Isolierung und Validierung von Podoplanin-positiven mesenchymalen Stammzellsubpopulationen mit einer indirekten magnetischen Perlenstrategie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine magnetische perlenbasierte Sortiermethode, bei der phycoerythrin-(PE)-markierte Flusszytometrie-Antikörper und Anti-PE-Mikroperlen verwendet werden, um spezifische mesenchymale Stammzellsubpopulationen mit hoher Postsort-Zielmarker-Positivität und erhaltener CCK-8-basierter Proliferation/Stoffwechselaktivität unter den getesteten Bedingungen zu isolieren, ohne teure Zellsortierer oder zielspezifische individuelle Perlen zu benötigen.

Zusammenfassung

Die Untersuchung der funktionellen Heterogenität in mesenchymalen Stammzellen basiert auf der effizienten Isolierung spezifischer Subpopulationen (z. B. podoplanin-positive (PDPN)-positive Zellen). Für die meisten Membranproteinziele sind die direkt verfügbaren kommerziellen magnetischen Perlen zur Sortierung jedoch begrenzt. Um dem entgegenzuwirken, hat unser Labor ein standardisiertes magnetisches Perlensortierprotokoll etabliert und getestet, das auf dem indirekten Kopplungsprinzip der "phycoerythrin (PE)-markierten Flusszytometrie-Antikörper/Anti-PE-Magnetperlen" basiert. Mit PDPN-positiven Zellen als Modell-Zielpopulation bereichert dieses Protokoll eine Zielzellfraktion, ohne auf teure flowzytometrische Zellsortierer angewiesen zu sein.

Forscher können kompatible, mit PE markierte Flowzytometrie-Antikörper verwenden, die auf zugängliche Zelloberflächenproteine abzielen, und sie mit kommerziell erhältlichen Anti-PE-Mikroperlen kombinieren, um nach zielspezifischer Optimierung einen Sortier-Workflow für ausgewählte Ziele zu etablieren. Dieser Ansatz vermeidet die langen Vorlaufzeiten und die hohen Kosten, die mit der Anpassung oder Bestellung zielspezifischer magnetischer Perlen für jedes neue Ziel verbunden sind, was ihn besonders geeignet für zugängliche Oberflächenmarker macht, die selten oder wenig erforscht sind. Im hier getesteten PDPN-Modellsystem ermöglichte das Protokoll die Anreicherung der Zielsubpopulation mit hoher PDPN-Positivität nach der Sortierung und bewahrte CCK-8-basierte Proliferation/metabolische Aktivität im Vergleich zu unsortierten MSCs.

Einleitung

Im Bereich der Orthopädie führen Verletzungen wie Knorpelschäden und Läsionen in der avaskulären Zone (weiße Zone) des Meniskus oft zu irreversibler Gelenkzerstörung und Funktionsverlust, was letztlich zu Arthrose führt. Dies ist größtenteils auf die schlechte Regenerationskapazität dieser Gewebe zurückzuführen, die auf einen Mangel an direkter Blut- und Lymphversorgung sowie auf das Vorhandensein hochdifferenzierter Zellen mit begrenzter Proliferations- ^{und Migrationskapazität} zurückzuführen ^ist. Um diese Herausforderung zu bewältigen, wurden verschiedene klinische Strategien erforscht, darunter der Einsatz von Exosomen ^5,6, autologer oder allogener Chondrozytentransplantation ^7,8 und Tissue Engineering ^Ansätze 9,10,11,12. In den letzten Jahren haben sich mesenchymale Stammzellen (MSCs) aufgrund ihres multilinealen Differenzierungspotenzials und immunmodulatorischen Eigenschaften als vielversprechende Zellquelle für regenerative Reparaturen etabliert und neue Hoffnung für die Knorpelregeneration 13,14,15,16 geschaffen.

Trotz ihres therapeutischen Potenzials weisen MSCs eine signifikante Heterogenität auf. Selbst innerhalb einer einzigen Gewebequelle, wie Knochenmark oder Nabelschnur, können unterschiedliche Subpopulationen von MSCs erhebliche Variabilität in der Proliferationskapazität, dem Potenzial zur Multilineage-Differenzierung (insbesondere der chondrogenen Differenzierung) und der regenerativen Funktion in vivo^zeigen 17,18,19. Daher ist die präzise Identifizierung und Isolierung funktional definierter MSC-Subpopulationen – wie solchen mit erhöhter chondrogener Kapazität – unerlässlich, um unser Verständnis ihrer biologischen Eigenschaften zu verbessern und die Wirksamkeit der Knorpelreparatur zu verbessern. Dies stellt einen entscheidenden Schritt in unserer Forschung dar.

Im Verlauf der Forschung wurden immer mehr neuartige Membranproteine als Marker funktionell unterschiedlicher MSC-Subpopulationen identifiziert. Diese Entdeckungen in effektive Zellsortierstrategien umzusetzen bleibt jedoch technisch herausfordernd. Konventionelle, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist zwar leistungsfähig, erfordert aber spezialisierte Instrumentierung und technisches Fachwissen, was ihre Zugänglichkeit in vielen Laboren einschränkt. Immunmagnetische Zellsortierung hingegen ist – wenn auch häufiger verbreitet – durch die begrenzte Verfügbarkeit kommerzieller Reagenzien eingeschränkt, die hauptsächlich für einige wenige gut etablierte Membranziele entwickelt wurden. Daher gibt es für viele neu entdeckte Marker mit potenzieller biologischer Bedeutung keine kommerziell verfügbaren magnetischen Perlen, was es erschwert, diese wertvollen MSC-Subpopulationen gezielt anzureichern.

Um diese Einschränkung zu überwinden, zielt die vorliegende Studie darauf ab, ein flexibles, kosteneffizientes und effizientes Protokoll für positive Zellselektion zu etablieren und zu standardisieren. Dieser Ansatz basiert auf der indirekten Konjugation kommerziell verfügbarer Phycoerythrin-(PE)-konjugierten Antikörper mit anti-PE-immunomagnetischen Perlen. Frühere Berichte haben gezeigt, dass podoplanin-positive (PDPN⁺) MSCs eine überlegene Fähigkeit zur Erhaltung und Differenzierung der Stammstärke im Vergleich zu ihren PDPN-Gegenstücken²⁰ besitzen. Darüber hinaus wurde die Beteiligung von PDPN⁺ MSCs an der Knorpelregeneration und dem Fortschreiten der Arthrose (OA) in der Literatur^21,22 dokumentiert. Mit Podoplanin (PDPN) – einem kürzlich identifizierten Kandidatenmarker funktionaler MSC-Subpopulationen – als Modellziel sortierten wir PDPN-positive Zellen aus knochenmark-abgeleiteten MSCs. Wir bieten ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Herstellung einer Einzelzellsuspension, zur Markierung von Antikörpern und Magnetperlen sowie zur magnetischen Trennung. Darüber hinaus bewerten wir den Ertrag, die PDPN-Positivität nach der Sortierung und die CCK-8-basierte Proliferation/metabolische Aktivität der sortierten Zellen. Durch die Standardisierung dieses Protokolls wollen wir Forschern eine vielseitige, zugängliche Methode zur Isolierung von Zielzellsubpopulationen unter Verwendung kompatibler Antikörper gegen zugängliche Zelloberflächenmarker bieten, um so die grundlegende Stammzellforschung und zukünftige translationale Anwendungen in der regenerativen Medizin zu erleichtern.

Protokoll

MSCs aus dem menschlichen Knochenmark wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle). Der Anbieter bestätigte die MSC-Identität durch positive Expression von CD73, CD90 und CD105; negative Expression von CD34, CD45 und HLA-DR; und das Potenzial der Trilineage-Differenzierung. Die Zellen wurden in der Kultur erweitert und an den Passagen 3–5 verwendet. Alle vom Menschen abgeleiteten Zellarbeit wurde in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Da die Zellen kommerziell erworben wurden und keine menschlichen Probanden direkt rekrutiert oder entnommen wurden, war keine direkte IRB-Zulassung erforderlich.

1. Herstellung einer Einzelzell-Suspension

HINWEIS: Die Qualität der Einzelzell-Suspension beeinflusst direkt die Sortiereffizienz. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gut verteilt, sehr lebensfähig und frei von Klumpen sind. Sichtbare Klumpen sollten durch wiederholtes, sanftes Pipettern zerstreut werden, bis die Klumpen nicht mehr sichtbar sind.

1. Wählen Sie MSCs (Passagen 3–5) aus, die 80–90 % Konfluenz erreicht haben. Verwerfe das Kulturmedium.
2. Waschen Sie die Zellen mit 2 × 10 ml vorgewärmtem PBS. Wiege das Gefäß vorsichtig und entsorge das PBS.
3. Fügen Sie 2 ml 0,25 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 3–5 Minuten. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, bis sie sich aufrunden und sich ablösen.
4. Fügen Sie 4 ml Kulturmedium mit 16,5 % FBS hinzu (siehe Materialtabelle), um das Trypsin zu neutralisieren. Pipette die Zellen vorsichtig, um eine vollständige Ablösung sicherzustellen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-mL-Zentrifugenrohr.
   HINWEIS: Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle Zellen gesammelt wurden.
5. Zentrifugiere bei 300 × g für 3 Minuten und entsorge das Supernatant.
6. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml Puffer wieder auf (siehe Materialtabelle). Fahren Sie mit der Zellenzählung fort.

2. Zellzählung und Konzentrationsanpassung

HINWEIS: Wenn die Gesamtzellzahl kleiner als 1 × 10⁷ ist, fügen Sie dennoch Antikörper und magnetische Reagenzien basierend auf dem Standardvolumen für 1 × 107^{Zellen hinzu} , um die Etikettierungseffizienz sicherzustellen.

1. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension erneut bei 300 × g für 3 Minuten und entsorgen Sie das Supernatant.
2. Die Zellen im Puffer werden wieder suspendiert, um eine Dichte von 1 × 10⁸ Zellen/mL zu erreichen.
   HINWEIS: Zum Beispiel, um 1 × 10^{7 Zellen zu} verarbeiten, wird das Pellet in 100 μL Puffer aufgehängt.
3. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 5-mL Polystyrolrohr mit rundem Boden.

3. Antikörperkennzeichnung

1. Fügen Sie 10 μL Fc Gamma RII Blocker hinzu (siehe Materialtabelle) pro 1 × 10^{7 Zellen} . Vorsichtig mischen und 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
2. Fügen Sie 5 μL PE-konjugierten antihumanen PDPN-Antikörper (siehe Materialtabelle) pro 1 × 10^{7 Zellen entsprechend} der vom Hersteller empfohlenen Konzentration hinzu. Vorsichtig mischen und 15–20 Minuten bei Zimmertemperatur befruchten, geschützt vor Licht.
   HINWEIS: Das Antikörpervolumen sollte gemäß dem Datenblatt des verwendeten Flusszytometrie-Antikörpers angepasst werden, da die Konzentrationen zwischen den Produkten variieren können.

4. Magnetische Perlenkennzeichnung

HINWEIS: Lassen Sie alle Reagenzien vor der Anwendung auf Eis und legen Sie sie nach jeder Zugabe sofort wieder ins Eis, um Aktivität und Konsistenz zu gewährleisten.

1. Fügen Sie 10 μL Selection Cocktail pro 1 × 107^{Zellen hinzu} (siehe Materialtabelle). Sanft verrühren und 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
2. Fügen Sie 5 μL magnetische Perlen pro 1 × 107^{Zellen hinzu} (siehe Materialtabelle). Vorsichtig mischen und 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren.
   HINWEIS: Vortischen Sie die magnetischen Perlen kräftig 30 Sekunden lang vor der Benutzung, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.

5. Magnetische Trennung

1. Platzieren Sie ein 5-ml-Polystyrolrohr mit rundem Boden mit der beschrifteten Zellprobe in den magnetischen Trennstand (siehe Materialtabelle).
2. Fügen Sie dem Rohr einen Puffer hinzu, um das Gesamtvolumen auf 2,5–3 ml zu bringen. Inkubiere 5 Minuten bei Zimmertemperatur.
3. Führen Sie die Trennung durch: Magnet und Rohr als eine Einheit zusammenhalten und sie umkehren, um das Überleitungsmittel in ein neues Sammelrohr zu gießen. Diese gesammelte Fraktion enthält die PDPN-negativen Zellen; Lass diesen Schlauch auf Eis.
   HINWEIS: Nehmen Sie das Rohr während dieses Schritts nicht vom magnetischen Halter, da dies die Trennung stört und das Verfahren zum Fehlschlagen führt.
4. Wiederhole die Schritte 5.1–5.3 dreimal. Jedes Mal fügen Sie dem ursprünglichen Röhrchen im Magneten Puffer hinzu, warten Sie 5 Minuten und gießen Sie das Überlagerungsmittel in dasselbe negative Fraktions-Sammelrohr wie in Schritt 5.4.
5. Nach der Endwäsche entferne das Rohr mit den magnetisch gebundenen Zellen vom Stativ. Dieses Rohr enthält die PDPN-positive Zellfraktion.
6. Fügen Sie 3 ml Puffer hinzu, um die positiven Zellen wieder zu suspendieren. Übertragen Sie diese Suspension in ein frisches, beschriftetes Rohr (das positive Fraktionsrohr).

6. Sammlung, Kultur und Validierung von Zielzellen

1. Zählen Sie die Zellen sowohl aus dem positiven als auch aus dem negativen Fraktionsrohr. Zeichnen Sie die Zellausbeute für jede Fraktion auf.
2. Zentrifugieren Sie die positive Fraktionszellsuspension bei 300 × g für 3 Minuten. Entsorge das Supernatant.
3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in MEM-Alpha-Kulturmedium, das 16,5 % FBS enthält. Passen Sie die Zelldichte nach Bedarf an und säen Sie die Zellen in Kulturplatten oder Flaschen ein.
4. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem 5%igen CO₂-Inkubator.

7. Probenvorbereitung für Reinheit und funktionale Validierung

1. Zählen Sie die Zellen und säen Sie sie auf eine 100 mm große Kulturschale mit einer Dichte von 3 × 10^{6 Zellen pro} Schale in 12 ml Kulturmedium. Vierundzwanzig Stunden nach der Aussaat beobachten Sie die Zellanheftung. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches Medium, um eventuelle restliche magnetische Perlen und nicht haftende Zellen zu entfernen.
2. Entnehmen Sie die Zellen durch Trypsinisierung. Sanft 10–15 Mal auf und ab pipetieren, um magnetische Perlen und Restantikörper zu lösen und zu entfernen.
3. Bewerten Sie den Prozentsatz der PDPN-PE-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie (siehe Supplemental File 1 für das detaillierte Protokoll).
4. Sammeln Sie Zellen während der logarithmischen Wachstumsphase. Säe sie in eine 96-Loch-Platte. Zu verschiedenen Zeitpunkten (0 H, 24 H, 48 H, 72 H) geben Sie CCK-8-Reagenz (siehe Materialtabelle) und messen Sie die Absorptionsfähigkeit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zeichnen Sie eine Proliferationskurve anhand der Daten auf.

Ergebnisse

Das Gesamtprinzip und der Arbeitsablauf des Experiments sind in Abbildung 1 dargestellt. Alle nachfolgenden experimentellen Daten basieren auf Passage 5-Zellen. Nach der magnetischen Trennung wurden die gewonnenen PDPN^+-Zellen 24–48 Stunden lang kultiviert. Nach dem Austausch des Kulturmediums zur Entfernung nicht haftender Zellen und potenzieller Rest-Magnetperlen (Abbildung 2A) bewerteten wir die Sortiereffizienz un...

Diskussion

In dieser Studie etablierten wir ein magnetisches perlenbasiertes Protokoll zur Isolierung von PDPN+-Zellen aus aus Knochenmark-abgeleiteten MSCs. Dieser Ansatz ermöglicht eine effiziente Anreicherung der PDPN-positiven Subpopulation, während CCK-8-basierte Proliferation/metabolische Aktivität unter den getesteten Bedingungen aufrechterhalten wird.

Im Vergleich zu herkömmlichen direkten immunmagnetischen Sortiermethoden liegt der größte Vorteil dieser Strategi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
7-AAD Cell Viability Assay Kit	KeyGEN	KGD1202-50
Anti-human CD32 Blocker (Fc gamma RII Blocker)	STEMCELL Technologies	18520
Buffer	STEMCELL Technologies	20104	Puffer
CCK-8	Meilunbio	MA0218-5
Dextran Magnetic Particles	STEMCELL Technologies	50100	Magnetische Partikel
Fetal Bovine Serum	Gibco	16050-122
Magnet	STEMCELL Technologies	18000	Magnetischer Trennständer
MEM Alpha Medium	Gibco	C12571500BT	MEM Alpha Medium (82,5%) + FBS (16,5%) + Penicillin-Streptomycin (1,0%)
MSCs	KeyGEN	KGG5575-1	Humane mesenchymale Stammzellen aus Knochenmark
PE-conjugated Anti-Human PDPN Antibody	ABclonal	A26770	PDPN-PE
PE Selection Cocktail	STEMCELL Technologies	18151	Selektionscocktail
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072