3D-Zellkultur-basierte hybride bioanalytische Plattform für optische Bildgebung unter Verwendung von Seidenfibroin-Schwämmen

Zusammenfassung

Der Artikel beschreibt eine einfache, zugängliche und reproduzierbare Methodik zur Herstellung und Kultur von 4T1-iRFP720-Brustkrebszellen aus Seidengerüsten unter kontrollierten Flussbedingungen, um eine dynamische Kultur zu unterstützen. Zellwachstum und -migration wurden als Konzeptnachweis mit einem in vivo optischen Bildgebungsinstrument als Hauptnicht-invasiven Messwert bewertet.

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine innovative bioanalytische Hybridplattform, die für die präklinische Bewertung zellulärer Eigenschaften entwickelt wurde. Das System kombiniert eine dreidimensionale (3D) Zellkultur, die auf einer künstlichen extrazellulären Matrix gezüchtet wurde, mit einer chromatografieinspirierten Array-Konfiguration. Schwämme, die aus dem Strukturprotein Silk Fibroin bestehen, dienen sowohl als biomimetische extrazelluläre Matrix als auch als stationäre Phase. Seidenfibroin-Schwämme wurden intern mit einem mehrstufigen Verfahren hergestellt, bei dem inhärente Sericinproteine aus rohen Seidenfasern entfernt wurden, gefolgt von Auflösung und Dialyse zur Reinigung der Fibroinlösung, Auflösung in organischem Lösungsmittel und anschließendem Salzbett-Gießen zur Herstellung seidenbasierter Schwämme mit kontrollierter Porosität/Porengrößen von 500–800 μm. Genetisch veränderte Brustkrebszelllinien 4T1-iRFP720 und 4T1-wt (nicht-fluoreszierende Kontrolle) wurden in Seidengerüsten mit einem kontinuierlichen Medienfluss über eine Pumpe kultiviert, und ihr zelluläres Wachstum sowie ihre Eigenschaften wurden nicht-invasiv mit optischen Bildgebungstechniken (in vivo optisches Bildgebungsinstrument) analysiert. Durch die Verbindung von zentralen Vorteilen chromatografischer Systeme (Automatisierung, Reproduzierbarkeit) mit der biologischen Relevanz fortschrittlicher 3D-Zellkulturen ermöglicht die Plattform in vitro die Modellierung gewebeähnlicher Architektur und Morphologie und erleichtert gleichzeitig die Überwachung dynamischen zellulären Verhaltens. Parallel dazu ermöglicht der Einsatz medizinischer Bildgebungstechnologie unter anderem eine Echtzeit- und längere Überwachung der zellulären Migration und des Wachstums. Dieser Ansatz bietet erhebliches Potenzial zur Untersuchung zellulärer Verhaltensweisen auf makroskopischer Ebene in einem laminarähnlichen Strömungssystem. Durch die Verbesserung der physiologischen Relevanz von In-vitro-Modellen kann diese Methode dazu beitragen, die translationale Lücke zu In-vivo-Studien zu überbrücken und entspricht dem Reduzieren, Ersetzen, Verfeinern (3R)-Rahmen für Tierversuche.

Einleitung

In lebenden Geweben finden Zellmigration und -wachstum innerhalb einer dreidimensionalen, heterogenen extrazellulären Matrix (ECM) statt, die von biophysikalischen und biochemischen Signalen wie interstitieller Flüssigkeitsfluss und Zell-Interaktionen gesteuert wird. Diese Faktoren regulieren die Zellpolarität, die Mechanotransduktion und die koordinierte Bewegung und bilden die Grundlage für wichtige biologische Prozesse, darunter Gewebereparatur und Krebsinvasion 1,2,3,4.

Trotz ihrer Bedeutung bewerten die meisten In-vitro-Migrationstests, wie Scratch- und Transwell-Assays, die Bewegung einzelner Zellen auf flachen, statischen Substraten. Obwohl einfach und kosteneffizient, reproduzieren diese 2D-Ansätze die strukturellen und dynamischen Merkmale der in vivo Mikroumgebung ^5,6 schlecht. Diese Einschränkung wird besonders kritisch im Zusammenhang mit Krebsmetastasen, bei denen Tumorzellen kollektiv durch mechanisch und chemisch vielfältige Gewebematrizen ^3,7,8 wandern. Obwohl 2D-Scratch-Assays beliebt sind, da sie leicht durchzuführen sind, spiegeln sie nicht die Komplexität des ECM oder die Auswirkungen von Fluid Flow⁶ wider. Transwell-basierte Ansätze liefern quantitative Auslesungen, jedoch nur an festen Endpunkten, wodurch eine kontinuierliche Beobachtung der Migration ^6,9 verhindert wird.

Neuere Studien haben gezeigt, dass der interstitielle Fluss das metastasische Potenzial verstärkt, während ECM-Steifheit und -Zusammensetzung den epithelial-mesenchymalen Übergang und die kollektive Migration^{fördern 4,10}. Fortschrittlichere 3D-Systeme, wie Sphäroide und Organoide, nähern sich nativen ECM-Umgebungen besser an; Ihre Anwendung ist jedoch oft durch Variabilität, begrenzte experimentelle Zugänglichkeit und Schwierigkeiten in der standardisierten Analyse^11,12 eingeschränkt. Mikrofluidische Plattformen bieten eine überlegene Kontrolle über mechanische und fluidische Bedingungen, doch ihre Abhängigkeit von spezialisierten Fertigungsmethoden und -ausrüstungen begrenzt ihre weitverbreitete Nutzung¹³. Daher bleibt die Rekonstruktion dieser integrierten Signale in vitro auf kontrollierte, zugängliche, nicht-invasive und kosteneffiziente Weise eine große Herausforderung ^5,14.

Um diese Herausforderungen zu bewältigen und die Lücke zwischen konventionellen 2D-Tests und komplexen In-vivo-Modellen zu schließen, entwickelten wir eine einfache, flussfähige 3D-Zellulärplattform auf Basis eines Seiden-Fibroin-Schwammgerüsts. Das System verwendet einen Seidenschwamm mit abstimmbaren mechanischen Eigenschaften als ECM-ähnliches Gerüst. Silk wurde wegen ihrer porösen Struktur ausgewählt, die eine sanfte Perfusion ermöglicht und den physiologisch relevanten interstitiellen Fluss^unterstützt. Seine Biokompatibilität und etablierte Verwendung in der Biomedizin und Gewebetechnik machen es zu einem geeigneten Material für diese Anwendung. Eine aktuelle Veröffentlichung zeigte zudem das ökologische Nachhaltigkeits- und Recyclingpotenzial des Gerüsts¹⁶. In einer weiteren Studie zeigten wir ihre Anpassungsfähigkeit über verschiedene bildgebende Verfahren hinweg, wie zum Beispiel die Positronenemissionstomographie¹⁷. Diese vorherige Arbeit bildete die Grundlage für die heutige Methodikbeschreibung, in der wir auf demselben Plattformkonzept in einer vereinfachten in vivo optischen Bildgebungskonfiguration aufbauen. Zusammen zeigen diese Studien das Potenzial des Systems für multimodale, bildgebende Beurteilung von konstruierten Gewebekonstrukten und unterstützen dessen Nutzung als vielseitige experimentelle Plattform zur Integration von In-vitro-Kulturen und in vivo-relevanten Ergebnissen über verschiedene Krebszellmodelle hinweg.

Als Proof-of-Concept kultivierten wir iRFP720-markierte 4T1-dreifach-negative Brustkrebszellen innerhalb des Gerüsts unter zwei Bedingungen mit geringem Scherspannungsfluss für fünf Tage. Nicht-invasive in-vivo optische Bildgebende Überwachung zeigte deutliche, flussgesteuerte Wachstumsmuster und signifikante Veränderungen in der Zellpopulationsdynamik im Vergleich zu statischen Kontrollen. Durch die Betonung von technischer Einfachheit und Reproduzierbarkeit bietet dieses Modell eine praktische Brücke zwischen 2D-Tests und In-vivo-Studien und ermöglicht es Forschern, auf makroskopischer Ebene und nicht-invasiv flussvermittelte zelluläre Eigenschaften in einem physiologisch relevanten, aber zugänglichen Format zu untersuchen. Im Gegensatz zu früheren Methoden, die oft auf destruktiven Endpunktanalysen basieren oder keine standardisierten Aussaatkriterien haben, führt dieses Protokoll einen systematischen Rahmen zur Optimierung der Gerüstproduktion und anschließend zur Zellbesetzung und Bildgebung ein. Dieser Ansatz verbessert die experimentelle Robustheit und bietet einen umfassenderen, longitudinalen Überblick über kollektive Zelldynamiken innerhalb von 3D-Matrizen, was eine bedeutende Verfeinerung gegenüber bestehenden Methoden zur Überwachung von Wachstum und Migration darstellt.

Protokoll

Der erste Abschnitt beschreibt die Vorbereitung von Seidenfibroin-Gerüsten basierend auf früheren veröffentlichten Arbeiten¹⁶. Die folgenden Abschnitte beschreiben die Optimierung der Zellaussaatdichte, die Integration von Fluss und optische Bildgebung zur Überwachung der Zellbewegung und des Wachstums. Diese Studie nutzte ausschließlich etablierte Maus-Brustkrebszelllinien (4T1-wt und 4T1-iRFP720) und umfasste keine menschlichen Teilnehmer, Patientenproben, Primärgewebe oder lebende Tiere. Gemäß institutionellen und nationalen Richtlinien war keine ethische Genehmigung erforderlich. Ein schematischer Überblick über den Arbeitsablauf ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Vorbereitung des Seidenfibroin-Schwamms

1. Kokonreinigung und Entgummi.
   1. Schneiden Sie die Kokons der Seidenraupe Bombyx mori L. mit einem Sicherheitsskalpell auf.
   2. Entfernen Sie die Larven und entfernen Sie die innerste Kokonschicht (kompakte Schicht direkt um die Larvenhöhle) mit einer Standard-Sezierungsnadel.
   3. Füllen Sie einen Becher mit 1,6 Liter doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O).
   4. Fügen Sie eine magnetische Rührstange hinzu und bringen Sie das Wasser beim Rühren zum Kochen; Decken Sie den Becher mit Alufolie ab, um die Erhitzung zu beschleunigen und den Wasserverlust zu reduzieren.
   5. Fügen Sie 3,4 g Na_2CO3 hinzu, wenn die Wassertemperatur etwa 70 °C erreicht.
   6. Wenn die Mischung zu kochen beginnt, geben Sie 4 g vorbereitete Kokons in die Lösung und rühren Sie mit einem Glasstab um.
   7. Kochen Sie die Kokons 30 Minuten lang und rühren Sie alle 10 Minuten mit einem Glasstab um, um eine richtige Belichtung zu gewährleisten.
   8. Entfernen Sie die Seide aus der Lösung und spülen Sie sie mehrmals mit Leitungswasser, um die restlichen Sericin zu entfernen.
   9. Drücken Sie überschüssiges Wasser heraus und verteilen Sie die Seidenfasern auf einer vorbereiteten Alufolieschale.
   10. Trocknen Sie die Seidenfasern in einem vorgeheizten Ofen bei 50 °C, bis sie vollständig getrocknet sind (ca. 18 H).
2. Auflösung und Dialyse
   1. Verwenden Sie absolutes Ethanol und wasserfreies CaCl₂ für die folgenden Schritte. Die Lösungsmatrix besteht aus 1 Teil CaCl₂, 2 Teilen Ethanol und 8 Teilen ddH₂O. Das Verhältnis von trocken entfetteter Seide zur Auflösungsmatrix beträgt 1:10 [w/w].
   2. Wiegen Sie die getrocknete Seide und berechnen Sie entsprechend die richtigen Mengen der Komponenten für die Auflösungsmatrix.
   3. Fülle die entsprechende Menge CaCl₂ in eine Flasche mit rundem Boden und einer Rührstange.
   4. Messen Sie die benötigte Menge Ethanol und ddH₂O ab und kombinieren Sie sie.
   5. Gib beim Rühren die Ethanol-ddH₂O-Mischung zum CaCl₂ hinzu.
   6. Stellen Sie eine Refluxvorrichtung ein und erhitzen Sie die Mischung auf 100 °C in einem Ölbad, damit sich das CaCl₂ auflöst und die Mischung zum Kochen kommt.
   7. Wenn die Mischung zu kochen beginnt, gib die getrocknete Seide hinzu und erhitze sie 45 Minuten unter Reflux.
   8. Bereiten Sie 15 cm lange 3,5 kDa Cellulose-Dialyseröhrchen vor, indem Sie sie mehrmals mit Wasser abspülen, um sie wieder zu befeuchten, und sichern Sie dann ein Ende mit einem Dichtungsclip um einen Glasstab.
   9. Nach dem Kochen wird die heiße Seidenlösung in den Schlauch übertragen und das gegenüberliegende Ende mit einem Clip versiegelt, wobei ein Abstand von 2–3 cm zwischen der Flüssigkeit und dem Dichtungsclip ohne Lufteinschlüsse gelassen wird.
   10. Setzen Sie das gefüllte Dialyserohr in ein 2-Liter-Becherglas mit ddH₂O und führen Sie eine Dialyse bei Raumtemperatur für 72 Stunden durch, wobei das Wasser zweimal täglich gewechselt wird, um eine effektive Reinigung zu gewährleisten.
   11. Zentrifugiere die Lösung bei 4500 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
   12. Gießen Sie das Überlagerungsmittel vorsichtig in Zentrifugenröhren, ohne das Pellet zu stören, und lagern Sie die Röhren bei -20 °C.
       HINWEIS: Füllen Sie die Zentrifugenröhren auf höchstens die Hälfte ihrer Kapazität und frieren Sie sie in horizontaler Position ein.
3. Lyophilisation
   1. Heizen Sie die Vakuumpumpe 20 Minuten vor und bedienen Sie den Lyophilisator gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   2. Stellen Sie die gefrorenen Zentrifugenröhren direkt aus dem Gefrierfach in eine Rundflasche.
   3. Befestige die Flasche am Gelyophilissator und gelyophilisiere 24 Stunden lang.
   4. Bis zur weiteren Verwendung sollte das lyophilisierte Seidenfibroin an einem trockenen Ort bei Zimmertemperatur aufbewahrt werden.
4. Lösungsmittelguss und Partikellaugung
   1. Geben Sie die benötigte Menge lyophilisierter Seide zu 1,1,1,3,3,3-Hexafluorisopropanol (HFIP) in einem Urinprobenbehälter unter einer Abzugshaube hinzu, um eine 16%ige [w/v]-Lösung mit einem Endvolumen von 30 ml zu erhalten, und schließen Sie den Behälter mit einem Deckel.
      VORSICHT: HFIP ist korrosiv und schädlich, wenn es eingeatmet, aufgenommen oder über die Haut aufgenommen wird; Behandeln Sie das Lösungsmittel in einer Abzugshaube und tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (PSA) und vermeiden Sie den Kontakt mit Haut, Augen und Dämpfen. Im Falle einer Verschüttung sammeln Sie die Flüssigkeit mit absorbierenden Materialien und reinigen Sie die betroffenen Stellen. Transferiere kontaminierte Materialien in ausgewiesene Behälter für gefährliche Abfälle.
   2. Verschließen Sie den Behälter fest und legen Sie ihn 18 Stunden lang auf den Orbitalshaker mit 70 U/min, damit sich die Seide auflösen kann.
   3. Siebe NaCl mit verschiedenen Netzen und stelle den Anteil von 500–800 μm beiseite.
   4. Füllen Sie eine Petrischale (9 cm Durchmesser, 8,5 cm Bodendurchmesser) mit 100 g des gesiebten Salzes (500–800 μm Fraktion), was eine Höhe von 1,2 cm ergibt. Achten Sie darauf, dass die Oberfläche gleichmäßig ausgeglichen ist.
   5. Gießen Sie vorsichtig 25,5 ml der vorbereiteten Seidenlösung über das Salzbett (Porogen zur Bildung von Schwammporen).
   6. Decken Sie die Petrischale mit dem Deckel ab und legen Sie sie für 10 Minuten auf einen Orbitalshaker bei 70 U/min, um eine gleichmäßige Infiltration der Seidenlösung in das Salzbett zu ermöglichen.
   7. Die Petrischale bei 37 °C 1 Stunde mit geschlossenem Deckel inkubieren lassen; anschließend wird die unbedeckte Petrischale bei 37 °C weitere 18 Stunden bebrütet.
   8. Um die Bildung von Beta-Blättern zu fördern, tauchen Sie das Seidenkomposit für 20 Minuten in einen Becher mit Methanol ein, nehmen Sie ihn dann heraus und trocknen sie bei 50 °C (ca. 1 H) in einem Ofen.
      VORSICHT: Methanol ist hochgiftig; Behandle sie mit einer Abzughaube und trage geeignete PSA, vermeiden Sie Hautkontakt und Dampfexposition. Im Falle einer Verschüttung sammeln Sie die Flüssigkeit mit absorbierenden Materialien und reinigen Sie die betroffenen Stellen. Transferiere kontaminierte Materialien in ausgewiesene Giftmüllbehälter.
   9. Entfernen Sie das porogene NaCl, indem Sie das Seidenkomposit mindestens 3 Stunden lang in einen Becher mit warmem Leitungswasser tauchen und alle 20–30 Minuten mit Wasserwechsel verwenden, bis das Material eine weiche, schwammartige Textur ohne harte Restteile erreicht.
   10. Lagern Sie den Seidenschwamm in 70 % Ethanol zur Desinfektion und kurzfristigen Konservierung bei 4 °C.
       HINWEIS: HFIP-haltige Lösungen wurden als halogenierte Lösungsmittelabfälle gesammelt, während Methanolabfälle gemäß institutionellen Richtlinien zur chemischen Sicherheit separat als nicht-halogenierte organische Lösungsmittelabfälle entsorgt wurden. Für die Dekontamination nach der Anwendung wurden Behälter und Arbeitsflächen, die HFIP oder Methanol ausgesetzt waren, mit einem kompatiblen Lösungsmittel abgespült und mit einer Reinigungslösung gereinigt. Anfängliche Spülungen und kontaminierte Verbrauchsmaterialien wurden als chemisch gefährliche Abfälle gesammelt.

2. Vorbereitung und Gleichgewicht des Seidengerüsts

1. Seiden-Fibroin-Schwämme werden mit einem Biopsie-Punch mit 6 mm Durchmesser geschnitten, um zylindrische Gerüste mit 6 mm Durchmesser und 12 mm Höhe zu erhalten.
   HINWEIS: Vorbereitete Seidenfibroin-Schwammgerüste können in 70 % Ethanol bei 4 °C bis zu 4 Monaten gelagert werden; Für längere Lagerung wird ein regelmäßiger Ersatz durch frisches Ethanol empfohlen. Ausgeglichene Gerüste können bis zu einem Monat in einem Zellkulturmedium bei 4 °C gelagert werden.
2. Geben Sie die Proben mit 70 % Ethanol in die Zentrifugenröhren zur Desinfektion.
3. Führen Sie die folgenden Schritte in einem zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank durch, um eine Kontamination zu verhindern.
4. Aspiriere Ethanol mit einer Pipette und drücke den Schwamm mit der Pinzette herunter.
5. Stellen Sie die Schwämme in eine Petrischale mit 10–20 ml ergänzendem Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640-Medium, um sie vollständig einzutauchen.
6. Tauschen Sie die Medien dreimal aus, mit einem kleinen Shake zwischen jedem Austausch.
7. Nach dem dritten Waschen frisches Medium hinzufügen, den Deckel fest schließen und mit Paraffinfolie umwickeln.
8. Lagern Sie die Schwämme mindestens eine Woche im Kühlschrank bei 4 °C auf, bevor sie zur Zellkultur verwendet werden. In dieser Zeit tauschen Sie die Medien 4–5 Mal aus.
   HINWEIS: Sicherstellen Sie die vollständige Entfernung des Ethanols, da Restethanol zytotoxisch ist und die Zellbindung sowie Lebensfähigkeit beeinträchtigt.

3. Hintergrundmessung und Bildoptimierung

1. Transportiere leere optisch transparente Filterröhren und optisch transparente Filterröhren mit unbesaaten Seidengerüsten zur in vivo optischen Bildgebung.
   HINWEIS: Die Bildgebung erfolgte mit einer in vivo optischen Bildgebung im 2D-Epifluoreszenzmodus.
2. Führen Sie Bildgebung in verschiedenen Filterpaaren durch (Anregung: 675 nm, 745 nm; Emission: 720 nm, 800 nm), Belichtungszeiten (4–60 s), Blendenstufen (1–8), Sichtfeld (13,5–22,5 cm) und unterschiedliche Lampenstufen (niedrig und hoch).
3. Bewerten Sie die Autofluoreszenz durch Bildgebung beider Plattformen unter identischen Bedingungen vor Verwendung von zellbesetzten Gerüsten.
4. Ersetzen Sie den männlichen Luer-Lock-Einlass durch einen abgeschnittenen weiblichen Luer-Lock-Stecker für reine Bildgebungseinrichtungen, um hochintensive Autofluoreszenzartefakte aus dem männlichen Luer-Lock-Stecker zu eliminieren. Wenn die Materialien für alle Experimente gleich sind, ist dieser Schritt nur einmal erforderlich.
    

4. Vorbereitung von Zellsuspensionen und Aussaat auf Seidenfibroin-Gerüsten

HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte in einem biologischen Sicherheitsschrank unter sterilen Bedingungen durch, da diese Verfahren den Umgang mit lebenden Zellen und zellhaltigen Proben umfassen.

1. Überwachen Sie regelmäßig 4T1-Wildtyp- (4T1-wt) und 4T1-iRFP720-Maus-dreifach-negative Brustkrebszellen auf Kontamination und auf Stabilität der iRFP720-Expression.
2. Halten Sie 4T1-wt und 4T1-iRFP720 murine dreifach-negative Brustkrebszellen in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kalbserum, 1 % L-Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %_CO2.
3. Passagezellen bei etwa 80 % Zusammenfluss mit 0,25 % Trypsin-EDTA, nach standardmäßigen aseptischen Zellkulturverfahren.
4. Verwenden Sie identische Durchgangsnummern und Kulturbedingungen für 4T1-wt- und 4T1-iRFP720-Zellen für alle vergleichenden Experimente.
5. Bereiten Sie eine Zellaussaatdichte von 5 × 10⁴ bis 5 × 10⁷ Zellen/mL vor (entsprechend einem Bereich von 1 × 10⁴ bis 1 × 10⁷ Zellen pro 200 μL). Bereiten Sie folgende Konzentrationen für die bildgebende Analyse vor, um die Signalintensität über verschiedene Zelldichten hinweg zu bestimmen und die optimale Konzentration zu bestimmen: 5 × 10⁴, 3,38 × 10⁵, 6,25 × 10⁵, 1,25 × 10⁶, 2,5 × 10⁶, 3,75 × 10⁶, 5 × 10⁶, 1,25 × 10⁷, 2,5 × 10⁷ und 5 × 10^{7 Zellen}/ml.
6. Bereite entsprechende Suspensionen von 4T1-wt-Zellen im gleichen Konzentrationsbereich wie die 4T1-iRFP720-Zellen vor, um als nicht-fluoreszierende Kontrollmechanismen zu dienen.
7. Stellen Sie einzelne Gerüste (vorbereitet in Abschnitt 2) in sterile, unbehandelte Petrischalen auf.
   HINWEIS: Verwenden Sie unbehandelte Petrischalen, um die Zellanhaftung an der Kunststoffoberfläche zu minimieren und die Zellanhaftung am Seidengerüst zu fördern.
8. Entfernen Sie überschüssiges Medium rund um jedes Gerüsts und aus dem Gerüst mit einer Pipette und achten Sie darauf, die Struktur nicht zu verformen.
9. Pipettieren Sie 200 μL der entsprechenden Zellsuspension direkt auf die Oberseite jedes Gerüsts, sodass das gesamte Volumen vom Gerüst absorbiert wird.
10. Inkubieren Sie Gerüste 4 Stunden lang bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %_CO2 , ohne die Schalen zu stören, um die Zellanhaftung zu ermöglichen.
11. Nach 4 Stunden wird jedes zellgesäte Gerüst vorsichtig in einen Brunnen einer 24-Loch-Platte mit 1 ml vorgewärmtem vollständigem Medium übertragen.
12. Gerüste werden über Nacht (16–24 H) bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %_CO2 bebrütet.

5. Montage von Kalibrierungsplattformen mit Fritten

HINWEIS: Führen Sie alle Montageschritte in einem biologischen Sicherheitsschrank mit sterilen Handschuhen, sterilen Pinzetten und sterilen Werkzeugen durch.

1. Entfernen Sie zellbezaimte Seidengerüste von den 24-Wellen-Platten mit steriler Pinzette und stützen Sie jedes Gerüst vorsichtig, um Kompression zu vermeiden.
2. Setzen Sie ein zellbesadetes Gerüst mit einer sterilen Säulen-Schubstange in den unteren Teil eines optisch transparenten Festphasen-Extraktionsrohrs ein.
3. Setzen Sie eine sterile Polyethylen-Fritte direkt über dem Gerüst mit der Schubstange.
   HINWEIS: Verwenden Sie Polyethylenfritten nur während der Signaloptimierung, da ihre Porengröße kleiner als der Zelldurchmesser ist und Zellmigration oder andere Zell-zu-Zell-Kontakte verhindert. Dies ermöglicht auch eine klare Signaltrennung, sodass die genaue Zellkonzentration zu jedem Signal identifiziert werden kann.
4. Wiederholen Sie die Stapelsequenz, ein Gerüst gefolgt von einem Fritten, bis fünf zellbesetzte Gerüste und fünf Fritten eingesetzt wurden.
5. Schließen Sie den Boden des Filterrohrs mit einem sterilen weiblichen Luer-Lock-Verbinder.
6. Schließen Sie den oberen Teil des Extraktionsrohrs mit einem sterilen männlichen Luer-Lock-Verbinder.

6. Signaloptimierung durch ein in vivo optisches Bildgebungsinstrument unter Verwendung von Kalibrierungsplattformen mit Fritten (nur einmal zur Systemvalidierung)

1. Transporte zellbasierte Plattformen zur Kalibrierung in den in-vivo-optischen Bildraum in einer lichtdichten Dunkelbox, um fluoreszierende Zellen vor Photobleaching zu schützen.
2. Bereiten Sie die in-vivo-optische Bildgebung gemäß institutioneller Sicherheit und Betriebsvorschriften vor.
3. Platzieren Sie zusammengesetzte, zellbesetzte Plattformen auf der Bildgebungsbühne.
4. Erfassen Sie 2D-Epifluoreszenzbilder mittels Anregung bei 675 nm und Emission bei 720 nm und optimieren Sie Bildparameter, einschließlich Belichtungszeit, Binningfaktor und f-Zahl, um maximale Signalintensität im linearen Detektionsbereich zu erreichen (siehe ergänzende Abbildung 1 und ergänzende Abbildung 2).
5. Enthalten Sie mindestens ein optisch transparentes Extraktionsrohr mit Gerüsten, die mit 4T1-wt-Zellen bei übereinstimmender Zelldichte besetzt sind, als nicht-fluoreszierende Referenzkontrolle.
6. Nehmen Sie Bilder für alle Proben mit identischen Aufnahmeeinstellungen auf, um einen quantitativen Vergleich der Fluoreszenzintensität zu ermöglichen (siehe ergänzende Abbildung 3 und ergänzende Abbildung 4).
7. Quantifizieren Sie Fluoreszenzsignale mit in-vivo optischer Bildanalysesoftware und bestimmen Sie die optimale Zellaussaatdichte (d. h. 5 × 10^{6 Zellen pro} Gerüst), die das maximale Signal ohne Sättigung liefert (siehe ergänzende Abbildung 5).
   HINWEIS: Die endgültigen Einstellungen des in-vivo-optischen Bildgebungssystems wurden auf Basis von Optimierungsexperimenten ausgewählt, um die Signalaufnahme innerhalb des linearen Dynamikbereichs des Systems sicherzustellen, eine Gerüstkapazitätssättigung zu vermeiden und ein stabiles Signal-Hintergrund-Verhältnis über experimentelle und Kontrollbedingungen hinweg aufrechtzuerhalten. Basierend auf optimierten Einstellungen solltest du alle experimentellen Bioreaktoren mit 5 × 10^{6 Zellen pro} Gerüst aussäen. Führen Sie Bildgebung im 2D-Epifluoreszenzmodus mit folgenden Einstellungen durch: Anregung: 675 nm (Bandbreite 30 nm); Emission: 720 nm (Bandbreite 20 nm), Belichtungszeit: 10 S, Binningfaktor: 8, F-Zahl: 8.

7. Experimentelle Plattformmontage (ohne Fritten)

1. Nach der Signaloptimierung werden Versuchsgerüste mit der bestimmten optimalen Zelldichte (d. h. 5 × 10⁶ Zellen/200 μL, siehe Abschnitt 4) eingesetzt.
2. Stell eine experimentelle Plattform mit insgesamt fünf Seidenschwämmen zusammen: ein zellbesetztes Gerüst und vier leere Gerüste ohne Polyethylenfritten, um die Zellkommunikation zu ermöglichen.
3. Versiegeln Sie die Oberseite des Filterrohrs mit einem sterilen männlichen Luer-Lock-Verbinder.
4. Konfigurieren Sie das Kultursystem für statische oder dynamische Kulturbedingungen
   1. Statische Kultur: Schließen Sie den unteren Port mit einem sterilen weiblichen Luer-Lock-Anschluss ab. Das System wird dann in ein Zentrifugenrohr mit locker sitzendem Deckel platziert.
      HINWEIS: Da das männliche Luer-Lock eine Öffnung hat, ermöglicht diese Konfiguration einen Gasaustausch und minimiert gleichzeitig das Kontaminationsrisiko. Bei diesem Setup wird das Medium einmal täglich manuell in der Haube ausgetauscht.
   2. Dynamische Kultur: Verbinden Sie den unteren Port mit sterilem Rohr und verbinden Sie die Einlassleitung mit dem männlichen Luer-Lock am oberen Port, um eine Perfusionskultur zu ermöglichen. Ständige Versorgung und Entnahme von Medien mit einem peristaltischen Pumpensystem (ergänzende Abbildung 6).

8. Dynamische Kultur auf der Plattform

1. Beginnen Sie mit der Desinfektion der Pumpe und des zugehörigen Schlauchs, indem Sie mit 70 % Ethanol bei maximalem Durchfluss für 10 Minuten spülen.
2. Spülen Sie die Pumpe und den Schlauch mindestens 10 Minuten mit einem sterilen Vollmedium, um den Restethanol zu entfernen. Ersetzen Sie durch frisches Medium und setzen Sie die Perfusion weitere 10 Minuten fort, um vor der Nutzung ein vollständiges Gleichgewicht des Systems sicherzustellen.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten vor der Zellanzaat vollständig mit Medium gefüllt und frei von Luftblasen sind.
3. Verbinden Sie den männlichen Luer-Lock-Einlass (oben) des montierten Reaktors mit der Auslassleitung der Pumpe über sterile Rohre und Luer-Lock-Anschlüsse.
4. Schließen Sie den Pumpeneinlass an ein steriles Reservoir mit vollständigem Medium an.
5. Verbinden Sie den Reaktorauslass (unten) mit dem Mediumreservoir, um eine Rezirkulations-Perfusionsschleife herzustellen. Diese Konfiguration ermöglicht eine kontinuierliche Durchströmung des Mediums durch das Gerüst, während ein geschlossenes Kreislaufsystem aufrechterhalten bleibt.
   HINWEIS: In diesem Protokoll wird die Perfusion in einer Umlaufkonfiguration durchgeführt, bei der das Medium kontinuierlich zwischen Reservoir und Reaktor zirkuliert wird. Dieser Ansatz minimiert den mittleren Verbrauch bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung des kontinuierlichen Durchflusses.
6. Stellen Sie die gewünschte Durchflussmenge der Pumpe so ein, dass sie die nominale Wandscherspannung (z. B. 1 dyn/^cm2 und 4 dyn/^cm2) anhand des inneren Kanalradius ( = 3 mm) basierend auf der Annahme des Poiseuille-Durchflusses¹⁹ anzeigt:
   
   wobei τ die Wandscherspannung (dyn/cm²) und Q die Volumenströmungsrate (cm³/s) ist, die Flüssigkeitsviskosität des RPMI-1640-Mediums (0,958 × 10^–3 N·s/^m² bei 37 °C)²⁰. Obwohl das eigentliche System ein poröses Seidengerüst enthält und daher von dieser idealisierten Geometrie abweicht, wurden die berechneten Werte als standardisierte operative Benchmarks verwendet, um reproduzierbare Vergleiche zwischen den Strömungsbedingungen zu ermöglichen. Die entsprechenden Durchflussraten betrugen 0,133 mL/min und 0,531 mL/min und wurden als Perfusionsbedingungen für die Kultur verwendet.
7. Starten Sie die Perfusion und überwachen Sie das System auf Lecks, Blasenbildung und stabilen Fluss.
8. Beginnen Sie mit der Perfusion mit einem Migrationshemmer oder einer Testsubstanz (z. B. Cucurbitacin E (CuE) bei 0,05 μmol/L im vollständigen Medium) oder ohne (Kontrolle) und halten Sie das gesamte Setup bis zu fünf Tage bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 %_CO2 . Schließen Sie daher den Pumpeneinlass an ein steriles Reservoir mit vollständigem Medium einschließlich der jeweiligen Testmasse an und starten Sie die Pumpe mit ähnlichen Einstellungen wie zuvor.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Ethanol vollständig aus Pumpe und Schlauch entfernt wird, indem Sie die definierten Mediumspülschritte durchführen. Entsorgen Sie den ersten Anteil des Mediums nach dem Abspülen vor dem Anschluss an zellgesätte Reaktoren und stellen Sie sicher, dass das System vollständig mit frischem Medium gefüllt und frei von Luftblasen ist.

9. Fluoreszenzbildgebung der experimentellen Plattform

1. Stoppen Sie die Pumpe, trennen Sie alle Schläuche und halten Sie sterile Bedingungen aufrecht.
2. Versiegeln Sie den Boden des SPE-Rohrs mit einem weiblichen Luer-Lock-Stecker, legen Sie das gesamte System in ein steriles 50-mL-Zentrifugenrohr und schließen Sie das Rohr sicher.
3. Übertragen Sie das System in einen Biosicherheitsschrank, um alle weiteren Schritte fortzusetzen. Im Inneren der Haube ersetzen Sie den männlichen Luer-Lock-Stecker durch einen abgeschnittenen, weiblichen Luer-Lock-Stecker, um das System vollständig zu schließen.
4. Setzen Sie das versiegelte System zurück in ein steriles 50-mL-Zentrifugenrohr und schließen Sie das Rohr sicher für den Transport.
   HINWEIS: Je nach Laborbedingungen muss der Fluss für die Bildgebung nicht gestoppt werden, wenn das System dicht ist. Dies war jedoch unter den gegebenen experimentellen Bedingungen nicht möglich.
5. Transportieren Sie versiegelte Reaktoren in den in-vivo-Raum des optischen Bildgebungssystems in einer lichtdichten Dunkelbox, um fluoreszierende Zellen vor Photobleaching zu schützen.
6. Setzen Sie die Reaktoren auf die Stufe des in-vivo-optischen Bildgebungssystems in den entsprechenden Halter.
7. Erfassen Sie 2D-Epifluoreszenzbilder mit den zuvor optimierten Parametern (z. B. Anregung 675 nm, Emission 720 nm, Belichtungszeit 10 s, Binning 8, f-Zahl 8).
8. Fügen Sie für jede Bildgebungssitzung 4T1-gesäte, unbesaidete Gerüste und leere Reaktorsteuerungen hinzu.
9. Quantifizieren Sie Fluoreszenzsignale mittels in-vivo optischer Bildgebungsanalyse.
10. Zeichnen Sie die quantitativen Ergebnisse für die Kontroll- und Behandlungsgruppen auf und erstellen Sie Vergleichsdiagramme, um die Wirkung des Testwirkstoffs auf das gemessene Ergebnis zu visualisieren.

10. Bildanalyse der experimentellen Plattform

1. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder an Tag 0, Tag 3 und Tag 5 und analysieren Sie sie mit Bildanalysesoftware.
2. Für jedes Bild wird vor der Analyse eine räumliche Kalibrierung durchgeführt. Misse die bekannte physikalische Länge der experimentellen Plattform in Pixeln mit dem Linienwerkzeug und gib die entsprechende reale Entfernung (85 mm) über Analyze > Set Scale ein, um die Pixel-zu-Länge-Umwandlung zu definieren.
3. Nach der Kalibrierung quantifizieren Sie die fluoreszierende Fläche, indem Sie manuell das Interessengebiet (ROI) mit dem freihändigen Auswahlwerkzeug umreißen.
4. Um den Nutzer-Bias zu minimieren, werden ROIs anhand konsistenter visueller Kriterien basierend auf der Fluoreszenzsignalintensität relativ zum Hintergrund definiert. Alle Analysen unter identischen Bedingungen durchführen und, wenn möglich, einen einzelnen ausgebildeten Bediener die Analyse durchführen lassen.
5. Identifizieren Sie das fluoreszierende Signal als helle Bereiche, die sich in den in vivo optischen Bildanalyse-Bildern deutlich vom dunklen Hintergrund unterscheiden können, und nutzen Sie diese Signale, um eine konsistente manuelle Segmentierung zu steuern.
6. Messen Sie die ausgewählten Regionen mit Analyze > Measure und notieren Sie die Flächenwerte für jeden Zeitpunkt. Wiederholen Sie dieses Verfahren für alle Bilder in allen experimentellen Gruppen.
7. Normalisieren Sie die Flächenmessungen auf den entsprechenden Tag 0-Wert für jede Probe mit Tabellenkalkulationssoftware, um Unterschiede in der Anfangsgröße zu berücksichtigen, und drücken Sie die Ergebnisse als Faltungsänderung relativ zum Ausgangsstand aus (Tag 0 = 1).

11. Statistische Analyse

1. Führen Sie alle Experimente mindestens in dreifacher Ausführung durch.
2. Wiederholen Sie alle Experimente mindestens dreimal (n = 3), bestimmen Sie die Mittelwerte sowie Standardabweichungen (SD).
3. Bestimmen Sie die statistische Signififikanz mittels zweiseitiger ANOVA, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest mit α = 0,05.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt eine benutzerfreundliche, kostengünstige Plattform zur makroskopischen Beobachtung von Zellwachstum und -bewegung in einer physiologisch relevanten 3D-Umgebung. Die Methode verwendet Seidenfibroin-Schwämme als ECM-Mimik und integriert kontrollierten interstitiellen Fluss, um dynamische Gewebebedingungen zu modellieren. Ein schematischer Überblick über die Schritt-für-Schritt-Verfahren von der Herstellung von Seidenschwamm und Gerüsten bis hin zur Zellsäung und...

Diskussion

Der in diesem Protokoll beschriebene Herstellungsprozess von Seidenschwamm ist standardisiert und gewährleistet eine reproduzierbare Gerüstfertigung, wie in einer früheren Studie¹⁶ berichtet. Die Herstellung von Schwämmen unter vollständig standardisierten Bedingungen wie Salzbetthöhe/-menge, Seidenlösungsvolumen und Methanolinkubation ist entscheidend, um einheitliche, vergleichbare Schwämme zu erhalten. Die produzierten Schwämme müssen die zuvor veröffentlichten...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Sigma-Aldrich	8.04515	Vorsicht: Gefahrstoff. Verwendet für die Auflösung von gefriergetrocknetem Seiden
24-Well Platte	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	Lagerung von zellbesiedelten Gerüsten während der Inkubation
4T1-iRFP720 murine triple-negative Brustkrebszellen	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), Universität Wien	N/A	Zellkulturexperimente; 4T1-iRFP720 wurde intern aus dem parentalen 4T1 (ATCC: CRL-2539) abgeleitet
4T1-wt murine triple-negative Brustkrebszellen	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), Universität Wien	ATCC: CRL-2539	Zellkulturexperimente
Bruker Alpha Compact FTIR mit Platinum-ATR-Sampling-Modul	Bruker	A220/D-01	FT-IR-Analyse
Calciumchlorid, wasserfrei, ≥93% Reagenzienqualität	Sigma-Aldrich	902179	Zur Herstellung der Lösungsmatrix
Zellkulturflask, T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	Verbrauchsmaterialien; für die Zellkultivierung
Zellkulturflask, T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	Verbrauchsmaterialien; für die Zellkultivierung
Zentrifuge 5804 R	Eppendorf	5805000010	Verwendet für Probentrennung durch Zentrifugation
Combi-Stopfen (weiblicher Luer-Lock-Anschluss)	Braun Melsungen AG	4495101	Verwendet für die Plattformmontage
Cucurbitacin E	Sigma-Aldrich	SML0577	Zellmigrationshemmer
Dermal Biopsie-Stanzer, ø 6 mm	Dahlhausen	1190001006	Verwendet zum Erhalt zylindrischer Schwammgerüste
Dialyseschläuche (3,5 kDa, Cellulose)	Spectra/Por von Spectrum Labs	SPEC132724	Zur Dialyse der Seidenfibroin-Lösung
Dulbecco's Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung	Sigma-Aldrich	D8537	Zur Erhaltung von Zellen
Ethanol, absolut	Merck	1.07017	Zur Herstellung der Lösungsmatrix
Excel	Microsoft	v2604	Datenorganisation, einfache Berechnungen und Darstellung
Fetalkalbenserum (FCS) wärmeinaktiviert	Biowest	S181H-500	Ergänzung für Zellkulturmedien
Fiji (ehemals ImageJ)	Open Source (https://imagej.net/software/fiji/)	N/A	Bildverarbeitung und -analyse
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	Statistische Analyse und Grafikerstellung
HPLC-Pumpe Hitachi L-7120 LaChrom	Merck	K-5244	Für dynamische Kulturbedingungen in der montierten Plattform
IVIS 200 Spectrum CT-System	PerkinElmer	128201	Optisches Bildgebungssystem mit CT-Fähigkeit
IVIS Living Image Software	PerkinElmer	v4.5.2	Software für die Erfassung, Visualisierung und quantitative Analyse von IVIS-Bildgebungsdaten
JEOL JSM-6510 Rasterelektronenmikroskop	JEOL GmbH	JSM-6510	REM-Bilder
L-Glutamin, 200 mM Lösung, geeignet für Zellkultur (L-Glu)	Sigma-Aldrich	G7513	Ergänzung für Zellkulturmedien
Lyophilisator Alpha 2-4 LD Plus	Martin Christ	101542	Zur Seidenfibroin-Lyophilisation
Männlicher Luer-Lock-Anschluss	Supelco (Sigma-Aldrich)	57020-U	Adapter für Probenreservoirs
Methanol, ≥99,9 %, HPLC-Gradient-Grad	Carl Roth	7342.1	Vorsicht: Giftig. Induktion der Beta-Faltblattbildung in Seiden-Verbundwerkstoffen
Optisch transparente Festphasenextraktion (SPE)-Röhrchen ohne Fritte	Sigma Aldrich	57240-U	Verwendet für die Plattformmontage
OPUS Spektroskopiesoftware	Bruker	v7.5	FT-IR-Analyse
Orbital- und Linearschüttler MI0103002	Four E'S Scientific	MI0103002	Einheitliche Verteilung/Mischung
Parafilm PM996	Sigma-Aldrich	P7793	Zum Versiegeln/Verpacken von Platten und Behältern zur Lagerung (z. B. Kühlung)
Penicillin-Streptomycin, flüssig, geeignet für Zellkultur (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Ergänzung für Zellkulturmedien
Petrischale, 9 cm	VWR	391-0598	Zum Salzbett-Schwammgießen; zum Einsetzen auf Seidengerüste
Polyethylenfritte für 1 mL SPE-Röhrchen	Supelco (Sigma Aldrich)	57244	Verwendet für die Plattformmontage
RPMI-1640-Medium, geeignet für Zellkultur	Sigma-Aldrich	R0883	Ergänztes Medium wird für die Seidenschwamm-Equilibrierung, Zellkulturerhaltung und verwandte Experimente verwendet
Serologische Pipette, 10 mL	Sarstedt	86.1254.025	Verbrauchsmaterialien; zur Erhaltung von Zellen
Serologische Pipette, 25 mL	Sarstedt	86.1685.020	Verbrauchsmaterialien; zur Erhaltung von Zellen
Serologische Pipette, 5 mL	Sarstedt	86.1253.025	Verbrauchsmaterialien; zur Erhaltung von Zellen
Seidenkokons von Bombyx mori L.	Sericulture and Agriculture Experimental Station, Vratsa, Bulgarien	N/A	Rohmaterial für die Seidenfibroin-Schwammproduktion
Natriumcarbonat, wasserfrei, ≥99,5% ACS	VWR	11552.A3	Verwendet für chemisches Entseiden, d. h. Entfernung von Sericin
Natriumchlorid, ≥98%, technisch	VWR	27788.366	Zum Salzbett-Schwammgießen
SPE-Säulenschieber	Carl ROTH	36P9.1	Verwendet für die Plattformmontage
Edelstahl-Analytische Siebe, 500 µm (ISO 3310-1)	ATECHNIK GmbH	200.050.222-046	Für NaCl-Siebung
Edelstahl-Analytische Siebe, 800 µm (ISO 33