Eine Netzwerkpharmakologie und molekulare Andockungsstudie zur TongBi-Formel zur Arthrose

Zusammenfassung

Dieses Protokoll prognostiziert potenzielle therapeutische Ziele und molekulare Mechanismen der TongBi-Formel gegen Arthrose mittels Netzwerkpharmakologie und molekularer Andockung.

Zusammenfassung

Diese Studie nutzte Netzwerkpharmakologie in Kombination mit molekularem Docking, um die potenziellen therapeutischen Ziele und molekularen Mechanismen der TongBi-Formel (TBF) bei Arthrose (OA) vorherzusagen. Aktive Komponenten und entsprechende Ziele von TBF wurden aus der traditionellen chinesischen Medizin Systems Pharmacology Database and Analysis Platform abgerufen, während OA-bezogene Ziele aus Online Mendelian Inheritance in Man, GeneCards, DrugBank und Therapeutic Target Database gesammelt wurden. Eine Netzwerk-Visualisierungs- und Analysesoftware wurde verwendet, um Verbindungen zu Verbindungen-Ziel- und Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken (PPI) zu erstellen. Funktionelle Annotation der Genontologie und die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway-Anreicherungsanalysen wurden mithilfe der Plattform Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery durchgeführt. Die molekulare Andockungsanalyse wurde mit einer molekularen Andocksoftware durchgeführt, um die vorhergesagte Bindungsaffinität zwischen wichtigen aktiven Verbindungen und Kern-Zielproteinen zu bewerten. Insgesamt wurden 47 überlappende Ziele zwischen TBF und OA identifiziert. Die Analyse des PPI-Netzwerks hob JUN, RELA, IL6, MAPK1 und IL10 als potenzielle Hub-Ziele hervor. Die Anreicherungsanalyse deutete darauf hin, dass TBF Entzündungen, den Lipidstoffwechsel und mehrere intrazelluläre Signalwege, die mit dem Fortschreiten von OA verbunden sind, regulieren kann. Molekulare Andockungsergebnisse zeigten günstige vorhergesagte Bindungsaffinitäten zwischen den aktiven Kernverbindungen und wichtigen OA-bezogenen Proteinzielen. Diese Ergebnisse bieten einen rechnergestützten Rahmen zum Verständnis der potenziellen Mechanismen von TBF im Vergleich zu OA und unterstützen weitere experimentelle Validierung.

Einleitung

Arthrose (OA) ist eine degenerative entzündliche Erkrankung des Gelenkknorpels¹. Derzeit sind etwa 58 Millionen Erwachsene von OA betroffen, und diese Zahl wird voraussichtlich bis 2040 auf 78,4 Millionen^steigen. OA ist weltweit eine häufige Ursache für Gelenkschmerzen und funktionelle Beeinträchtigungen³. Aufgrund der starken Schmerzen, die mit Arthrose verbunden sind, erleben Patienten häufig erhebliche Behinderungen im Alltag⁴. Alter, weibliches Geschlecht, Fettleibigkeit und Gelenkschäden sind die Hauptrisikofaktoren für OA⁵. Obwohl die Prävalenz von OA extrem hoch ist und erhebliche Auswirkungen auf Gesundheitssysteme hat, bleiben die verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten begrenzt⁶. Die moderne Medizin verwendet häufig symptomatische Behandlungen wie nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente und Knorpelschutzmittel. Eine langfristige Verabreichung führt jedoch häufig zu Nebenwirkungen, darunter Magen-Darm-Schäden sowie eine abnormale Leber- und Nierenfunktion⁷. Daher besteht ein dringender Bedarf, neue Behandlungsmethoden oder alternative Therapien für OA zu entwickeln.

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) hat umfangreiche Erfahrungen in der Behandlung von OA gesammelt, wobei der Schwerpunkt auf Syndromdifferenzierung und ganzheitlicher Regulation liegt. Die TongBi-Formel (TBF) ist ein klassisches Rezept, das hauptsächlich aus Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian und Xiangfu besteht. Aus Sicht der TCM stammt die pathologische Natur der OA hauptsächlich aus der Invasion von Wind, Kälte und Feuchtigkeit sowie der Stagnation von Qi und Blut⁸. Die pflanzliche Kompatibilität von TBF ist darauf ausgelegt, diesen zentralen pathologischen Mechanismus zu erfüllen, wobei alle medizinischen Komponenten synergetisch wirken, um Wind und Feuchtigkeit zu vertreiben, Meridiane auszubaggern und die Durchblutung zu fördern, was den typischen TCM-Syndrommerkmalen der OA entspricht. Zunehmende klinische Studien legen nahe, dass modifizierte TBF Gelenkschmerzen lindern und die motorische Funktion der Gliedmaßen bei Patienten mit OA⁹ verbessern kann. Weitere klinische Beobachtungen haben auch ihr Potenzial zur Regulierung von Entzündungsreaktionen in OA-Fällen¹⁰ gezeigt, während eine aktuelle Metaanalyse die klinische Anwendbarkeit für die OA-Intervention¹¹ weiter bestätigt hat.

TBF wird traditionell verwendet, um Wind zu vertreiben, Kanäle zu entstopfen, Kälte zu verteilen, Feuchtigkeit zu beseitigen sowie die Durchblutung sowie Ernährung zu fördern. Die spezifischen Mechanismen, durch die TBF potenzielle therapeutische Effekte gegen OA ausübt, sind jedoch unklar, und seine aktiven Komponenten sowie Schlüsselziele sind noch nicht bestimmt. Um diese Mechanismen systematischer und umfassender zu untersuchen, verwendeten wir einen Netzwerkpharmakologieansatz, um eine Netzwerkkarte zu erstellen, die die Beziehungen zwischen Medikamenten, Zielgruppen^{und Krankheiten} illustriert. Darüber hinaus wurden Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen durchgeführt, um die potenziellen molekularen Mechanismen und Signalwege zu erforschen, die an der pharmakologischen Wirkung von TBF¹³ beteiligt sind. Um die pharmakologischen Mechanismen von TCM-Verschreibungen systematisch zu untersuchen, etablierte diese Studie einen vollständigen analytischen Workflow mit Wirkstoffscreening, Zielvorhersage, Netzwerkaufbau, funktioneller Anreicherungsanalyse und molekularem Andocken. Ein solcher Forschungsrahmen wurde als standardisiertes und reproduzierbares Paradigma zur Untersuchung der molekularen Mechanismen von TCM-Formeln im Vergleich zu OA¹⁴ anerkannt. Bestehende methodologische Studien haben die wissenschaftliche Rationalität und praktische Anwendbarkeit dieser Forschungsstrategie weiter bestätigt¹⁵. Über die methodologische Standardisierung hinaus hilft die vorliegende Studie, die materiellen Grundlagen und Kernregulierungsziele der TBF in OA zu definieren. Darüber hinaus bietet es theoretische Referenzen für die klinische Anwendung und zukünftige experimentelle Validierung von TBF und bietet zudem einen praktikablen methodischen Rahmen für die mechanistische Erkundung anderer TCM-Rezepte.

In dieser Studie verwendeten wir einen Netzwerkpharmakologie-Ansatz, um aktive Komponenten zu screenen und ein Verbindung-Ziel-Netzwerk in Kombination mit OA-bezogenen Zielgenen zu konstruieren. Funktionale Anreicherungsanalysen und molekulare Andockungen wurden anschließend für die mechanistische Erkundung durchgeführt. Netzwerkpharmakologie integriert biologische und pharmakologische Informationen, um die Beziehungen zwischen Arzneimittel und Zielkrankheit aus einer umfassenden und facettenreichen Perspektive zu untersuchen¹⁶. Wir glauben, dass dieser Ansatz dazu beitragen kann, die potenziellen pharmakologischen Mechanismen der TBF zu klären und eine theoretische Grundlage für spätere experimentelle Forschung zu schaffen. Der Arbeitsablauf der Studie ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1. Arbeitsablauf des Netzwerks, Pharmakologie und Studiendesign für molekulare Andockung. Schematische Übersicht des analytischen Arbeitsablaufs, der zur Untersuchung der möglichen Mechanismen der TongBi-Formel (TBF) gegen Arthrose (OA) verwendet wird. Der Arbeitsablauf umfasste das Screening von aktiven Verbindungen, Zielvorhersagen, OA-bezogene Zielerfassung, Schnittschnittanalyse, Netzwerkaufbau, Analyse der Protein-Protein-Interaktion (PPI), Genontologie (GO) und die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen sowie molekulare Andockungsvalidierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Protokoll

An dieser Studie waren weder menschliche Teilnehmer, Wirbeltiere noch Gewebeproben beteiligt. Alle Analysen wurden mithilfe öffentlich zugänglicher bioinformatischer Datenbanken und molekularer Andockmethoden durchgeführt; daher war keine ethische Genehmigung erforderlich.

Screening von Komponenten und entsprechenden Zielen von TBF
Alle pflanzlichen Inhaltsstoffe von TBF, darunter Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian und Xiangfu, wurden in der TCM Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) (abgerufen Januar 2026) durchsucht. Die genauen Suchbegriffe entsprachen den standardisierten lateinischen Namen jeder Kräutermedizin: Angelicae Sinensis Radix (Danggui), Radix Salviae (Danshen), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng), Caulis Piperis Kadsurae (Haifengteng), Impatiens balsamina (Tougucao), Radix Angelicae Biseratae (Duhuo), Radix Clematidis (Weilingxian) und Cyperi Rhizoma (Xiangfu). Die chemischen Komponenten wurden gemäß den festen Schwellenwerten der oralen Bioverfügbarkeit (OB) ≥ 30 % und der Arzneimittelähnlichkeit (DL) ≥ 0,18 untersucht. Diese Grenzwerte werden in pharmakologischen Studien des TCM-Netzwerks häufig verwendet, um bioverfügbare und arzneimittelähnliche Wirkstoffe mit potenzieller In-vivo-Aktivität zu identifizieren. Verbindungen ohne explizite OB- oder DL-Werte in der Datenbank wurden ausgeschlossen, um die Zuverlässigkeit und Konsistenz des aktiven Verbindungsscreenings zu gewährleisten.

Die entsprechenden Proteinziele der getesteten Wirkstoffe wurden anschließend aus der TCM-Pharmakologiedatenbank abgerufen. Die Standardisierung des Zielgens erfolgte mithilfe der Universal Protein Resource (UniProt) Proteinannotationsdatenbank, wobei die Spezies auf Homo sapiens beschränkt war (abgerufen Januar 2026). Ursprüngliche Proteinnamen wurden in offizielle menschliche Gensymbole umgewandelt, während redundante und nicht-menschliche Zieleinträge manuell ausgeschlossen wurden. Doppelte Ziele wurden durch manuellen Vergleich und Zusammenstellung entfernt, um den finalen TBF-Zieldatensatz zu erstellen.

Identifikation von OA-bezogenen Zielen und potenziellen therapeutischen Zielen der TBF für OA
OA-bezogene Ziele wurden mit dem genauen Suchbegriff "Osteoarthritis" in den Online-Datenbanken Mendelian Inheritance in Man (OMIM), GeneCards, DrugBank und Therapeutic Target Database (TTD) abgerufen (abgerufen Januar 2026). Doppelte Ziele, die aus verschiedenen Datenbanken gewonnen wurden, wurden manuell durch Datensammlung und -vergleich entfernt, um den OA-bezogenen Zieldatensatz zu erzeugen. Für GeneCards wurden nur Ziele mit einem Relevanzwert ≥ 3 beibehalten. Ziele, die von OMIM, DrugBank und TTD mit dem Schlüsselwort "Arthrose" abgerufen wurden, unterlagen keinen zusätzlichen Filterkriterien. Die überlappenden Ziele zwischen aktiven verbindungsbezogenen und OA-bezogenen Zielen wurden mit dem Online-Analysetool Venny 2.1.0 Venn identifiziert. Die Schnittanalyse wurde durchgeführt, um die potenziellen therapeutischen Ziele von TBF gegen OA zu bestimmen.

Bau des TBF–Component–Target Netzwerks
Komponenten-Ziel-Interaktionsdaten wurden in die Netzwerkvisualisierungs- und Analysesoftware Cytoscape 3.10.2 importiert, um das TBF–Component–Target-Netzwerk zu erstellen (abgerufen Januar 2026). Im konstruierten Netzwerk repräsentierten die Knoten pflanzliche Verbindungen und Zielgene, während die Ränder die Wechselwirkungen zwischen aktiven Verbindungen und entsprechenden Zielen darstellten. Um redundante Analysen zu vermeiden, wurden doppelte Verbindungen, die zwischen mehreren Kräutern geteilt wurden, zu einem einzigen einzigartigen Knoten zusammengeführt. Die topologische Analyse des Netzwerks wurde anschließend unter Verwendung des Gradwerts als primärem Bewertungsparameter durchgeführt. Kernaktive Verbindungen wurden anhand der Gradrangfolge identifiziert und als Ligandenkandidaten für die anschließende molekulare Andockungsanalyse ausgewählt.

PPI-Netzwerkbau
Potenzielle therapeutische Ziele wurden für die PPI-Analyse in die STRING-PPI-Datenbank importiert (abgerufen Januar 2026). Der Speziesparameter war auf Homo sapiens beschränkt, und der minimale erforderliche Interaktionskonfidenzwert wurde auf 0,9 gesetzt, während alle übrigen Parameter auf Standardeinstellungen beibehalten wurden. Die generierten Interaktionsdaten wurden exportiert und mit der Netzwerkvisualisierungs- und Analysesoftware weiter visualisiert. Die topologische Analyse des PPI-Netzwerks wurde mit dem CytoHubba-Netzwerktopologieanalyse-Plugin durchgeführt. Grad, Zwischenheitszentralität und Nähezentralität wurden berechnet, um die Knotenwichtigkeit innerhalb des Interaktionsnetzwerks zu bewerten. Kern-Zielproteine wurden anhand integrierter topologischer Eigenschaften identifiziert und für die anschließende molekulare Andockungsanalyse ausgewählt. Der Maximal Clique Centrality-Algorithmus wurde verwendet, um Hub-Ziele zu überprüfen. Knoten ohne interagierende Partner wurden ausgeschlossen, was zu einer geringeren Anzahl von Knoten im endgültigen Netzwerk führte als im ursprünglich importierten Zieldatensatz.

GO und KEGG
Die funktionelle Anreicherungsanalyse der GO und die KEGG-Signalweganreicherungsanalyse wurden durchgeführt, um die potenziellen biologischen Funktionen und Signalwege zu untersuchen, die mit den identifizierten therapeutischen Zielen von TBF gegen OA verbunden sind. Die GO-Analyse umfasste die drei Standard-Ontologiekategorien: biologischer Prozess (BP), zelluläre Komponente (CC) und molekulare Funktion (MF), wobei biologischer Prozess als primärer Interpretationsfokus festgelegt wurde.

Die Analyse der funktionalen Anreicherung wurde mit der Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) in Kombination mit der R-Statistikanalysesoftware (Version 4.3.1; abgerufen im Januar 2026) durchgeführt. Die Anreicherungsergebnisse wurden mit dem clusterProfiler-Paket verarbeitet und visualisiert, wobei die Dotplot- und Balkendiagrammfunktionen zur Erstellung von Anreicherungsdiagrammen verwendet wurden. Alle Zielgene wurden vor dem Homo sapiens-Hintergrund annotiert. Die Benjamini–Hochberg-Methode wurde für mehrfache Testkorrekturen angewandt, und ein angepasster P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die Visualisierung der GO- und KEGG-Anreicherungsergebnisse wurde mit der Online-Analyseplattform MicrobiomeAnalyst/MicrobiomeNet durchgeführt (abgerufen Januar 2026). Balkendiagramme und Blasendiagramme wurden erstellt, um die am stärksten angereicherten GO-Terme und KEGG-Pfade darzustellen.

Molekulares Andocken
Die offiziellen Gennamen und die entsprechenden Protein Data Bank (PDB)-Identifikatoren der obersten Kernziele wurden aus der Proteinannotationsdatenbank17 abgerufen, und ihre dreidimensionalen Kristallstrukturen wurden aus dem RCSB-PDB heruntergeladen (abgerufen Februar 2026). Für jedes Zielprotein wurde Kette A als Rezeptorstruktur beibehalten, während redundante Proteinketten, Heteroatome und nicht verwandte Strukturfragmente während der Rezeptorpräparation entfernt wurden. Die dreidimensionalen Strukturen der aktiven Kernverbindungen wurden aus der PubChem-Datenbank abgerufen (abgerufen Februar 2026). In dieser Studie wurde Quercetin als repräsentativer Andockungsligand ausgewählt, da es die höchste topologische Zentralität im Komponenten-Ziel-Netzwerk aufweist und ein gut charakterisiertes Flavonoid mit berichteten schützenden Effekten gegen OA-Pathogenese ist.

Die Vorverarbeitung von Rezeptoren und Liganden erfolgte mit molekularer Andockvorbereitungssoftware, einschließlich Entfernung von Wassermolekülen, Wasserstoffatomzufügung, Protonierungsbehandlung und Gasteiger-Ladungszuweisung. Die molekulare Andockanalyse wurde anschließend mit der molekularen Andocksoftware Version 1.5.7 durchgeführt. Die Gitterbox-Dimensionen wurden angepasst, um die vorhergesagten Bindungsregionen jedes Zielproteins abzudecken. Die Gitterbox war auf die native Ligandenbindungstasche jedes Zielproteins zentriert, mit einer einheitlichen Größe von 40 Å × 40 Å × 40 Å und einem Gitterabstand von 0,375 Å. Andockberechnungen wurden mit einem Erschöpfungsparameter von 8 durchgeführt, und für jedes Liganden-Ziel-Paar wurden neun Bindungskonformationen generiert. Die Andockkonformation mit der niedrigsten vorhergesagten Bindungsenergie wurde als repräsentative Bindungspose für die spätere strukturelle Interpretation ausgewählt. In dieser Studie wurden keine Redocking-Validierung und positiv-kontrollierter Ligandenvergleich durchgeführt. Alle Andockverfahren und Parametereinstellungen folgten den Standardprotokollen, die in der Netzwerkpharmakologie üblicherweise verwendet werden, um die Zuverlässigkeit der vorhergesagten Bindungsmodi zu unterstützen. Andock-Konformierungen wurden mit der molekularen Visualisierungssoftware Version 2.5.4 visualisiert. Eine Bindungsenergie von ≤−5,0 kcal/mol wurde als Hinweis auf eine stabile Liganden-Rezeptor-Bindung angesehen.

Ergebnisse

Chemische Zusammensetzung und Ziel-Screening von TBF
Insgesamt wurden nach dem Screening 2 aktive Komponenten aus Danggui, 65 aus Danshen, 24 aus Jixueteng, 21 aus Haifengteng, 6 aus Tougucao, 9 aus Duhuo, 7 aus Weilingxian und 18 aus Xiangfu identifiziert. Detaillierte Informationen zu den gescreenten Wirkstoffen finden Sie in Ergänzungstabelle 1. Insgesamt wurden zunächst 2672 potenzielle Ziele geborgen, darunter 266 Ziele für Danggui, 689 für Danshen, 236 für Duhuo, 188 für Haifengteng, 545 für Jixueteng, 192 für Tougucao, 102 für Weilingxian und 454 für Xiangfu. Detaillierte Zielinformationen sind in ergänzender Tabelle 2 dargestellt. Nach der Entfernung der doppelten Einträge wurden 258 nicht redundante Ziele, die mit TBF verknüpft sind, erreicht.

Das TBF–Component–Target-Netzwerk
Das TBF–Component–Target-Netzwerk wurde mithilfe von Daten aus der TCM-Pharmakologiedatenbank aufgebaut, darunter 152 Wirkstoffe, 258 nicht redundante Ziele und 8 Knoten für pflanzliche Medikamente. Diese Daten wurden in zwei Dateien organisiert, die als "Netzwerk" und "Typ" bezeichnet wurden (Ergänzende Tabelle 3). Nach dem Import der Dateien in die Netzwerkvisualisierungs- und Analysesoftware wurde ein umfassendes Netzwerk mit 578 Knoten und 3022 Kanten eingerichtet (Abbildung 2). Im konstruierten Netzwerk repräsentierten die Knoten pflanzliche Arzneimittel, bioaktive Verbindungen und entsprechende Zielproteine, während die Kanten die vorhergesagten Wechselwirkungen zwischen Verbindungen und Zielgruppen darstellten. Größere Knotengröße und dunklere Farbintensität deuteten auf höhere Gradwerte und eine erhöhte Netzwerkverbindung hin. Basierend auf der Gradbewertung aus der topologischen Analyse des Netzwerks wurden die fünf wichtigsten Wirkstoffe als Quercetin (A7-MOL000098), Beta-Sitosterol (B8-MOL000358), Luteolin (A1-MOL000006), Kaempferol (C1-MOL000422) und Stigmasterol (C2-MOL000449) identifiziert.

Abbildung 2. TBF–Komponent–Ziel-Interaktionsnetzwerk. Netzwerkvisualisierung der Interaktionen zwischen TBF, aktiven Verbindungen und vorhergesagten Zielgenen. Knoten stehen für pflanzliche Arzneimittel, Wirkstoffe oder Zielproteine, während Kanten vorhergesagte Wechselwirkungen zwischen Verbindungen und Zielobjekten darstellen. Größere Knotengröße und dunklere Farbintensität deuten auf höhere Gradwerte und eine erhöhte Netzwerkverbindung hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Zielinformationen im Zusammenhang mit OA und potenziellen therapeutischen Zielen der TBF
Das Schlüsselwort "Osteoarthritis" wurde in vier Datenbanken durchsucht und ergab 428 potenzielle krankheitsbezogene Ziele, darunter 9 von OMIM, 349 von GeneCards, 32 von DrugBank und 38 von TTD. Ein Venn-Diagramm, das die Zielverteilung zwischen den vier Datenbanken veranschaulicht, ist in Abbildung 3 dargestellt. Nach dem Zusammenführen und Entfernen der doppelten Einträge wurden 398 eindeutige, OA-bezogene Ziele erreicht. Die Schnittanalyse zwischen OA-bezogenen Zielen und TBF-aktiven Verbindungen identifizierte 47 überlappende Ziele, die als potenzielle therapeutische Ziele von TBF gegen OA galten. Das entsprechende Venn-Diagramm, das mit dem Online-Venn-Analysetool erstellt wurde, ist in Abbildung 4 dargestellt.

Abbildung 3. Venn-Diagramm von OA-bezogenen Zielen, abgerufen aus mehreren Datenbanken. Venn-Diagramm, das die Überschneidungen zwischen OA-bezogenen Zielen zeigt, die aus den Datenbanken OMIM, GeneCards, DrugBank und Therapeutic Target Database (TTD) identifiziert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4. Identifikation überlappender Ziele zwischen TBF und OA. Venn-Diagramm, das die Schnittstelle zwischen aktiven, verbindungsbezogenen Zielen von TBF und OA-bezogenen Zielen zeigt. Die überlappenden Ziele wurden als potenzielle therapeutische Ziele von TBF gegen OA betrachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Aufbau und Analyse des PPI-Netzwerks
Die PPI-Netzwerkanalyse der 47 überlappenden Ziele wurde mit der PPI-Datenbank (Abbildung 5) durchgeführt und anschließend mit Netzwerkvisualisierungs- und Analysesoftware visualisiert. Während des Netzwerkaufbaus wurden getrennte Knoten, die isolierte Ziele ohne Protein-Protein-Interaktionen (PPIs) repräsentieren, gemäß den Standardverfahren der Netzwerktopologie entfernt, was zu einem verfeinerten Netzwerk mit 39 Knoten und 108 Kanten führte (Abbildung 6). Knotengröße und Farbintensität spiegelten Gradwerte wider und zeigten die relative Bedeutung der Ziele im Netzwerk.

Abbildung 5. STRING-PPI-Netzwerk überlappender Ziele. PPI-Netzwerk, das mit der STRING-Datenbank für die überlappenden Ziele zwischen TBF und OA generiert wird. Knoten repräsentieren Zielproteine und Kanten die vorhergesagten PPIs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6. Analyse des Kern-PPI-Netzwerks. Verfeinertes PPI-Netzwerk nach Entfernung der getrennten Knoten. Knotengröße und Farbintensität stellen Gradwerte dar und zeigen die relative Bedeutung der Ziele im Netzwerk an. Kernziele wie JUN, RELA, IL6, MAPK1 und IL10 zeigten eine hohe Netzwerkverbindung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Die topologische Analyse des PPI-Netzwerks wurde mit dem Netzwerktopologieanalyse-Plugin mit dem Degree-Algorithmus durchgeführt, um topologische Eigenschaften der Knoten zu berechnen. Die Top 10 Ziele, geordnet nach Gradwert, sind in Tabelle 1 dargestellt. Die fünf höchstplatzierten Ziele, darunter JUN, RELA, IL6, MAPK1 und IL10, wurden als Kernziele für die anschließende molekulare Andockungsanalyse basierend auf Gradwert, Nähe-Zentralität und Zwischen-Zentralität ausgewählt.

GO-Biologische Funktion und KEGG-Signalweganalyse von TBF bei OA
Die GO-Anreicherungsanalyse identifizierte mehrere OA-bezogene biologische Funktionen, darunter Zytokinaktivität, Transkriptionsfaktorbindung und Wachstumsfaktoraktivität, was auf eine mögliche Beteiligung von TBF an der Regulation von Entzündung, Transkriptionsaktivität und Knorpelhomöostase hindeutet. Die 20 wichtigsten angereicherten GO-Begriffe wurden nach Zählwerten gerankt und mit einem Balkendiagramm visualisiert (Abbildung 7). Die KEGG-Signalweganreicherungsanalyse konzentrierte sich auf OA-bezogene Signalwege, einschließlich des fortgeschrittenen Glykations-Endprodukt-Rezeptors für den fortgeschrittenen Glykations-Endprodukt-Signalweg, des Interleukin-17 (IL-17)-Signalwegs, des Tumornekrosefaktor-(TNF)-Signalwegs und des T-Zell-Rezeptor-Signalwegs, die mit der Entzündungsregulation, Chondrozytenkatabolismus und Immunantworten bei OA assoziiert sind. Die während der Anreicherungsanalyse identifizierten infektionskrankheitsbezogenen Signalwege wurden in der vorliegenden Studie nicht als direkte OA-Mechanismen interpretiert. Die KEGG-Weganalyse wurde mit der statistischen Analysesoftware durchgeführt, um eine Blasendiagramm-Visualisierung zu erstellen (Abbildung 8). Insgesamt wurden 20 signifikant angereicherte Signalwege identifiziert. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass TBF OA-bezogene biologische Prozesse und Signalwege durch einen multizielmäßigen pharmakologischen Mechanismus regulieren kann.

Abbildung 7. GO-Anreicherungsanalyse potenzieller therapeutischer Ziele. Bar-Diagramm, das die 20 wichtigsten angereicherten GO-Begriffe zeigt, die mit den potenziellen therapeutischen Zielen von TBF gegen OA assoziiert sind. Die angereicherten Begriffe umfassen biologische Prozesse, molekulare Funktionen und zelluläre Komponenten, die mit Entzündung, transkriptionaler Regulation und Knorpelhomöostase zusammenhängen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 8. KEGG-Anreicherungsanalyse potenzieller therapeutischer Ziele. Blasenplot-Visualisierung der obersten angereicherten KEGG-Signalwege, die mit den potenziellen therapeutischen Zielen von TBF gegen OA assoziiert sind. Die Blasengröße stellt die Anzahl der angereicherten Gene dar, während die Farbintensität das Signifikanzniveau der Anreicherung widerspiegelt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Molekulare Andockverifikation
Um die potenziellen Bindungsinteraktionen zwischen der Hauptwirkstoffverbindung von TBF und den aus dem PPI-Netzwerk identifizierten Kernzielen weiter zu untersuchen, wurde eine molekulare Andockungsanalyse zwischen Quercetin, der bestbewerteten aktiven Verbindung im Komponenten-Ziel-Netzwerk, und den fünf Kernzielen JUN, RELA, IL6, MAPK1 und IL10 durchgeführt (Tabelle 2). Quercetin zeigte die höchste topologische Bedeutung im Komponenten-Ziel-Netzwerk und wurde weithin als repräsentative bioaktive Verbindung in Verbindung mit entzündungshemmender Wirkung und Regulation des Knorpelstoffwechsels^{berichtet 18,19}. Die vorhergesagten Bindungsenergien betrugen −8,4 kcal/mol für JUN, −7,6 kcal/mol für RELA, −6,9 kcal/mol für IL6 und −6,7 kcal/mol für MAPK1 und IL10, was auf günstige vorhergesagte Bindungsaffinitäten zwischen Quercetin und den ausgewählten Kernzielen hinweist. Die Visualisierung der Liganden-Rezeptor-Bindungskonformationen erleichterte die Interpretation potenzieller molekularer Wechselwirkungen. Die molekulare Visualisierungssoftware Version 2.5.4 wurde verwendet, um die optimalen Andockkonformationen zwischen Quercetin und den fünf Kernzielen zu visualisieren (Abbildung 9–13).

Abbildung 9. Molekular-Andockmodell von Quercetin mit JUN (PDB-ID: 1JNM). Dreidimensionale molekulare Andockungskonformation von Quercetin gebunden an JUN. Quercetin wurde vorhergesagt, innerhalb der bZIP-Domäne von JUN zu binden und mit struktureller Komplementarität in die hydrophobe Bindungshöhle zu passen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 10. Molekulares Andockmodell von Quercetin mit RELA (PDB ID: 7LEU). Dreidimensionale molekulare Andockungskonformation von Quercetin gebunden an RELA. Es wurde vorhergesagt, dass Quercetin durch nicht-kovalente Wechselwirkungen mit der aktiven Region der RELA-Rel-Homologiedomäne interagiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 11. Molekulares Andockmodell von Quercetin mit IL6 (PDB ID: 1ALU). Dreidimensionale molekulare Andockungskonformation von Quercetin, gebunden an IL6. Es wurde vorhergesagt, dass Quercetin die konservierte Rezeptorbindungsrille von IL6 besetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 12. Molekulares Andockmodell von Quercetin mit MAPK1 (PDB ID: 6D5Y). Dreidimensionale molekulare Andockungskonformation von Quercetin gebunden an MAPK1. Es wurde vorhergesagt, dass Quercetin die ATP-bindende Pocket von MAPK1 besetzt, was auf mögliche kinasebezogene Interaktionen hindeutet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 13. Molekulares Andockmodell von Quercetin mit IL10 (PDB ID: 1ILK). Dreidimensionale molekulare Andockungskonformation von Quercetin, gebunden an IL10. Es wurde vorhergesagt, dass Quercetin in der Nähe des Dimer-Interface-Bereichs von IL10 wechselwirkt und zur Stabilisierung des Proteinkomplexes beitragen kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Datenverfügbarkeit:
Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Manuskript, in Tabellen, Abbildungen und ergänzenden Materialien enthalten. Ergänzende Tabelle 1 enthält die gescreenten aktiven Verbindungen der TongBi-Formel (TBF), Ergänzungstabelle 2 liefert die entsprechenden vorhergesagten Zielinformationen und Ergänzungstabelle 3 enthält die Netzwerkcodierungs- und Interaktionsdaten, die für den Netzwerkaufbau und die topologische Analyse verwendet werden.

Gen	Proteinname	Abschluss	Nähe, Zentralität,	Zentralität der Zwischenheit
JUN	Transkriptionsfaktor AP-1	18	0.58	0.22
RELA	Transkriptionsfaktor p65	15	0.56	0.15
IL6	Interleukin 6	14	0.59	0.33
MAPK1	Mitogenaktivierte Proteinkinase 1	13	0.54	0.16
IL10	Interleukin 10	10	0.47	0.12
ESR1	Östrogenrezeptor	10	0.44	0.03
IL2	Interleukin 2	9	0.53	0.05
AKT1	RAC-Alpha-Serin/Threonin-Protein-Kinase	9	0.44	0.04
MMP1	Matrix-Metallopeptidase 1	8	0.44	0.03
MMP2	Matrix-Metallopeptidase 2	8	0.44	0.03

Tabelle 1: Topologische Parameter der Kernziele im PPI-Netzwerk. Topologische Parameter der Hauptziele, die in der PPI-Netzwerkanalyse identifiziert wurden. Ausmaß, Nähe-Zentralität und Zwischen-Zentralität wurden berechnet, um die Bedeutung der Knoten zu bewerten und zentrale therapeutische Ziele zu identifizieren, die mit TBF gegen OA verbunden sind. Ziele mit höheren Grad- und Zentralitätswerten galten innerhalb des Interaktionsnetzwerks als wichtiger.

Ziel	PDB-ID	Aktive Standortkoordinaten (X, Y, Z)	Ligand	Bindungsaffinität (kcal/mol)
JUN	1JNM	X = 10,201; Y = 0,493; Z = 19,492	Quercetin	−8,4
RELA	7LEU	X = 1,717; Y = 23,889; Z = −0,778		−7,6
IL6	1ALU	X = 2,599; Y = −20,016; Z = 8,749		−6,9
MAPK1	6D5Y	X = 7,052; Y = 12,800; Z = 20,749		−6,7
IL10	1ILK	X = 17,836; Y = 46,443; Z = 38,685		−6,7

Tabelle 2: Molekulare Andockparameter und Bindungsaffinitäten zwischen Quercetin und Kern-Zielproteinen. Molekulare Andockungen zwischen Quercetin und den ausgewählten Kern-Zielproteinen JUN, RELA, IL6, MAPK1 und IL10. Die Tabelle zeigt Identifier der Protein Data Bank (PDB), Koordinaten des aktiven Standortgitterzentrums, die für Andockberechnungen verwendet werden, sowie vorhergesagte Bindungsaffinitätswerte, die aus molekularer Andockanalyse gewonnen wurden. Niedrigere Bindungsenergiewerte deuten auf eine stärkere vorhergesagte Bindungsaffinität zwischen Liganden und Rezeptor hin.

Ergänzende Tabelle 1: Wirkstoffe identifiziert aus TBF. Detaillierte Informationen zu den von TBF getesteten Wirkstoffe, einschließlich Verbindungsnamen, molekularen Kennungen, OB-Werten, DL-Werten und entsprechenden pflanzlichen Quellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 2: Vorhergesagte Ziele, die den aktiven Verbindungen von TBF entsprechen. Umfassende Liste vorhergesagter Proteinziele, die den getesteten Wirkstoffen von TBF entsprechen, einschließlich standardisierter menschlicher Gensymbole, die nach Zielnormalisierung und Deduplizierung erhalten wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 3: Netzwerkkodierungsinformationen für das TBF–Component–Target-Netzwerk. Detaillierte Codierungsinformationen, die für den Aufbau des TBF-Komponenten-Ziel-Interaktionsnetzwerks verwendet werden, einschließlich molekularer Identifikatoren, Zielinformationen, Netzwerkbeziehungen und Knotenklassifikationsdaten, die für die Analyse der Netzwerktopologie verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Diese Studie nutzte Netzwerkpharmakologie und molekulare Andockmethoden, um die potenziellen Mechanismen von TBF gegen OA zu untersuchen. Die analysierten Kernkräutermedizin umfassten Danggui, Danshen, Jixueteng, Haifengteng, Tougucao, Duhuo, Weilingxian und Xiangfu. Frühere Studien haben gezeigt, dass Danggui (Angelica sinensis Radix) artrosebedingte pathologische Veränderungen lindern kann, darunter Knorpeldegeneration, subchondrale Knochensklerose, abnormalen Gang und Knieschwellungen bei Destabilisierung der medialen Meniskusmodelle²⁰. In IL-1β-induzierten OA-Zellmodellen reduzierte Danggui die Ansammlung reaktiver Sauerstoffspezies und erhöhte die Aktivität von antioxidativen Enzymen, darunter Superoxiddismutase und Glutathion²¹. Danshenindion IIA, ein aktiver Bestandteil von Salvia miltiorrhiza, wurde berichtet, dass es Knorpeldegeneration lindert, die subchondrale Knochenremodellierungshomöostase wiederherstellt und die abnormale Angiogenese in OA-Mausmodellen²² unterdrückt. Darüber hinaus können Bestandteile, die von S. miltiorrhiza gewonnen werden, oxidativen Stress und Knochenstoffwechsel^regulieren. Spatholobus suberectus Es wurde berichtet, dass Dunn die PI3K/Akt/mTOR- und Ras/Raf/MAPK-Signalwege²⁵ reguliert, die mit dem Knorpelstoffwechsel und der Arthroseprogression assoziiert sind. Extrakte von S. suberectus Dunn hemmen außerdem die Produktion proinflammatorischer Chemokine²⁶. Darüber hinaus könnten die bei Impatiens balsamina berichteten entzündungshemmenden und antioxidativen Aktivitäten für die OA-Pathogenese relevant sein, da chronische Entzündungen und oxidativer Stress zur Knorpeldegeneration^{beitragen 27}. Radix Angelicae Biseratae wurde außerdem mit verbesserter Durchblutung und Linderung arthritisbedingter Symptome in Verbindung gebracht^28,29. Begrenzte Studien haben die potenziellen therapeutischen Effekte von Jixueteng (Spatholobus suberectus Dunn), Haifengteng (Caulis piperis Kadsurae) und Xiangfu (Cyperi rhizoma) bei OA untersucht.

Eine rechnergestützte Vorhersage basierend auf dem PPI-Netzwerk deutete darauf hin, dass TBF durch die Regulation der Entzündungsreaktionen und den Schutz des Gelenkknorpels therapeutische Effekte gegen OA ausüben könnte, obwohl diese Vorhersagen weitere experimentelle Validierung erfordern. Die Kernziele mit relativ hohen Gradwerten im PPI-Netzwerk waren JUN, RELA, IL6, MAPK1 und IL10. Frühere Studien haben gezeigt, dass JUN mit der Alterung der Chondrozyten und dem Fortschreiten von OA assoziiert ist. JunB/Jun Doppelmutantenmäuse zeigen eine entzündliche Infiltration im Gelenkgewebe, begleitet von Knochenabbau und Periostitis³⁰. Transkriptomische Analysen von osteoarthritischem Knorpel und Synovium zeigten ebenfalls eine reduzierte JUN-Expression³¹. Darüber hinaus wurde eine verminderte JUN-Proteinexpression in vorderen Kreuzbandtransektions-induzierten Rattenmodellen und seneszenten Chondrozyten³² beobachtet. Frühere Studien deuteten außerdem darauf hin, dass JUN-bezogene Signalgebung Knorpeldegeneration, Apoptose, Autophagie und extrazelluläre Matrix-Stoffwechsel in OA-Chondrozyten^{regulieren kann 33}. Frühere Studien haben außerdem gezeigt, dass Transfer-RNA-abgeleitete Fragmente die Proliferation und das Überleben von Gelenkchondrozyten über RELA-assoziierte Signalwege^{regulieren 34}. Darüber hinaus verbesserte die Hochregulation des Sox9-Gens in Verbindung mit der Hemmung der RELA-Expression in mesenchymalen Stromazellen die chondrogenen und immunmodulatorischen Fähigkeiten und verlangsamte das Fortschreiten der OA in experimentellen Modellen³⁵. Diese Ergebnisse stützen die potenzielle Relevanz von JUN- und RELA-bezogenen Signalwegen, die in der vorliegenden rechnergestützten Analyse identifiziert wurden.

IL6 ist ein wichtiger entzündlicher Mediator bei OA und spielt eine wichtige Rolle im Knorpelstoffwechsel, indem es sowohl den Abbau als auch die Reparaturprozesse beeinflusst. Unter chronischen, niedriggradigen Entzündungszuständen tragen erhöhte IL6-Spiegel zur Chondrozyten-Seneszenz, zur verminderten Knorpelmatrixsynthese und zur Störung der Knorpelhomeostase³⁶ bei. Frühere Studien haben gezeigt, dass die IL6-Rezeptor/JAK2-Signalübertragung an der Regulation der Apoptose von seneszenten Zellen beteiligt ist und gezielte Entfernung von seneszenten Zellen die OA-Progression³⁷ abschwächen kann. Darüber hinaus berichteten Li Q und Kollegen, dass die Hochregulation von miR-186-5p die Entzündungsantworten in IL-1β-stimulierten Chondrozyten regulierte, während die Hemmung von miR-186-5p die OA-Progression durch Steigerung der MAPK1-Expression³⁸ linderte. Diese Ergebnisse stützen die mögliche Beteiligung von IL6- und MAPK1-bezogenen Signalwegen, die in der vorliegenden rechnergestützten Analyse identifiziert wurden.

IL10 spielt eine schützende Rolle bei der Knorpelhomöostase und kann zur Erhaltung des Knorpelmikroumfelds beitragen. Frühere Studien haben gezeigt, dass IL10 die Chondrozytenapoptose durch Regulation mitochondrialer apoptotischer Wege, Reduktion der Caspaseaktivität und Modulation des Bax/Bcl-2-Verhältnisses³⁹ hemmt. Darüber hinaus wurde IL10 mit einer reduzierten extrazellulären Matrixdegradation und einer verminderten Expression matrixabbaubezogener Faktoren in Verbindung gebracht, darunter MMP3, MMP13, ADAMTS4 und induzierbarer Stickstoffoxidsynthase, in den Modellen⁴⁰ des komprimierten Gelenkknorpels. Die KEGG-Signalweganreicherungsanalyse in der vorliegenden Studie deutete darauf hin, dass die IL-17-, TNF- und hypoxie-induzierbaren Faktor-1 (HIF-1) Signalwege mit den vorhergesagten therapeutischen Effekten von TBF gegen OA assoziiert sein könnten, obwohl diese rechnergestützten Vorhersagen experimentelle Bestätigung erfordern. Frühere Studien haben gezeigt, dass IL-17 durch die Regulation der Entzündungsreaktionen und die Aktivität der Synovialzellen zur OA-Progression beiträgt^41,42. Die erhöhte IL-17-Expression korreliert ebenfalls positiv mit dem Krankheitsschwere bei Knie-OA⁴³. TNF-α ist ein weiterer wichtiger entzündlicher Mediator, der mit OA-bedingter Entzündung, Schmerzen und Knorpeldegeneration in Verbindung steht, und die Hemmung der TNF-α-Signalübertragung kann den Krankheitsfortschritt lindern⁴⁴. Darüber hinaus spielt HIF-1α eine wichtige Rolle beim hypoxischen Stoffwechsel der Chondrozyten, der Regulierung der extrazellulären Matrix, der synovialen Entzündung und der Remodellierung des subchondralen Knochens bei OA⁴⁵. Frühere Studien haben auch nahegelegt, dass die Hemmung der HIF-1α-bezogenen Signalübertragung die Chondrozytenfunktion schützen und Knorpeldegeneration⁴⁶ reduzieren kann. Diese Ergebnisse stimmen mit den durch die vorliegenden Computeranreicherungsanalyse identifizierten Signalwege überein.

Diese In-silico-Studie hat mehrere wichtige Einschränkungen. Erstens stützte sich die Analyse auf öffentlich zugängliche Datenbanken, die unvollständige oder voreingenommene Informationen zu pflanzlichen Verbindungen und Zielannotationen enthalten können. Darüber hinaus beinhalten rechnergestützte Zielvorhersagemethoden eine inhärente Unsicherheit, und die in dieser Studie identifizierten vorhergesagten Wechselwirkungen erfordern eine experimentelle Verifikation. Die molekulare Andockungsanalyse spiegelt das theoretische Bindungspotenzial wider und nicht direkte physiologische oder pharmakologische Aktivitäten. Außerdem wurden keine in-vitro - oder in-vivo-Experimente durchgeführt, um die rechnergestützten Vorhersagen zu validieren. Faktoren wie Kräuterdosierung, Pharmakokinetik und die Gesamtverfügbarkeit der kombinierten Formel wurden ebenfalls nicht bewertet. Daher sollten alle aus der vorliegenden Studie gewonnenen Schlussfolgerungen als prädiktiv betrachtet werden und eine weitere experimentelle Bestätigung erfordern.

Die vorliegende Studie, basierend auf Netzwerkpharmakologie und molekularen Andockungsanalysen, bietet einen prädiktiven Rahmen zur Untersuchung der potenziellen Mechanismen von TBF im Vergleich zu OA. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass TBF mehrere OA-bezogene Ziele durch Wechselwirkungen zwischen Wirkstoffen, die aus seinen acht Bestandteilen stammen, regulieren kann. Die identifizierten Ziele waren mit biologischen Prozessen und Signalwegen bereichert, die mit der Entzündungsregulation, dem Lipidstoffwechsel und hypoxiebezogenen Signalwegen verbunden sind, einschließlich der IL-17-, TNF- und HIF-1-Signalwege. Die molekulare Andockungsanalyse zeigte zudem günstige vorhergesagte Bindungsaffinitäten zwischen Quercetin und den Kernzielen JUN, RELA, IL6, MAPK1 und IL10. Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass TBF Multi-Komponenten- und Multi-Target-regulatorische Effekte gegen OA ausüben könnte. Diese Studie bietet zudem eine theoretische Strategie und einen methodischen Rahmen für zukünftige mechanistische Studien und die experimentelle Validierung von TCM-Formeln in der OA-Forschung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AutoDockTools	Software	Version 1.5.7; The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
AutoDock Vina	Software	Version 1.5.7; The Scripps Research Institute	https://autodock.scripps.edu/
barplot function	R-Visualisierungsfunktion	clusterProfiler-Paket	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
clusterProfiler	R-Paket	Bioconductor-Paket für Enrichment-Analyse	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
CytoHubba	Plugin	Kompatibel mit Cytoscape 3.10.2	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba
Cytoscape	Software	Version 3.10.2; Cytoscape Consortium	https://cytoscape.org/
DAVID	Datenbank	Datenbank für Annotation, Visualisierung und Integrierte Entdeckung	https://david.ncifcrf.gov/
dotplot function	R-Visualisierungsfunktion	clusterProfiler-Paket	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/
DrugBank	Datenbank	University of Alberta	https://go.drugbank.com/
GeneCards	Datenbank	GeneCards Suite	https://www.genecards.org/
MicrobiomeAnalyst / MicrobiomeNet	Online-Plattform	Online-Enrichment-Visualisierungsplattform	https://microbiomenet.com/
OMIM	Datenbank	Online Mendelian Inheritance in Man	https://www.omim.org/
PDB	Datenbank	RCSB Protein Data Bank	https://www.rcsb.org/
PubChem	Datenbank	National Center for Biotechnology Information	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
PyMOL	Software	Version 2.5.4	https://pymol.org/
R	Software	Version 4.3.1; R Foundation for Statistical Computing	https://www.r-project.org/
STRING	Datenbank	Suchwerkzeug für die Retrieval von interaktiven Genen/Proteinen	https://cn.string-db.org/
TCMSP	Datenbank	Traditionelle Chinesische Medizin Systeme Pharmakologie Datenbank und Analyseplattform	http://tcmspw.com/tcmsp.php
TTD	Datenbank	Therapeutisches Ziel Datenbank	https://db.idrblab.net/ttd/
UniProt	Datenbank	Universal Protein Resource	https://www.uniprot.org/
Venny	Software	Version 2.1.0	https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html