Großangelegte Produktion extrazellulärer Vesikel aus hochdichten 3D-Zellkulturen in Hohlfaserperfusions-Bioreaktoren

Zusammenfassung

Es werden Anweisungen zur Einrichtung und Nutzung eines 3D-Perfusions-Hohlfaser-Bioreaktors zur Produktion von extrazellulären Vesikeln aus MSC und anderen Zelltypen bereitgestellt. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um extrazelluläre Vesikel in hohen Konzentrationen kontinuierlich zu erzeugen und dabei die Zelldichte in hohlen Faser-Bioreaktoren zu kontrollieren.

Zusammenfassung

Der Fortschritt im Bereich der Exosomenforschung wird durch die Anzahl kleiner Zellen und die geringe Produktivität der ausgeschiedenen Exosomen in traditioneller 2D-Zellkultur behindert. Hochdichte Zellkulturen in Hohlfaser-Bioreaktoren (HFBRs) ermöglichen eine kontinuierliche Produktion von ausgeschiedenen Biomolekülen und extrazellulären Vesikeln (EVs) aus großen Zellanzahlen über längere Zeiträume in hohen Konzentrationen in 3D-Kulturen. Dieses Protokoll beschreibt die Sammlung konzentrierter sekretierter Exosomen, während optimale Zellmasse und 3D-Perfusionskulturbedingungen erhalten bleiben, was das Wachstum hoher Zelldichte über mehrere Wochen oder Monate kontinuierlicher Produktion in einem kommerziell erhältlichen HFBR unterstützt. Das System ist kompakt, geschlossen, einmalgebrauchsfähig, cGMP-konform sein, einfach zu bedienen und passt in einen Standard-CO-2-Inkubator . Bestimmte Zellen, wie mesenchymale Stammzellen (MSCs) und humane Fruchtwasserstammzellen (HAFSCs), können unter diesen Bedingungen eine verminderte Proliferation aufweisen, was die Differenzierung und den Phänotyp im Laufe der Zeit beeinflussen kann. Repräsentative Ergebnisse zeigen typische EV-Erträge und Zellviabilität über Wochen oder länger kontinuierlicher Produktion. Diese Methode liefert reproduzierbare, hochwertige EV-Ernten, die sowohl für Forschung als auch für klinische Anwendungen geeignet sind.

Einleitung

Extrazelluläre Vesikel werden zunehmend für ihre Rolle in der interzellulären Kommunikation und therapeutischen Anwendungen anerkannt, einschließlich regenerativer Medizin. Traditionelle 2D-Zellkulturmethoden sind arbeitsintensiv und von begrenztem Ertrag, manchmal benötigen sie Hunderte von Kulturkolben, um genügend EVs für Experimente oder^Tierversuche zu ^erhalten. Die klinische Übersetzungs-Skalierung nutzt in der Regel traditionelle gerührte Bioreaktoren mit Mikroträgern oder anderen Unterstützungen. Diese Systeme sind von Natur aus nicht-physiologisch, ineffizient und können unterschiedliche Ergebnisse haben. Hohlfaser-Bioreaktoren bieten eine dreidimensionale, perfusionsbasierte Umgebung, die hochdichte Zellkulturen auf einem kompakten Fußabgrund und in einem potenziell für klinische Anwendungen geeigneten Maßstab^{unterstützt 3,4}.

HFBRs bieten ein kompaktes, hochdichtes Zellkultursystem, das eine kontinuierliche Produktion konzentrierter Elektrofahrzeuge mit weniger Arbeitskraft, Zeit und Platz im Vergleich zur traditionellen 2D-Kultur⁵ ermöglicht. Sie ermöglichen hochdichte Zellkulturen in kompaktem Raum und ermöglichen so die großflächige Produktion von Elektrofahrzeugen in jedem Labor. HFBRs kultivieren große Mengen von Zellen (1X10⁹ bis 1×10¹⁰) in einem kleinen Volumen (20–60 ml) in einem Standard-CO2-Inkubator und benötigen keine spezielle Ausrüstung. Diese Systeme ermöglichen kontinuierliche, konzentrierte EV-Ernten über Wochen oder Monate hinweg und erleichtern gleichzeitig die Verwendung von reduziertem Serum oder chemisch definierten Medien. In einem HFBR werden die Zellen im kleinen Volumen des zusätzlichen Kapillarraums (ECS) gehalten, das durch eine halbdurchlässige Hohlfasermembran mit definiertem Molekulargewichts-Cut-off (MWCO) vom Umlaufmedium getrennt ist (Abbildung 1). Kleine Moleküle wie Glukose und Laktat können die Fasern leicht durchqueren, während größere Elemente wie Antikörper oder extrazelluläre Vesikel im ECS zurückgehalten und konzentriert werden, wo sie entnommen werden können.

Drei grundlegende Eigenschaften unterscheiden die Kultur hohlfaseriger Zellen von allen anderen Methoden: 1) Das hohe Flächen-zu-Volumen-Verhältnis (200 cm²/mL) ermöglicht in vivo-ähnliche Zelldichten, 1–2 × 10⁸Zellen pro ml. 2) Die Zellen sind an eine poröse Unterlage gebunden, nicht an eine nicht-poröse Kunststoffschale. Zellaufteilung ist^{nicht erforderlich.} Der Molekulargewichts-Cut-off (MWCO) der Faser kann kontrolliert werden. Abgesonderte Produkte werden im ECS der Kartusche 10–100X zurückgehalten und konzentriert. Außerdem können spezifische Proteinmatrizen wie Fibronektin oder Kollagen leicht auf die Faseroberfläche aufgetragen werden, ohne den Fluss über die Fasern zu beeinflussen.

HFBR bietet eine 3D-perfusionsbasierte Kulturumgebung, die in-vivo-ähnlicher ist als 2D-Kultur⁶, reduziert auf einzigartige Weise die Abhängigkeit der Zellen von Serumunterstützung und vereinfacht ihren Mediumbedarf. Diese hochdichte Kulturumgebung könnte Unterschiede in der Proteinverarbeitung im Vergleich zur 2D-Kultur unterstützen, zusammen mit einer berichteten erhöhten EV-Bioaktivität^{von 7,8,9}. Hohlfaser-Bioreaktoren sind "histozentrisch"; Sie versuchen, die gewebeähnlichen Eigenschaften der In-vivo-Zellphysiologie ¹⁰ nachzuahmen. Die beiden wichtigsten Merkmale eines histozentrischen Bioreaktors sind 1) hohe Zelldichte, die es den Zellen ermöglicht, ihre eigene spezifische Mikroumgebung zu erzeugen, und 2) keine Spaltung oder Weitergabe von Zellen ist erforderlich, sodass sich Zell-zu-Zell-Interaktionen und 3D-Strukturen wie Sphäroide organisch im Laufe der Zeit entwickeln können. Diese Methode ermöglicht Zelldichten, die mit herkömmlichen 2D-Kultursystemen schwer zu erreichen sind, und ermöglicht die Verwendung vereinfachter, proteinfreier und chemisch definierter Medien.

Jeder Zelltyp, der in Kolben kultiviert werden kann, kann in einem hohlfaserigen Bioreaktor kultiviert werden. Transformierte Zelllinien werden proliferativ^sein. Der wichtigste Parameter ist die Glukoseaufnahmerate. Die Glukoseüberwachung bietet ein direktes Maß für die metabolische Aktivität, was die Optimierung des Erntezeitpunkts und die Kontrolle der Zelldichte¹² ermöglicht. Es ist wichtig, die Zellmasse innerhalb der Kartusche so zu kontrollieren, dass die Glukoseaufnahmerate die Kapazität des Systems zur Sauerstoffabgabe und zur^{CO2-Entfernung} nicht überschreitet. Dies geschieht, indem während der Ernte einfach die Zellmasse entfernt wird. MSCs und HAFSCs vermehren sich nicht im hohlfaserigen Bioreaktor, sondern bleiben ruhig. Diese Zellen benötigen vor der Aussäung im Bioreaktor eine Expansion. Sobald die Kultur jedoch etabliert ist, können Elektrofahrzeuge wochen- oder monatelang kontinuierlich geerntet werden. Der MSC-Phänotyp verändert sich über 30 Tage Kultur nicht, mit Ausnahme vielleicht der CD105-Expression, die in dieser Zeit abnimmt. Als MSCs aus dem Bioreaktor anschließend in einem Kolben mit serumhaltigem Medium plattiert wurden, kehrte die CD105-Expression auf das Anfangsniveau¹³ zurück. Die CD105-Expression kann als Marker für 2D-vs. 3D-Kultur dienen. Transiente Transfektionstechniken können auch verwendet werden, um einen quasi-stabilen Transfectant¹⁴ herzustellen.

Beispiele für die stärker in-vivo Zellkulturbedingungen und Vorteile der 3D-Hohlfaserzellkultur umfassen vollständige und einheitliche posttranslationale Veränderungen über die Zeit^15,16, Bildung von Villi durch Magenepithel für Cryptosporidiumkultur¹⁷, 3D-Leber¹⁸, 3D-Blut-Hirn-Schranken-Modell¹⁹, Plasmodium-Sporozoit-Bildung²⁰ und Kokultivierung von Knochenmark/Stammzellen²¹.

Bei HFBR sind EVs hochkonzentriert, mit reduzierter Kontamination durch intrazelluläre Proteine und Membranfragmente, da die Zelllyse begrenzt ist. Hohlfaser-Bioreaktoren sind mit jedem Medium kompatibel, vorausgesetzt, es gibt keine hochmolekulargewichtigen Komponenten, die die Fasern nicht kreuzen. Falls erforderlich, können diese großen Moleküle direkt in das ECS des Bioreaktors eingefügt werden. Glukosereiche Medien, wie DMEM, werden bevorzugt. Weniger komplexe, proteinfreie Zellkulturmedien können die Reinigung vereinfachen, indem sie die Proteinlast reduzieren. Mesenchymale Stammzellen und humane Fruchtwasserstammzellen wurden in Standardbasalmedien und FBS sowie in mehreren kommerziell erhältlichen MSC-Medienformulierungen kultiviert. HFBR kann Grammmengen an Exosomen mit handelsüblichen Kartuschen produzieren. Ein Hohlfaser-Bioreaktor ist eine nützliche Methode für die großflächige Produktion von Exosomen unter potenziellen cGMP-Bedingungen und stellt einen Paradigmenwechsel in der Förderung sowohl der Exosomenforschung als auch der klinischen Translation dar.

Der erfolgreiche Einsatz eines hohlfaserigen Bioreaktors zur Herstellung von extrazellulären Vesikeln ist sehr protokollspezifisch. Die Manipulation des Bioreaktors, der Zellaussädichte, der Erntehäufigkeit und des verwendeten Mediums können alle zu einem erfolgreichen Bioreaktorbetrieb beitragen. Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur Verwendung eines hohlfaserigen Bioreaktors, um extrazelluläre Vesikel aus hochdichten Zellkulturen herzustellen und zu sammeln. Das Ziel ist es, einen reproduzierbaren Ansatz für die EV-Ernte bereitzustellen, einschließlich Anleitungen zu Systemaufbau, Zellimpfung, Kulturpflege und Ernteverfahren. Die Methode soll eine konsistente EV-Produktion für Forschungsanwendungen unterstützen und einen Rahmen bieten, der für verschiedene Zelltypen und experimentelle Ziele angepasst werden kann.

Protokoll

Alle Verfahren entsprechen den Standardrichtlinien der Good Laboratory Practice (GLP) sowie Good Cell and Tissue Culture Practice.

HINWEIS: Die Patrone ist vorgefertigt und gamma-sterilisiert. Er ist doppelt verpackt, und an jeder Verbindung sind Luer-Kappen angebracht, sodass er vollständig versiegelt ist und außerhalb der Beutel steril bleibt. Siehe Abbildung 2 zur Identifikation des Cartridge-Ports. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur in einer laminaren Flusshaube durchgeführt.

1. Vorbereitung und Sterilisation der Reservoirdeckel.

1. Entfernen Sie die beiden kurzen Schlauchstücke aus der doppelt verpackten Kartusche.
2. Befestigen Sie das Rohr an den Schlauchwiderhaken am Edelstahlrohr des Reservoirdeckels.
3. Wickeln Sie die kurzen Schläuche und die freiliegenden Enden des Edelstahlrohrs mit Alufolie, um die Sterilität nach dem Autoklavieren zu gewährleisten. Geben Sie die zusammengesetzten Komponenten in einen Autoklavenbeutel.
4. Autoklav verwendet einen Trockenzyklus bei 121 °C für 15–30 Minuten. Lassen Sie die Kappe vor der Benutzung auf Zimmertemperatur abkühlen.

2. Die Hohlfaserpatrone an die Reservoirflasche befestigen

1. Übertragen Sie 50 ml PBS aus einer 1-Liter-Flasche in ein 50 ml konisches Rohr für spätere Nutzung.
2. Entferne den Behälterdeckel vom Autoklavbeutel und entferne Schutzfolie von den langen Stahlrohren.
3. Nimm den Deckel von der PBS-Flasche und schraube den Behälterdeckel an seinem Platz fest. Nehmen Sie die Kartusche aus dem inneren sterilen Beutel.
4. Entferne die Alufolie von einem der Rohrstücke oben auf dem Reservoirdeckel.
5. Entferne die Lockerkappe von einem der langen Röhrenstücke und befestige sie am Reservoir-Schlauch am Behälterdeckel. Benutze etwas Rückwärtsspin, um Knicken zu verhindern.
6. Wiederhole das für die zweite Rohrverbindung.
7. Drücke vorsichtig den braunen Pumpenschlauch zusammen, um PBS durch das System zu treiben, bis alle Luftblasen entfernt sind.

3. Füllen des zusätzlichen Kapillarraums (ECS)

1. Ziehen Sie 20 ml PBS mit einer Großnadel von mindestens 1,5" Länge in eine sterile Spritze; Eine stumpfe Nadel wird aus Sicherheitsgründen bevorzugt.
2. Desinfizieren Sie beide Seitenanschlussanschlüsse mit Alkohol und lassen Sie sie trocknen.
3. Befestigen Sie die mit PBS gefüllte Spritze an einem Seitenport und eine leere sterile Spritze an der gegenüberliegenden Öffnung. Schließe beide Endanschlüsse und öffne beide Seitenanschlüsse.
4. Injizieren Sie PBS langsam in das ECS, während Sie die Kartusche leicht schräg halten, um Luftblasen zu minimieren. Die leere Spritze auf der gegenüberliegenden Seite füllt sich mit Luft.
5. Wenn Luft im ECS vorhanden ist, öffnen Sie den rechten Endanschluss und entlassen Sie die Flüssigkeit in die leere Spritze, bis das ECS mit Flüssigkeit gefüllt ist (das zieht PBS aus der Reservoirflasche, durch die Fasern und in das ECS).
6. Schließe beide Seitenschlittenklemmen, öffne beide Endöffnungsschlittenklemmen und prüfe den Durchfluss, indem du den Pumpenschlauch vorsichtig mit den Fingern zusammendrückst.
7. Lass die leeren Spritzen an den Seitenöffnungen als Kappen befestigt. Ersetze die Spritzen jedes Mal durch neue, wenn sie aus der laminaren Flusshaube gegangen sind.

4. Beschichtung von Fasern und Zellinokulation

HINWEIS: Die Verfahren zur Beschichtung von Fasern mit einem bestimmten Matrixprotein und zum Inokulieren von Zellen sind im Wesentlichen die gleichen. Überschüssige Flüssigkeit fließt durch die Fasern in das Reservoir, während die Zellen oder das Beschichtungsmaterial außen an den Fasern im ECS verbleibt. 1 × 10 oder⁸ Zellen zum Säen werden empfohlen. 100–500 μg Matrixprotein in 20 ml PBS werden für das 4.000 cm^² lange HFBR empfohlen. Matrixproteine, die an Faseroberflächen gebunden sind, beeinflussen MWCO nicht

1. Bereiten Sie eine Beschichtungslösung oder Zellsuspension in einem sterilen 50-mL konischen Rohr vor. 1 x 108 Zellen in konditioniertem Medium aus Kolbenerweiterung oder 100–500 μg Matrixprotein in PBS. Volumen 20 mL.
2. Entnehmen Sie 20 ml Zellen oder Beschichtungslösung mit einer großen Nadel in eine sterile Spritze.
3. Schließen Sie die Spritze mit der Lösung an einen Seitenport und eine leere sterile Spritze an die andere Seite.
4. Schließe beide Endanschlüsse und öffne beide Seitenanschlüsse.
5. Mischen Sie die Lösung vorsichtig, indem Sie Flüssigkeit zwischen den beiden Spritzen übertragen. Lassen Sie die Hälfte der Lösung in jeder Spritze. Schließe beide Seitenanschlüsse.
6. Öffnen Sie den rechten Endanschluss und lösen Sie den Behälterdeckel um eine Vierteldrehung.
7. Injiziere die Lösung aus einer Spritze in das ECS. Schließe den angeschlossenen Seitenanschluss.
8. Injiziere die Lösung aus der anderen Spritze. Schließe den angeschlossenen Seitenanschluss. Öffne beide Endanschlüsse.
9. Wenn Zellen geimpft werden, lassen Sie die Kartusche 30 Minuten bei Raumtemperatur horizontal stehen, drehen Sie sie dann um 180° entlang der langen Achse und lassen Sie sie weitere 30 Minuten ruhen.
   1. Wenn Sie die Fasern mit Matrix-Protein beschichten, lassen Sie sie über Nacht bei Zimmertemperatur stehen.
10. Setzen Sie die Kartusche in das Duet-Pumpensystem ein und starten Sie den Durchfluss bei 25.

5. Vorbereitung auf die Ernte (siehe Abbildung 2)

1. Befestigen Sie eine leere sterile Spritze mit einem 3-Wege-Absperrhahn und sterilem Filter an den rechten Anschluss.
2. Stellen Sie den 3-Wege-Absperrhahn so ein, dass er durch den sterilen Filter entlüftet werden kann. Befestigen Sie eine zweite leere sterile Spritze am linken Seitenanschluss.

6. Sammlung von konditioniertem Medium (Ernte)

1. Öffnen Sie den rechten Port und halten Sie die sterile Entlüftung durch den Filter aufrecht.
2. Kippen Sie das rechte Ende der Patrone nach oben und ziehen Sie das konditionierte Medium (Produkt) in die linke Spritze heraus. Lassen Sie den ECS-Inhalt vollständig in die linke Spritze ab.
3. Schließe den rechten Port. Schließen Sie die linke Öffnung, entfernen Sie die Spritze und sammeln Sie die Ernte in einem 50-mL konischen Rohr.
4. Setze die Spritze am linken Port wieder ein. Öffne den linken Port. Öffnen Sie den rechten Endanschluss.
   Schrauben Sie den Reservoirdeckel um eine Vierteldrehung ab.
5. Kippe das linke Ende der Kartusche nach oben und fülle das ECS, indem du an der Spritze, die mit dem linken Port verbunden ist, entziehst. Fülle das ECS vollständig, bis der flüssige Meniskus in der Mitte des seitlichen Portrohrs ist.
6. Schließe den rechten Endport. Öffnen Sie den rechten Anschluss und stellen Sie den 3-Wege-Stopphahn so ein, dass er durch den Filter entlüftet.
7. Öffne den linken Port. Kippe die Kartusche nach rechts und lasse das ECS vollständig in die linke Spritze ab.
8. Schließe den linken Port. Entferne die Spritze und sammle das geerntete ECS in das 50-mL-konische Rohr.
9. Setze die Spritze in den linken Anschluss ein. Schließe den rechten Port. Öffnen Sie den rechten Port
10. Kippen Sie die linke Seite der Patrone nach oben und füllen Sie das ECS, indem Sie mit der linken Spritze zurückziehen. Fülle das ECS vollständig, bis der flüssige Meniskus in der Mitte des seitlichen Portrohrs ist.
11. Schließe den linken Port. Öffne den linken Endanschluss. Zieh den Reservoirdeckel fest.
12. Überprüfen Sie den Systemfluss, indem Sie den Pumpenschlauch manuell komprimieren, bevor Sie die Kartusche an die Duet-Pumpe zurückgeben.

7. Den Bioreaktor in das Pumpensystem einführen.

1. Stellen Sie den Durchfluss der Pumpe auf 25 im Steuerkasten ein. Die Kartusche lässt sich leichter einbauen, solange die Pumpe läuft.
2. Greifen Sie den rechten Rand des Flusspfad-Stativs. Schiebe den Pumpenschlauch in den Pumpenschlauch.
3. Schieben Sie die Basis des Durchflusswegs in den Schlitz an der Pumpenbasis. Stellen Sie sicher, dass das rechteckige Register in den Ausschnitt am Strömungssteller einrastet.
4. Stellen Sie die Reservoirflasche in die Vertiefung an der Seite der Pumpenbasis.
5. Das dünne Stromkabel passt zwischen die Dichtung des Inkubators. Die Steuerbox hat einen Magneten, um sie an der Seite des Inkubators zu befestigen.

8. Glukosespiegel überwachen

1. Mit einer 1-ml-Pipette entnehmen Sie eine 1-ml-Probe des Mediums aus der Reservoirflasche.
2. Messen Sie die Glukosekonzentration mit einem kompatiblen Glukosemessgerät, indem Sie einen kleinen Tropfen des beprobten Mediums auf den Teststreifen des Messgeräts geben.

9. Berechnung der Glukoseaufnahmerate

HINWEIS: Die Glukoseaufnahmerate wird berechnet, indem die Glukosemessung 24 Stunden später von der ursprünglichen Glukosemessung subtrahiert wird. Da die Rate vom Reservoirvolumen abhängt, multiplizieren Sie den Abfall der Glukosekonzentration mit dem Reservoirvolumen in Litern. Wenn sich zum Beispiel 250 ml in der Reservoirflasche befinden, multiplizieren Sie mit 0,25 (25 %). (Glukose1-Glukose2) X (Reservoirflasche in Litern). 250 mL sind 0,25 L. Wenn mehr als ein Tag vergangen ist, teilen Sie dies durch die Anzahl der Tage. Zum Beispiel: Anfangsglukose 4,5 g/L; Glukose 24 Stunden später messen: 2,7 g/L; Reservoirflasche: 250 mL. 4,5-2,7=1,8 g. 1,8X.25 (Reservoirflasche ist 0,25 l), 0,45 g Glukose verbraucht. Die Glukoseaufnahme beträgt 450 mg/Tag.

10. Viabilitätsprüfung

1. Sammeln Sie eine kleine Zellprobe mithilfe des Ernteprotokolls.
2. Plattenzellen in einen T-25-Kulturkolben mit frischem, 10 % serumhaltigem Medium einleiten. Bewerten Sie Bindung und Lebensfähigkeit visuell.

11. Tägliche Pflege der Patrone und die erste Woche der Kultur.

HINWEIS: Während der ersten Kulturwoche expandieren die proliferativen Zellen auf ihre Zielmenge von 1–2 Gramm Glukose pro Tag.

1. Tag 0: Zellen inokulieren, die Ausgangsglukosekonzentration aus der Medienformulierung bestimmen. Startvolumen des Reservoirs: 125 mL.
2. Tag 1-2: Jeden Tag die Glukose messen. Wenn die Ausgangsglukose zu 50 % erschöpft ist, ersetzen Sie das 125 ml Reservoir durch frisches Medium von 250 ml und reduzieren Sie das Serum auf 7,5 %.
3. Tag 3-4: Glukose messen. Wenn der Anfangsglukose zu 50 % erschöpft ist, ersetzen Sie das 250-ml-Reservoir durch 500 ml frisches Medium und reduzieren Sie das Serum auf 5 %.
4. Tag 4-5: Glukose messen. Wenn der Anfangsglukose zu 50 % erschöpft ist, ersetzen Sie 500 ml durch 1 L frisches Medium. Reduziere das Serum auf 2,5 % und wechsle bei Bedarf auf chemisch definierte Medien.
5. Tag 6+: Glukose messen, ECS ernten. Kontrolliere die Zelldichte durch Ernte, um die Glukoseaufnahme zwischen 1 und 2 Gramm pro Tag zu halten.
6. Bei nicht-proliferativen Zellen beginnen Sie mit 125 ml in der Reservoirflasche und wechseln Sie das Medium alle 3 Tage.
7. Bei erheblichem Glukoseverbrauch erhöhen Sie das Reservoir auf 250 ml. Entferne das Serum an den Tagen 3-4 aus dem ECS und ersetze es durch Basalmedium.

Ergebnisse

Nach diesem Protokoll verbraucht eine 4.000 cm^lange 2-Kartusche mit proliferierenden Zelllinien typischerweise 1–2 g Glukose pro Tag. Dies entspricht 1 L Medium alle 2–3 Tage bei Verwendung eines glukosereichen Mediums wie DMEM. Die Zellen erreichen ihre maximale Dichte innerhalb einer Woche nach der Aussaat. Die Ernte sollte nach 5–7 Tagen beginnen oder wenn die Glukoseaufnahme 1 g pro Tag erreicht, und sollte dann, wenn möglich, täglich durchgeführt werden. Während dieser ersten Kulturwoche kann das serumhaltige Medium im ECS durch serumfreies Basalmedium ersetzt werden, während das Serum im zirkulierenden Medium erhalten bleibt, falls Serum benötigt wird. Sobald die Glukoseaufnahme 1 g pro Tag erreicht, können Sie leicht auf reduziertes Serummedium oder andere chemisch definierte Medien umsteigen. MSCs und HAFSCs verbrauchen Glukose deutlich geringer als transformierte Zelllinien wie CHO, 293 oder Hybridome. Die Bildung von Sphäroiden ist typisch für MSC und HAFSC sowie für andere Zelltypen (Abbildung 3). Die tägliche Blutzuckermessung liefert eine zuverlässige Messung der Kulturgesundheit und der Stoffwechselaktivität. Standardisierte, kommerziell erhältliche xenofreie Medien wurden erfolgreich mit MSC und HAFSC eingesetzt. Die Erntemengen betragen etwa 20 ml. 24-Stunden-Intervalle zwischen den Ernten sind optimal, da die EV-Konzentrationen nach 24 Stunden ein Maximum erreichen (Abbildung 4). Typische Exosomenkonzentrationen im geernteten Medium liegen zwischen 1–5 × 10¹² Partikeln/mL, abhängig von Zelltyp, Zellaussetzzahlen und weiteren Faktoren, und können nach der Zentrifugation sichtbare Pellets erzeugen (Abbildung 5). Eine große Anzahl von Zellen kann ausgesät werden und sollte auf der Zellanzahl, nicht auf der Kulturfläche basieren (Abbildung 6).

Die Ergebnisse zeigen, dass die Produktion von Elektrofahrzeugen mit der Stoffwechselaktivität korreliert, gemessen an der Glukoseaufnahme, was einen praktischen Parameter zur Überwachung und Optimierung der Kulturleistung darstellt. Die tägliche Ernte in 24-Stunden-Intervallen maximiert die EV-Konzentration und erhält gleichzeitig die Kulturstabilität. Diese Erkenntnisse unterstützen die Verwendung von Glukosemessung und kontrollierter Erntehäufigkeit als Schlüsselparameter für die reproduzierbare EV-Produktion in Hohlfaser-Bioreaktoren.

Abbildung 1: Querschnitt des Hohlfaser-Bioreaktors. Medium fließt durch das Innere der Fasern, und die Zellen haften an deren Außenseiten. Kleinmolekulare Komponenten wie Glukose und Laktat können die Fasern leicht durchqueren. Ausgeschiedene Produkte wie EVs können die Fasern nicht durchqueren und werden stark im Bereich außerhalb der Fasern konzentriert, dem sogenannten ECS (extrakapillarer Raum). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Foto der Patrone mit identifizierten Öffnungen und Klemmen. Einwegrückschlagventile auf dem Durchflussweg erzeugen einen Umlaufstrom des Mediums. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Mesenchymale Stammzellen, humane Amnion-Stammzellen, kardiale Vorläufer und einige andere Zelltypen bilden Sphäroide, wenn sie in ausreichender Zahl in die Kartusche eingesät werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Messung der EV-Konzentrationen nach verschiedenen Zeitintervall-Ernten. Nach 24 Stunden erreicht die EV-Konzentration eine maximale Konzentration. Die optimale Ernte erfolgt nach 24 Stunden. (Daten mit freundlicher Genehmigung von Paolo Neviani, EV Core, Children's Hospital of Los Angeles). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: Eine Woche Ernte von Elektrofahrzeugen aus DIFI-Zellen, die im C2011 Hohlfaser-Bioreaktor kultiviert wurden. Elektrofahrzeuge werden durch differentielle Zentrifugation isoliert. (Daten mit freundlicher Genehmigung von Jeff Franklin, Vanderbilt University)^18,19. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: Eine überraschend große Anzahl von Zellen kann in den Hohlfaser-Bioreaktor eingepflanzt werden. MSCs nehmen in der 2D-Kultur viel Platz ein; wenn sie in der 3D-Kultur als Sphäroide gezüchtet werden, nehmen sie weniger Platz ein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Hohlfaser-Bioreaktoren sind nicht in der Lage, Proteine oder Antikörper in echten kommerziellen Mengen vernünftig herzustellen. Sie besitzen jedoch eine einzigartige Fähigkeit, relativ große Zellmengen bei hoher Dichte zu kultivieren und ein konzentriertes EV-Produkt in klinisch relevantem Maßstab abzusondern. Erst in den letzten Jahren wurden die wahren Vorteile eines histozentrischen Bioreaktors erkannt. Die hochdichten Perfusionskulturbedingungen führen zu konzentrierten EVs unter Verwendung eines cGMP-konformen Mediums in Mengen, die für Forschung und potenzielle klinische Anwendungen geeignet sein könnten. Eine einzelne Ernte aus einem 4.000 cm^{großen Behälter} kann 5 × 10¹² bis 1 × 10¹⁴ EVs in einem Volumen von 10–20 ml enthalten. Diese Erträge liegen im in Studien zur EV-Dosierung²² berichteten Bereich.

Die tägliche Überwachung der Glukoseaufnahmerate ist ein wichtiger Parameter zur Bewertung der Kulturleistung und ein direkter Indikator für den Zellstoffwechsel, die Zellanzahl und die Gesundheit. Im Allgemeinen werden Medien mit höherer Glukose bevorzugt, wie zum Beispiel DMEM, das eine Anfangsglukosekonzentration von 4,5 g/L aufweist. Das Medium sollte zu frischem Medium gewechselt werden, wenn der Glukose zu 50 % verbraucht ist. Bestimmte Zellen, wie MSCs, scheinen Glukose zu konsumieren und Laktat bei Glukosekonzentrationen über 3 g/L zu produzieren, bevor sie auf Glutamin umschalten und Ammoniak bei Konzentrationen unter 3 g/L produzieren. Eine vollständige metabolische Profilierung von MSCs in 3D-Kultur wurde bisher nicht durchgeführt.

Der wichtigste Parameter für eine erfolgreiche Bioreaktorkultur ist die Zellinokulationszahl. Eine Mindestzahl der Inokulationszellen für einen 4.000 cm großen C2011-Bioreaktor beträgt 1 ×108^Zellen. Für nicht-proliferierende Zellen wie MSC oder HAFSC wird eine größere Anzahl bevorzugt, bis zu 1 × insgesamt 10^{9 Zellen}. Das Reservoirvolumen sollte proportional zur Anzahl der Zellen in der Patrone sein. 1 × 10^{8 Zellen sollten} ein Reservoir von nicht größer als 125 ml verwenden. 1 × 10^{9 Zellen sollten} ein Reservoir von nicht größer als 1 L besitzen. Ein zu großes Reservoir kann die Zellen in die Verzögerungsphase schicken. Dies ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen keine Glukoseaufnahme aufnehmen, obwohl sie lebensfähig sind, wie durch die Trypan-Blau-Färbung bestimmt wird. In diesem Fall reduzieren Sie das Reservoirvolumen oder pflanzen Sie mehr Zellen aus. Mehrere Zellinokulationen können erforderlich sein, um genügend Zellzahlen für eine effektive Bioreaktorkultur zu erhalten. Einfach weitere Zellen auf die bereits in der Kartusche befindlichen Zellen einsetzen. Bei der Bewertung der Bioreaktorleistung sollte die Größe des Zellinokulums beachtet werden. Eine zehnfache Steigerung der Zellaussaatung kann zu einer zehnfachen erhöhten EV-Produktion führen.

Änderungen am Protokoll können Änderungen der Medienformulierungen, Oberflächenbeschichtungen, Zellnummern, Erntevolumen, Erntehäufigkeit oder Spritzengröße umfassen, abhängig vom Zelltyp und der gewünschten Ausbeute. Kontinuierliche Kultur ermöglicht eine einfache, Echtzeit-Optimierung der Zustände, da während der Kultur Änderungen vorgenommen werden können und Ergebnisse in Echtzeit^{erzielt werden}. Die Fehlersuche sollte sich auf die Aufrechterhaltung der Sterilität und die Überwachung der Stoffwechselaktivität konzentrieren. Stellen Sie sicher, dass keine Verstopfungen oder Knicke im Rohr vorhanden sind, besonders um die Schlittenklemmen. Bakterielle Kontamination führt zu einem schnellen Glukosekonsum und Trübung in der Reservoirflasche. Die Pilzkontamination zeigt sich durch eine flauschige weiße Ansammlung an der linken Endkappe der Kartusche, die den Durchfluss blockiert. Die Nutzung des Hohlfaser-Bioreaktorsystems erfordert eine geschickte Handhabung und strikte Einhaltung von Protokollen. Wichtige Schritte sind das Aussäen der richtigen Zellanzahl, die Aufrechterhaltung der Sterilität während der Ernte und die sorgfältige Überwachung des Glukosekonsums, um Überwucherung oder Nährstoffmangel zu verhindern. Die meisten Zellen heften sich an die Fasern, manchmal abhängig von der fibronektinbeschichteten Proteinmatrix, die eine schnelle Zellanhaftung erleichtert. Einige Zellen, wie MSCs, HAFSCs und kardiale Vorläufer, bleiben an Fasern gebunden und bilden 3D-Sphäroide.

Das HFBR-System unterstützt hochdichte, chemisch definierte und xenofreie Kulturen der meisten Zelltypen und ermöglicht so die großflächige EV-Produktion²³. Die tägliche Glukosemessung liefert eine zuverlässige Kennzahl für die Leistung von Bioreaktoren. Das geschlossene, perfusionsbasierte System ist mit cGMP-Standards kompatibel, und eine Skalierung ist mit größeren Patronen oder sogar mehreren Patronen möglich. Die Produktion von Elektrofahrzeugen im Grammaßstab könnte unter optimierten Bedingungen möglich sein. Der Hohlfaser-Bioreaktor bietet eine reproduzierbare Plattform für die nachhaltige Produktion und Sammlung von Elektrofahrzeugen unter kontrollierten Bedingungen. Das hier beschriebene Protokoll legt Wert auf praktische Überlegungen, darunter Systemaufbau, aseptische Handhabung und metabolische Überwachung, um einen konsistenten Betrieb und zuverlässige Ergebnisse zu unterstützen. Weitere Studien können erforderlich sein, um EV-Eigenschaften und funktionale Eigenschaften unter verschiedenen Kulturbedingungen zu bewerten und die Leistung mit alternativen Produktionssystemen zu vergleichen.

Diese Methode ist breit anwendbar für Forschung und klinische EV-Produktion, einschließlich regenerativer Medizin und therapeutischer Anwendungen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
16 gauge 1,5" Nadel	Stellar Scientific	SOLM-111615
3-Wege-Hahn, steril	Cole-Parmer	UX-48523-28
20ml Luer-Lock-Spritze	Becton Dickenson	302830
25ml steril serologische Pipette	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
25mm Spritzenfilter, steril	Thomas Scientific	1162B74
38 mm Reservoir-Kappe	FiberCell Systems	A1006
50 ml Konische Zentrifugenrohr	Stellar Scientific	T50-101-PK
500 ml Dulbecco's Phosphat-Puffer-Salinel'oe sung	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
CVS Sterile Alkohol-Präparationspads, 480 CT	CVS Pharmacy	Artikel-Nr. 376560
Hohlfaser-Bioreaktor	FiberCell Systems	C2011
Human Fibronektin, 1 mg	Corning	354008