Altersspezifische Pyroptose-Biomarkeranalyse und nicht-pharmakologische Intervention beim akuten Atemnotsyndrom

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen integrierten bioinformatischen und maschinellen Lern-Workflow zur Identifizierung altersstratifizierter Pyroptose-Biomarker beim akuten Atemnotsyndrom (ARDS), kombiniert mit einer in vivo Methodik unter Verwendung eines LPS-induzierten Rattenmodells, um die vorläufige Wirksamkeit von Spektrumenergie, Wasser und Ferninfrarotstrahlung experimentell zu validieren.

Zusammenfassung

Das akute Atemnotsyndrom (ARDS) ist eine lebensbedrohliche entzündliche Lungenerkrankung mit hoher Morbidität und Mortalität, bei der sich Pyroptose als entscheidender pathogener Mechanismus herauskristallisiert hat. Da altersbedingte immun- und molekulare Unterschiede die Pyroptose und die therapeutische Antwort beeinflussen können, zielte diese Studie darauf ab, altersspezifische pyroptoseassoziierte Biomarker zu identifizieren und das therapeutische Potenzial von Spektrum-Energiewasser (SEW) in Kombination mit Ferninfrarotstrahlung (FIR) zu bewerten. Der umfassende Arbeitsablauf des Protokolls umfasst die Verarbeitung von transkriptomischen Datensätzen, die Altersstratifizierung, maschinelles Lernen und die Analyse der Immuninfiltration, um altersspezifische Hub-Gene zu identifizieren. Diese computergestützte Phase wird von einer in vivo experimentellen Validierung mit einem LPS-induzierten ARDS-Rattenmodell gefolgt, bei dem histologische Bewertung, ELISA und Western Blotting eingesetzt wird, um die SEW+FIR-Intervention rigoros zu bewerten und die Hub Genexpression zu überprüfen. Sechzehn pyroptosassoziierte Gene wurden identifiziert, von denen AXL und GSDME überwiegend mit dem ARDS-Schweregrad bei älteren Patienten assoziiert waren, während SPP1 bei jüngeren Personen relevanter war. Es wurden deutliche Immunsignaturen beobachtet, mit M2-Makrophagenanreicherung und Immunsuppression bei älteren Patienten, im Gegensatz zu einer proinflammatorischen Aktivierung bei jüngeren. Funktionelle Analysen identifizierten diese Gene in metabolische, inflammatoriske und immunregulatorische Wege. In vivo linderte die SEW+FIR-Behandlung die Lungenschädigung, unterdrückte die Produktion von entzündlichen Zytokinen (IL-1β, IL-18, IL-6, TNF-α) und modulierte die Expression von AXL, GSDME und SPP1. Zusammenfassend unterstreichen diese Ergebnisse altersabhängige Unterschiede in pyroptosebezogenen Mechanismen bei ARDS und identifizieren AXL, GSDME und SPP1 als vorläufige Biomarkerkandidaten, die eine weitere klinische Validierung verdienen. Im aktuellen experimentellen Mausmodell zeigte SEW+FIR schützende Effekte, indem es systemische Entzündungen linderte und pyroptose-bezogene Signalübertragung modulierte, was eine grundlegende In-vivo-Unterstützung für sein Potenzial als nicht-pharmakologische Zusatzstrategie lieferte.

Einleitung

Akute Lungenverletzung (ALI)/akutes Atemnotsyndrom (ARDS) ist eine schwere Atemwegserkrankung, die durch einen akuten Beginn schwerer Hypoxämie und nicht-kardiogenes Lungenödem gekennzeichnet ist, das hauptsächlich durch diffuse Alveolarschäden^{verursacht wird 1}. Es kann durch eine Reihe von pulmonalen und extrapulmonalen Verletzungen ausgelöst werden. Pulmonale Ursachen sind infektiöse Pneumonie, Aspiration von Mageninhalt und schwere thorakale Traumata, während extrapulmonale Auslöser durch systemische Entzündungsreaktionen entstehen, die sekundär zu nicht-pulmonalen Verletzungen wie Sepsis, Pankreatitis, nicht-thorakalem Trauma, schweren Verbrennungen, massiven Transfusionen und Reperfusionsverletzungen nach Lungentransplantation oder Thrombektomie ^1,2 entstehen. Trotz Fortschritten in der unterstützenden Versorgung bleibt ARDS eine große klinische Herausforderung in der Intensivmedizin mit hohen Morbiditäts- und Sterblichkeitsraten weltweit³. Daher ist das Verständnis der Pathogenese von ALI/ARDS entscheidend, um wirksame Behandlungen zu entwickeln.

Pyroptose, eine entzündliche Form des programmierten Zelltodes, die im Zusammenhang mit Tumorsuppression und onkologischen^Therapien umfassend charakterisiert wurde, gilt heute als entscheidender Akteur in der ARDS-Pathophysiologie⁵. Im Gegensatz zur Apoptose wird die Pyroptose durch die Inflammasomaktivierung und die anschließende Spaltung von Gasdermin D (GSDMD) vermittelt, was zur Membranporenbildung, Zelllyse und zur Freisetzung proinflammatorischer Zytokine wie Interleukin-1β (IL-1β) und Interleukin-18 (IL-18)⁶ führt. Bei ARDS trägt eine übermäßige Aktivierung der Pyroptose in alveolaren Makrophagen, Epithelzellen und Endothelzellen zu einer übertriebenen Entzündungsreaktion, einer Störung der alveolär-kapillaren Barriere, einem Lungenödem und einem Fortschreiten der Hypoxämie⁷ bei. Wachsende Evidenz legt nahe, dass die gezielte Zielsetzung wichtiger Regulatoren im Pyroptoseweg eine neuartige Strategie darstellen könnte, um Entzündungen abzuschwächen und klinische Ergebnisse bei ARDS ^8,9 zu verbessern. Dennoch bleibt eine kritische Wissenslücke bezüglich der Auswirkungen des Alterns – einem entscheidenden Faktoren für die Anfälligkeit und Prognose von ARDS – auf die pyroptotische Landschaft bestehen. Aktuelle Studien behandeln ARDS oft als monolithische Erkrankung und übersehen dabei das Potenzial altersspezifischer molekularer Treiber, die personalisierte therapeutische Reaktionen bestimmen könnten.

In den letzten Jahren hat der Einsatz neuartiger biophysikalischer Interventionen und fortschrittlicher funktioneller Materialien – wie SEW und Ferninfrarotstrahlung (FIR)-Emitter – als nicht-pharmakologische Strategien zur Modulation von Immunantworten und zur Unterdrückung von Entzündungen^10,11 an Bedeutung gewonnen. Es wurde berichtet, dass diese Therapien die Proliferation der Leukozyten und die phagozytische Aktivität steigern, Gewebeödeme reduzieren und endotoxininduzierte Mikrokreislaufstörungen mildern – darunter Leukozytenadhäsion, Erythrozytenaggregation, Thrombozytenaktivierung und Endothelverletzung 12,13,14. Bei lipopolysaccharidbedingten (LPS)-induzierten ARDS-Ratten reduzierten kombinierte SEW- und FIR-Behandlungen signifikant die Spiegel von IL-1β und IL-18 – den charakteristischen nachgeschalteten Effektoren der pyroptotischen Kaskade – sowohl im Serum als auch in der bronchoalveolaren Lavalageflüssigkeit (BALF). Diese Belege deuten stark darauf hin, dass die schützenden Effekte von SEW+FIR durch die Unterdrückung des durch Inflammasom verursachten Zelltod vermittelt werden könnten. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass SEW bei eigenständiger Anwendung oder als Lösungsmittel die Expressionswerte von Interleukin-8 (IL-8) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) senkte, während die Expressionswerte von Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-10 (IL-10) im Blutserum erhöht und histopathologische Lungenschäden 15,16,17,18 verbessert wurden.

Aufbauend auf diesen Beobachtungen stellten wir die Hypothese auf, dass die therapeutische Wirksamkeit der kombinierten SEW und FIR (SEW+FIR) bei ARDS auf ihrer Fähigkeit beruht, altersspezifische pyroptotische Signalwege zu modulieren und so die lungenartige Immunhomöostase gezielt wiederherzustellen. Derzeit basiert das Fundament des ARDS-Managements auf mechanischer Belüftung und begrenzten pharmakologischen Wirkstoffen wie Kortikosteroiden, die häufig Risiken für beatmungseingelöste Lungenschäden oder systemische^{Immunsuppression} bergen. Im Vergleich zu diesen konventionellen Therapien bietet SEW+FIR eine nicht-invasive, nicht-pharmakologische Alternative, die frühe entzündliche Kaskaden sicher abschwächen kann, ohne sekundäre Organtoxizität. Praktisch ist dieses Protokoll am besten geeignet als frühe Zusatzintervention bei milden bis moderaten ARDS. Die Hauptbegrenzung besteht darin, dass seine Wirksamkeit bei schweren, späten fibrotischen ARDS noch nicht bewiesen ist und es keine notwendigen lebenserhaltenden Maßnahmen in einer intensiven Versorgung ersetzen kann. Um unsere Hypothese zu testen, haben wir eine integrierte Pipeline entwickelt, die altersstratifiziertes transkriptomisches Profiling und maschinelles Lernen mit vivo-Validierung verbindet. Dieser Ansatz identifiziert nicht nur AXL, GSDME und SPP1 als neuartige, altersspezifische therapeutische Ziele, sondern liefert auch die ersten mechanistischen Belege für das klinische Potenzial von SEW+FIR als präzise nicht-pharmakologische Intervention für ARDS.

Protokoll

Alle Tierversuchsverfahren wurden streng gemäß den vom Ausschuss für experimenteller Tierschutz und Ethik des Dongzhimen-Krankenhauses, Beijing University of Chinese Medicine (Genehmigung Nr. 19-54), vor Beginn der Studie genehmigten Richtlinien durchgeführt.

Datenquelle und Datenverarbeitung
Zwei Genexpressionsdatensätze (GSE89953 und GSE116560) wurden aus der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank²⁰ abgerufen. Der Datensatz GSE89953, der gesamt-alveoläre makrophage-transkriptomische Daten von ARDS-Patienten verschiedener Altersgruppen enthält, wurde für differenzielle Expressions- und Netzwerkanalysen verwendet. Der GSE116560-Datensatz, der klinische Informationen wie den Status der mechanischen Belüftung enthält, wurde für maschinelles Lernen und prognostische Modellierung verwendet. Zusätzlich wurden 608 mit Pyroptose assoziierte Gene aus einer umfassenden Datenbank für menschliche Genannotationen extrahiert, wobei ein Korrelationswert von über 1 als Screeningkriterium diente. Genexpressionsdaten wurden mit dem Limma-Paket in R normalisiert. Klinische Studiennummer: nicht anwendbar.

Identifikation von DEGs
Die Patienten im GSE89953-Datensatz wurden in zwei Altersgruppen eingeteilt: niedriges Alter (<45 Jahre) und hochaltes (≥45 Jahre). Diese Grenze wurde auf Grundlage epidemiologischer Erkenntnisse ausgewählt, die darauf hindeuten, dass das mittlere Alter für ARDS-Beginn etwa 45 Jahre^{und 21} Jahre beträgt. Um die Robustheit dieses Schwellenwerts sicherzustellen, wurden Sensitivitätsanalysen mit alternativen Altersgrenzwerten (50 und 55 Jahre) durchgeführt. Diese Analysen zeigten konsistente Muster bei der Identifikation von Hubgens und Modulclustering und validierten damit statistisch die 45-Jahres-Grenze für spätere Downstream-Analysen. Der Datensatz wurde mit dem Limma-Paket in R normalisiert. Differentiell exprimierte Gene (DEGs) zwischen Altersgruppen wurden mittels linearer Modellierung mit empirischer Bayes-Moderation identifiziert. Gene mit einem angepassten P-Wert < 0,05 und |log₂-fache Veränderung| ≥ 0,5 galten als statistisch signifikante DEGs. Vulkandiagramme und Heatmaps wurden erstellt, um DEGs mit dem ggplot2-Paket in R zu visualisieren.

Pyroptose-assoziierte Gen-Identifikation und Anreicherungsanalyse
Pyroptose-bezogene Gene wurden aus der Genannotationsdatenbank mit dem Schlüsselwort "Pyroptose" abgerufen. Die Schnittmenge von DEGs und pyroptosassoziierten Genen wurde als differenziell exprimierte pyroptose-bezogene Gene (DEPGs) definiert. Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Signalweganreicherungsanalysen von DEPGs wurden mit dem clusterProfiler-Paket in R²² durchgeführt. Die Kategorien Biologischer Prozess (BP), Zelluläre Komponente (CC) und Molekulare Funktion (MF) wurden annotiert, und der Z-Score ≥ 1 sowie angepasste P-Werte < 0,05 wurden als signifikant angesehen.

Analyse des gewichteten Gen-Koexpressionsnetzwerks (WGCNA)
Um Genmodule zu identifizieren, die mit Pyroptose assoziiert sind, wurde WGCNA mit dem WGCNA R-Paket durchgeführt. Ein signiertes Netzwerk wurde mit einer Soft-Threshold-Power (β) von 26 aufgebaut, um eine skalierungsfreie Topologie²³ zu gewährleisten. Die Module wurden über den dynamischen Baumschnitt-Algorithmus mit einer Mindestmodulgröße von 30, einer tiefen Aufteilung von 2 und einer Merging-Schwelle (Schnitthöhe) von 0,25 identifiziert. Die Korrelation zwischen Moduleigengen und Pyroptosemerkmalen wurde berechnet. Die Gensatz-Variationsanalyse (GSVA) wurde an ausgewählten Modulen unter Verwendung von typischen Gensets durchgeführt, die von MsigDB^24,25 heruntergeladen wurden.

Maschinelles Lernen
Der GSE116560-Datensatz wurde in Hoch- und Niedrigaltersgruppen unterteilt, wobei 45 Jahre als Grenze dienten, und beide Gruppen wurden mit Machine-Learning-Algorithmen analysiert. Die Regressionsanalyse des Least Absolute Shrinkage and Selection Operator (LASSO) wurde mit dem glmnet-Paket (Version 4.1-2) in R implementiert, wobei der optimale Strafparameter (λ) durch 10-fache Kreuzvalidierung (1-SE-Kriterium) bestimmt wird. Für den Random Forest-(RF)-Algorithmus wurden 500 Bäume (ntree = 500) konstruiert, und die Anzahl der bei jedem Split (mtry) ausgewählten Features wurde auf die Quadratwurzel der Gesamtzahl der Prädiktoren gesetzt, um die Modellstabilität zu gewährleisten. Überlappende Gene beider Methoden wurden als altersspezifische Signaturgene definiert.

Aufbau und Bewertung diagnostischer Modelle
Ein diagnostisches Vorhersagemodell wurde auf Basis der identifizierten Signaturgene erstellt. Zur Entwicklung des Modells wurde logistische Regression eingesetzt, und ein Nomogramm wurde erstellt, um seine Vorhersagekraft zu visualisieren. Die Leistung des Modells wurde mittels einer Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC)-Kurve bewertet, und die Fläche unter der Kurve (AUC) wurde berechnet, um deren diagnostische Genauigkeit zu bewerten. Die interne Validierung erfolgte mittels Bootstrap-Resampling. Eine weitere Bewertung der Modellstabilität und klinischen Nützlichkeit erfolgte mittels Kalibrierungsdiagrammen und Entscheidungskurvenanalyse (DCA).

Immuninfiltrationsanalyse
Die Zusammensetzung von Immunzellen in Gruppen mit hohem und niedrigem Alter wurde mithilfe des CIBERSORT-Algorithmus auf Basis der LM22-Signaturmatrix geschätzt. Die relativen Anteile von 22 Immunzelltypen wurden zwischen den Gruppen verglichen. Die differenzielle Expression von Hub-Genen über Immunzell-Subsets hinweg wurde mit Einzelstichprobendaten analysiert und in Heatmaps und Histogrammen visualisiert.

Genmengenanreicherungsanalyse (GSEA)
GSEA wurde separat an Hub-Genen aus den Hoch- und Niedrigaltersgruppen durchgeführt. Die Gensatzanreicherungsanalyse (GSEA) wurde mithilfe der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Gen-Sets durchgeführt. Die Gene wurden anhand des Signal-Rausch-Verhältnisses (oder Fold-Change) zwischen Hoch- und Niedrigexpressionsgruppen bewertet. Anreicherungs- und normalisierte Anreicherungswerte (NES) wurden dann mit 1.000 Permutationen berechnet, um signifikant angereicherte Signalwege zu identifizieren. Wege mit einer Falschentdeckungsrate (FDR) von weniger als 0,25 und einem nominalen P-Wert von weniger als 0,05 wurden signifikant angereichert. Diese Analyse wurde dann verwendet, um die biologischen Signalwege abzuleiten, die von jedem Hub-Gen reguliert werden können.

Versuchstiere
In dieser Studie wurden achtzehn männliche SPF-Sprague Dawley-Ratten (im Alter von 6 bis 7 Wochen, 180 g ± 10 g) eingesetzt. Detaillierte Lieferanteninformationen sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Reagenzien und Instrumente
Elektromagnetisch feldbehandelte Wasservorbereitungsgeräte und Ferninfrarot-Emissionsinstrumente wurden für experimentelle Interventionen eingesetzt, um Spektrumenergie-Wasser- (SEW) bzw. Ferninfrarotstrahlung (FIR) zu liefern. Lipopolysaccharid (LPS) wurde verwendet, um ARDS zu modellieren. Die Zytokinspiegel (IL-1β, IL-18, IL-6, TNF-α) wurden mit spezifischen ELISA-Kits quantifiziert. Die Proteinexpressionswerte (AXL, SPP1, Caspase-3, GSDME, GAPDH) wurden anhand spezifischer primärer Antikörper und entsprechender HRP-konjugierter sekundärer Antikörper bewertet. Die Probenverarbeitung und -analyse wurden mit Standardlaborausrüstung durchgeführt, darunter ein Biomikroskop, ein Mikrotom, eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge, ein Ultra-Niedrigtemperatur-Gefrierschrank und ein Mikroplattenleser. Vollständige Details aller Reagenzien, Antikörper und Instrumente sowie deren jeweiligen Hersteller sind in der Materialtabelle enthalten.

Tiergruppierung und Modellierung
Achtzehn Sprague-Dawley-Ratten wurden zufällig den Gruppen Control, Model und SEW+FIR zugeordnet, mit jeweils sechs Ratten pro Gruppe. Jede Gruppe wurde täglich gewogen und dokumentiert. Die SEW+FIR-Gruppe erhielt täglich 20 Minuten FIR-Therapie (Wellenlänge 4 μm–14 μm, Bestrahlungsentfernung 20 cm von der dorsalen Oberfläche) in einer temperaturkontrollierten Umgebung (22 °C ± 2 °C), während gleichzeitig SEW mit einer Dosis von 1 mL/100 g/d durch orale Gavage⁷ erhalten wurde. Destilliertes Wasser wurde oral an die Kontroll- und Modellgruppen mit einer entsprechenden Dosis von 1 mL/100 g/Tag verabreicht. NÄH- und destilliertes Wasser wurden einmal täglich für 7 Tage nach Erhitzen in einem warmen Bad mit 60 °C verabreicht. Am siebten Tag, 6 Stunden nach der Fütterung, wurden die Modell- und SEW+FIR-Gruppen mit einer LPS-Lösung in einer Dosis von 2 mg/kg nach Gewicht durch die Schwanzvene injiziert, während die Kontrollgruppe mit 0,9 % physiologischem Kochsalzlösungsinhalt in einer Dosis von 2 mg/kg nach Gewicht behandelt wurde. Die Modellierungstechnik galt als ausgereifte und stabile Methode, um mit einer einzelnen LPS-Injektion über die Schwanzvene eine systemische Entzündungsreaktion auszulösen. Das Lungengewebe aus der Lungenpathologie in den modellierten Gruppen stimmte mit den ARDS-Eigenschaften²⁵ überein. Checkpoint: Eine erfolgreiche ARDS-Einleitung zeigt sichtbare Lethargie, Tachypnoe und eine Gewichtsreduktion von ~10 % innerhalb von 16 Stunden nach^{der Injektion 26} Stunden.

Sammlung rattenbezogener Indikatoren
Sechzehn Stunden später wurden alle drei Gruppen intraperitoneal mit 3 % Pentobarbitalnatrium in einer Dosis von 30 mg/kg Körpergewicht injiziert, um eine Anästhesie zu induzieren. KRITISCH: Die Tiefe der Anästhesie muss streng durch den Verlust des Pedalrückzugsreflexes vor jeglicher Verfahrensintervention bestätigt werden. Darüber hinaus wurden strenge Biosicherheitsprotokolle eingehalten; alle mit LPS kontaminierten Materialien, biologische Flüssigkeiten und Tierkadaver wurden in ausgewiesenen Biohazard-Abfallbehältern zur ordnungsgemäßen Verbrennung entsorgt. Fünf Milliliter Blut wurden aus der Bauchaorta in sterile Röhren entnommen, und das Serum wurde durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 20 Minuten bei 4 °C isoliert. Das Serum wurde anschließend bei −80 °C für eine weitere Analyse gelagert. Nach der Thorakotomie und Ligation des rechten pulmonalen hilums wurde die bronchoalveolare Lavage-Flüssigkeit (BALF) durch dreifaches Spülen der linken Lunge mit vorgekühltem, phosphatgepuffertem Kochsalzlösungslösung (PBS) über eine endotracheale Kanüle gewonnen. Das BALF wurde dann bei 1.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, und das Supernatant bei −80 °C gelagert. Der obere Lappen der rechten Lunge wurde entfernt und mit kalter physiologischer Kochsalzlösung gereinigt, um das Blut zu entfernen. Neun Bände physiologischer Kochsalzlösung wurden relativ zum Gewebegewicht hinzugefügt, und die Probe wurde mit einer Augenschere in einem Eisbad gehackt. Ein 10%iges Lungengewebehomogenat wurde mit einem Homogenisator hergestellt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 700 x g für 15 Minuten bei 4 °C. Das Supernatant wurde gesammelt und bei −80 °C für weitere biochemische Analysen gelagert. Zusätzlich wurde ein Teil des rechten Lungengewebes jeder Ratte mit 4 % Paraformaldehyd für die histologische Untersuchung fixiert.

Beobachtungsindikatoren und Erkennungsmethoden
Der untere Lappen der rechten Lunge wurde durch Standardeinbettung, Gewebeschneiden, Entwachsen, HE-Färbung, Farbtrennung, Dehydrierung und Filmversiegelung nach der Fixierung in 4%-Paraformaldehyd verarbeitet. Das Lungengewebe jeder Gruppe zeigte pathologische Veränderungen, die unter einem Lichtmikroskop beobachtet wurden.

Pathologische Auffälligkeiten in der alveolären Architektur und beim Septum, im Ausmaß der entzündlichen Zellinfiltration, Hyperämie und pulmonalem Kapillarödem wurden unter Lichtmikroskop festgestellt. Die Abteilung für Pathologie der Universität Peking für Chinesische Medizin unterstützte die Beobachtung. Der histologische Lungenverletzungswert wurde berechnet, um die Lungenverletzung wie folgt zu beurteilen: keine Verletzung = 0, Verletzung in weniger als 25 % des Feldes = 1, Verletzung in 25–50 % = 2, Verletzung in 50–75 % = 3 und Verletzung in mehr als 75 % = 4. Zehn Felder wurden zufällig ausgewählt und von Forschern, die der Gruppe blind waren, bewertet.

ELISA wurde an den zuvor entnommenen BALF-Supernatanten, Lungengewebehomogenaten und Blutserumproben gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz wurden die Proben 90 Minuten lang in vorbeschichteten Brunnen bei 37 °C inkubiert. Nach fünfmaliger Reinigung mit Waschpuffer wurden biotinylierte Detektionsantikörper (1:100-Verdünnung) für 60 Minuten bei 37 °C aufgetragen. Nach einem weiteren Waschschritt wurde HRP-Konjugat hinzugefügt und im Dunkeln 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenmesser gemessen, um die Probenkonzentrationen zu berechnen.

Die Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt, um die Expressionswerte von AXL, SPP1, Caspase-1, GSDMD, Caspase-3, GSDME und GAPDH in Lungengewebe- und BALF-Proben bei −80°C zu bewerten. Die Proteine wurden gemäß den Anweisungen im Proteinextraktions-Kit entnommen und lysiert. Gleiche Mengen an Proteinextrakten (40 μg) wurden pro Lane geladen und von SDS-PAGE aufgelöst. Die Polypeptide wurden anschließend getrennt und auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % fettfreier Trockenmilch in TBST für 1 Stunde bei Zimmertemperatur blockiert und dann über Nacht bei 4 °C mit den spezifischen primären Antikörpern (verdünnt 1:1000) inkubiert. Nach dreimaliger Reinigung mit TBST für jeweils 10 Minuten wurden die Membranen mit den entsprechenden HRP-konjugierten sekundären Antikörpern (verdünnt 1:5000) in Blocklösung bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. GAPDH wurde als internes Referenzprotein verwendet. Die Proteinbänder wurden mit einem Enhanced Chemiluminescence (ECL)-Kit mit einer Belichtungszeit von 1–5 Minuten visualisiert, und die Ergebnisse wurden mit Bildverarbeitungssoftware analysiert. Die relativen Expressionsniveaus der Zielproteine wurden als Verhältnis des Zielproteins zu GAPDH berechnet.

Statistische Analyse
Quantitative Indizes wurden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben, und die statistische Analyse erfolgte mit statistischer Software. Der Kruskal–Wallis-Test oder Einweg-ANOVA wurde verwendet, um Unterschiede zwischen mehreren Gruppen zu vergleichen, je nachdem, ob die Daten normal verteilt waren. Alle Statistiken wurden mit einem zweiseitigen Hypothesentest bewertet. Bei Analysen mit mehreren Vergleichen, wie der differentiellen Genexpression und der Infiltration von Immunzellen, wurden die P-Werte mit der Benjamini-Hochberg-Methode der False Discovery Rate (FDR) angepasst. Ein bereinigter P-Wert von 0,05 oder niedriger galt als statistisch signifikant. Grafiksoftware wurde für das Diagrammieren verwendet.

Ergebnisse

Identifikation von DEGs in GSE89953 verschiedenen Altersgruppen und entsprechende funktionelle Anreicherungsanalyse
Rohausdrucksdaten aus dem GSE89953-Datensatz wurden mit der Funktion normalizeBetweenArrays im Limma-Paket (Abbildung 1A) normalisiert, und Boxplots vor und nach der Normalisierung bestätigten eine verbesserte Konsistenz zwischen den Stichproben. Die differenzielle Expressionsanalyse basierend auf der normalisierten Matrix i...

Diskussion

Die Anhäufung von entzündlichen Verletzungen und Immundysregulation ist ein Kennzeichen des akuten Atemungsdisstress-Syndroms (ARDS) und führt zu schweren Lungenschäden und hoher Sterblichkeit. Aufgrund der komplexen Pathogenese und fehlender wirksamer Therapien ist die Identifizierung präziser therapeutischer Ziele entscheidend, um die Ergebnisse zu verbessern. Neue Belege deuten darauf hin, dass Pyroptose, eine Form des programmierten Zelltodes, eine zentrale Rolle beim Fortschreiten v...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anti-AXL-Antikörper	Abcam	ab215205
Anti-Caspase-3-Antikörper	Abcam	ab184787
Anti-GAPDH-Antikörper	Abcam	ab8245
Anti-GSDME-Antikörper	Abcam	ab215191
Anti-SPP1-Antikörper	Abcam	ab307994
Biomikroskop	OLYMPUS, Japan	BH2
FIR-Instrument	Guangdong JFC Gruppe	JF-802
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG H& L (HRP)	Abcam	ab6721
GraphPad Prism 10.1.2	GraphPad-Software	-
Hochgeschwindigkeitszentrifuge	Thermo, USA	Sorvall ST16R
IL-18 ELISA-Bausatz	Jiangsu Meibiao Biotechnology Co., Ltd.	MB-1735B
IL-1β ELISA-Kit	Jiangsu Meibiao Biotechnology Co., Ltd.	MB-1588B
IL-6 ELISA-Bausatz	Jiangsu Meibiao Biotechnology Co., Ltd.	MB-50054A
ImageJ	NIH	-
Lipopolysaccharid (LPS)	Sigma, USA	L6511
Männliche SPF Sprague Dawley-Ratten (6-7 Wochen)	Beijing HFK Bioscience Co., Ltd., China	SCXK(Beijing) 2019-008 (Lizenz)
Mikroplatten-Leser (Varioskan Flash)	Thermowissenschaftlich	Varioskan Flash
Mikrotome	LEICA	RM2235
R-Software (limma, clusterProfiler, WGCNA, glmnet, randomForest)	R-Stiftung für statistische Berechnung	-
Nähvorbereitungsinstrument	Guangdong JFC Gruppe	JF-139
SPSS 26.0	IBM	-
Tabellenbilanz	Shanghai Cany Precision Instruments Co., Ltd.	HC· TP11· 10
TNF-α ELISA-Kit	Jiangsu Meibiao Biotechnology Co., Ltd.	MB-50051A
Ultra-Niedrigtemperatur-Gefrierschrank	Thermo, USA	Forma 900 Serie