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Diese Studie verwendete ausschließlich öffentlich zugängliche, de-identifizierte Datensätze und beinhaltete keine direkten Versuche am Menschen oder Tier; Daher waren keine zusätzliche Zustimmung des Ethikausschusses und eine informierte Zustimmung erforderlich.
Datendownload und -verarbeitung
RNA-Sequenzierungsdaten und entsprechende klinische Informationen zum Lungenplattenepithelkarzinom (LUSC) wurden aus der Cancer Genome Atlas (TCGA)-Datenbank über das Genomic Data Commons-Datenportal im Rahmen des TCGA-LUSC-Projekts bezogen. Die in dieser Studie verwendete TCGA-LUSC-Expressionsmatrix basierte auf FPKM-Werten. Die Genexpressionswerte wurden vor nachgelagerten Analysen transformiert und normalisiert. Klinische Variablen umfassten Alter, Geschlecht, Tumorstadium, pathologisches TNM-Stadium, Grade, Überlebenszeit und Überlebensstatus, sofern verfügbar. Insgesamt wurden zunächst 489 TCGA-LUSC-Fälle gefunden, und 381 Patienten mit vollständigen Expressionsprofilen und Gesamtüberlebensinformationen wurden in den prognostischen Modellaufbau und interne Evaluation einbezogen.
Unabhängige Validierungsdatensätze wurden am 3. Januar 2026 aus der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank heruntergeladen. GSE30219 basierte auf der GPL570-Plattform und umfasste 307 LUSC-Patienten mit verfügbaren Expressions- und Gesamtüberlebensinformationen. GSE37745 basierte außerdem auf der GPL570-Plattform und umfasste 196 LUSC-Patienten mit verfügbaren Informationen zur Expression und dem Gesamtüberleben. GSE57148 basierte auf der GPL11154-Plattform und umfasste 91 normale Lungengewebe und 98 Lungengewebe von Patienten mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), insgesamt 189 Proben. GSE57148 wurde verwendet, um COPD-assoziiert differenziell exprimierte Gene zu identifizieren, während GSE30219 und GSE37745 als unabhängige externe Validierungskohorten verwendet wurden.
Für GEO-Datensätze wurde die Probe-Annotation mit dem entsprechenden R-Annotationspaket und den Plattformannotationsdateien durchgeführt. Sondenkennzeichen wurden in offizielle Gensymbole umgewandelt. Wenn mehrere Sonden auf dasselbe Gen abgebildet wurden, wurde die Sonde mit dem höchsten durchschnittlichen Expressionswert beibehalten, um dieses Gen darzustellen. Nach der Gen-Symbol-Übereinstimmung wurden in den Validierungsdatensätzen keine fehlenden Modellgene festgestellt. TCGA-LUSC, GSE30219 und GSE37745 wurden als allgemeine LUSC-Kohorten analysiert, da der Patientenniveau COPD-Komorbidität in den für diese Analyse verwendeten Annotationen nicht bestätigt wurde.
Da TCGA- und GEO-Datensätze mit unterschiedlichen Ausdrucksplattformen generiert wurden, wurden plattformübergreifende Normalisierung und Batch-Effektkorrektur mit Standard-R-basierten Vorverarbeitungsmethoden vor der Modellanwendung durchgeführt. Das Risikomodell wurde in der TCGA-LUSC-Kohorte trainiert und anschließend unabhängig in jeder externen GEO-Kohorte evaluiert, anstatt alle Kohorten direkt zusammenzuführen. Die differentielle Expressionsanalyse wurde mit dem Limma-R-Paket durchgeführt. COPD-assoziierte differenziell exprimierte Gene in GSE57148 wurden mit |log2FC| gescreent. > 0,263 und P < 0,05. Diese log2FC-Schwelle entspricht einer etwa 1,2-fachen Veränderung und wurde als exploratives Screening-Kriterium verwendet, um potenziell relevante PANoptos-assoziierte Gene zu erhalten. Insgesamt wurden 277 PANoptose-assoziierte Gene aus zuvor veröffentlichten Apoptose-, Pyroptose-, Nekropotose- und PANoptose-bezogenen Studien kuratiert und sind in ergänzender Tabelle 1 aufgeführt.
Analyse der funktionellen Anreicherung von Genen
Um die funktionellen Auswirkungen der ausgewählten COPD-assoziierten PANoptose-Gene zu klären, wurden Gene Ontology (GO) und die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Anreicherungsanalysen mit dem clusterProfiler R-Paket und der Organisation durchgeführt. Hs.eg.db Annotationspaket. Die Kategorien GO-biologische Prozesse, zelluläre Komponenten und molekulare Funktionen wurden bewertet. Die KEGG-Anreicherungsanalyse des Signalwegs wurde durchgeführt, um Signalwege zu identifizieren, die mit den ausgewählten Genen assoziiert sind. P-Werte wurden für mehrfache Tests mit der Benjamini-Hochberg-Falschentdeckungsrate-Methode angepasst, wo anwendbar. Anreicherungsterme mit P < 0,05 wurden in dieser explorativen Analyse als statistisch signifikant angesehen. Anreicherungsdiagramme wurden mit ggplot2 generiert.
Unüberwachte Clustering-Analyse von PANoptosis-assoziierten Genexpressionsmustern
Um die molekulare Heterogenität im Zusammenhang mit der PANoptosis-assoziierten Genexpression in LUSC zu erforschen, wurde ein Konsens-Clustering mit dem ConsensusClusterPlus R-Paket durchgeführt. LUSC-Proben wurden anhand der Expressionsprofile von überlebensassoziierten PANoptose-Genen gruppiert. Hierarchische Clusterung wurde mit Pearson-Korrelationsdistanz angewendet. Die maximale Anzahl der Cluster wurde auf sechs gesetzt, und es wurden 1.000 Wiederbeprobungsiterationen durchgeführt, um die Robustheit der Clustering zu bewerten. Die optimale Clusterzahl wurde durch die Bewertung der Konsensmatrix, der kumulativen Verteilungsfunktionskurve, des Delta-Flächendiagramms und der biologischen Interpretierbarkeit der resultierenden Gruppen bestimmt. Basierend auf diesen Kriterien wurde k = 2 für die nachgelagerte Analyse ausgewählt. Die Überlebensunterschiede zwischen den beiden molekularen Gruppen wurden mittels Kaplan-Meier-Analyse und dem Log-Rank-Test bewertet.
Analyse der Unterschiede in der Immunmikroumgebung zwischen Subtypen
Um die Merkmale der Immunmikroumgebung zwischen molekularen Subtypen zu vergleichen, wurde die Infiltration von Immunzellen mittels des CIBERSORT-Dekonvolutionsalgorithmus mit der LM22-Leukozytensignaturmatrix geschätzt. Die Analyse wurde in R mit den Paketen e1071 und preprocessCore durchgeführt. CIBERSORT-Permutationswerte P wurden aufgezeichnet, um die Zuverlässigkeit von Dekonvolutionsschätzungen zu bewerten. Da diese Studie explorativ war und auf retrospektiven transkriptomischen Daten basierte, wurden Immunzellunterschiede als rechnerisch abgeleitete Immuninfiltrationsmuster und nicht als direkte zelluläre Messungen interpretiert.
Der ESTIMATE-Algorithmus wurde verwendet, um Stromal-Score, Immun-Score, ESTIMATE-Score und Tumorreinheit für jede Tumorprobe zu berechnen. GSVA wurde angewandt, um die Anreicherungswerte auf Pfadebene anhand ausgewählter Gensätze zu schätzen. Gruppenweise Unterschiede in Immunzellfraktionen, Immun-Checkpoint-Genen, HLA-Familiengenen und ESTIMATE-abgeleiteten Scores wurden mittels nichtparametrischer Tests bewertet. Für mehrere immunbezogene Vergleiche wurde die Benjamini-Hochberg-Korrektur angewandt, wo es angebracht war; Analysen mit nominalen P-Werten wurden als explorativ interpretiert. Die Spearman-Rangkorrelationsanalyse wurde verwendet, um Assoziationen zwischen Genexpression und immunbezogenen Markern zu bewerten, wobei sowohl Korrelationskoeffizienten als auch P-Werte dort angegeben wurden. HLA-Transkriptunterschiede wurden als transskriptionelle Veränderungen im Zusammenhang mit Antigenpräsentation interpretiert und nicht als direkte funktionelle Belege für eine erhöhte Antigenpräsentationskapazität.
Etablierung einer prognostischen Signatur in Bezug auf PANoptosis-assoziierte Gene
Die TCGA-LUSC-Kohorte mit vollständigen Expressionsprofilen und allgemeinen Überlebensinformationen wurde für den prognostischen Modellaufbau verwendet. Unter den 489 zunächst gefundenen TCGA-LUSC-Fällen wurden 381 Patienten mit vollständigen Gesamtüberlebensdaten in die prognostische Analyse einbezogen. Diese Patienten wurden zufällig in eine Ausbildungskohorte und eine interne Testkohorte mit einem Verhältnis von 7:3 eingeteilt. Eine geschichtete Randomisierung wurde nach Überlebensstatus durchgeführt, um eine vergleichbare Verteilung der Überlebensereignisse zwischen den Trainings- und Testkohorten aufrechtzuerhalten.
In der Trainingskohorte wurde erstmals die univariate Cox-Proportional-Hazard-Regression eingesetzt, um die Assoziation zwischen jedem kandidaten PANoptosis-assoziierten Gen und dem Gesamtüberleben zu bewerten. Gene mit P < 0,05 galten als prognostische Kandidaten und wurden anschließend mit dem glmnet R-Paket in die LASSO-Cox-Regression aufgenommen. Zehnfache Kreuzvalidierung wurde verwendet, um den optimalen Strafparameter auszuwählen und Überanpassung zu reduzieren. Basierend auf den LASSO Cox-Regressionskoeffizienten und den entsprechenden normalisierten Genexpressionswerten wurde für jeden Patienten ein individualisierter Risikoscore mit der Formel berechnet:
Risiko-Score = Σ(coefi × Xi)
wobei Coefi den Regressionskoeffizienten jedes ausgewählten Gens und Xi den normalisierten Expressionswert des entsprechenden Gens darstellt. Das endgültige prognostische Modell enthielt 12 Gene: GSDMD, IL18, NFKBIA, PIK3CA, IL1B, BIRC3, MCL1, PSMB10, LMNA, CFLAR, IL1R1 und AKT3. Die vollständige koeffizientenbasierte Risiko-Score-Gleichung ist in ergänzender Tabelle 2 dargestellt.
Der mittlere Risikowert in der Ausbildungskohorte wurde als Grenzwert verwendet, um Patienten in Hochrisiko- und Niedrigrisikogruppen einzuteilen. Die gleiche Risiko-Score-Formel wurde auf die interne Testkohorte sowie auf die externen Validierungskohorten GSE30219 und GSE37745 angewendet. Kaplan-Meier-Überlebensanalyse, Log-Rang-Tests und zeitabhängige Empfänger-Funktionscharakteristik-Analyse wurden zur Bewertung der Modellleistung verwendet. Da die Validierungsdatensätze mit Mikroarray-Plattformen erstellt wurden und keine bestätigte COPD-Komorbiditätsannotation enthielten, wurde die externe Validierung als retrospektive Bewertung in unabhängigen LUSC-Kohorten interpretiert und nicht als Validierung bei klinisch bestätigten COPD-komorbiden LUSC-Patienten.
Analyse der Arzneimittelsensitivitätsvorhersage
Die Arzneimittelsensitivität wurde mit dem pRRophetic R-Paket geschätzt, das die Arzneimittelantwort aus Tumorgenexpressionsprofilen basierend auf pharmakogenomischen Referenzdaten aus der Datenbank Genomics of Drug Sensitivity in Cancer vorhersagt. Für jede Patientenprobe wurden vorhergesagte Werte der halbmaximalen inhibitorischen Konzentration (IC50) berechnet. Ausdrucksmatrizen wurden gemäß den pRRophetischen Eingabeanforderungen verarbeitet, und die Batch-Effektkorrektur erfolgte mit dem standardisierten pRRophetic-kompatiblen Workflow. Vorhergesagte IC50-Werte wurden auf der pRRophetischen Ausgangsskala angegeben.
Acht Kandidaten, darunter Sorafenib, Gefitinib, Bleomycin, Bosutinib, Etoposid, Lenalidomid, Camptothecin und Methotrexat, wurden als exploratives Medikamentensensibilitätspanel bewertet. Unterschiede in den vorhergesagten IC50-Werten zwischen Hoch- und Niedrigrisikogruppen wurden mit dem Wilcoxon-Rangsummentest verglichen. Diese Ergebnisse wurden als rechnergestützte Arzneimittelsensitivitätsschätzungen interpretiert und nicht als gemessene klinische Chemotherapie-Antwort oder experimentell bestätigte Arzneimittelresistenz.
Statistische Analyse
Alle statistischen Analysen wurden mit R-Software durchgeführt. Kontinuierliche Variablen zwischen zwei Gruppen wurden mit dem Wilcoxon-Rangsummentest verglichen, während Vergleiche zwischen mehr als zwei Gruppen bei Bedarf mit dem Kruskal-Wallis-Test durchgeführt wurden. Das Gesamtüberleben wurde als primärer Überlebensendpunkt definiert. Kaplan-Meier-Überlebenskurven wurden erstellt, um Überlebensunterschiede zwischen den Gruppen zu vergleichen, und die statistische Signifikanz wurde mit dem Log-Rank-Test bewertet. Univariat und multivariat
Cox-Proportional-Hazard-Regressionsanalysen wurden verwendet, um prognostische Zusammenhänge zwischen klinischen Variablen, Risikogruppe und Gesamtüberleben zu bewerten. Variablen mit klinischer Relevanz oder statistischer Signifikanz in der Univariaten Cox-Analyse wurden für die multivariate Cox-Regression berücksichtigt. Die Annahme der proportionalen Gefahren wurde anhand von Schoenfeld-Residuen bewertet. Fehlende klinische Variablen wurden mittels vollständiger Fallanalyse für Cox-Regression und Nomogrammkonstruktion behandelt. Die Kollinearität zwischen klinischen Variablen wurde vor der multivariaten Modellierung bewertet.
Zeitabhängige ROC-Kurven wurden verwendet, um die prädiktive Leistung des Risikomodells für das Gesamtüberleben von 1, 3 und 5 Jahren zu bewerten. Ein Nomogramm wurde mit Variablen konstruiert, die im multivariaten Modell beibehalten wurden, oder Variablen mit ausreichender klinischer Verfügbarkeit. Kalibrierungsdiagramme wurden verwendet, um vorhergesagte und beobachtete Überlebenswahrscheinlichkeiten zu vergleichen. Die Entscheidungskurvenanalyse wurde als explorative Bewertung des potenziellen Nettonutzens über ausgewählte Schwellenwahrscheinlichkeiten durchgeführt.
Die Spearman-Rangkorrelationsanalyse wurde verwendet, um Zusammenhänge zwischen Genexpression und immunbezogenen Merkmalen zu bewerten. Korrelationskoeffizienten und P-Werte wurden, wo anwendbar, angegeben. Für mehrere Vergleiche wurde die Korrektur der Benjamini-Hochberg-Falschentdeckungsrate angewandt, wo es angebracht war. Analysen, die mit nominalen P-Werten berichtet wurden, galten als explorativ. Ein zweiseitiger P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.