwendung von AAV-X1.1 unter dem Cdh5-Promotor  (vaskuläres endotheliales Kaderin), (2) eine chirurgische Vorbereitung eines stabilen 3 mm × 3 mm starken kortikalen Schädelfensters und (3) eine zweiwellige Zwei-Photonen-Bildgebung mit zwei Wellenlängen, um gleichzeitig das 920 nm angeregte grüne Sensorkanalsignal und das 1040 nm angeregte intravaskuläre Tetramethylrhodamin (TMR)–Dextran zu erfassen Referenzkanal. Der TMR–Dextran-Kanal bietet eine Referenz für das Gefäßlumen und unterstützt die Gefäßauswahl, Bewegungsbewertung und die Bewertung der Gefäßintegrität. Als Anwendungsbeispiel beschreiben wir mit Nikotinamid-Mononukleotid-assoziierte Veränderungen der endothelialen Sensorkanalfluoreszenz nach Trinkwasser-, Oral-Gavage- oder intravenöser Verabreichung. Dieses Protokoll legt Wert auf kritische Schritte, empfohlene Überlegungen zur Virusdosierung und Titerung, Fehlersuche und quantitative Analysestrategien, sodass Labore in vivo eine Überwachung der zerebrovaskulären NAD⁺ -Biosensor-Kanaldynamik für Studien zum Neurometabolismus bei Gesundheit und Krankheit umsetzen können.

Einleitung

Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD⁺) ist ein zentraler Kofaktor für das Redox-Gleichgewicht, mitochondriale Aktivität, DNA-Reparatur und stressempfindliche Signalübertragung. Im Gehirngefäß wird die endotheliale NAD⁺ -Homöostase zunehmend als aktiver Regulator der Barrierenintegrität, des Gefäßtonus und der neurovaskulären Kopplung anerkannt, statt als passiver metabolischer Auswerter¹. Die Störung des endothelialen NAD⁺ -Stoffwechsels wurde mit alternsassoziierter Blut-Hirn-Schranke (BBB)-Leckage und einer beeinträchtigten neurovaskulären Homöostase in Verbindung gebracht, was die Notwendigkeit von Methoden unterstreicht, die die endothelialen Stoffwechseldynamiken direkt im lebenden Hirngewebe^{auflösen können 2}.

Die meisten derzeit verwendeten Ansätze zur Quantifizierung von NAD⁺ basieren auf biochemischen Endpunktmessungen, fixierten Gewebefärbungen oder ex vivo Sensoranzeigen. Obwohl informativ, bewahren diese Ansätze keine intakte mikrovaskuläre Architektur, können schnelle Veränderungen innerhalb des Tieres über die Zeit nicht leicht unterscheiden und bieten bei Anwendung auf heterogenes Hirngewebe eine begrenzte Spezifität des Zelltyps. Im Gegensatz dazu ermöglicht die chronische Schädelfenster-Zweiphotonenbildgebung die wiederholte Visualisierung kortikaler Mikrogefäße bei lebenden Mäusen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung, was sie gut geeignet macht, metabolisch responsive Endothelsignale unter definierten physiologischen oder pharmakologischen Interventionen^{zu überwachen (3,4,5}).

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen End-to-End-Workflow für die Echtzeitüberwachung der endothelialen NAD^+-Dynamik im Gehirn in vivo bereitzustellen. Die Methode kombiniert systemische Abgabe eines endothelial-gezielten, verbesserten grün-fluoreszenten Proteins (eGFP)-basierten NAD^+-Sensors, verpackt im adenoassoziierten Virus (AAV)-X1.1 und gesteuert vom Cdh5-Promotor, einem stabilen 3 mm × 3 mm großen Schädelfenster für optischen Zugriff ^6,7,8, sowie eine zweiwellige Zwei-Photonen-Bildgebung mit einem intravaskulären Tetramethylrhodamin (TMR)–Dextran-Referenzkanal¹. Der Sensormechanismus wurde wie folgt klargestellt: Cambronne et al. LigA-cpVenus zytoplasmatischer NAD^+-Biosensor ist ein inverser Antwortsensor auf cpVenus. Die NAD^+-Bindung reduziert cpVenus/eGFP-ähnliche Fluoreszenz in der Standard-488-nm-Anregungsmessung, während ein 405-nm-Anregungskanal als Referenz für die ratiometrische Normalisierung dient. Daher sollte rohe grüne Fluoreszenz nicht als direktes positives Maß für die NAD^+-Konzentration interpretiert werden. In dieser Zwei-Photonen-Implementierung wird die 920-nm-Anregung verwendet, um das grüne Sensorkanalsignal zu erfassen, während die 1040-nm-Anregung für den TMR–dextran-vaskulären Referenzkanal verwendet wird; Daher entspricht die derzeitige 920/1040 nm-Erfassung nicht einer kalibrierten 488/405 nm-Ratiometriemessung. Der Biosensor von Cambronne et al. wurde ausgewählt, weil er umfassend validiert ist, um intrazelluläre NAD⁺-Dynamiken zu überwachen, und mit der aktuellen Doppelwellenlängen-Bildgebungskonfiguration kompatibel ist. Obwohl neuere Indikatoren wie FiNad alternative Ansätze zur Überwachung der NAD^+-Dynamik bieten, würde deren Implementierung eine Modifikation des derzeit für TMR–dextran verwendeten roten Fluoreszenzkanals erfordern. Der Cambronne-Sensor berichtet über relative Veränderungen der NAD^+-Verfügbarkeit innerhalb eines endlichen Dynamikbereichs und wurde in zellulären und subzellulären Anwendungen validiert; die Signalinterpretation kann jedoch durch Ausdrucksniveau, pH-Wert, Photobleaching und optische Pfadvariabilität beeinflusst werden, und die absolute NAD^+-Quantifizierung erfordert eine Kalibrierung oder orthogonale biochemische Validierung. AAV-X1.1 wurde ausgewählt, weil endothelial-tropische AAV-Varianten berichtet wurden, dass sie das zentrale Nervensystem effizient transduzieren ^6,7. In unserem vorläufigen Vergleich mehrerer AAV-Serotypen, darunter AAV9, AAV-BR1, AAV-HNO und AAV-X1.1, wobei CAG- oder Cdh5-getriebene verbesserte grüne fluoreszierende Proteinexpression als Reporter verwendet wurden, ergab AAV-X1.1 das günstigste vaskulär-assoziierte Expressionsmuster unter den getesteten Serotypen. Der Cdh5-Promotor wurde anschließend verwendet, um die Transgenexpression auf vaskuläre Endothelzellen weiter einzuschränken, was mit früheren Berichten übereinstimmt, die eine endothelialselektive Transgenexpression in vivo⁶ zeigten.

Im Vergleich zu ex vivo NAD^+-Tests erhält dieser Ansatz das intakte Gefäßnetz, ermöglicht longitudinale Messungen beim selben Tier und ermöglicht eine gleichzeitige Beurteilung der endothelialen Stoffwechselsignale sowie einer Gefäßlumenreferenz. Der Workflow ist besonders nützlich für Studien zu Alterung, entzündlichem Stress, BBB-Dysfunktion und schnellen Reaktionen auf metabolische Interventionen wie die Verabreichung von Nikotinamidmononukleotid (NMN) 9,10,11,12,13. Diese Methode ist am geeignetsten, wenn die experimentelle Frage wiederholte Visualisierung kortikaler Mikrogefäße bei lebenden Mäusen und relativer Veränderungen eines endothelialen Sensorkanalsignals erfordert. Sie ist weniger geeignet für die absolute NAD^+-Quantifizierung ohne zusätzliche ratiometrische Kalibrierung oder biochemische Validierung. Praktische Einschränkungen umfassen die kortikale optische Zugänglichkeit, bildgebende Tiefenbeschränkungen, die Abhängigkeit von einer erfolgreichen endothelialen AAV-Transduktion, potenzielle kraniale fensterassoziierte Entzündung und die Notwendigkeit eines zwei-photonen-Mikroskops mit zwei Wellenlängen. Chronische Schädelfenster-Einnistung kann lokale Entzündungen, vaskuläre Reaktivität, Gliose, Opazität oder Gewebeumbildung induzieren, die alle die Endothelphysiologie und Sensorkanalmessungen ^{beeinflussen können 1,3,4}. Um diese Störfaktoren zu minimieren, erfordert das Protokoll aseptische Operationen, intermittierendes Bohren mit häufigem Kühlen, sorgfältige Hämostase, das Vermeiden von adhäsiven Kontakten mit der Dura, postoperative Analgesie, tägliche Überwachung und Ausschluss von Tieren mit anhaltender Opazität, entzündlichen Ablagerungen, Infektionen, instabiler Gefäßmorphologie oder schlechter Signalstabilität der Ausgangslinien.

Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Animal Ethics Committee der University of Health and Rehabilitation Sciences im Rahmen des Projekts "Mechanistic Study of Metabolic Probe-Based Observation of Blood–Brain Barrier Integrity" (Zulassungsnummer KFDX: NR. 2023-1023) genehmigt. Führen Sie alle Operationen unter aseptischen Bedingungen durch und bieten Sie perioperative Analgesie sowie unterstützende Versorgung gemäß dem genehmigten Tierprotokoll an. Im repräsentativen Arbeitsablauf wird Buprenorphin-Hydrochlorid (0,05–0,1 mg/kg, subkutan) vor oder unmittelbar nach der Operation verabreicht und dann alle 8–12 Stunden für 24–48 Stunden bei Bedarf. Holen Sie Mäuse in einem erwärmten Käfig und überwachen Sie sie, bis normale Haltung, spontane Bewegung und stabile Atmung wiederhergestellt sind.

1. Experimenteller Überblick

1. Verwenden Sie erwachsene C57BL/6J-Mäuse im Alter von 10–12 Wochen und mit einem Gewicht von 23–25 g für die repräsentativen Experimente.
2. Pflegen Sie Mäuse unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen mit einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus, einer Umgebungstemperatur von 22°C–24°C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 40%–60% sowie ad-libitum-Zugang zu Nahrung und Wasser.
3. Gewöhnen Sie die Tiere mindestens 7 Tage vor den Eingriffen.
4. Verwenden Sie jedes Geschlecht entsprechend dem experimentellen Design. Geben Sie Geschlecht, Tierzahlen und Gruppenzuweisung für jedes Experiment an. Der hier gezeigte repräsentative Bilddatensatz verwendete N = 3 Mäuse.
5. Zuerst systemisches AAV verabreichen und vor der Bildgebung eine 3–4-wöchige Expression einplanen.
6. Führe eine Schädelfenster-Operation 3–5 Tage vor der Bildgebung durch.
7. Betäuben Sie Mäuse am Bildgebungstag, injizieren Sie TMR–Dextran intravenös und führen die Bildgebung nach ausreichender Tracer-Zirkulation durch.
8. Verabreichen Sie NMN gemäß dem gewählten Interventionsplan. Bieten Sie 5 Tage vor der Bildgebung eine Trinkwassersupplementierung bereit, führen Sie im vordefinierten Abstand vor der Bildgebenden Aufnahme orale Gavage durch oder verabreichen Sie während der Bildgebenden Sitzung nach der Baseline-Aufnahme intravenöses NMN.
   HINWEIS: Pausieren Sie das Protokoll nach der AAV-Verabreichung während der 3–4-wöchigen Ausdrucksphase und halten Sie die Tiere unter routinemäßiger Gesundheitsüberwachung und unter standardisierten Unterhaltungsbedingungen. Pausieren Sie das Protokoll nach einer Schädelfensteroperation während der 3–5-tägigen Erholungsphase. Bevor Sie mit der Bildgebung beginnen, sollten Sie ein stabiles Körpergewicht, eine normale Pflege und Aktivität, das Fehlen einer Infektion oder übermäßige Entzündung sowie ein klares Schädelfenster bestätigen.

2. Schädelfenster-Chirurgie für longitudinale kortikale Bildgebung

1. Präoperative Vorbereitung
   1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente und legen Sie vor der Einleitung der Anästhesie ein steriles Feld her.
   2. Stellen Sie das homöotherme Heizsystem so ein, dass es die Körpertemperatur bei 36,5 °C bis 37,5 °C hält, vorzugsweise mit einem rektalen Sonden-Rückkopplungsregler.
   3. Bereiten Sie Atemwegsüberwachungsgeräte vor und bestätigen Sie vor der Operation eine stabile Operation.
   4. Bereiten Sie vor Beginn des Eingriffs sterile Kochsalzlösung, saugfähige Abstriche, hämostatische Materialien, einen sterilen Glasdeckel Nr. 1,5, eine Metallkopfplatte und Zahnklement vor.
   5. Verwenden Sie einen sterilen No. 1,5 Glasdeckel, um das 3 mm × 3 mm große Schädelfenster vollständig abzudecken und bündig am Schädelrand zu sitzen.
   6. Bereiten Sie einen Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer vor, der mit einem 0,5–1,0 mm Gratkorn ausgestattet ist.
   7. Betreiben Sie den Bohrer mit etwa der Hälfte der Höchstgeschwindigkeit und stellen Sie sicher, dass während der Schädelausdünnung sofort eine sterile Kochsalzlösungsbewässerung angewendet werden kann.
   8. Tragen Sie beim Bohren sterile Kochsalzlösung bei Raumtemperatur mit einem Wattestäbchen oder Tropfen auf, um den Schädel zu kühlen und Knochenstaub zu entfernen.
2. Anästhesie, Kopfhautvorbereitung und Schädelfreilegung
   1. Betäuben Sie Mäuse mit frisch zubereiteter Avertin-Arbeitslösung (1,25 %, 12,5 mg/ml) durch intraperitoneale Injektion bei 200–250 mg/kg.
      1. Bereiten Sie die Avertin-Arbeitslösung aus 2,2,2-Tribromoethanol und 2-Methyl-2-Butanol gemäß institutionellen Betriebsvorschriften vor, schützen Sie die Lösung vor Licht und verwerfen Sie Präparate mit Niederschlag oder Verfärbung.
   2. Bestätigen Sie eine stabile chirurgische Ebene durch Verlust des Pedalrückzugsreflexes und stabiler Atmung.
   3. Tragen Sie unmittelbar nach der Einleitung der Anästhesie eine Augensalbe auf beide Augen auf.
   4. Wenn Inhalationsanästhesie verwendet wird, wird eine Anästhesie mit 3%–4% Isofluran induziert.
   5. Halten Sie eine Anästhesie mit 1 %–2 % Isofluran im Sauerstoff bei 0,5–1,0 L/min und passen Sie sie entsprechend Atmung und Reflexen an.
      VORSICHT: Behandeln Sie Anästhetika gemäß den institutionellen Sicherheitsvorschriften und verwenden Sie geeignete Säuberungssysteme bei der Verabreichung der Inhalationsanästhesie.
   6. Fixiere die Maus in einem stereotaxischen Rahmen oder in einen speziellen Kopfhalter, der stabilen Zugang zum dorsalen Schädel bietet.
   7. Halten Sie die Körpertemperatur bei 36,5°C–37,5°C mit einem rückkopplungsgesteuerten Heizkissen und einer rektalen Sonde, wenn verfügbar.
   8. Rasieren Sie die Kopfhaut und entfernen Sie lose Haare vom Operationsfeld.
   9. Desinfizieren Sie die Kopfhaut mit wechselnder Povidon-Jod- oder Iodphorlösung und 70 % Ethanol für drei Zyklen.
   10. Vermeiden Sie es, Desinfektionsmittel in die Augen oder die Schädelöffnung zu lassen.
   11. Mache einen Schnitt auf der Kopfhaut in der Mitte und ziehe die Haut sanft zurück.
   12. Den Schädel ausreichend freilegen, um sowohl die Schädelfensterbildung als auch die Fixierung der Kopfplatte zu ermöglichen.
   13. Entfernen Sie das Periost und das verbliebene Bindegewebe mit einer feinen Pinzette oder einer Skalpellklinge.
   14. Trocknen Sie den Schädel vorsichtig mit sterilen Wattestäbchen für etwa 10–20 Sekunden, bis die Oberfläche matt statt nass erscheint.
   15. Vermeiden Sie eine übermäßige Dehydrierung des freiliegenden Gewebes.
3. Markierung einer 3 mm × 3 mm Kraniotomie
   1. Identifizieren Sie Bregma und Lambda unter dem chirurgischen Mikroskop.
   2. Nutzen Sie diese anatomischen Orientierungspunkte, um die Mittellinie und die Zielregion der Kortikale zu orientieren.
   3. Markieren Sie ein 3 mm × 3 mm großes Quadrat über einer Hemisphäre des dorsalen somatosensorischen Kortex.
   4. Positioniere die vordere Kante etwa 0,5 mm hinter dem Bregma und die mediale Kante etwa 1,0 mm lateral zur Mittellinie.
   5. Vermeiden Sie wann immer möglich große Schädelnähte und große Oberflächengefäße.
4. Bohren und Knochenklappenentfernung
   1. Verdünnen Sie den Schädel entlang des markierten Randes mit intermittierendem Bohrkontakt statt kontinuierlichem Druck.
   2. Tragen Sie während des Bohrens wiederholt sterile Kochsalzlösung auf, um thermische Schäden zu vermeiden.
   3. Geben Sie pro Anwendung etwa 20–50 μL sterile Kochsalzlösung oder ausreichend, um die Schädeloberfläche feucht und kühl zu halten.
   4. Wiederholen Sie die Bewässerung alle 10–20 Sekunden oder wenn sich Knochenstaub ansammelt oder Wärmeansammlung vermutet wird.
   5. Verdünnen Sie weiter, bis der Knochen gleichmäßig durchsichtig und leicht flexibel ist.
   6. Überprüfen Sie eine ausreichende Ausdünnung durch Beobachtung sichtbarer duraler Gefäße, erhaltener Duralpulsation und fehlender kortikaler Kompression oder thermischer Verfärbung.
   7. Hören Sie sofort auf zu bohren, wenn übermäßige Hitzeansammlung, Blutungen oder verminderte durale Pulsation auftritt.
   8. Bewässern Sie den Bereich und bewerten Sie den Bereich erneut, bevor Sie fortfahren.
   9. Heben Sie die Knochenlappe vorsichtig von einer Ecke mit einer feinen Pinzette oder einer Nadelspitze an.
   10. Verdünne den Umfang erneut, falls Widerstand besteht.
   11. Bewahren Sie die Dura während der Knochenlappenentfernung intakt.
   12. Spülen Sie Knochenstaub mit steriler Kochsalzlösung ab.
   13. Kontrolliere leichte Blutungen mit sanfter Kochsalzlösungsspülung und absorbierenden Abstrichen.
   14. Halten Sie die Blutung als akzeptabel an, wenn sie innerhalb von 1–2 Minuten nach Spülung und Kontakt mit Absorptionsabstrich abklingt.
   15. Schließen Sie das Tier aus oder beenden Sie den Eingriff, wenn die Blutung länger als etwa 5 Minuten anhält.
   16. Schließen Sie das Tier aus oder beenden Sie den Eingriff, wenn die Dura gerissen ist, eine kortikale Kompression auftritt oder Blut den Bildgebungsbereich verdeckt.
       HINWEIS: Der Eingriff kann nach vollständiger Hämostase und vor dem Einsetzen der Deckung vorübergehend unterbrochen werden. Halten Sie die freiliegende Dura in feuchtem Zustand mit steriler Kochsalzlösung und setzen Sie erst wieder auf, nachdem keine aktive Blutung bestätigt ist.
5. Fensterabdichtung und Fixierung der Kopfplatte
   1. Bestätigen Sie, dass die freiliegende Dura sauber, feucht und frei von aktiven Blutungen ist.
   2. Legen Sie einen sterilen Deckdeckel über die Kraniotomie.
   3. Positioniere den Deckmantel am Schädelrand, der die Kraniotomie umgibt, ohne die Dura zu komprimieren.
   4. Überprüfen Sie die korrekte Positionierung, indem Sie eine bündige Deckungsoberfläche, das Fehlen von eingeschlossenen Luftblasen, erhaltene durale Pulsation und einen klaren optischen Weg bestätigen.
   5. Bereiten Sie Zahnkleber oder Super-Bond C&B-Kleber gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
      1. Für die repräsentative Super-Bond C&B-Zubereitung mischen Sie 1 Löffel Pulver mit 1 Tropfen Katalysator und 4 Tropfen Monomer in einer vorgekühlten keramischen Schelle, die unmittelbar vor der Anwendung bei etwa −20°C gehalten wird.
   6. Kleber nur um den äußeren Schädelrand rund um den Deckdeckel auftragen.
   7. Vermeiden Sie Klebstoffkontakt mit der Dura und vermeiden Sie Kapillardochtrücken unter dem Glas.
   8. Lass den Klebstoff bei Raumtemperatur etwa 5–10 Minuten aushärten.
      VORSICHT: Zahnbeton und Klebstoffkomponenten können flüchtige oder reizende Chemikalien enthalten. Behandeln Sie sie gemäß institutionellen Sicherheitsvorschriften und verwenden Sie eine angemessene Belüftung.
   9. Positioniere eine maßgefertigte Titan-Kopfplatte um das Schädelfenster.
   10. Verwenden Sie eine Kopfplatte mit einer etwa 10 mm zentralen Öffnung, die mit dem Bildbehälter kompatibel ist.
   11. Zentriert das Schädelfenster innerhalb der Kopfplattenöffnung.
   12. Tragen Sie Zahnkleber nur auf Schädelkontaktbereiche außerhalb des optischen Fensters auf.
   13. Lassen Sie den Zement etwa 5–10 Minuten vollständig aushärten, bevor Sie das Tier bewegen.
6. Postoperative Erholung und Qualitätskontrolle der Fenster
   1. Verabreichen Sie postoperative Analgesie gemäß dem genehmigten Tierprotokoll.
   2. Im repräsentativen Arbeitsablauf wird Buprenorphinhydrochlorid mit 0,05–0,1 mg/kg subkutan alle 8–12 Stunden für 24–48 Stunden verabreicht.
   3. Holen Sie Mäuse in einem erwärmten Käfig.
   4. Überwachen Sie täglich Atmung, Haltung, Bewegung, Pflege und Körpergewicht.
   5. Akzeptieren Sie Schädelfenster mit transparenter Glasoberfläche, sichtbarer kortikaler Gefäße, intakter Dura, minimalem Restblut, keinem Klebstoff unter dem Deckzettel, keine Infektion und stabiler Fixierung der Kopfplatte.
   6. Tiere mit ausgeprägter Opazität, anhaltenden Blutungen, entzündlichen Abfällen, Infektionen, Fensterverschiebung, starkem Gewichtsverlust (>15 %) oder schlechter Pflege und Aktivität werden ausgeschlossen.
   7. Nach 3–5 Tagen Genesung wird die Bildgebung durchgeführt.
   8. Bestätigen Sie normale Aktivität, normales Pflegeverhalten, stabiles Körpergewicht, fehlende Schmerzen oder Infektionen und ein transparentes Schädelfenster mit deutlich sichtbaren Gefäßen vor der Bildgebung.
      HINWEIS: Das Protokoll kann während der postoperativen Erholungsphase pausiert werden. Pflegen Sie Mäuse unter normalen Unterbringungsbedingungen, überwachen Sie täglich das Körpergewicht und die Fensterklarheit und nehmen Sie die Bildgebung erst wieder auf, wenn alle Genesungskriterien erfüllt sind.

3. AAV-vermittelte endotheliale NAD⁺ -Sensorexpression

1. Virale Konstruktion und Vorbereitung
   1. Verwenden Sie einen eGFP/cpVenus-basierten, genetisch codierten NAD⁺ -Biosensor, der vom endothelialen Cdh5-Promotor angetrieben wird.
   2. Verwenden Sie Cambronne et al. LigA-cpVenus zytoplasmatische NAD^+- Biosensorsequenz (zum Beispiel Addgene-Plasmid #186787 oder ein gleichwertiger, sequenzverifizierter Insert).
   3. Klonen Sie den Cdh5-Promotor stromaufwärts der NAD^+- Biosensor-Codingsequenz mithilfe des CV232-Vektor-Backbones.
   4. Verpacken Sie die Expression-Kassette in das AAV-X1.1-Kapsid als maßgeschneiderte virale Präparate.
      1. Erfassen Sie den Anbieter der Virusproduktion, die Reinigungsmethode, die Quantifizierungsmethode des Virusgenoms, die Produktionslotnummer und das Analysezertifikat für jede AAV-Präparat.
   5. Erfassen Sie die Plasmidkarte, die Ergebnisse der Sequenzverifikation, Informationen zur Virusproduktion, Reinigungsinformationen, den Virus-Genom-Titer und das Analysezertifikat für jede virale Präparat.
      1. Protokollieren Sie die Konstruktkarte, den Sequenzverifizierungsbericht, die Batchnummer der viralen Produktion, den Quantitativen Polymerase-Kettenreaktionsbericht (qPCR), die Reinigungsdokumentation und das Analysezertifikat für jede in der Studie verwendete Viralpräparat.
   6. Siehe die Materialtabelle für alle Konstruktdetails.
   7. Verwenden Sie High-Titer AAV-Präparate mit lot-spezifischen qPCR-Titern, typischerweise mehr als 2 × 10¹³ vg/mL.
   8. Einweg-Aliquots bei −80°C aufbewahren.
   9. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen.
   10. Erfassen Sie die Produktionscharge, den qPCR-Titer, die Speicherdauer und die zulässige Los-zu-Los-Variation vor der Nutzung.
2. Systemische AAV-Verwaltung
   1. Einen viralen Aliquot auf Eis auftauen.
   2. Verdünnen Sie das Virus in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf ein finales Injektionsvolumen von 100–200 μL pro Maus.
   3. Halten Sie eine Enddosis von 2 ×^10-12 vg pro Maus bei Tieren ein.
      1. Berechnen Sie das Injektionsvolumen aus dem lot-spezifischen viralen Genom-Titer. Für die repräsentative Präparation mit einem qPCR-Titer von 1,39 × 10¹³ vg/mL injizieren Sie etwa 144 μL, um eine Dosis von 2 × 10¹² vg pro Maus zu liefern.
   4. Das Virus wird durch eine retro-orbitale venöse Sinusinjektion mit einer sterilen 29-G-Insulinspritze abgegeben.
   5. Injizieren Sie die virale Suspension langsam über etwa 10–20 Sekunden.
   6. Bestätigen Sie die erfolgreiche Geburt, indem Sie das Fehlen von Leckage, übermäßigen Blutungen und Augenschäden überprüfen.
   7. Validieren und melden Sie jede alternative Verwaltungsmöglichkeit separat.
   8. Beobachten Sie die Maus, bis die normale Haltung und spontane Bewegung wiederhergestellt sind.
   9. Bestätigen Sie stabile Atmung und das Ausbleiben von Blutungen oder Beschwerden.
   10. Bringen Sie das Tier erst nach vollständiger Genesung in seinen Stammkäfig zurück.
   11. Planen Sie 21–28 Tage für die Sensorexpression vor der Bildgebung ein.
   12. Halten Sie innerhalb jedes Vergleichssets ein konsistentes Ausdrucksintervall bei.
   13. Validieren Sie Expressionsintervalle außerhalb des 21–28-Tage-Bereichs separat.
       HINWEIS: Das Protokoll kann während der AAV-Ausdrucksphase pausiert werden. Führen Sie regelmäßige Haltung und Gesundheitsüberwachung durch und beginnen Sie erst mit einer Schädelfenster-Operation, wenn das geplante Ausdrucksintervall abgelaufen ist und das Tier gesund bleibt.
3. Validierung der Endothelrestriktion
   1. Tiere vor der formellen Datenerhebung überprüfen.
   2. Akzeptieren Sie Tiere, wenn das grüne Sensorkanalsignal nachweisbar ist und dem Gefäßnetz folgt.
   3. Bestätigen Sie, dass das Signal entlang der Gefäßwände neben dem TMR–dextran–positiven Lumen angereichert ist.
   4. Bestätigen Sie das Fehlen dominanter diffuser parenchymaler Fluoreszenz.
   5. Gleiche Akzeptanzkriterien in allen experimentellen Gruppen anwenden.
   6. Perfuser-Mäuse mit PBS, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd, wenn eine Post-hoc-Validierung erforderlich ist.
   7. Sammeln Sie das Gehirn und bereiten Sie 30–40 μm koronale oder sagittale Schnitte vor.
   8. Färbungen mit Endothelmarkern wie Tomatenlektin, CD31 oder vaskulärem endothelialem Cadherin (VE-Cadherin).
      1. Erfassen Sie die Antikörperquelle, Katalognummer, Chargennummer, Wirtsart, Verdünnung, Inkubationsbedingungen und Nachweismethode für jedes Validierungsexperiment.
   9. Bewerten Sie bei Bedarf die Expression von Nikotinamidphosphoribosyltransferase (NAMPT) und Poly(ADP-ribose) Polymerase 1 (PARP1).
   10. Verwenden Sie primäre Antikörperverdünnungen, die für die Gewebevorbereitung optimiert sind.
   11. Erfassen Sie Fluoreszenz- oder konfokale Bilder mit identischen Aufnahmeeinstellungen in verschiedenen Gruppen.
   12. Quantifizieren Sie Kolokalisierung als den Anteil des sensorpositiven Signals, der mit oder unmittelbar angrenzend an gefäßmarker-positive Regionen liegt.
   13. Tiere werden ausgeschlossen, wenn sich das größte wahrnehmbare Signal außerhalb der Gefäßstrukturen befindet.
   14. Tiere sollten ausgeschlossen werden, wenn die Behälterwandanreicherung fehlt.
   15. Tiere werden ausgeschlossen, wenn eine abweichende parenchymale Fluoreszenz eine zuverlässige Auswahl des Interessensbereichs verhindert.
   16. Tiere werden ausgeschlossen, wenn die Sensorkanalfluoreszenz während der Baseline-Erfassung gesättigt oder instabil ist.

4. Zwei-Photonen-Bildgebung und quantitative Analyse

1. Bildgebungstagsvorbereitung und intravaskuläre Referenzkennzeichnung
   1. Betäuben Sie Mäuse mit frisch zubereiteter Avertin-Arbeitslösung (1,25 %, 12,5 mg/mL) durch intraperitoneale Injektion bei 200–250 mg/kg oder verwenden Sie das vom institutionellen Tierprotokoll genehmigte Anästhesieregime.
   2. Bestätigen Sie eine stabile chirurgische Ebene durch Verlust des Pedalrückzugs und stabile Atmung.
   3. Tragen Sie sofort nach der Einleitung eine Augensalbe auf.
   4. Wenn Inhalationsanästhesie verwendet wird, wird eine Anästhesie mit 3%–4% Isofluran induziert.
   5. Halten Sie eine Anästhesie mit 1 %–2 % Isofluran im Sauerstoff bei 0,5–1,0 L/min und passen Sie sie entsprechend Atmung und Reflexen an.
   6. Bereiten Sie 70 kDa TMR-Dextran in sterilem PBS mit 10–25 mg/ml vor.
   7. Schützen Sie die TMR–dextran-Lösung vor Licht und filtern Sie die Lösung, falls es die institutionelle Praxis vorschreibt.
   8. TMR-Dextran intravenös mit 20 mg/kg injizieren.
   9. Passen Sie das Einspritzvolumen entsprechend der Lagerkonzentration an. Für eine 25-g-Maus verabreichen Sie etwa 0,5 mg Gesamtfarbemittel.
   10. Bereiten Sie den Tracer frisch vor oder lagern Sie Aliquots nach den Empfehlungen des Herstellers lichtgeschützt.
   11. Lassen Sie TMR–dextran 5–10 Minuten vor der Bildaufnahme zirkulieren.
2. Mikroskopkonfiguration
   1. Verwenden Sie ein Zwei-Photonen-Mikroskop mit zwei Wellenlängen, das für eine 920-nm-Anregung des eGFP-basierten Sensorkanals konfiguriert ist.
   2. Verwenden Sie einen 1040-nm-Anregungspfad für den TMR–dextran vaskulären Referenzkanal.
   3. Die repräsentative Bildgebung wurde mit einem Nikon A1 MP/A1R MP+ Multiphotonenmikroskop durchgeführt, das von der NIS-Elements AR/AR-Analyse-Software gesteuert wurde (Version 5.42.06).
   4. Zeichnen Sie die Laserquellen, Pulsparameter, Strahlkombinationskonfiguration, Detektortyp und Softwareversion für jedes Bildgebungssystem auf.
   5. Detektionskanäle so konfigurieren, dass das Sensorkanalsignal vom TMR–dextran-Signal getrennt wird.
   6. Verwenden Sie nicht abgescannte Photomultiplier-Röhren (PMT) oder Galliumarsenidphosfiddetektoren (GaAsP).
   7. Sammeln Sie grüne Sensorkanalemissionen zwischen etwa 500 und 550 nm.
   8. Erfassung von TMR–Dextran-Emissionen zwischen etwa 570 und 650 nm.
      1. Im repräsentativen Datensatz wird die grüne Sensorkanal-Emission mit einem 525/50-nm-Emissionsfilter erfasst und die TMR–dextran-Emission mit einem 575/25 nm- oder 610/75-nm-Emissionsfilter erfasst.
   9. Minimieren Sie das spektrale Durchfließen zwischen den Kanälen.
   10. Halten Sie die Detektorverstärkungs- und Versatzeinstellungen innerhalb jedes Vergleichssets konstant.
   11. Überprüfen Sie die Kanaltrennung mit Einzelkanalsteuerungen, wenn verfügbar.
   12. Verwenden Sie ein Nikon CFI75 Apochromat 25XC W 1300 Wasserimmersionsobjektiv oder ein gleichwertiges Objektiv (25×, numerische Blendenöffnung 1,10, Arbeitsabstand 2,0 mm).
   13. Bestätigen Sie die Kanal-Koregistrierung anhand fester vaskulärer Orientierungsmerkmale wie Bifurkationen und Lumenkanten.
   14. Wiederholen Sie die Ko-Registrierung nach jeder Anpassung des optischen Pfades.
   15. Misse die Laserleistung an der Probenebene vor der Bildgebung.
   16. Halten Sie innerhalb jedes Vergleichssets eine Laserleistungskonstante von 920 nm.
   17. Halten Sie innerhalb jedes Vergleichssets eine Laserleistungskonstante von 1040 nm.
   18. Verwenden Sie etwa 10–20 mW bei 920 nm und 8–18 mW bei 1040 nm als repräsentative Arbeitsbereiche.
   19. Passen Sie die Laserleistung entsprechend der Bildtiefe und der Qualität des Schädelfensters an.
   20. Felder mit mehr als 20 % Signalverlust während der 120-Sekunden-Basisperiode ausgeschlossen.
   21. Felder mit sichtbaren phototoxischen Veränderungen werden ausgeschlossen.
3. Erwerbungseinstellungen
   1. Wählen Sie Sichtfelder mit einem klaren optischen Fenster, scharf fokussierten Mikrogefäßen und minimaler Bewegung.
   2. Akzeptieren Sie Fenster mit transparentem Deckzettel, sichtbarer kortikaler Gefäße, intakte Dura, minimales Restblut, keinen Klebstoff unter dem Deckblatt, keine Infektion und stabile Fixierung der Kopfplatte.
   3. Tiere mit ausgeprägter Opazität, anhaltenden Blutungen, entzündlichen Ablagerungen, Infektionen, Fensterverschiebung, starkem Gewichtsverlust (>15 %) oder schlechter Pflege/Aktivität ausgeschlossen.
   4. Nehmen Sie Zeitrafferbilder bei 512 × 512 Pixeln auf.
   5. Nehmen Sie repräsentative Standbilder mit 1024 × 1024 Pixeln auf, wenn höhere räumliche Details erforderlich sind.
   6. Halte innerhalb jedes Vergleichssets Pixelgröße, Zoom, Scangeschwindigkeit und Sichtfeldkonstante bei.
   7. Erfassen Sie Z-Stacks mit einer Schrittweite von 1–3 μm.
   8. Bilde kortikale Mikrogefäße in Tiefen von etwa 200–250 μm unter der Pialoberfläche.
   9. Erweitern Sie die Bildtiefe auf etwa 400 μm, wenn die Fensterqualität es zulässt.
   10. Halten Sie die Bildtiefen-Konstante für gepaarte Vergleiche.
   11. Erreichen Sie einen 120-Sekunden-Ausgangswert in 1-Sekunden-Intervallen vor akuten Eingriffen.
   12. Die Aufnahme wird für den vordefinierten Zeitraum nach der Intervention fortgesetzt.
   13. Zeichnen Sie intravenöse NMN-Reaktionen etwa 10–30 Minuten nach der Injektion auf.
   14. Beziehen Sie Trinkwasser- und Oral-Gavage-Datensätze an vordefinierten experimentellen Endpunkten.
   15. Behalten Sie in allen Vergleichsgruppen identische Erwerbseinstellungen bei.
4. NMN-Intervention (Anwendungsbeispiel)
   1. Löse NMN in sterilem Trinkwasser auf.
   2. Stellen Sie die NMN-Konzentration so an, dass sie etwa 100 mg/kg/Tag abliefert.
   3. Schützen Sie die Trinkflasche vor Licht.
   4. Ersetzen Sie NMN-haltiges Trinkwasser alle 24–48 Stunden.
   5. Überwachen Sie den Wasserverbrauch mithilfe von Flaschengewichtsmessungen.
   6. Berechnen Sie die geschätzte NMN-Aufnahme anhand des Wasserverbrauchs und Körpergewichts.
   7. Setzen Sie die Supplementierung 5 Tage vor der Bildgebenden fort.
   8. Bereite NMN mit 1 mg/ml für orale Gavage vor.
   9. Geben Sie 200 μL pro Maus mit einer 20G, 38 mm abgerundeten Gavage-Nadel.
   10. Führe Bildgebung 30–60 Minuten nach der Gavage durch.
   11. Bereiten Sie NMN mit 1 mg/mL für die intravenöse Abgabe vor.
   12. Injizieren Sie 100 μL pro Maus durch den retro-orbitalen venösen Sinus oder die Schwanzvene.
   13. Die Injektion wird langsam über 10–20 Sekunden abgegeben.
   14. Beginnen Sie sofort mit der Bildgebenden oder innerhalb von 5 Minuten nach der Injektion.
   15. Sammeln Sie nach 5 Tagen Nahrungsergänzung Trinkwasserdatensätze.
   16. Erfassen Sie Oral-Gavage-Datensätze zu einem festen Zeitpunkt nach der Gavage.
   17. Erfassen Sie unmittelbar vor der intravenösen Injektion einen Ausgangswert.
   18. Zeichnen Sie die akuten Reaktionen etwa 10–30 Minuten nach der intravenösen Injektion auf.
5. Bildverarbeitung und Signalextraktion
   1. Führen Sie eine Bewegungskorrektur durch, wenn Bewegungsartefakte vorhanden sind.
   2. Verwenden Sie Fiji/ImageJ (Version 1.8.0 oder neuer) mit StackReg, TurboReg oder einem entsprechenden Rigid-Body-Registrierungsalgorithmus.
   3. Verwenden Sie Gefäßmarkierungen im TMR–Dextran-Kanal zur Orientierung der Registrierung.
   4. Akzeptieren Sie Datensätze nur, wenn die Restverschiebung nach der Korrektur weniger als etwa 1–2 Pixel beträgt.
   5. Bestätigen Sie, dass die Grenzen der Gefäßregion von Interesse (ROI) während der gesamten Übernahme stabil bleiben.
   6. Verwenden Sie den TMR–Dextran-Kanal, um Gefäßlumen zu segmentieren.
   7. Definiere endotheliale ROIs, die unmittelbar an das Lumen angrenzen.
   8. Wählen Sie Mikrogefäße mit stabiler Lumen-Markierung, minimaler Bewegung und sichtbarem Sensorkanalsignal aus.
   9. Untersuchen Sie Gefäßdurchmesser von etwa 5–80 μm.
   10. Definieren Sie endotheliale ROIs als gefäßwandassoziierte Regionen, die etwa 2–5 μm breit sind.
   11. Analysieren Sie 3–5 Schiffe pro Sichtfeld, wenn verfügbar.
   12. Analysieren Sie 1–3 Sichtfelder pro Maus, wenn verfügbar.
   13. Definieren Sie Hintergrund-ROIs in Geweberegionen ohne Tracer- und Sensorsignale.
   14. Platzieren Sie Hintergrund-ROIs mindestens 20 μm von den analysierten Gefäßen und Bildartefakten entfernt.
   15. Subtrahiere die mittlere Hintergrundintensität von jedem Kanal vor der Normalisierung.
   16. Wenden Sie dieselbe Hintergrund-Subtraktionsstrategie auf alle Proben an.
   17. Extrahiere Zeitreihen-Mittelintensitätswerte für F_sensor(t).
   18. Extrahiere Zeitreihen-Mittelintensitätswerte für F_ref(t).
   19. Führen Sie Messungen mit NIS-Elements AR/AR-Analyse oder Fiji/ImageJ durch.
   20. Exportiere RAW-Bilddateien als ND2-Dateien.
   21. Exportiere Analysekopien als 16-Bit-TIFF-Stacks, wenn möglich.
   22. Exportiere ROI-Zeitreihendaten als CSV-Dateien.
   23. Berechnen Sie hintergrundsubtrahierte Fluoreszenzwerte vor der Normalisierung.
   24. Berechnen Sie ΔF/F₀ mit ΔF/F₀ = (F(t) − F₀)/F₀.
   25. Definiere F₀ als das mittlere Signal während der 120-Sekunden-Basisphase.
   26. Berechnen Sie die vaskuläre Referenznormalisierung als F_sensor(t)/F_ref(t).
   27. Berichte über Peak-Veränderung, Zeit-zu-Peak, Fläche unter der Kurve und Erholungskinetik, wenn die Erwerbsdauer es erlaubt.
   28. Interpretieren Sie das 920-nm-Sensor-Kanalsignal nicht als kalibrierte NAD⁺ -Konzentration.
   29. Führen Sie zusätzliche ratiometrische Kalibrierung oder biochemische Validierung durch, wenn quantitative NAD^+- Messungen erforderlich sind.
6. Statistik und Berichterstattung
   1. Definiere die Maus als die biologische experimentelle Einheit.
   2. Durchschnittliche Messungen auf Gefäßniveau innerhalb jeder Maus vor der Analyse auf Gruppenebene oder Anwendung eines verschachtelten statistischen Modells.
   3. Verwenden Sie gepaarte zweiseitige t-Tests für normal verteilte In-Maus-Vergleiche.
   4. Verwenden Sie Wilcoxon-Matched-Pairs-Tests mit Vorzeichenrang, wenn die Normalitätsannahmen nicht erfüllt sind.
   5. Verwenden Sie wiederholte, ANOVA oder Mixed-Effects-Modelle für Analysen, die mehr als zwei verwandte Bedingungen umfassen.
   6. Wenden Sie entsprechende Mehrfachvergleichskorrekturen an.
   7. Führen Sie statistische Analysen mit GraphPad Prism oder ähnlicher Software durch.
   8. Definiere die statistische Signifikanz als p < 0,05.
   9. Geben Sie in jeder Abbildung den genauen statistischen Test an.
   10. Code Bilddateien vor ROI-Auswahl und Quantifizierung, wann immer möglich.
   11. Halten Sie die Analysten-Blinding aufrecht, bis ROI-Messungen und Qualitätskontrollentscheidungen abgeschlossen sind.
   12. Verwenden Sie N = 3 Mäuse als biologische experimentelle Einheit im repräsentativen Datensatz.
       HINWEIS: Pausieren Sie die Bildaufnahme während aktiver Zeitrafferaufnahmen nicht. Bildverarbeitung und quantitative Analyse können nach dem Export der Rohdaten pausiert werden. Speichere ND2-Dateien, TIFF-Analysedateien, ROI-Dateien, Metadaten und CSV-Messtabellen in einem gesicherten Archiv. Zeichnen Sie die Laserleistung, Detektoreinstellungen, Bildtiefe, Tiererkennung, Behandlungszuweisung und Ausschlussentscheidungen für jede Bildaufnahmesitzung auf.

Ergebnisse

Eine erfolgreiche Vorbereitung ergibt ein transparentes und mechanisch stabiles Schädelfenster, das für die Längsbildgebung geeignet ist. Abbildung 1A fasst den Verfahrensablauf von der Anästhesie und Schädelexposition über Kraniotomie bis hin zur Platzierung des Decklings, der Fixierung der Kopfplatte und der postoperativen Erholung zusammen. Abbildung 1B zeigt repräsentative Serienfotos der wichtigsten chirurgischen Schritte. ...

Diskussion

Dieses Protokoll bietet einen End-to-End-Workflow zur Überwachung des endothelialen NAD^+- Stoffwechsels im Gehirn in vivo. Wichtige Erfolgsfaktoren sind: (i) Fensterklarheit und Stabilität, einschließlich der Minimierung von thermischen Schäden und der Kontrolle von Blutungen während des Bohrens; (ii) Endothelspezifität und angemessene Sensorexpression, die durch angemessene Auswahl des AAV-Kapsids, des Promotors, der Dosis und des Expressionsintervalls erreicht werde...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	VORSICHT: Giftiger/schädlicher Chemikalie. Wird verwendet, um die Avertin-Anästhesielösung für die Kranialfenster-Chirurgie herzustellen. Typische Arbeitslösung: 1,25 % (12,5 mg/ml), intraperitoneal verabreicht bei 200–250 mg/kg.
2-Methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	VORSICHT: Giftiger/schädlicher Chemikalie. Lösungsmittel zur Herstellung der konzentrierten Avertin-Stammlösung. Vor Licht schützen und Zubereitungen, die Ausfällungen oder Verfärbungen aufweisen, entsorgen.
Absorbente Tupfer	Winner Medical	Sterile medizinische Wattestäbchen	Verwendet für Hämostase, Trocknung des Schädels, Spülung und Aufrechterhaltung des Operationsfeldes.
AAV-X1.1-Cdh5-zytoplasmatischer NAD+ Biosensor-SV40 pA	Shanghai GeneChem Co., Ltd.; Addgene-Quellen für Plasmide	GeneChem-Konstrukt GCPV5052075; Addgene #186787; Addgene #196836	Endothel-gezielter NAD+ Biosensor, verpackt in AAV-X1.1. Expressionskassette: Cdh5-Promotor-zytoplasmatischer NAD+ Biosensor-SV40 Poly(A). Repräsentative Injektionsdosis: 2 × 1012 vg/Maus. Aliquote bei –80 °C lagern und wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. Notieren Sie das Chargen-spezifische qPCR-Titer, die Chargennummer, das Plasmid-Map, die Sequenzverifizierung und das Analysezertifikat.
Analgetikum (Buprenorphinhydrochlorid)	MCE	HY-B0071	Perioperative und postoperative Analgesie. Repräsentative Dosis: 0,05–0,1 mg/kg subkutan alle 8–12 h für 24–48 h.
Anästhesie-Verabreichungssystem	RWD Life Science	R500 mit R580 Verdampfer	Verwendet für die Isofluran-Verabreichung während der Bildgebung. Typischer Sauerstoffstrom: 0,5–1,0 l/min.
Anästhetikum (Isofluran)	RWD Life Science	R510-22 Serie	Verwendet für die Bildgebungsanästhesie. Typische Einstellungen: 3–4 % Induktion und 1–2 % Erhaltung.
Deckgläschen	Eigenherstellung	Keine Katalognummer	Steriles Glasdeckgläschen Nr. 1,5, das ein 3 × 3 mm großes Kranialfenster vollständig bedeckt und flach auf dem Schädelrand aufliegt.
Zahnzement/Klebstoff	Sun Medical	Super-Bond C&B; VZB/JAP8147	Verwendet für die Abdichtung des Kranialfensters und die Befestigung der Titan-Kopfplatte. Repräsentative Zubereitung: 1 Löffel Pulver, 1 Tropfen Katalysator und 4 Tropfen Monomer. Etwa 5–10 min bei Raumtemperatur aushärten.
Zahnbohrer	RWD Life Science	78001 Mikrobohrer	Hochgeschwindigkeitsbohrer, der zum Schädelverdünnen und zur Kraniotomie verwendet wird. Etwa die Hälfte der maximalen Geschwindigkeit mit häufigem Salzwasser-Kühlen verwenden.
Desinfektionslösung	Winner Medical	Povidon-Iod/Iodophor und 70 % Ethanol	Verwendet zur Kopfhautvorbereitung vor der Operation. Wechselnde Desinfektionsmittel für drei Zyklen auftragen.
Feinpinzette	JZ Brand	JD1050/JD1070	Verwendet für die Entfernung des Periosts, die Gewebemanipulation und das Heben des Knochenlappens.
Magensonde	RWD Life Science	20G, 38 mm, Kugelspitze	Verwendet für die orale Verabreichung von NMN.
Kopfplatte	Eigenherstellung	Keine Katalognummer	Titan-Kopfplatte mit einer zentralen Öffnung von etwa 10 mm, kompatibel mit dem Bildgebungshalter.
Wärmepad/Homoiotherm-Controller	RWD Life Science	69020 mit 69023-Pad	Verwendet, um die Körpertemperatur während der Operation und Bildgebung auf etwa 36,5–37,5 °C zu halten.
Bilderfassungssoftware	Nikon	NIS-Elements AR/AR Analysis v5.42.06	Verwendet für Mikroskopsteuerung und Bilderfassung. Repräsentative Einstellungen umfassen 512 × 512 oder 1024 × 1024 Pixel, 1–3 μm z-Schritt und 1 s Zeitraffer-Intervall.
Bildanalysesoftware	NIH	Fiji/ImageJ v1.8.0 oder höher	Verwendet für Bewegungskorrektur, ROI-Auswahl, Hintergrundsubtraktion, Intensitätsextraktion und CSV-Export.
Intravenöse Injektionsmaterialien	BD	329461	Sterile 1 ml Insulinspritze mit 29G Nadel für AAV-, TMR-Dextran- und NMN-Injektionen.
NMN (Nicotinamid-Mononukleotid)	Selleck Chemicals	S5259	NAD+-Vorläufer, der für Trinkwasser-, oral-gavische und intravenöse Verabreichungsexperimente verwendet wird.
Augensalbe	Lokale zertifizierte Apotheke	Nicht anwendbar	Verwendet zur Verhinderung des Austrocknens der Hornhaut während der Narkose.
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Servicebio	G4202-100ML oder G4202-500ML	Sterile 1× PBS, verwendet für Virusverdünnung, Tracer-Zubereitung, Gewebespülung und Reagenzvorbereitung.
Atemüberwachungssystem	RWD Life Science	Integriertes Überwachungsmodul	Verwendet zur Überwachung der Atmung und Anästhesietiefe während der Operation und Bildgebung.
Salin (0,9 % NaCl, steril)	Servicebio	G4702-500ML	Verwendet zum Kühlen des Schädels, zur Spülung, zur Befeuchtung des Gewebes und zur Herstellung von Lösungen.
Stereotaktischer Rahmen/Kopfhalter	Eigenherstellung	Keine Katalognummer	Verwendet für eine stabile Positionierung während der Kranialfenster-Chirurgie und Bildgebung.
Chirurgisches Mikroskop	Olympus	SZ61	Verwendet während der Kranialfenster-Chirurgie zum Schädelverdünnen, zur Kraniotomie und zur Platzierung des Deckgläschens.
TMR-Dextran (70 kDa)	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	D1818	Intravaskulärer Fluoreszenztracer, der zur vaskulären Referenzmarkierung verwendet wird. Typische Konzentration: 10–25 mg/ml. Bei 20 mg/kg injizieren und 5–10 min zirkulieren lassen, bevor die Bildgebung beginnt.
Tomatenlectin (DyLight 488)	Vector Laboratories	DL-1174	Verwendet für die post hoc vaskuläre/endotheliale Validierung.
Zwei-Photonen-Mikroskop	Nikon	A1R MP+ Multi