Quantifizierung der NK-Zell-Zytotoxizität, verstärkt durch chimerische Antigenrezeptoren und therapeutische Antikörper mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll bietet einen standardisierten in-vitro. Arbeitsablauf für die konsistente Messung der natürlichen, chimerischen Antigenrezeptor-vermittelten und antikörperabhängigen Zytotoxizität menschlicher natürlicher Killerzellen mittels lebender Zellbildgebung und Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Natürliche Killerzellen (NK) sind angeborene Lymphozyten, die eine entscheidende Rolle beim schützenden Immunsystem gegen verschiedene intrazelluläre Krankheitserreger und Krebsarten spielen. Ihre Hauptfunktion besteht darin, Zielzellen zu töten, die infiziert, bösartig transformiert oder mit Antikörpern durch antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) beschichtet sind. NK-Zellen können auch genetisch verändert werden, um chimerische Antigenrezeptoren (CARs) zu exprimieren, die eine gezielte Erkennung spezifischer Antigene ermöglichen. Die quantitative Messung der NK-Zell-Zytotoxizität ist unerlässlich für die Bewertung der Basisfunktionalität sowie für die präklinische Bewertung monoklonaler Antikörper und CAR-Engineering-Strategien. Allerdings bleiben in-vitro-funktionelle Assays zwischen den Laboren aufgrund von Unterschieden in der Zellpräparation, Zielzellen, Effektor-zu-Ziel-Verhältnissen, Ko-Inkubationszeiten und Auslesemethoden sehr unterschiedlich, was die Reproduzierbarkeit und Kreuzstudienvergleiche einschränkt. Dieser Artikel präsentiert ein standardisiertes Protokoll zur quantitativen Bewertung der NK-Zell-Zytotoxizität mittels Durchflusszytometrie und Echtzeit-Lebendzellbildgebung. Primäre humane NK-Zellen und CAR-exprimierende NK-92-Zellen wurden auf ihre Fähigkeit getestet, Krebszellen und antikörperbeschichtete Zielzellen in einem 96-Well-Plattenformat abzutöten, um natürliche Zytotoxizität, CAR-vermittelte Tötung und ADCC zu messen. Das Überleben der Zielzelle wurde entweder kontinuierlich mittels lebender Zellbildgebung oder zu einem definierten Zeitpunkt mittels Durchflusszytometrie gemessen, was auch eine phänotypische Charakterisierung von NK-Zellen und Zielzellen ermöglichte. Diese Protokolle bieten einen robusten Rahmen unter Verwendung routinemäßiger Gewebekultur, Bildgebung und Flowzytometrie, um eine reproduzierbare Quantifizierung der NK-Zell-Effektorfunktionen für Studien zur angeborenen Immunität und NK-zellbasierten Immuntherapien zu ermöglichen.

Einleitung

Natürliche Killerzellen (NK) sind angeborene Lymphozyten, die eine zentrale Rolle bei der Immunüberwachung gegen viral infizierte und bösartige Zellen spielen und eine schnelle und starke Zytotoxizität aufweisen. Im Gegensatz zu B- und T-Zellen exprimieren NK-Zellen keine antigenspezifischen Rezeptoren, sondern verlassen sich stattdessen auf eine Vielzahl aktivernder und hemmender Rezeptoren, um den Verlust der Expression der Klasse I des Major Histocompatibility Complex oder zellulären Stress zu erkennen. Dies ermöglicht es ihnen, direkte Zytotoxizität zu vermitteln, indem sie zytotoxische Granulate mit Perforin und Granzymen freisetzen oder in manchen Fällen die Todesrezeptoren 1,2,3,4 aktivieren. Neben der natürlichen Zytotoxizität exprimieren NK-Zellen FcγRIII (CD16), einen Rezeptor, der den Fc-Anteil des Immunglobulins G (IgG) erkennt und antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) gegen IgG-beschichtete Zielzellen ^5,6 vermittelt.

Aufgrund ihrer intrinsischen zytotoxischen Mechanismen und ihres günstigen Sicherheitsprofils haben sich NK-Zellen als vielversprechende Kandidaten für die zelluläre Immuntherapie etabliert. Mit dem Potenzial für allogene Anwendungen können NK-Zellen als "fertige" Therapie mit minimalem Risiko für Graft-gegen-Wirt-Erkrankung fungieren, was eine breitere klinische Anwendbarkeit und reduzierte Kosten ermöglicht⁷. Jüngste Fortschritte haben das therapeutische Potenzial von NK-Zellen durch genetische Ingenieurstechniken weiter erweitert, darunter die Einführung chimerischer Antigenrezeptoren (CARs), die NK-Zellen umleiten, um spezifische Tumorantigene zu erkennen. CAR-NK-Zellen haben in in vivo Xenograft-Modellen und klinischen Studien eine antitumorwirksame Wirksamkeit gezeigt, mit reduzierter Toxizität im Vergleich zu CAR-T-Zellen ^8,9,10. Daher wächst das Interesse an der Entwicklung entwickelter NK-Zell-Plattformen und antikörperbasierter therapeutischer Strategien. In diesem Zusammenhang ist eine genaue und quantitative Messung der Tötungskapazität von NK-Zellen unerlässlich, um die Biologie der NK-Zellen, die Wirksamkeit von CAR oder anderen entwickelten NK-Zelltherapien zu bewerten und monoklonale Antikörper zu bewerten, die auf ADCC angewiesen sind.

Eine Vielzahl von In-vitro-Assays wurde in Laboren weit verbreitet eingesetzt, um die NK-Zell-Zytotoxizität zu bewerten. Gängige Methoden sind radioaktive Chrom-51-Freisetzungstests, Laktatdehydrogenase-Freisetzungstests und Calcein-Acetoxymethyl-Freisetzungstests^11,12. Obwohl diese traditionellen Methoden weit verbreitet zur Messung der Zytotoxizität verwendet werden, stützen sie sich auf indirekte Anzeigen des Zelltodes, liefern Endpunktmessungen statt kinetischer Daten und bieten eine begrenzte Empfindlichkeit und einen begrenzten Dynamikbereich. Sie geben auch keine Informationen über den Phänotyp oder den Aktivierungszustand der Effektorzellen. In jüngerer Zeit werden Plattformen für Live-Cell-Bildgebung und Flowzytometrie zunehmend eingesetzt, da sie eine direkte Quantifizierung des Überlebens der Zielzelle, die Überwachung des Tötungsprozesses über die Zeit und eine gleichzeitige phänotypische Analyse von Effektor- und Zielzellen^{ermöglichen 13,14}. Doch selbst unter diesen neueren Ansätzen besteht erhebliche Variabilität zwischen Laboren und veröffentlichten Studien, einschließlich Unterschieden in der Zielzellpräparation, den Effektor-Ziel-(E:T)-Verhältnissen und den Co-Inkubationszeiten, was die Reproduzierbarkeit und Querstudienvergleiche einschränkt, insbesondere bei präklinischen Bewertungen von NK-zellbasierten Immuntherapien.

Dieser Artikel präsentiert einen standardisierten Workflow zur quantitativen Bewertung der NK-Zell-Zytotoxizität unter Verwendung von zwei unabhängigen, komplementären Plattformen: Echtzeit-, Live-Zell-Imaging (IncuCyte SX5) und Flowzytometrie-basierten Endpunkt-Assays. Die Lebendzellbildgebung ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung des Überlebens der Zielzelle während der Kokultur mit Effektorzellen, was eine kinetische Bewertung der Zytotoxizität über mehrere E:T-Verhältnisse und experimentelle Bedingungen mit minimaler Assay-Manipulation^ermöglicht. Im Gegensatz dazu liefert die Durchflusszytometrie eine hochsensible Endpunktmessung des Zielzelltods sowie eine gleichzeitige phänotypische Charakterisierung von NK-Zellen und Zielzellen mittels eines Multimarker-Färbungspanels.

Zusätzlich integriert dieses Protokoll standardisierte experimentelle Parameter, darunter E:T-Verhältnisse, Inkubationsbedingungen, Plattenformat und analytische Arbeitsabläufe, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern und den Vergleich von Zytotoxizitätsmessungen zwischen Laboren und Studien zu erleichtern. Der Workflow ermöglicht die quantitative Bewertung mehrerer NK-Effektorfunktionen, darunter natürliche Zytotoxizität, CAR-vermitteltes Töten und ADCC, und ist kompatibel mit primären menschlichen NK-Zellzellen und NK-Zelllinien. Dieses Protokoll bietet einen praktischen Rahmen für Studien zur NK-Zellbiologie und die präklinische Bewertung der Entwicklung von NK-zellbasierten Immuntherapien.

Protokoll

Die Verwendung der menschlichen Spenderproben für die Forschung wurde vom Institutional Review Board genehmigt und gemäß institutionellen Richtlinien durchgeführt (Approval #2022P000699).

1. Echtzeit-Lebendzell-Bildgebungs-Tötungstest

1. Mantelplatten
   1. Fügen Sie 50 μL/Bohrloch-Poly-D-lysin (0,1 mg/mL in phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS]) zu einem 6 × 10-Gitter in einer flachen 96-Well-Platte hinzu. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, damit der Boden jedes Schachts vollständig abgedeckt ist.
   2. Inkubieren Sie die Platte 2 Stunden bei Zimmertemperatur (RT; 18°C–26°C) mit dem Deckel drauf.
   3. Wasche Brunnen 3× mit 200 μL/Well PBS und entsorge das Supernatant.
      HINWEIS: Beschichtete Platten können mit Parafilm versiegelt und bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden, wobei jeweils 200 μL PBS hinzugefügt werden. Stellen Sie sicher, dass die Platten steril bleiben, verwerfen Sie PBS und lassen Sie sie vor der Nutzung auf RT ausgleichen.
2. Bereite Zielzellen vor
   1. Bereiten Sie 10 ml 2× SYTOX Orange (200 nM) vor, indem Sie die SYTOX Orangen-Lagerlösung (250 μM in DMSO) in NK-92-Kulturmedium (fügen Sie 8 μL Lager zu 10 mL Gesamtvolumen hinzu) in einem 15-mL konischen Zentrifugenrohr vor.
      HINWEIS: Das Kulturmedium für NK-92-Zellen besteht aus Advanced RPMI-1640 Medium, 10 % fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin, 100 μg/mL Primosín und 500 U/mL humanem IL-2.
      VORSICHT: SYTOX Orange ist ein fluoreszierender Farbstoff und kann Risiken bei Haut- oder Augenkontakt mit sich bringen. Umgang mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und gemäß den institutionellen Sicherheitsrichtlinien.
   2. Zähle Zielzellen mit einer farbstoffbasierten Zellzählmethode (z. B. Trypanblau) oder einer gleichwertigen validierten Methode (z. B. automatisiertem Zellzähler).
      HINWEIS: In diesem Test waren die Zielzellen Ramos-Zellen, eine B-Zell-Alterungsantigen-exprimierende (BCMA⁺) B-Zell-Lymphomzelllinie, die wir so entwickelten, dass sie das nahe-infrarote (NIR) fluoreszierende Protein emiRFP670 exprimierten.
   3. Übertragen Sie die benötigte Menge in ein 15-mL-Zentrifugenrohr mit konischem Boden.
   4. Zentrifuge (5 Min, 300 × g, RT, Beschleunigung = Maximum; Verzögerung [Bremse] = Maximum).
   5. Entsorge das Supernatant.
   6. Setzen Sie Zielzellen auf eine Endkonzentration von 2,5 × 10⁵ Zellen/mL (2,5 × 10⁴ Zellen/100 μL) in 2× SYTOX Orange Medien wieder auf.
      HINWEIS: Resuspendierte Zielzellen können bei 37°C mit 5 % CO₂ im Röhrchen bis zu 30 Minuten gehalten werden, während Effektorzellverdünnungen hergestellt werden.
      HINWEIS: Für eine vollständige Platte × 60 Bohrlöcher 2,5 × 10⁴ Zellen pro Bohrloch = 1,5 × insgesamt 106 Zielzellen. Bereite 2,0 × 10^{6 Zellen vor}, um den Verlust zu berücksichtigen. Passen Sie die Zellanzahl basierend auf der Probengröße und der gewünschten Saatdichte an.
3. Effektive Effektorzellen bereiten
   1. Bewertung der Konzentration und Lebensfähigkeit von NK-92-Zellen mit einer auf Farbstoffausschluss basierenden Zellzählmethode (z. B. Trypanblau) oder einer gleichwertigen validierten Methode. Fahren Sie nur vor, wenn die Viabilität ≥80 % beträgt, da eine geringere Viabilität die Assay-Leistung beeinträchtigen kann.
      HINWEIS: NK-92-Zellen, die konstruiert wurden, um das fluoreszierende Protein ZsGreen stabil zu exprimieren, entweder allein (Kontrolle) oder mit BCMA-gezielten CAR-Konstrukten, wurden als Effektorzellen verwendet.
   2. Zählen und übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in einzelne 15-mL-Zentrifugenröhren mit konischem Boden.
      HINWEIS: Berechnen Sie die Gesamtzahl der benötigten Effektorzellen, indem Sie die benötigte Anzahl der benötigten Zellen über alle E:T-Verhältnisse für eine Replikation addieren, mit der Anzahl der Replikate multiplizieren und 50 % Überschuss hinzufügen, um den Zellverlust zu berücksichtigen. Runde Zahlen nach Bedarf, um die Vorbereitung zu erleichtern. Zum Beispiel verwenden Sie für E:T-Verhältnisse von 2:1 bis 0,25:1 1,5 × 10⁵ NK-Zellen pro Replikat. Für Trilikate bereiten Sie 4,5 × 10⁵ Zellen pro Bedingung vor, basierend auf dem in ergänzender Abbildung 1A beschriebenen Plattenlayout.
   3. Zentrifugenzellen (5 Min, 300 × g, RT, Beschleunigung = Maximum; Verzögerung [Bremse] = Maximum).
   4. Entsorge das Supernatant.
   5. Die Zellen werden auf eine Endkonzentration von 5,0 × 10⁵ Zellen/ml (5,0 × 10⁴ Zellen/100 μL) wieder suspendiert.
4. Vorbereitung von Effektorzellverdünnungen
   1. Bereiten Sie Effektorzellverdünnungen vor, einschließlich einer Ziel-Only-Kontrolle, in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden (siehe ergänzende Abbildung 1A für ein repräsentatives Plattenlayout mit vier Bedingungen in dreifachen Exemplaren). Jede Bedingung wird in dreifacher Ausgabe vorbereitet.
   2. Fügen Sie 240 μL/Bohrloch von Effektorzellen (5,0 × 10⁵ Zellen/mL) zu Wells hinzu, was einem E:T-Verhältnis von 2:1 entspricht.
   3. Fügen Sie 120 μL/Bohrloch Medien zu allen verbleibenden Bohrlöchern hinzu.
   4. Führen 2-fache serielle Verdünnungen von E:T = 2:1-Bohrungen bis E:T = 0,25:1-Bohrungen durch. Gründlich durch Pipettern ≥5 Mal und Wechsel der Spitzen zwischen den Transfers.
      HINWEIS: Sollten Bildgebende Untersuchungen im Bildgebungssystem nicht geplant werden, sollten Sie diese vor der Vorbereitung der Kokultur planen. Vorbereitete Effektorzell-Verdünnungen können bei 37°C mit 5 % CO₂ in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden bis zu 30 Minuten aufrechterhalten werden, während das Live-Cell-Bildgebungssystem eingerichtet wird.
5. Aufbau von Kokultur
   1. Erhalten Sie die mit Poly-D-Lysin beschichtete flache 96-Well-Platte.
   2. Fügen Sie allen Bohrlöchern 100 μL/Bohrloch Zielzellsuspension hinzu. Richte die Zielzellen vor der Abgabe gründlich wieder auf, indem du ≥5 Mal mit einer geeigneten Pipette (z. B. 200 μL) auf und ab pipettieren solltest, um die Blasenbildung während des Transfers zu vermeiden.
   3. Fügen Sie 100 μL/Brunnen Effektorzellsuspension zu den entsprechenden Bohrungen hinzu. Lassen Sie die Effektorzellen unmittelbar vor der Abgabe gründlich wieder suspendieren, indem Sie ≥5 Mal mit einer geeigneten Pipette (z. B. 200 μL) auf und ab pipettieren und Blasenbildung während des Transfers vermeiden.
   4. Fügen Sie 200 μL/bohrloch-PBS zu den umliegenden ungenutzten Bohrlöchern hinzu.
   5. Zentrifugieren Sie die Platte (2 Min, 100 × g, RT, Beschleunigung = niedrig [z. B. 2]; Verzögerung [Bremse] = niedrig [z. B. 2]).
      HINWEIS: Dieser weiche Spin ist entscheidend, um die Zellen schnell und gleichmäßig am Boden des Bohrlochs für eine genaue Bildgebung auf der IncuCyte SX5 zu platzieren. Wir verwenden eine Eppendorf-Zentrifuge 5810R mit Schwing-Bucket-Rotor und Beschleunigungseinstellungen auf 2 (von 9).
   6. Platzieren Sie die Platte in das Live-Cell-Bildgebungssystem und nehmen Sie alle 1 Stunde für 24 Stunden Bilder auf (bei Bedarf bis zu 72 Stunden verlängerbar). Stellen Sie sicher, dass die Bildgebung unter standardisierten Inkubationsbedingungen (37°C/5 % CO₂) durchgeführt wird.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass die Bildgebung bei t = 0 h die Ausgangszielzellzählungen genau widerspiegelt, beginnen Sie die Bildaufnahme innerhalb von 10–15 Minuten nach Kokulturaufbau und Zentrifugation. Bei einer Vollplatte mit drei Bildkanälen (d. h. grün, orange und NIR) beträgt die Scanzeit etwa 10 Minuten pro Stunde für 3 Bilder pro Bohrloch bei 20× Vergrößerung.
   7. Überprüfe die Bildqualität nach dem ersten Scan und passe die Einstellungen bei Bedarf an.
6. Instrumenteneinstellungen
   1. Stellen Sie das spektrale Unmixing ein, um die Fluoreszenzüberlagerung von SYTOX Orange in den grünen Kanal zu korrigieren. Passen Sie den Unmix-Wert in der Software an, indem Sie die grünen und orangen Kanäle vergleichen und bestätigen, dass Orange⁺ tote Zellen nicht fälschlicherweise als Green⁺ erkannt werden. Für das repräsentative Experiment (Abbildung 1) wurde der Beitrag des orangen Kanals zum grünen Kanal auf 8,5 % gesetzt. Diese Werte sind datensatzspezifisch und sollten für jedes Experiment optimiert werden.
   2. Konfigurieren Sie die nicht-adhärente Zell-für-Zell-Analyse, um eine genaue Segmentierung und Maskierung aller Zellen innerhalb jedes Sichtfelds sicherzustellen (siehe ergänzende Abbildung 1B für die repräsentative Einrichtung). Die folgenden Parameter werden für das Live-Cell-Bildgebungssystem unter Verwendung von Suspensionseffektor- und Zielzelllinienmodellen empfohlen:
      1. Setzen Sie den erwarteten Objektdurchmesser auf 15 μm (ungefährer Zelldurchmesser).
      2. Stellen Sie die Schwellen- und Texturempfindlichkeit auf 5 ein.
      3. Stellen Sie die Kantenempfindlichkeit auf 10 ein, um die Trennung der Zellcluster zu erleichtern.
      4. Stellen Sie den akzeptierten Filterbereich für Objektflächen auf 50–2000 μm² ein, um Trümmer und große Objekte auszuschließen.
      5. Setzen Sie das Exzentrizitätsmaximum auf 0,95, um nichtzelluläre Objekte auszuschließen.
   3. Klassifizierungsschwellenwerte konfigurieren (siehe ergänzende Abbildung 1C für repräsentative Gating). Verwenden Sie Ziel-only Kontrollbrunnen, um die Ausgangspopulation NIR^+/Orange⁻ lebende Zielzelle zu definieren. Anschließend werden Kokulturbrunnen zu späteren Zeitpunkten (z. B. t = 4 H) verwendet, um eine klare Trennung mit minimaler Überlappung zwischen NIR⁺/⁻ - und Orange⁺/⁻ -Populationen zu bestätigen. Beispiele für Klassifikationsschwellen und Analyseparameter sind in ergänzender Abbildung 1C dargestellt.
      1. Setze die Orange-Intensitätsschwelle auf etwa 15.
      2. Setze die NIR-Intensitätsschwelle auf etwa 0,1.
         HINWEIS: Parameter- und Schwellenwerte können je nach Instrument, Software, Zelllinienmodell und Fluoreszenzsignalintensität variieren.
         HINWEIS: Dieses Protokoll kann für primäre humane NK-Zell-Zytotoxizität oder ADCC-Assays angepasst werden, wenn Zielzellen stabil NIR-Fluoreszenz exprimieren (z. B. emiRFP670). Es kann auch für Durchflusszytometrie-basierte Tötungstests angepasst werden, indem Poly-D-Lysin-Beschichtung weggelassen und flache oder rundbodenige 96-Well-Platten verwendet werden.

Abbildung 1. Quantifizierung der Kinetik und Potenz der chimerischen Antigenrezeptor-(CAR) NK-92-zellvermittelten Zytotoxizität mittels Echtzeit-Lebendzellbildgebung. (A) Schematische Übersicht des IncuCyte Live-Cell-Bildgebungstests zur Überwachung der NK-zellvermittelten Zytotoxizität. ^BCMA+ Ramos-Zielzellen, die emiRFP670 (naher infraroter [NIR]-Kanal) exprimieren, werden mit NK-92-Effektorzellen kokultiviert, die ZsGreen (grüner Kanal) exprimieren, und der Zelltod wird mit SYTOX Orange (oranger Kanal) nachgewiesen. (B) Repräsentatives Fluoreszenzbild eines Kokulturbrunnens mit einem Effektor-Ziel-(E:T)-Verhältnis von 1:1 bei 12 Stunden. Lebende Ziel-Zellen (emiRFP670⁺) sind blau dargestellt, NK-92-Effektorzellen (ZsGreen⁺) in Grün und tote Zellen (SYTOX Orange⁺) in Rot. Die Bilder wurden mit dem nicht-haftenden Cell-by-Cell-Analysemodul mit 20× Vergrößerung aufgenommen. Skala = 100 μm. (C) Quantifizierung des Wachstums und Überlebens von Zielzellen über die Zeit bei unterschiedlichen E:T-Verhältnissen für Kontroll- und CAR-exprimierende NK-92-Zellen. (D) Quantifizierung des Überlebens von Zielzellen als Funktion des E:T-Verhältnisses an mehreren Zeitpunkten (4, 8, 16 und 24 Stunden). Zielzellzählungen wurden zu jedem Zeitpunkt auf Ziel-only Wells (E:T = 0:1) normalisiert. (E) Schematische Darstellung quantitativer Metriken zur Bewertung der Zytotoxizität: KR₅₀, Killer-zu-Ziel-Verhältnis erforderlich, um 50 % Killing bei 12 Stunden zu erreichen; KT₅₀, benötigte Zeit, um 50 % Killing bei einem E:T-Verhältnis von 1:1 zu erreichen; und IKI₅₀, integrierter Killerindex, definiert als der Bereich der Heatmap unterhalb der 50%-Überlebens-Isoklin. (F) Heatmaps, die das Wachstum und das Überleben der Zielzellen als Funktion des E:T-Verhältnisses und der Zeit für jeden Effektorzustand zeigen. Quantitative Werte für KR₅₀, KT₅₀ und IKI₅₀ sind für jede Erkrankung angegeben. Rohe lebende Zielzellzählungen wurden aus der gated NIR^+/SYTOX Orange^– Population mithilfe einer Zell-für-Zell-Klassifikationsanalyse in der IncuCyte 2021C-Software gewonnen. Alle Bedingungen wurden dreifach durchgeführt (n = 3). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung präsentiert. Die nichtlineare Regressionsanalyse wurde verwendet, um Zytotoxizitätstrends in den Panels D und F zu modellieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Quantifizierung der antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizität mittels Durchflusszytometrie

1. Primäre menschliche NK-Zellen bereiten
   HINWEIS: Primäre humane NK-Zellen wurden aus leukozytengreichertem peripherem Blut isoliert, das von gesunden erwachsenen Spendern mit einer NK-Zellanreicherungsmethode gefolgt von Dichtegradientenzentrifugation gewonnen wurde, wie zuvor beschrieben³. Gereinigte NK-Zellen wurden bei 5 × 10⁶ Zellen/ml in Gefrierlösung (90 % FBS und 10 % Dimethylsulfoxid [DMSO]) als 0,5-ml-Aliquoten in Kryovialen kryokonserviert und bis zur Verwendung³ bei weniger als −150 °C gelagert.
   1. Taue ein Fläschchen mit 5 × 10^{6 primären} menschlichen NK-Zellen auf, indem du das Kryovial vorsichtig in einem 37°C-Wasserbad etwa 1 Minute lang bewegt, bis nur noch ein kleiner Eiskristall übrig bleibt.
      VORSICHT: Behandeln Sie alle vom Menschen stammenden Proben mit geeigneten Biosicherheitsverfahren und persönlichen Schutzmitteln gemäß den institutionellen Richtlinien.
      VORSICHT: DMSO erleichtert die Hautaufnahme von Chemikalien. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung und vermeiden Sie direkten Kontakt.
   2. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen in ein 15-mL konisches Zentrifugenrohr mit 10 ml vorgewärmtem (37°C) NK-Zellkulturmedium und mischen Sie es durch sanftes Wirbeln.
      HINWEIS: Das NK-Zellkulturmedium besteht aus Advanced RPMI-1640, ergänzt mit 10 % FBS, 10 % humanem AB-Serum, 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin, 100 μg/mL Primocin und 50 U/mL humanem IL-2.
   3. Zentrifugenzellen (5 Min, 300 × g, RT, Beschleunigung = Maximum; Verzögerung [Bremse] = Maximum).
   4. Entsorge das Supernatant.
   5. Setzen Sie das Pellet in 5 mL vorgewärmtes (37°C) NK-Zellkulturmedium wieder auf.
   6. Zentrifugenzellen (5 Min, 300 × g, RT, Beschleunigung = Maximum; Verzögerung [Bremse] = Maximum).
   7. Entsorge das Supernatant.
   8. Setzen Sie das Pellet in 1 ml vorgewärmtes NK-Zellkulturmedium wieder auf.
   9. Übertragen Sie die Suspension in einen Brunnen einer 24-Wellen-Gewebekulturplatte.
   10. Fügen Sie 1 ml steriles PBS in die umliegenden Brunnen hinzu, um die Verdunstung zu minimieren.
   11. Inkubieren Sie die 24-Well-Platte bei einem Winkel von 45° (mit einem Plattengestell oder einer Stütze zur Aufrechterhaltung des Winkels) bei 37°C und 5 % CO₂ für 16–24 Stunden, um die NK-Zell-Rückgewinnung zu ermöglichen.
       HINWEIS: Primäre menschliche NK-Zellen benötigen einen engen Kontakt zwischen Zellen und Zellen für maximales Überleben und Erholung, was durch das Kippen der 24-Well-Platte und das Ermöglichen einer Ansammlung am Rand der Brunnen erreicht werden kann. Halten Sie eine konstante Inkubationszeit über die Experimente hinweg aufrecht.
       HINWEIS: Nach der Erholungsphase wird direkt mit der Vorbereitung der Zielzelle und der Kokultivierung übergefahren.
2. Färbungszielzellen mit Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE).
   1. Nehmen Sie 5 × 10⁵ Zielzellen und übertragen Sie sie in eine 15-mL konische Zentrifugenröhre.
      HINWEIS: Eine CD38⁺-Patientenabgeleitete Lymphomzelllinie wurde als Zielzell¹⁶ verwendet.
   2. Wasche die Zellen einmal mit 10 mL PBS.
   3. Zentrifugenzellen (5 Min, 300 × g, RT, Beschleunigung = Maximum; Verzögerung [Bremse] = Maximum).
   4. Bereiten Sie eine 0,5 μM Arbeitslösung von CFSE in PBS mit einer 5 mM großen Serienlösung vor, indem 1 μL 5 mM CFSE-Lager in 10 mL PBS in einem 15-mL konischen Zentrifugenrohr verdünnt wird.
      VORSICHT: CFSE ist ein reaktiver, aminbindender fluoreszierender Farbstoff und kann Risiken bei Haut- oder Augenexposition bergen. Behandeln Sie mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung und entsorgen Sie ungenutztes Reagenz gemäß den örtlichen Biosicherheitsrichtlinien.
   5. Entsorge das Supernatant.
   6. Setzen Sie das Pellet mit etwa 1 × 10^{6 Zellen} /mL in der CFSE-Lösung wieder auf.
   7. Inkubieren Sie 15 Minuten bei 37°C, wobei das Rohr in Alufolie eingewickelt oder in einen undurchsichtigen Behälter gelegt wird, um vor Licht zu schützen.
   8. Dämpfen Sie die Reaktion, indem Sie 5–10 Bände Kulturmedium hinzufügen.
   9. Inkubiere 5 Minuten bei 37°C.
   10. Zentrifugenzellen (5 Min, 300 × g, RT, Beschleunigung = Maximum; Verzögerung [Bremse] = Maximum).
   11. Entsorge das Supernatant.
   12. Resuspendiere die Zellen bei 2,5 × 10⁵ Zellen/mL, sodass 100 μL 2,5 × 104^{Zellen enthalten} .
       HINWEIS: Gehen Sie direkt zur Beschichtung über, um eine konstante CFSE-Signalintensität und die Lebensfähigkeit der Zielzelle aufrechtzuerhalten.
3. Plattenzielzellen
   1. Erhalten Sie eine 96-Bohrloch-Platte mit rundem Boden.
   2. Fügen Sie 100 μL/Wellen der Zielzellen (2,5 × 10⁵ Zellen/mL) mit einer Mehrkanalpipette zu den vorgesehenen Bohrlöchern hinzu (siehe ergänzende Abbildung 2). Jede Bedingung ist dreifach angelegt.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension vor dem Plattieren homogen ist.
4. Antikörper vorbereiten und hinzufügen
   1. Bereiten Sie 200 μL 4× Antikörperlösung (100 μg/mL) in einem NK-Zellkulturmedium für jeden Testantikörper und jede abgestimmte Isotypkontrolle vor.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist modular und kann an jeden Antikörper angepasst werden, der ADCC gegen die gewählte Zielzelllinie vermittelt. Die Konzentrationen und Formulierungen von Antikörpern können variieren; Passen Sie die Verdünnungen entsprechend an. Konservierungsstoffe wie Azid können das Überleben der Zielzellen und die Funktionalität der NK-Zellen beeinträchtigen. Während eine Reihe von Antikörperkonzentrationen getestet werden kann, wird hier eine Endkonzentration von 25 μg/mL verwendet.
   2. Übertragen Sie Antikörperlösungen auf eine Tiefbrunnenplatte.
   3. Fügen Sie 50 μL/Brunnen Antikörperlösung zu den Zielzellen hinzu und mischen Sie gründlich durch Pipettieren ≥5 Mal.
   4. Fügen Sie 50 μL/Bohrloch NK-Zellkulturmedium zu Antikörper-Kontrollbrunnen hinzu und mischen Sie gründlich durch Pipettieren ≥5 Mal.
   5. Inkubieren Sie 25–30 Minuten bei 37°C mit 5 % CO₂.
5. Bereite NK-Zellen vor und füge sie hinzu
   1. Zählen und erhalten Sie 2 × 10⁵ NK-Zellen mit einer auf Farbstoff ausgeschlossenen Zellzählungsmethode (z. B. Trypanblau) oder einer gleichwertigen validierten Methode. Die Anzahl reicht für drei NK-zellhaltige Bedingungen aus, die dreifach plattiert sind, wobei ein Überschuss den Pipettverlust berücksichtigt (siehe ergänzende Abbildung 2). Fahren Sie fort, wenn die Viabilität ≥75 % beträgt, da eine geringere Viabilität die Assay-Leistung beeinträchtigen kann.
   2. Die Zellen werden auf 2,5 × 10⁵ Zellen/mL in 800 μL primärem humanem NK-Zellkulturmedium resuspendiert (Endkonzentration = 1,25 × 10⁴ Zellen/50 μL).
   3. Fügen Sie 50 μL/Bohrloch NK-Zellen zu den entsprechenden Brunnen hinzu und mischen Sie gründlich durch ≥5-faches Pipetieren.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension vor dem Plattieren homogen ist.
   4. Fügen Sie 50 μL/Brunnen Kulturmedium hinzu, um die Bohrlöcher zu kontrollieren, und mischen Sie gründlich durch ≥5 Pipettieren.
6. Einrichtung der finalen Kokultur
   1. Inspizieren Sie sorgfältig die 96-Bohrloch-Platte mit rundem Boden und bestätigen, dass alle Bohrlöcher 200 μL mit gleichmäßigen Meniskuswerten und ohne Blasen enthalten.
   2. Zentrifugieren Sie die Platte (2 Min, 100 × g, Beschleunigung = niedrig [z. B. 2]; Verzögerung [Bremse] = niedrig [z. B. 2]).
      HINWEIS: Dieser weiche Spin ist wichtig, um Zellen schnell zu beruhigen und den Kontakt zwischen Zelle zu erhöhen. Wir verwenden eine Eppendorf-Zentrifuge 5810R mit Schwing-Bucket-Rotor und Beschleunigungseinstellungen auf 2 (von 9).
   3. Inkubieren Sie 16–18 Stunden (über Nacht) bei 37°C mit 5 % CO₂.
      HINWEIS: Diese Inkubationsdauer ist für die Zytotoxizitätsanzeige optimiert und nicht für die Degranulation, die am besten durch die Messung der CD107a-Expression zu früheren Zeitpunkten (2–6 H) bewertet werden kann. Daher können die Spitzen-Degranulationsantworten unterschätzt werden.
      HINWEIS: Die Inkubation wird nicht über 18 Stunden hinaus verlängert, da eine verlängerte Kokultur zu übermäßigem Zielzelltod in Kontrollbrunnen und zu einem verringerten Dynamikumfang zwischen den experimentellen Bedingungen führen kann.
7. Durchflusszytometrie durchführen
   1. Zentrifuge (5 Min, 300 × g, Beschleunigung = Maximum; Verzögerung [Bremse] = Maximum).
   2. Entsorge das Supernatant.
   3. Wasche alle Bohrlöcher mit 200 μL/Bohrloch FACS-Puffer (2 % FBS, 2 mM EDTA in PBS).
   4. Bereiten Sie eine Oberflächenantikörper-Mastermischung im FACS-Puffer vor, indem Sie CD56-BV421 bei 1:50 Verdünnung, CD16-BV785 bei 1:50 Verdünnung und CD107a-PE-Cy7 bei 1:25 verdünnen.
      HINWEIS: Berechnen Sie das gesamte Mastermixvolumen basierend auf dem experimentellen Plattendesign (Anzahl der Bohrungen × 50 μL/Bohrloch + 20 % Überschuss). Antikörperklone können sich in der Färbungsintensität und der Epitope-Zugänglichkeit unterscheiden. Klone, die in den repräsentativen Daten verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt, und alternative Klone benötigen möglicherweise eine Titration. Zusätzliche Antikörper können für die Phänotypisierung von NK-Zell-Subsets (z. B. KIRs, NKG2A/C/D und CD57) und Aktivierungsmarker (z. B. CD69 und HLA-DR) einbezogen werden.
   5. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μL/Brunnen Antikörper-Mastermischung und mischen Sie gründlich durch Pipettieren ≥5 Mal.
   6. Inkubieren Sie 15 Minuten bei 4 °C, wobei der Teller in Alufolie eingewickelt oder in einen undurchsichtigen Behälter gelegt wird, um vor Licht zu schützen.
   7. Füge 150 μL/Welle des FACS-Puffers hinzu.
   8. Zentrifuge (5 Min, 300 × g, Beschleunigung = Maximum; Verzögerung [Bremse] = Maximum).
   9. Entsorge das Supernatant.
   10. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL/Well von 5 μM 4′,6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) im FACS-Puffer und beginnen Sie sofort mit der Flowzytometrie-Aufnahme. Eine Pre-Acquisition-Inkubation ist nicht erforderlich.
   11. Daten werden durch Durchflusszytometrie erfasst und Fluoreszenzkanäle für CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI und weitere Fluorophore erfasst.
       HINWEIS: Erfassungseinstellungen (z. B. Detektorspannungen, Kompensation und Gating) können eine Optimierung erfordern. Verwenden Sie unbefleckte und einzelfarbene Kontrollen für Kompensation und Gitterbefestigung, mit Kompensationsperlen oder repräsentativen Zellen, je nach Angelegenheit. Fluoreszenz-minus-eins-Kontrollen sollten für Marker mit kontinuierlicher oder schwacher Expression (z. B. CD107a) in Betracht gezogen werden. Beibehalten Sie konsistente Einstellungen und Gating-Strategien, einschließlich lebender und toter Gating sowie Identifikation von Ziel- und Effektorpopulationen, über Experimente hinweg.
       HINWEIS: Sowohl Schritt 1 als auch Schritt 2 können für adhärente Zielzellen angepasst werden. Samen zielen Zellen (mit ihren jeweiligen Kulturmedien) in einer flachen 96-Well-Platte einen Tag vor der Kokultivierung mit einer Dichte, die am Tag des Tests etwa 70 % Konfluenz erreicht. Nach Bestätigung der Haftung entsorgen Sie das Zielzellmedium und ersetzen durch 100 μL frisches NK-Zell-Medien, dann fügen Sie Effektorzellen hinzu, um die Kokultur einzuleiten. Aufgrund von Unterschieden in Zellgröße und Morphologie sollten IncuCyte-Zell-für-Zell-Analyseparameter für jede adhärente Zelllinie optimiert werden.
       HINWEIS: Für Durchflusszytometrie-basierte Tests mit adhärenten Zellen wird nach der Kokultur die Platte (300 × g, 5 min) zentrifugiert und der Supernatant entsorgt. Fügen Sie 100 μL/Bohrung TrypLE hinzu und inkubieren Sie bei 37°C mit 5 % CO2_{für etwa} 5–15 Minuten (je nach Zelllinie), um die Zellen abzukoppeln. Fügen Sie 100 μL/Bohrloch FACS-Puffer hinzu, mischen Sie durch Pipettieren in einer kreisförmigen Bewegung auf und übertragen Sie alle Zellen auf eine 96-Bohrloch-Platte mit rundem Boden. Untersuchen Sie die Brunnen mikroskopisch, um die vollständige Ablösung zu bestätigen, bevor Sie mit der Färbung beginnen (Schritt 2, Unterschritt 7). Optimieren Sie die TrypLE-Inkubationszeit nach Bedarf, um eine Einzelzellsuspension zu erreichen.

Ergebnisse

Um die Zytotoxizität von NK-Zellen in Echtzeit zu quantifizieren, wurden NK-92-Effektorzellen, die zur Expression von Anti-BCMA-CARs konstruiert wurden, mit BCMA⁺ Ramos-Zielzellen in einer schwarzen, klaren flachen 96-Well-Platte kokultiviert und mittels lebender Zellbildgebung überwacht (Abbildung 1A und ergänzende Abbildung 1A). Effektorzellen wurden bei E:T-Verhältnissen von 0:1 (nur Ziel), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 und 2:1 hinzugefügt, wobei jede Bedingung im Dreifachverfahren ausgeführt wurde. Drei verschiedene CAR-NK-92-Konstrukte wurden bewertet: CAR1 ohne kostimulierende Domäne, CAR2 mit einer 4-1BB (CD137) kostimulierenden Domäne und CAR3 mit einer DAP10-kostimulatorischen Domäne, zusammen mit Kontrollzellen von NK-92, die einen ausschließlich ZsGreen-Vektor exprimieren. Alle Effektorzellen wurden durch lentivirale Transduktion erzeugt, wie zuvor beschrieben⁴ mit ZsGreen-P2A-CAR-Transgenkassetten. Ramos-Zielzellen wurden ähnlich mit einem emiRFP670-codierenden lentiviralen Vektor transduziert. Das Wachstum und Überleben der Zielzellen wurden stündlich über einen Zeitraum von 24 Stunden mit dem Live-Cell-Bildgebungsinstrument verfolgt, wobei die grüne Fluoreszenz für ZsGreen⁺ NK-92-Zellen, die orangefarbene Fluoreszenz für SYTOX Orange^+- tote Zellen und die NIR-Fluoreszenz für emiRFP670⁺ Zielzellen gemessen wurden (Abbildung 1A und ergänzende Abbildung 1B und 1C).

Mikroskopische Bilder wurden in festgelegten Zeitintervallen aufgenommen, um Effektorzellen, lebende Zielzellen und tote Zellen während der Kokultur zu visualisieren (Abbildung 1B). Die Quantifizierung des Wachstums und des Überlebens von Zielzellen zeigte, dass CAR2- und CAR3-NK-92-Zellen eine schnellere Tötungskinetik aufwiesen als CAR1-NK-92-Zellen, insbesondere zu früheren Zeitpunkten bei einem E:T-Verhältnis von 1:1. Die Tötung von Zielzellen nahm mit höheren E:T-Verhältnissen zu, einschließlich der Kontrollzellen von NK-92, die natürliche Zytotoxizität zeigten (Abbildung 1C). Diese Messungen unterstreichen die Fähigkeit der Live-Cell-Bildgebung, dynamische Veränderungen der zytotoxischen Aktivität zu erfassen. Das Überleben von Zielzellen wurde ebenfalls als Funktion des E:T-Verhältnisses zu definierten Zeitpunkten analysiert, um die Potenz von CAR NK-92 zu vergleichen. CAR2- und CAR3-NK-92-Zellen zeigten eine höhere Potenz bei niedrigeren E:T-Verhältnissen zu späteren Zeitpunkten (z. B. E:T = 0,25:1 bei 24 Stunden) und bei mittleren E:T-Verhältnissen zu früheren Zeitpunkten (z. B. E:T = 1:1 bei 4 Stunden) (Abbildung 1D). Zwischen den CAR2- und CAR3 NK-92-Effektorzellen wurden keine signifikanten Unterschiede im Töten zwischen den Analysen beobachtet.

Eine Heatmap, die das E:T-Verhältnis, die Ko-Inkubationszeit und das Überleben der Zielzellen integriert, bietet eine umfassende Visualisierung der natürlichen und CAR-vermittelten Zytotoxizität in allen Effektorpopulationen und ermöglicht eine quantitative Bewertung. Drei Parameter wurden definiert, um Potenz und Kinetik zu quantifizieren: KR₅₀, das Killer-zu-Ziel-Verhältnis, das 50 % Tötung (bei 12 Stunden) erreicht; KT₅₀, die Co-Inkubationszeit, die benötigt wird, um 50 % Killing zu erreichen (bei einem E:T-Verhältnis von 1:1); und IKI₅₀, der integrierte Killer-Index, der den Bereich der Heatmap unter 50 % Überlebensrate darstellt, definiert durch das 50 % Überlebens-Isoklin (Abbildung 1E). Diese Kennzahlen ermöglichen den Vergleich der Zellpotenz von CAR NK-92 (KR₅₀), der Killing-Kinetik (KT₅₀) und der integrierten zytotoxischen Leistung (IKI₅₀) (Abbildung 1F). Diese Analyse zeigt, wie der Assay quantitativ konstruierte NK-Zellplattformen über mehrere Parameter innerhalb eines einzigen Experiments hinweg vergleichen kann.

Flusszytometrie mit Zellzählung wurde verwendet, um ADCC zu messen, indem fluoreszenzmarkierte Zielzellen mit primären humanen NK-Zellen in Anwesenheit oder Fehlen therapeutischer Antikörper kokultiviert und die verbleibende lebende Zielzellpopulation nach 16–18 Stunden Inkubation quantifiziert wurde (Abbildung 2A). Durchflusszytometer wie Cytek Aurora, BD Symphony oder BD Fortessa mit einem Hochdurchsatz-Probenehmer können verwendet werden. Im repräsentativen Aufbau (Ergänzungsabbildung 2) wurden CD38⁺ -Patienten-abgeleitete Lymphom-Zielzellen in einer 96-Well-Platte mit rundem Boden plattiert, und Daratumumab (oder Isotyp-Antikörper) wurde zu geeigneten Wells hinzugefügt. NK-Zellen wurden anschließend mit einem E:T-Verhältnis von 0,5:1 kokultiviert, einem Verhältnis, das für diese Zielzellen optimiert wurde, um natürliche Tötung zu minimieren und gleichzeitig ADCC zu erkennen. Nach der Inkubation wurde Flusszytometrie durchgeführt, um Zellpopulationen mittels Vorwärts- und Seitenstreuung aufzulösen, nicht lebensfähige Ereignisse mittels DAPI auszuschließen und CFSE⁺ -Zielzellen von CD56⁺CD16⁺ NK-Zellen für eine parallele Analyse zu trennen (Abbildung 2B). Dieses Design ermöglicht eine gleichzeitige Messung von Zytotoxizität und phänotypische Charakterisierung.

Abbildung 2. Der auf Flow Cytometrie basierende antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) Assay ermöglicht eine gleichzeitige Quantifizierung des Überlebens der Zielzellen und der Aktivierung der NK-Zellen. (A) Schematische Übersicht des ADCC-Assays. CFSE-markierte CD38^+-Lymphom-Zielzellen wurden mit 2,5 × 10^{4 Zellen pro} Welle plattiert und unter fünf Bedingungen kultiviert: Zielzellen allein; Zielzellen mit Daratumumab (25 μg/mL); Zielzellen mit NK-Zellen (E:T = 0,5:1); Zielzellen mit NK-Zellen und Daratumumab; und Zielzellen mit NK-Zellen und Isotyp-Kontrollantikörper (25 μg/mL). (B) Repräsentative Durchflusszytometrie-Gating-Strategie. Ereignisse wurden zunächst durch Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung gesteuert, gefolgt vom Ausschluss nicht-lebensfähiger Zellen mittels DAPI. Zielzellen wurden als CFSE^+-Ereignisse identifiziert, NK-Zellen als CD56⁺ und CD16^+-Ereignisse. Die Degranulation von NK-Zellen wurde anhand der CD107a-Expression bewertet. (C) Quantifizierung des Überlebens der Zielzelle, ausgedrückt als Prozentsatz relativ zur Ziel-reinen Kontrollbedingung (auf 100 % gesetzt). (D) Quantifizierung der NK-Zell-Degranulation, angegeben als Prozentsatz der CD107a^+-Zellen innerhalb der NK-Zellpopulation. Balken stehen für Mittelwert ± Standardabweichung, und überlagerte Punkte stehen für einzelne Replikationsbohrlöcher (n = 3). Die statistische Analyse wurde mit einer Einweg-Varianzanalyse mit Tukeys post-hoc-Mehrfachvergleichstest durchgeführt. Die statistische Signifikanz ist wie folgt angegeben: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Der primäre Endpunkt ist das Überleben der Zielzelle, berechnet innerhalb des Live-CFSE⁺ -Gates und auf die Ziel-only-Bedingung, die auf 100 % Überleben gesetzt ist. Diese Normalisierung steuert den spontanen Verlust von Zielzellen und ermöglicht einen direkten Vergleich zwischen den Bedingungen. In repräsentativen Daten (Abbildung 2C) reduzierte die Zugabe von Daratumumab allein das Überleben der Zielzellen nicht, was bestätigt, dass der Antikörper ohne Effektorzellen keinen direkten Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zielzellen hat. Die Kokultur mit NK-Zellen allein reduzierte das Überleben der Zielzellen auf etwa 70 %, was auf natürliche Zytotoxizität im Ausgangszustand hinweist. Die Zugabe von Daratumumab reduzierte das Überleben weiter auf etwa 37 %, was mit einer verstärkten antikörpervermittelten Tötung übereinstimmt, während der Isotyp-Kontrollzustand eine Überlebensrate von etwa 62 % zeigte, vergleichbar mit der NK-reinen Erkrankung. Erfolgreiche Experimente zeigen eine klare Trennung zwischen antikörperbehandelten und Kontrollbedingungen mit hoher Reproduzierbarkeit über Replikaten hinweg.

Die sekundäre Phänotypisierung von NK-Zellen liefert komplementäre Bestätigung des Zusammenhangs zwischen Zielzell-Killing und Effektoraktivierung. Die NK-Zell-Degranulation, gemessen als Prozentsatz der CD107a⁺ NK-Zellen, war bei der Kokultivierung von NK-Zielzellen ohne Antikörper am niedrigsten und am höchsten bei der mit Daratumumab behandelten Erkrankung (etwa 31 %), wobei die Isotyp-Kontrolle eine intermediäre Degranulation (ca. 19 %) zeigte, was eine antikörpervermittelte Aktivierung unterstützte (Abbildung 2D). Diese Ergebnisse zeigen, dass der Assay Zielzelltötung von Effektoraktivierung unterscheiden kann. Obwohl Degranulations- und Überlebenstrends im Allgemeinen ausgerichtet sind, überschneiden sie sich nicht vollständig, was darauf hindeutet, dass sie verwandte, aber unterschiedliche biologische Prozesse darstellen.

Suboptimale Experimente zeigen typischerweise eine verringerte Trennung zwischen den Zuständen, Variabilität der Zellzahlen zwischen den Bohrungen, einen hohen Zielzelltod in Kontrollbohrungen, eine schwache CFSE-Färbung oder erhöhte Hintergrunddegranulation. Diese Ergebnisse können auf eine schlechte Lebensfähigkeit der Zielzellen, inkonsistente NK-Zell-Wiederherstellung, unzureichende Mischung oder Variabilität bei Färbung und Erwerb zurückzuführen sein. Da der Test unabhängig Ziel- und Effektorkompartimente identifiziert, kann er erweitert werden, um zusätzliche Phänotypisierung von Zielzellen (z. B. Antigendichte oder Ligandenexpression) sowie eine umfassendere NK-Zellcharakterisierung einzuschließen. Die Einbeziehung einer "nur NK"-Bedingung kann die Baseline-Degranulation und die Lebensfähigkeit der NK-Zellen weiter quantifizieren. Dieses Multiparameter-Design ist ein wesentlicher Vorteil, da funktionelle Zytotoxizität neben mechanistischen Immunphänotypen interpretiert werden kann.

Ergänzende Abbildung 1. Repräsentativer Plattenlayout- und Analyse-Workflow für den Zytotoxizitätstest bei lebenden Zellen. (A) Repräsentatives 96-Well-Plattenlayout für den CAR NK-Zell-Killing-Assay. Vier Bedingungen der Effektorzellen sind in Quadranten angeordnet, die jeweils in E:T-Verhältnissen von 0:1 (nur Zielkontrolle), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 und 2:1 getestet werden, wobei jede Bedingung im dreifachen Zustand durchgeführt wird (insgesamt 60 Assay-Bohrungen). (B) Repräsentative Konfiguration der nicht-adhärenten Zell-für-Zell-Analyse in der IncuCyte 2021C-Software, die spektrale Entmischungs-, Segmentierungs- und Maskierungsparameter illustriert, die zur Identifizierung einzelner Effektor- und Zielzellen verwendet werden, während Trümmer und Aggregate ausgeschlossen werden. (C) Repräsentative Zell-für-Zell-Klassifikationsstrategie unter Verwendung von NIR versus SYTOX Orange Fluoreszenz zur Definition der lebenden Zielzellpopulation. Ziel-only Brunnen und Kokulturbrunnen zu einem Beispielzeitpunkt (t = 4 H) werden verwendet, um die Trennung zwischen lebenden und toten Zellpopulationen zu bestätigen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2. Repräsentative Plattenanordnung für einen auf Durchflusszytometrie basierenden ADCC-Assay. Repräsentatives 96-Well-Plattenlayout, das fünf experimentelle Bedingungen illustriert, veranschaulicht und dreifach über die Reihen B–D und Spalten 2–6 (Gesamtzahl der Assay-Wells = 15): (1) Ziel-Only-Kontrolle, (2) Zielzellen mit Daratumumab, (3) Zielzellen mit NK-Zellen, (4) Zielzellen mit NK-Zellen und Daratumumab und (5) Zielzellen mit NK-Zellen und Isotyp-Kontrollantikörper. Zielzellen wurden mit 2,5 × 10⁴ Zellen pro Bohrloch plattiert, und NK-Zellen wurden mit 1,25 × 10⁴ Zellen pro Bohrloch hinzugefügt, um ein E:T-Verhältnis von 0,5:1 zu erreichen. Antikörper wurden bei einer Endkonzentration von 25 μg/mL verwendet. Die umliegenden Brunnen wurden mit PBS gefüllt, um die Verdunstung zu minimieren. Die Target-only-Bedingung wurde verwendet, um das Überleben der Zielzelle zu normalisieren, und die Isotyp-Kontrolle berücksichtigte die Antikörperformulierungseffekte unabhängig von der Antigen-Spezifität. Eine Optimierung des E:T-Verhältnisses kann je nach Anfälligkeit der Zielzelllinie erforderlich sein. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Diese Protokolle bieten zwei komplementäre Ansätze zur Quantifizierung der NK-Zell-Zytotoxizität in einem standardisierten 96-Well-Plattenformat. Schritt 1 verwendet Echtzeit-Lebendzell-Bildgebung, um den Verlust von Zielzellen kontinuierlich zu überwachen, und eignet sich hervorragend zur Bewertung der Kinetik natürlicher und CAR-vermittelter Tötung über mehrere E:T-Verhältnisse. Schritt 2 verwendet Flusszytometrie, um ADCC nach einer definierten Ko-Inkubationszeit zu quantifizieren, während gleichzeitig Ziel- und Effektorkompartimente für die phänotypische Analyse getrennt^{werden 17}. Diese Methoden, die als komplementäre Prüfplattformen präsentiert werden, um unterschiedliche biologische Prozesse zu modellieren, sind ebenfalls leicht austauschbar. Primäre menschliche NK-Zellen können für ADCC-Assays auf Basis lebender Zellbilder verwendet werden und können auch für CAR-vermittelte Tötung in Durchflusszytometrie-Assays entwickelt werden. Darüber hinaus ermöglicht die Einführung von CD16 (z. B. durch lentivirale Transduktion) die Einführung von CD16 (z. B. durch lentivirale Transduktion) NK-92-Zellen leicht, potente ADCC zu vermitteln. Daher können beide Assays auf individuelle wissenschaftliche und translationelle Bedürfnisse zugeschnitten werden.

Es gibt mehrere Schritte, die besonders wichtig für die Reproduzierbarkeit in beiden Assays sind. Kleine Veränderungen in der Anzahl der Effektorzellen und des Phänotyps können das Überleben der Zielzellen drastisch beeinflussen. Eine genaue Zellzählung und eine gründliche Resuspension während der Beschichtung sind unerlässlich, um Abweichungen der Zellzählung und unvollständige Mischung zu minimieren. Ebenso muss die Zellpräparation zwischen den Experimenten konsistent bleiben, einschließlich Lebensfähigkeit, Erholungszeit und vorheriger Zytokinexposition, um eine einheitliche Funktionalität des Effektors sicherzustellen. Die Plattengeometrie ist ein weiterer wichtiger Faktor für die Prüfungsleistung. Im Live-Cell-Imaging-Workflow unterstützen flach-unter-beschichtete Platten stabile Bildaufnahme und konsistente Feldanalysen, während im Flowzytometrie-Workflow Rundbodenplatten den Kontakt zwischen Zell und Zell fördern und die Rückgewinnung nicht adhärenter Kokulturen am Endpunkt erleichtern. Außerdem muss die Qualität der fluoreszierenden Markierung vor dem Test bestätigt werden, da schlechte Zielzell-Diskriminierung durch Bildgebung oder schwache CFSE-Trennung durch Durchflusszytometrie die Quantifizierung und Interpretation beeinträchtigen.

Diese beiden Arbeitsabläufe stellen unterschiedliche technische Überlegungen dar. Beim Live-Cell-Bildgebungsassay sind häufige Ursachen für schlechte Datenqualität ungleichmäßige Zellplattenbildung, dichte Zellcluster oder Klumpbildung sowie suboptimale Bildanalyse-Schwellenwerte, die alle leicht korrigierbar sind. Diese Probleme können die Zellanzahl verzerren und im Laufe der Zeit zu inkonsistentem Tracking führen. Im auf Durchflusszytometrie basierenden Test werden suboptimale Ergebnisse häufiger durch hohen Hintergrund-Zielzelltod, schwache Trennung von Ziel- und Effektorpopulationen, schlechte Antikörperfärbung oder inkonsistentes Pipetieren zwischen Replikationsbrunnen verursacht. Da diese Assays für vergleichende Analysen konzipiert sind, ist die Einbeziehung geeigneter interner Kontrollen für die Interpretation unerlässlich, darunter zielbasierte Kontrollen zur Normalisierung und abgestimmte negative Kontrollen für antikörper- oder CAR-spezifische Bedingungen.

Bei diesen Methoden müssen mehrere gemeinsame und assay-spezifische Einschränkungen berücksichtigt werden. Der Live-Cell-Bildgebungstest liefert eine zeitliche Auflösung, hängt jedoch von genauen fluoreszierenden Markierungs- und Bildanalyseparametern ab, die beide durch Zellclustering, spektrale Überlappung oder Veränderungen in der Morphologie während der Kokultur^beeinflusst werden können. In manchen Fällen, insbesondere wenn Assays primäre Effektorzellen betreffen, ist es schwierig oder nicht machbar, eine angemessene fluoreszierende Markierung ohne Veränderung der Tötungsdynamik zu erreichen. Der auf Flusszytometrie basierende Test bietet eine höhere phänotypische Auflösung an einem definierten Endpunkt, unterscheidet jedoch nicht unabhängig von Early von Late Killing, es sei denn, es werden mehrere übereinstimmende Zeitpunkte gesammelt, was kostspielig und zeitaufwendig sein kann¹⁷. Darüber hinaus können Endpunktmessungen nicht nur den Tod von Zielzellen widerspiegeln, sondern auch Unterschiede in der Proliferation der Zielzelle, der Effektorverschleiß oder der Wiederherstellung während der Probenbehandlung. Mechanistische Anzeigen wie CD107a lassen sich daher am besten als komplementäre Indikatoren für die Aktivierung der Effektorzelle interpretieren, nicht als direkte Substitute für die Elimination der Zielzelle¹⁹. Im weiteren Sinne reproduziert keine der beiden Plattformen vollständig die räumliche Architektur, stromalen Interaktionen, Zytokingradienten oder Trafficking-Einschränkungen, die die Funktion der NK-Zellen in vivo prägen.

Bei der Interpretation von NK-Zell-Kill-Assays müssen auch mehrere biologische Faktoren berücksichtigt werden. Die Spender-zu-Spender-Variabilität ist typisch für Experimente mit primären menschlichen NK-Zellen, die sich in zytotoxischem Potenzial und Teilmengezusammensetzung aufgrund von Spenderalter, Geschlecht, Infektionskrankheitsgeschichte und Rezeptorpolymorphismen unterscheiden²⁰. Die Verwendung von NK-92-Zellen reduziert die Variabilität erheblich, aber diese Zellen können dennoch quellen- und passagebezogene Veränderungen aufweisen¹⁸. Unser Protokoll mindert technische oder experimentelle Unterschiede durch standardisierte Parameter und Vergleiche mit denselben Platten, um diese biologischen Faktoren genauer zu bewerten. Wo möglich, empfehlen wir, definierte NK-92-Durchgangsbereiche mit festen Viabilitätsschwellen zu verwenden. Für primäre NK-Zellen sollten Assays NK-Zellen mehrerer Spender für jede Erkrankung verwenden, wobei statistische Analysen die Spender-zu-Spender-Variabilität berücksichtigen (z. B. gepaarte oder gemischte Effekte), da relative Unterschiede zwischen den Zuständen im Allgemeinen zwischen den Spendern erhalten bleiben. Darüber hinaus können zusätzliche NK-Zellmarker (z. B. KIRs, NKG2A/C/D und CD57) in Antikörperpanels integriert werden, die für die Durchflusszytometrie verwendet werden, um Teilmengenfrequenzen zwischen Spendern zu vergleichen und die subset-spezifische NK-Zellaktivierung (d. h. CD107a und CD69) zu bewerten, was die Interpretation der Ergebnisse weiter erleichtert. Schließlich müssen für alle NK-Zell-Tötungstests bestimmte zusätzliche Szenarien berücksichtigt werden. Die Expression zielgerichteter Antigene auf NK-Zellen, entweder durch endogene Expression oder durch den Erwerb von Antigenen aus Zielzellen durch Trogozytose, kann zu NK-Zell-Fratricide und Störungsergebnissen führen. Zum Beispiel kann Daratumumab CD38 anvisieren, das auf NK-Zellen exprimiert wird, und Brudermord²¹ induzieren, wodurch die Stärke von ADCC gegenüber den vorgesehenen Zielen begrenzt wird. Glücklicherweise ermöglichen Lebendzellbildgebung und Durchflusszytometrie-Assays die Quantifizierung von NK-Zellen zur Beurteilung von Brudermord.

Trotz dieser Einschränkungen bietet die kombinierte Anwendung von Lebendzellbildgebung und Durchflusszytometrie einen praktischen Rahmen für reproduzierbare NK-Zell-Funktionstests in einer Vielzahl von grundlegenden und präklinischen Anwendungen. Der bildgebende Workflow ist vorteilhaft, wenn zeitliches Verhalten wichtig ist, wie etwa die Unterscheidung zwischen schnellen und verzögerten zytotoxischen Reaktionen oder beim Vergleich der Killing-Kinetik zwischen CAR-Designs²². Der auf Flusszytometrie basierende Arbeitsablauf ist vorteilhaft, wenn funktionale Auslesungen zusammen mit Effektor- und Zielzell-Phänotypen innerhalb derselben Probe interpretiert werden müssen. Gemeinsam ermöglichen diese Ansätze die quantitative Bewertung von Natural Killing, CAR-vermittelter Zytotoxizität und ADCC mittels weit zugänglicher experimenteller Plattformen. Durch die Etablierung eines standardisierten und skalierbaren Rahmens erleichtert dieses System rigoroses Benchmarking und mechanistische Untersuchungen über NK-Zell-basierte Modalitäten hinweg und beschleunigt so die Entwicklung und klinische Umsetzung von Immuntherapien der nächsten Generation.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Advanced RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	12633020	Basalmedium für NK-92 und primäre menschliche NK-Zell-Kulturmedien (siehe Protokoll für vollständige Formulierung)
Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)	BioLegend	328618	Degranulationsmarker für die Durchflusszytometrie
Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)	BioLegend	302046	Durchflusszytometrie
Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)	BioLegend	318328	Durchflusszytometrie
Tischzentrifuge mit Schwenkgehäuse-Rotor kompatibel mit 15-ml-Röhrchen und 96-Well-Platten (Eppendorf Centrifuge 5810R)	Eppendorf	5811000015	Zum Zellpelletieren und Plattenzentrifugieren (100–300 × g)
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	Zellproliferationsfarbstoff zur Markierung von Zielzellen
Cytek Aurora spektrale Durchflusszytometer (oder gleichwertig)	Cytek Biosciences	N7-00003	Zur Durchflusszytometrie-Erfassung und -Analyse verwendet
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindol)	BioLegend	422801	Kernfärbung für Live/Dead-Unterscheidung
96-Well-Tiefplatten	USA Scientific	1896-2110	Zur Antikörperzubereitung verwendet
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Kryokonservierungsreagenz
Fötales Kälberserum (FBS)	Avantor	76419-584	Basalmedium-Supplementierung; verwendet in FACS-Puffer (2% FBS)
Allzweck-Wasserbad, 10 L (37 °C)	PolyScience	WBE10	Zum Auftauen von Zellen
GlutaMAX (L-Alanyl-L-Glutamin-Ergänzung)	Thermo Fisher Scientific	35050061	Stabile Glutaminquelle
Humanes AB-Serum	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	Ergänzung für primäre menschliche NK-Zell-Kulturmedien
IncuCyte SX5 Live-Zell-Imaging-System	Sartorius	4816	Live-Zell-Imaging in Echtzeit und Zell-für-Zell-Analyse
LUNA-FL Dual-Fluoreszenz-Zellzähler (oder gleichwertig)	Logos Biosystems	L20001	Automatisierte Zellzählung
Parafilm M (4 Zoll × 250 ft Rolle)	Genesee	16-101	Plattenversiegelung und -lagerung
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), steril (pH 7,2–7,4)	Corning	21-020-CV	Verwendet für Waschungen und FACS-Puffer-Zubereitung
Poly-D-Lysin (0,1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	Plattenbeschichtungsreagenz
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	Antibiotikum
Rekombinantes humanes Interleukin-2 (IL-2)	R&D Systems	202-IL-500	Zytokin
RosetteSep Human NK-Zell-Anreicherungskit	STEMCELL Technologies	15065	Humanes NK-Zell-Anreicherungscocktail
SYTOX Orange Totzellfärbung	Thermo Fisher Scientific	S34861	Lebensfähigkeitsfarbstoff für Live-Zell-Imaging
Trypanblau 0,4%	Gibco	15250-061	Lebensfähigkeitsfarbstoff für die Zellzählung
TrypLE Express Enzym (1X), ohne Phenolrot	Thermo Fisher Scientific	12604039	Zur Ablösung von adhärenten Zellen
UltraPure EDTA (0,5 M, pH 8,0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	Verwendet zur FACS-Puffer-Zubereitung
15-ml-Konuszentrifugenröhrchen mit konischem Boden	Corning	352097	Steril
24-Well-Gewebekulturplatte (gewebekulturbehandelt)	Corning	3524	Verwendet für NK-Zell-Wiederherstellung
96-Well-Clear-Rundbodenplatte (gewebekulturbehandelt)	Corning	3799	Verwendet für Co-Kultur- und Durchflusszytometrie-Assays
96-Well-Flachboden-schwarze Polystyrolplatte mit klaren Rändern (gewebekulturbehandelt)	Corning	3603	Kompatibel mit Live-Zell-Imaging-Systemen