Effiziente Identifikationstechniken für 61 Öl-Tee-Sorten (Camellia oleifera abel) unter Verwendung der MCID-Strategie und DNA-Markern

Zusammenfassung

Diese Studie verwendete ein manuelles Sortenidentifikationsdiagramm (MCID), das aus Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)-Bandingmustern abgeleitet wurde, um 61 Camellia oleifera Abel-Sorten effizient und reproduzierbar für die Nutzung von Keimplasmaressourcen und die Identifizierung von Ölteesorten zu identifizieren.

Zusammenfassung

Es ist entscheidend, Keimstoffmaterialien und -Sorten von Camellia oleifera Abel [Öltee (Ot)] zu identifizieren, um Keimstoffressourcen zu bewerten und Mechanismen zum Schutz von Ot-Sorten zu bewerten. Diese Studie verwendete eine optimierte RAPD-Technik, bei der die Länge des RAPD-Primers verlängert und die PCR-Annealing-Temperatur abgeschirmt wurde, wodurch 61 Ot-Sorten aus verschiedenen Regionen identifiziert wurden. Darüber hinaus wurde ein MCID entwickelt, um effiziente RAPD-Marker für die Sortenidentifikation zu entwickeln. Aus 80 RAPD-beliebigen 11-nt-Primern wurden 10 Primer mit klaren polymorphen Bändern (PBs) für die PCR-Analyse der 61 Sorten ausgewählt. Darüber hinaus wurde die MCID-Strategie angewandt, um 61 Sorten manuell anhand der in den DNA-Fingerabdrücken beobachteten PBs der 10 Primer zu unterscheiden, was das Ot-Kultivar-Identifikationsdiagramm (Ot-CID) erzeugte. Dieses Ot-CID bezeichnete jede Sorte einzeln, wobei PBs zur Sortenidentifikation verwendet wurden, wobei die entsprechenden Primer genau auf dem Ot-CID platziert wurden. Die MCID-Strategie bietet einen einfachen und praktischen Ansatz zur Pflanzenidentifikation unter Verwendung von DNA-Markern. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz eine praktische und effiziente Methode zur Sortenidentifikation. Das resultierende Ot-CID von 61 Ot-Sorten unterschied Ot-Varianten effektiv anhand von RAPD-Markern und erleichterte so die Sortendifferenzierung für den Schutz der Sortenrechte und die frühe Setzlingsidentifikation in der Baumschulindustrie.

Einleitung

Camellia oleifera Abel [Öltee (Ot)] gehört zu den wichtigsten holzigen, essbaren Ölbaumarten der Welt¹. China gilt als Ursprungs- und Diversitätszentrum für Ot, mit reichlich vorhandenen Keimmaterialressourcen². Die alte Tradition des Ot, der vegetativen Vermehrung und vielfältigen globalen Zuchtprogrammen hat zur Entstehung zahlreicher Sorten^geführt. Die weitverbreitete weltweite Kultivierung der Ot-Kultur hat zu Sorten mit Homonymen (unterschiedliche Sorten mit demselben Namen) und Synonymen (Sorten mit mehr als einem Namen) ^geführt4. Daher ist es entscheidend, Techniken zur Verwaltung einer großen Bandbreite an Ot-Keimplasma zu entwickeln und verschiedene Sorten genau zu unterscheiden ^3,5.

Trotz der Anwendung von DNA-basierten molekularen Markern bei der Charakterisierung von Sorten, der genetischen Forschung und der Erkennung von Ot, die genetische Vielfalt aufklären und Pflanzenindividuen unterscheiden können, hat keine Studie erfolgreich eine nennenswerte Anzahl von Ot-Sorten identifiziert oder eine verlässliche Grundlage für die Differenzierung von Sorten geliefert 6,7,8,9 . Der Mangel an zuverlässigen Methoden ist die Hauptbegrenzung für die Anwendung von DNA-Markern bei der Identifizierung von Pflanzenkulturen. Dies könnte daran liegen, dass die analytischen Techniken für DNA-Fingerabdrücke keine relevanten Informationen liefern, die eindeutig Primer und polymorphe Marker zur Unterscheidung der Sorten definieren, die identifiziert werden müssen. Die analytischen Techniken für DNA-Bandingmuster (sogenannte Cluster-Analysen) sind ungeeignet, um Sorten oder Arten effektiv zu unterscheiden.

Obwohl DNA-Molekularidentifikationskarten (IDs) für über 200 Ot-Sorten mit den SNP-Markern 2,3,10,11 entwickelt wurden, gibt es dennoch mehrere Herausforderungen: (1) Das Ot-Genom ist komplex, wobei die Mehrheit der kultivierten Kamelien hexaploid ist, während das Referenzgenom zur Erstellung der DNA-Molekular-IDs triploid ist, was zu gewisser Ungenauigkeit führen ^{kann 3}. (2) Die Ganzgenomsequenzierung ist teuer, insbesondere für Labore mit begrenzten Einrichtungen, was ihre weitverbreitete Anwendung für großflächige Sortenanalysen verhindert. Darüber hinaus erfordern PCR-Amplifikationsprodukte eine Sequenzierung oder Fluoreszenzdetektion, was Prozess¹² weiter erschwert. (3) Mangels unterscheidender Marker für neue Sorten ist es notwendig, neue Markerprimer zu entwickeln, was auch die Neucodierung von ID-Kartencodes für bestehende Typen erfordert. Dies führt zu einer überwältigenden Anzahl von Code-Positionen, was die Wirksamkeit der Varietätsdifferenzierung verringert. Daher ist es unerlässlich, Techniken anzuwenden, die eine einfache, zuverlässige, referenzfähige und praktische Überprüfung von Ot-Sorten für den Ot-Baumschulsektor, das landwirtschaftliche Unternehmen, den Pflanzenpatentschutz sowie die Erhaltung und Bewertung genetischer Ressourcen^bieten.

Traditionelle Strategien zur Sortenidentifikation basierten auf morphologischen, physiologischen und agronomischen Merkmalen, doch diese Eigenschaften haben Grenzen, da sie anfällig für Umwelteinflüsse sind und eine umfassende Bewertung vollständig entwickelter Pflanzen erfordern^13,14. Darüber hinaus haben molekulare Marker den deutlichen Vorteil, von Umweltvariablen nicht beeinflusst zu werden, und dienen somit als effizientes Werkzeug für die genaue Charakterisierung von Sorten^14,15. Kürzlich wurden verschiedene DNA-basierte Indizes zur Bewertung von Fingerabdrücken, genetischer Vielfalt, Sorte und Reinheit 16,17,18,19,20,21,22 etabliert. Der RAPD-Marker ist für die Sortenanalyse aufgrund seiner Einfachheit, Effizienz und der fehlenden Anforderungen an frühere Sequenzdaten^23,24 vorteilhaft. Der RAPD-Ansatz kann verbessert werden, indem 11-Nukleotid-(nt)-Primer zusammen mit ihrer festgelegten PCR-Glühtemperatur für die Anwendung im Pflanzen-Fingerprinting ausgewählt werden, wodurch RAPD als bevorzugte Methode zur Identifikation und Bewertung der genetischen Vielfalt etabliert wird^25,26. Diese Marker wurden umfangreich in Pflanzendifferenzierungs- und genetischen Korrelationsstudien verschiedener Pflanzenarten eingesetzt, darunter Aprikose²⁷, Zierpfirsich²⁸, Granatapfel²⁹, Landrassen²⁰ und Walnuss³⁰ (Çilesiz et al., 2025). Trotz ihrer weitverbreiteten Anwendung bleiben viele DNA-Marker-basierte Ansätze für die routinemäßige Identifizierung von Pflanzensorten noch nicht ausreichend praktisch oder optimiert.

Daher verwendete diese Studie eine neuartige Analysetechnik zur reproduzierbaren Identifikation verschiedener Ot-Sorten. Das MCID, das aus RAPD-Bandingmustern abgeleitet wurde, differenzierte 61 Ot-Sorten für die Nutzung von Keimplasmaressourcen und die Sortenidentifikation.

Die hier beschriebene RAPD-MCID-Strategie (Abbildung 1) ist am besten geeignet für die Charakterisierung von Germplasma im kleinen bis mittelgroßen Maßstab in Laboren mit Standard-PCR- und Gelelektrophorese-Infrastruktur, aber begrenztem Zugang zu Sequenzierungseinrichtungen. Es eignet sich auch gut für schnelle, kosteneffiziente Voruntersuchungen vor einer detaillierteren genetischen Analyse. Die wichtigsten operationellen Grenzen der Methode sind die Abhängigkeit von dominanten Markern und die Notwendigkeit einer sorgfältigen Standardisierung der PCR-Bedingungen zur Sicherstellung einer laborübergreifenden Reproduzierbarkeit. Für groß angelegte Germplasmabanken oder legale Sortenregistrierungen wird die komplementäre Verwendung von kodominanten Markern wie SSRs oder SNPs empfohlen.

Protokoll

1. Pflanzenmaterial

1. Sammeln Sie junge Blätter von gesunden, aktiv wachsenden Trieben jeder Ölteesorte aus dem National Camellia Germplasm Repository, Shucheng County, Provinz Anhui.
2. Siehe Tabelle 1 für die Namen und Herkunft dieser Sorten.

2. Genomische DNA-Extraktion

1. Extrahieren Sie die gesamte genomische DNA mit einem Pflanzen-DNA-Extraktionsset gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Die DNA wurde mit 1× TE-Puffer eluiert. Nach der Elution sollten Sie bestätigen, dass die extrahierte DNA-Lösung klar und farblos erscheint. Missen Sie die DNA-Konzentration mit einem Mikrovolumenspektrophotometer.
3. Stellen Sie die DNA-Konzentration auf 30 ng·^μL-1 mit 1× TE-Puffer ein und lagern Sie die angepasste DNA-Lösung bei -20 °C.

3. Auswahl des RAPD-Primers

1. Erstelle 80 zufällige Primer für die RAPD-Analyse und analysiere sie mit einigen Genotypen. Wählen Sie 11-nt-RAPD-Primer, die klare und eindeutige Bandingmuster über alle getesteten Genotypen hinweg erzeugen.
2. Verwenden Sie die ausgewählten Primer für die Genotypisierung, um die Glaubwürdigkeit der amplifizierten Fragmente zu erhöhen. Wählen Sie 10 gut aufgelöste Primer mit reproduzierbaren Bändern für weitere Analysen aus, wie in Tabelle 2 aufgeführt.

4. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) PCR

1. Bereiten Sie die Verstärkungsreaktionen vor, indem Sie die zuvor beschriebene Methode²³ leicht modifizieren. Bereiten Sie die Reaktionslösungen gemäß der in Tabelle S1 aufgeführten Zusammensetzung vor.
2. Durchführung von PCR mit einem thermischen Zyklus unter folgenden Bedingungen: Vordenaturierung bei 94 °C für 5 Minuten; 42 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 30 Sekunden, Glühen für 1 Minute bei der optimierten Temperatur in Tabelle 2 und Verlängerung bei 72 °C für 2 Minuten; und eine letzte Verlängerung bei 72 °C für 10 Minuten.

5. Nachweis und Analyse von PCR-Produkten

1. Trennen Sie die amplifizierten DNA-Fragmente mittels Gelelektrophorese bei 100 V in 1,3 % Agarose (w/v), hergestellt in einem 1× TAE-Puffer, der 0,001 M EDTA und 0,04 M Trisacetat bei pH 8,0 enthält. Färben Sie die Gele mit Ethidiumbromid bei 0,5 μg·^μL-1.
   VORSICHT: Ethidiumbromid ist ein potentes Mutagen. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung beim Umgang mit Ethidiumbromidlösungen oder gefärbten Gelen.
2. Lassen Sie das Gel bei einer konstanten Spannung von 100 V für 45–60 Minuten laufen oder bis die Front des Bromphenol-blauen Farbstoffs etwa zwei Drittel der Gellänge abgewandert ist. Nach dem Färben und Entfärben beobachten Sie das Gel unter UV-Transillumination.
   HINWEIS: Bestätigen Sie, dass unterschiedliche DNA-Bänder unter UV-Transillumination deutlich sichtbar sind. Stellen Sie sicher, dass die DNA-Leiter scharfe, gut getrennte Bänder von 100 bis 2.000 bp aufweist.
3. Erfassen Sie die polymorphen Bänder (PBs) der Sorten basierend auf ihrem Vorhandensein oder Fehlen unter ultraviolettem Licht.
4. Führen Sie jede PCR-Verstärkung dreifach durch, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen. Werten Sie nur Bänder, die in allen drei unabhängigen Replikaten konstant vorhanden oder fehlen, für die nachgelagerte Analyse. Bestätigen Sie, dass die Konkordanzrate der Band-Scoring zwischen Replikaten 95 % übersteigt.

6. Datenanalyse

1. Bewerten Sie die Bänder für die Sortenidentifikation basierend auf ihrer Anwesenheit oder Abwesenheit, indem Sie klar sichtbaren Bändern "+ o" und "−" an fehlende Bänder bei der entsprechenden Molekülgröße aller Sorten vergeben. Beziehen Sie nur Bänder ein, die über drei unabhängige Replikate konsistent beobachtet werden.
2. Klassifizieren Sie Sorten mit deutlichen Bändern im Fingerabdruck, der von einem einzelnen Primer erzeugt wird, unabhängig voneinander. Sorten mit identischen Bandmustern in dieselbe Untergruppe einzuordnen. Unterscheiden Sie alle Ölteesorten schrittweise und vollständig anhand dieser Parameter.

7. Anwendung und Effizienz des Diagramms bei der Sortenidentifikation

1. Wählen Sie zufällig zwei Ölteesortengruppen aus den Intra- und Inter-Gruppen aus, um die Anwendbarkeit und Funktionalität des Diagramms mit 61 Ölteesorten zu überprüfen. Führen Sie die Auswahl manuell durch, indem Sie auf verschiedene Zweige des Ot-CID-Diagramms zurückgreifen, ohne Software zu verwenden.
   HINWEIS: 2 Ot-Sortengruppen wurden zufällig ausgewählt, um die Anwendbarkeit und Funktionalität des Diagramms mit 61 Ot-Sorten zu überprüfen.
2. Benennen Sie die beiden ausgewählten Gruppen als "A" und "B". Überprüfen Sie die relevanten Primer für jede Gruppe vom Ot-CID.

8. Leitlinien zur Entsorgung gefährlicher Abfälle

1. Bereiten Sie alle Ethidiumbromid-Lösungen in einem ausgewiesenen Bereich vor und handhaben Sie sie. Sammeln Sie alle mit Ethidiumbromid kontaminierten Feststoffe und flüssigen Abfälle getrennt zur Entsorgung gemäß den institutionellen Richtlinien für gefährliche Abfälle.
2. Entsorgen Sie alle mit Ethidiumbromid kontaminierten Materialien in ausgewiesenen Behältern für gefährliche Abfälle. Wenden Sie sich bei Unsicherheit an das institutionelle Amt für Umweltschutz und Sicherheit für genehmigte Entsorgungsverfahren.

Ergebnisse

Die hier präsentierten repräsentativen Ergebnisse veranschaulichen den gesamten Arbeitsablauf der RAPD-MCID-Strategie, von der ersten Primer-Prüfung über hierarchische Sortendiskriminierung bis hin zur finalen Validierung. Der schrittweise Diskriminierungsprozess ist in Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4, Abb...

Diskussion

DNA-Marker sind leistungsstarke Werkzeuge, die zur Identifizierung von Pflanzensorten und Art²⁴ verwendet werden. Diese Marker wurden entwickelt und in Tausenden von Studien zu genetischer Analyse, Sortenidentifikation usw. eingesetzt; Sie sind jedoch weder einfach noch weit verbreitet in der Genotypisierung^24,31. Dies liegt an dem Mangel an effizienten und einfachen Methoden, die DNA-Marker zur S...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zentrifuge	Eppendorf,Deutschland	5427R	Verwendet für die Extraktion genomischer DNA aus Ölteeblättern
Hi-DNAsecure Pflanzen-Kit	Tiangen, China	DP350	Verwendet für die Extraktion genomischer DNA aus Ölteeblättern
PCR-Genamplifikationsinstrument	Monad, China	MP60901	Verwendet für PCR-Amplifikation
SolarRed Agarose LE	Solarbio, China	A8202	Verwendet für PCR-Fragmentelektrophorese
TAE	Tsingke, China	TSG001	Verwendet für PCR-Fragmentelektrophorese
TaKaRa Ex Taq	Takara, Japan	RR001A	Verwendet für PCR-Amplifikation
Thermo Scientific NanoDrop 2000C Spektrophotometer	ABI,USA		Verwendet zur Bestimmung der RNA-Konzentration