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Methodenartikel

Koloniebildender Unit-Assay, angepasst für patientenabgeleitetes Knochenmark und periphere mononukleare Blutzellen

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DOI:

10.3791/71526

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26. Juni 2026

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1Department of Developmental & Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Ruth L. and David S. Gottesman Stem Cell Institute, Albert Einstein College of Medicine, 3Montefiore-Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Albert Einstein Flow Cytometry Core, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Hematology Oncology, Montefiore Medical Center, Albert Einstein College of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Einleitung der Differenzierung menschlicher hämatopoietischer Stamm- und Vorläuferzellen, die aus dem Knochenmark und peripheren mononuklearen Blutzellen des Patienten stammen. Der Test verwendet ein halbfestes Kulturmedium, das die Verpflichtung der erythroiden und myeloiden Linie unterstützt und standardisierte Kennzahlen für die reproduzierbare Kolonieklassifikation für die präklinische Wirkstoffcharakterisierung.

Zusammenfassung

Der Colony-Forming Unit (CFU)-Test ist eine grundlegende Technik zur Untersuchung hämatologischer Erkrankungen, einschließlich myelodysplastischer Syndrome (MDS) und akuter myelooider Leukämie (AML). Dieser Test verwendet halbfeste Medien, die mit definierten Zytokin-Kombinationen ergänzt werden, um das dreidimensionale Wachstum und die linienspezifische Differenzierung von erythroiden und myeloiden Vorläuferzellen zu unterstützen. Allerdings stellen periphere Blut- und Knochenmarkproben von Patienten abgeleitete periphere Blut- und Knochenmarkproben aufgrund verminderter Lebensfähigkeit, erhöhter Handhabungsempfindlichkeit und Variabilität im Koloniewachstum technische Herausforderungen dar. Darüber hinaus zeigen bestehende Richtlinien zur Identifizierung und Zählung von Kolonien erhebliche Variabilitäten bei der Definition von Koloniegröße und Linientypen, was die Reproduzierbarkeit zwischen den Studien einschränkt. Das hier beschriebene Protokoll ist für das Wachstum und die Differenzierung hämatopoietischer Stamm- und Vorläuferzellen optimiert, die aus MDS- und AML-Patientenproben isoliert wurden. Das Protokoll legt Wert auf sanfte Zellbehandlung, sterile Verarbeitung von Patientenproben, optimierte Kulturbedingungen und auf die auf patientenabgeleitete Zellen zugeschnittene Wachstumsdauern. Dieses Protokoll bietet einen praktischen Rahmen für CFU-Assays mit patientenabgeleiteten Proben und etabliert eine Standardkennzahl für konsistente Kolonienzählungen und -analysen in der hämatologischen Malignologieforschung.

Einleitung

Hämatopoiese ist ein streng regulierter Prozess, bei dem hämatopoietische Stammzellen (HSCs), die in Knochenmarknischen leben, alle reifen Blutzelllinien hervorbringen. Durch eine hierarchische Abfolge von Differenzierungsereignissen erzeugen HSCs multipotente Vorläufer, die sich nach und nach zu erythroide, myeloiden und lymphoiden Linien binden, bevor sie die terminale Reifung zu funktionellen zirkulierenden Blutzellen durchlaufen. Dieser Prozess wird durch koordinierte Signalübertragung innerhalb der Knochenmarkmikroumgebung sowie durch intrinsische transkriptionelle und epigenetische Regulationsmechanismen gesteuert. Störungen dieser regulatorischen Wege, insbesondere durch die Anhäufung genetischer oder somatischer Mutationen in HSCs, können die normale Differenzierung beeinträchtigen und zur klonalen Expansion abnormer Vorläufer führen. Solche Veränderungen können letztlich zu hämatologischen Störungen führen, die durch ineffektive Hämatopoese und Zytopesien gekennzeichnet sind, einschließlich myelodysplastischer Syndrome (MDS) und akuter myelooider Leukämie (AML)1,2,3,4,5.

Der Colony-Forming Unit (CFU)-Test ist eine gut etablierte In-vitro-Technik zur Bewertung des Differenzierungspotenzials hämatopoietischer Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs). Ursprünglich als kurzfristiger Test zur Messung der Proliferations- und Differenzierungskapazität hämatopoietischer Vorläufer 6,7,8 entwickelt, ist der CFU-Test seitdem ein weit verbreitetes Werkzeug sowohl in der klinischen als auch in der experimentellen Hämatologie9. In präklinischen Laborumgebungen wird der Test häufig verwendet, um die Auswirkungen genetischer Störungen oder Kandidatentherapien auf die hämatopoetische Differenzierung zu bewerten. Im Kontext der MDS- und AML-Forschung bieten CFU-Assays eine funktionelle Übersicht, um zu verstehen, wie molekulare und genetische Veränderungen die Differenzierungsfähigkeit von von Patienten abgeleitetem Knochenmark oder peripheren Blutzellen beeinflussen.

Der CFU-Test beinhaltet die Kultivierung von HSPCs in einem methylzellulosebasierten halbfesten Medium, das mit definierten Wachstumsfaktoren ergänzt wird, die die linienspezifische Expansion und Differenzierung unterstützen. Unter diesen Bedingungen vermehren sich die Vorläuferzellen und bilden diskrete Kolonien, die morphologisch nach der Linienidentität klassifiziert werden können. Ein kommerziell erhältliches, auf Methylcellulose basierendes halbfestes Medium, das für die Differenzierung von Erythroiden und Myeloiden optimiert ist, wird in diesem Protokoll verwendet. Das Medium enthält eine Kombination von Zytokinen, darunter Interleukin-3 (IL-3), Interleukin-6 (IL-6), Stammzellfaktor (SCF), Erythropoietin (EPO), Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF). Zusammen unterstützen diese Faktoren das Wachstum erythroider Vorläufer wie koloniebildende Unit-erythroid (CFU-E) und burst-bildende Unit-Erythroiden (BFU-E), myeloide Granulozyten-Makrophagen-Progenitoren (CFU-GM) sowie multipotente Progenitoren wie Granulozyten-, Erythrozyten-, Monocyten- und Megakaryzyten-Progenitoren (CFU-GEMM)10,11.

Trotz seines breiten Nutzens ist das oben erwähnte halbfeste Medium in seiner Differenzierungsfähigkeit begrenzt, da es die Differenzierung von Megakaryozyten und Blutplättchen nicht ausreichend unterstützt. Für diese Anwendungen sind spezialisiertere Formulierungen mit Thrombozytenwachstumsfaktoren geeigneter; Sie liegen jedoch außerhalb des Geltungsbereichs des dargestellten Protokolls. Insgesamt können Forscher durch sorgfältige Auswahl der Medienformulierung in Kombination mit morphologischer Bewertung und nachgelagerten Analysen wie Flowzytometrie die Arzneimittelsensitivität durch Analyse der Linienbindung und des Differenzierungspotenzials12 effektiv bewerten.

In dieser Studie wird der CFU-Test verwendet, um das therapeutische Potenzial von Kombinationstherapien zur Behandlung von rückfälligen/refraktären Hochrisiko-MDS zu untersuchen. Pyrimethamin ist ein klinisch zugelassenes Antifolat, das zur Behandlung von Toxoplasmose und parasitärer Malaria eingesetzt wird und kürzlich als Krebshemmer untersucht wurde. Neuere Studien haben gezeigt, dass die Pyrimethamin-Behandlung durch Hemmung wichtiger Signalwege wirken kann, die die de-novo-Pyrimidinsynthese regulieren16. In diesem Protokoll werden CFU-Assays verwendet, um die klinische Wirksamkeit von Pyrimethamin als Einzelmitteltherapie und als Kombinationstherapie mit Venetoclax zu untersuchen, das derzeit eine Frontlinientherapie für MDS- und AML-Behandlungist.

Trotz seines weitverbreiteten Einsatzes weist der CFU-Test mehrere technische Einschränkungen auf. Die Identifizierung und Klassifikation von Kolonien stützt sich stark auf morphologische Kriterien, die zwischen Beobachtern und zwischen Forschungszentren Variabilität verursachen können (6,19,20,21). Darüber hinaus zeigen patientenabgeleitete Proben von Personen mit MDS oder AML oft eine verminderte Zelllebensfähigkeit, erhöhte Fragilität und Heterogenität, was die Koloniebildung und nachfolgendeAnalysen erschweren kann. Die Vorbereitung von Kolonien für eine weitere Charakterisierung, einschließlich Durchflusszytometrie, kann daher eine sorgfältige Handhabung erfordern, um die Zellintegrität zu erhalten. Das Fehlen standardisierter Verfahren zur Kolonie-Identifikation, Zählung und nachgelagerten Analyse trägt zusätzlich zur Variabilität zwischen den Studien bei. Diese technischen Überlegungen unterstreichen die Notwendigkeit standardisierter Verfahren, die speziell für patientenabgeleitete hämatopoetische Proben optimiert sind.

Dieses Protokoll beschreibt einen optimierten Arbeitsablauf für die Durchführung von CFU-Assays mit mononuklearen Zellen, die aus primärem Knochenmark oder peripheren Blutproben von Patienten mit hämatologischen Malignitäten gewonnen wurden. Der Ansatz konzentriert sich auf praktische Strategien zum Umgang mit empfindlichen patientenabgeleiteten Zellen, zur Etablierung zuverlässiger Kulturbedingungen und zur Umsetzung einheitlicher Kriterien zur Kolonie-Identifizierung und Quantifizierung. Durch detaillierte methodische Orientierung und die Betonung reproduzierbarer Analysepraktiken zielt dieses Protokoll darauf ab, eine zuverlässigere Bewertung der hämatopoietischen Differenzierung und therapeutischen Reaktion in präklinischen Studien zu MDS und AML zu ermöglichen.

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Protokoll

Diese Studie verwendet deidentifizierte menschliche Bioproben, die aus einer Biobank unter einem vom Institutional Review Board genehmigten Protokoll "Molecular Biology of Benignant and Malignant Hematological Disorders" (IRB Protocol #200536) am Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center gewonnen wurden. Alle Verfahren wurden gemäß den ethischen Richtlinien der Institution durchgeführt. Alle Reagenzien und Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung von von Patienten abgeleiteten Knochenmark- oder peripheren Blutmononuklearzellen

HINWEIS: Nach den gängigen Richtlinien zur Behandlung von Patientenproben wird empfohlen, einen Ganzkörperkittel und reißfeste Einweghandschuhe im Labor zu tragen sowie unter einer Labor-Zellkulturhaube zum persönlichen Schutz vor der Blutübertragung von Krankheitserregern zu arbeiten. Alle Pipettenspitzen und serologischen Pipetten, die mit Patientenzellen in Kontakt kommen, sollten mindestens 30 Minuten in einer 10%igen Bleichlösung eingeweicht werden, bevor sie in Biohazard-Abfälle entsorgt werden.

  1. Experimentelle Vorbereitung
    1. Warmes IMDM-Medien, fetales Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin-Antibiotika (Pen-Streptokokken) auf 37 °C für mindestens 30 Minuten.
    2. Über Nacht halbfestes Material bei 4 °C aufgetaut. Am Tag des Anschenkens erwärme die Flasche mindestens 30 Minuten auf Zimmertemperatur (RT).
    3. Sterilisiere die Zellkulturhaube mit UV-Sterilisation für 15 Minuten und sprühe dann die Haubenoberflächen, Pipetten und Röhrenracks mit 70 % Ethanol (EtOH).
    4. Bereiten Sie einen Abfallbecher vor, der eine 10%ige Bleichlösung enthält, groß genug, um kontaminierte Pipettespitzen und serologische Pipetten aufzusammeln.
    5. Erhalten Sie Knochenmark- oder periphere Blut-Mononuklearzellen, die durch Dichtegradientenzentrifugationsmethoden isoliert werden. Zellen können am selben Tag der Entnahme oder aus eingefrorenen, biogelagerten Proben verwendet werden.
  2. Wenn Proben eingefroren sind, tauen Sie sie schnell in einem 37 °C starken Wasserbad auf, bis das meiste Eis geschmolzen ist und nur noch ein kleiner Eiskristall übrig bleibt. Legen Sie die Proben nach dem Auftauen sofort auf Eis.
    HINWEIS: Patientenproben sind sehr empfindlich gegenüber Auftauen. Es ist wichtig, die Proben so schnell wie möglich und in Chargen aufzutauen, um den Zelltod zu minimieren.
  3. Suspendierte Zellen in 5 ml erwärmtem Vollwachstumsmedium (IMDM-Medien ergänzt mit 4 % FBS und 1 % Pen-Strep).
  4. Bestimmen Sie die Zellkonzentration und Lebensfähigkeit mit AO/PI-Färbungsfarbstoff und einem automatisierten Zellzähler.
  5. Zentrifugiere die Zellen bei 350 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren. Entsorge Supernatant.
  6. Resuspendiere die Zellen in 5 ml steriler Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS). Wiederholen Sie die Zentrifugation an Pelletzellen und entsorgen Sie Supernatanten.
  7. Zellen in vollständigen Wachstumsmedien auf eine Konzentration von 2 Millionen lebenden Zellen/ml suspendieren. Bereite genug Zellen für 100.000 Zellen pro Brunnen einer 6-Well-Platte vor.

2. Medikamentenvorbereitung und Behandlungsverabreichung.

HINWEIS: Pyrimethamin wird als lyophilisiertes Pulver gewonnen und intern in Dimethylsulfoxid (DMSO) bei einer Konzentration von 100 mM rekonstituiert; Aliquots werden bei −80 °C gelagert. Venetoclax wird vorgelöst in DMSO bei einer Konzentration von 10 mM gekauft und bei -20 °C gelagert. Für dieses Experiment werden Venetoclax und Pyrimethamin als eine einzige Dosis über freie Aufnahme parallel zu einer Vehicle-Control-DMSO-Behandlung verabreicht.
VORSICHT: Pyrimethamin, Venetoclax und DMSO sind biologisch gefährliche Stoffe. Nur unter der Motorhaube handhaben, PSA tragen und besonders vorsichtig verwenden.

  1. Am Tag des Anrichtens tauen Sie das Medikament Aliquot auf Eis, im Vortex auf und drehen Sie 30 Sekunden lang mit maximaler Geschwindigkeit auf einer Mini-Zentrifuge auf dem Tisch.
  2. Wirbeln Sie vorn und rühren Sie eine Flasche halbfestes Material kräftig, bis alle Komponenten homogenisiert sind. Lassen Sie die Haube 30 Minuten ungestört bei Raumtemperatur, damit Blasen an die Oberfläche steigen können.
  3. Bereiten Sie 3 mL Aliquots halbfestes Material in sterilen 15 mL konischen Röhren vor. Lassen Sie die Röhren 30 Minuten ungestört bleiben, damit die Blasen an die Oberfläche steigen können. Aliquots mit extra halbfestem Medium können erneut eingefroren und bei -20 °C für spätere Verwendung gelagert werden.
  4. Fügen Sie nicht mehr als 10 μL Arzneimittelvolumen dem halbfesten Medium hinzu. Für dieses Experiment werden die Konzentrationen von Venetoclax und Pyrimethamin entsprechend empirisch bestimmten synergistischen Bedingungen angepasst. Zu einer Fahrzeugsteuerungsgruppe werden entsprechende Volumina DMSO hinzugefügt. Bereite für jede Bedingung doppelte 3-mL-Aliquots vor.
    HINWEIS: Es ist wichtig, das Volumen des hinzugefügten Medikaments gering zu halten, damit es die Endkonzentration des Medikaments im halbfesten Medium nicht beeinflusst.
  5. Vortex-Medien in 4–5 kurzen Phasen, um das Medikament vollständig in die Medien zu integrieren.
    HINWEIS: Halten Sie die Zellmischung nicht über längere Zeit am Vortexor, da dies zum Zelltod führen kann.
  6. Fügen Sie 100 μL Zellen oder ein entsprechendes Volumen von 200.000 Zellen zu den 3 mL Aliquoten des halbfesten Mediums hinzu. Vortexmischung in kurzen Stößen, bis sie vollständig eingebaut/homogenisiert sind.
  7. Befestigen Sie eine stumpfe 16-G-Nadel an einer 3-ml-Spritze und lassen Sie Nadel und Spritze in die Zellmischung fallen. Lassen Sie es 30 Minuten ungestört, damit die Blasen an die Oberfläche steigen können.

3. Beschichtung der medikamentös behandelten Zellsuspension.

  1. Mit einer untergetauchten Nadel und einer Spritze nehmen Sie die Zell- und Arzneimittelmischung auf, wobei Sie darauf achten, keine Luftblasen anzusaugen. Warten Sie 3–5 Minuten und nehmen Sie dann die restliche Mischung auf, die sich an den Seiten des 15-ml-konischen Rohrs gesammelt hat.
  2. In einer sterilen 6-Well-Platte wird die Zellmischung tropfweise hinzugefügt und große Tropfen zwischen zwei Brunnen einer äußeren Säule der Platte abwechselnd groß gelassen. Verteilen Sie die Mischung, indem Sie die Platte sanft in kreisenden Bewegungen kippen, um den gesamten Boden der Brunnen gleichmäßig zu bedecken. Diese beiden Brunnen stellen technische Replikate dar.
    HINWEIS: Wenn sich Blasen bilden oder versehentlich zu den Brunnen hinzugefügt werden, verwenden Sie eine Pipettenfilterspitze, um die Blasen vorsichtig zum Rand der Platte zu platzen oder zu bewegen. Große Blasen, die in der Platte zurückbleiben, können das Wachstum der Kolonien beeinträchtigen.
  3. Gib die Kolonie-Assay-Mischung nur zu den äußeren Säulen der 6-Well-Platte. In die Mittelsäule geben Sie jedem Brunnen 5 ml steriles Wasser. Das Zuführen von Wasser zu den Brunnen stellt sicher, dass genügend Feuchtigkeit vorhanden ist, damit das halbfeste Medium nicht austrocknet.
  4. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C Inkubator mit 5 %CO2. Überwachen Sie das Zellwachstum und den Wasserstand zweimal pro Woche. Die Zellen sollten etwa 7 Tage nach der Plattenierung sichtbare Kolonien bilden, und die Platten sollten zwischen 14 und 21 Tagen nach der Plattierung eine 75%–80%-Konfluenz erreichen.

4. Koloniebildgebung und Zählung

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt Parameter, die für den Einsatz im EVOS M7000-Bildgebungssystem validiert sind. Diese Einstellungen müssen möglicherweise optimiert oder angepasst werden, um mit anderen Plattenbildgebungssystemen kompatibel zu sein.

  1. Entfernen Sie die Schutzabdeckung des Lichtfilters von der Mikroskopplattform. Schalten Sie das Mikroskop ein und öffnen Sie das zugehörige Softwareprogramm.
  2. Setzen Sie einen Lichtdiffusor in die obere Linse des Mikroskopgeräts ein.
  3. Setzen Sie die Plattenposition auf die Plattform so, dass Schacht A1 in der oberen linken Ecke liegt.
  4. In der Bildgebungssoftware geben Sie die folgenden Fokuseinstellungen ein:
    1. Wählen Sie das zu fotografierende Gefäß aus. In diesem Protokoll wird eine 6-Well-Platte verwendet.
    2. Stelle das Ziel auf 4X.
    3. Wählen Sie die Lichtquelle als Trans oder schalten Sie das Mikroskop in den Hellfeldmodus.
    4. Schalten Sie das Mikroskoplicht ein und stellen Sie die Lichtintensität manuell mit dem groben Regler ein. Für das in diesem Protokoll verwendete Instrument liegt der optimale Bereich für bildgebende Kolonien bei etwa 0,03.
    5. Wenn das Instrument eine Autofokusfunktion hat, nutze sie, um den Fokus anzupassen. Wenn nötig, stellen Sie den Fokus weiter mit den manuellen Feinfokus-Einstellungen ein.
  5. Geben Sie die folgenden automatisierten Bildaufnahmeeinstellungen ein:
    1. Wählen Sie den gesamten Brunnenbereich aus, der in jedem Brunnen abgebildet werden soll.
    2. Wählen Sie die automatisierte Bildaufnahme so aus, dass sie von der Mitte des Brunnens beginnt und spiralförmig nach außen zu den Rändern des Brunnens führt.
    3. Wähle Autofokus-Einstellungen so aus, dass das Instrument in jedem Schacht neu fokussiert wird.
    4. Wähle aus, dass die RAW-Bilder in jedem Brunnen gemeinsam getilet oder zusammengeführt werden.
    5. Wählen Sie aus, dass die Bilder horizontal und vertikal invertiert werden.
    6. Wählen Sie die Datenspeichereinstellungen aus, um "getiled image" und "merged image" zu sammeln.
    7. Führe den automatischen Kennzeichen-Scan durch. Das in diesem Protokoll verwendete Instrument läuft mit einer Geschwindigkeit von 1,5 Minuten pro Well.
    8. Entfernen Sie die Platte, legen Sie die Schutzfilterabdeckung über die Mikroskopplattform, schalten Sie das Mikroskop aus und schließen Sie die Software.
    9. Nach der Bildgebung zählen Sie die gesamten einzelnen Kolonien sowie myeloide und erythroide-Subtypen in jedem Brunnen manuell anhand der gekachelten Fugen-Bohrloch-Bilder.
  6. Definieren Sie Kolonien gemäß folgender morphologischer Charakterisierung:
    1. Betrachten wir eine einzelne Kolonie oder eine Koloniegruppe als unterschieden, wenn sie weit genug von einer anderen Zellpopulation entfernt ist, also eine Entfernung, die ihrer eigenen Länge entspricht. Populationen, die sich innerhalb dieses Distanzlimits befinden, werden in einer Kolonienzählung zusammengefasst.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Erythroidekolonien tief pigmentiert und dunkelrot erscheinen. Diese Kolonien erscheinen als dicht wachsende Einzelpopulationen oder Cluster mit klar definierten Rändern. Kleinere erythroide Kolonien, die aus langsam wachsenden unreifen Zellpopulationen bestehen, werden als CFU-E klassifiziert. Größere Kolonien mit ausgewachseneren Populationen werden als BFU-E klassifiziert.
    3. Überprüfen Sie, ob die myeloiden Kolonien Zellen enthalten, die transparenter erscheinen und heller gefärbt sind. Myeloide Kolonien sind weiter verteilt und enthalten keine klar definierten Rande. Myeloide Kolonien wachsen meist häufiger als einzelne Populationen statt als Cluster, obwohl gelegentlich auch Cluster zu sehen sein können. In beiden Fällen werden myeloide Kolonien als CFU-GM klassifiziert.
    4. Klassifizieren Sie die gemischten Kolonien, die sowohl erythroide als auch myeloide Subtypen enthalten, als CFU-GEMM.

5. Zellentnahme und -einfrieren für die nachgelagerte Analyse mittels Durchflusszytometrie

  1. Führen Sie die folgenden Schritte vor Beginn aus:
    1. a. Bereiten Sie einen fluoreszenzaktivierten Zellsortierpuffer (FACS-Puffer, bestehend aus DPBS/4 % FBS) und Gefriermedium (FBS/10 % DMSO) in einem 37 °C Wasserbad für mindestens 30 Minuten vor.
  2. Fügen Sie 5 ml erwärmten FACS-Puffer auf die Oberfläche jedes Bohrlochs hinzu. Inkubieren Sie Platten mindestens 30 Minuten in einem 37 °C Inkubator, um das halbfeste Material aufzulösen.
  3. Zellen werden mit einer 5-mL-Pipette gründlich wieder suspendiert und in ein steriles 50-mL-konisches Rohr übertragen.
  4. Mit 5 ml erwärmtem FACS-Puffer wird jeder Brunnen dreimal gewaschen und das gesamte Volumen auf das 50-mL konische Rohr übertragen.
  5. Die Zellen gut wieder suspendieren, indem sie in 4–5 kurzen Phasen vortisieren und dann mit 400 x g für 10 Minuten in RT zu den Pelletzellen zentrifugieren. Ist das Pellet nach der Zentrifugation nicht sichtbar, bleiben die Zellen in halbfesten Medien suspendiert. Ohne zu aspirieren, fügen Sie dem Rohr zusätzlich 10–15 mL DPBS hinzu, um das halbfeste Medium weiter zu verdünnen und wieder gut zu suspendieren. Falls nötig, 10–15 Minuten bei 37 °C inkubieren, um das Medium vollständig aufzulösen, und dann erneut die Pelletzellen verwenden.
  6. Aspiratieren Sie das Supernatant und lassen Sie die Zellen in einem 10-ml-FACS-Puffer wieder suspendieren. Zentrifugiere mit 400 x g für 10 Minuten mit RT zu den Pelletzellen.
  7. Cellen in Gefriermedien wieder suspendieren und 3 Millionen Zellen pro Kryoviale Aktivität verwenden. Fläschchen in einem kontrollierten Gefrierbehälter bei -80 °C für 24 Stunden einfrieren, um eine Kühlrate von 1 °C pro Minute zu erreichen.
  8. Übertragen Sie Kryoviale so schnell wie möglich in flüssigen Stickstoffspeicher.
    HINWEIS: Proben, die über längere Zeit bei -20 °C aufbewahrt werden, haben eine verminderte Lebensfähigkeit. Es ist wichtig, die Zellen auf flüssigen Stickstoff umzustellen, um sie langfristig zu speichern.

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Ergebnisse

Abbildung 1 veranschaulicht die Pipeline des Kolonie-Assays von der Isolierung der Patientenproben bis zur Analyse von Kolonienzahlen und Koloniemorphologie. Abbildung 2 zeigt die wichtigsten Einstellungen für Bildgebungskolonien auf einem Hellfeldmikroskop. Abbildung 3 und Abbildung 4 zeigen repräsentative Bilder der Koloniebildung aus einer ei...

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Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll beschreibt einen optimierten Arbeitsablauf für die Durchführung von CFU-Assays mit primären Knochenmark- und peripheren Blutproben von Patienten, mit besonderem Augenmerk auf die Erhaltung der Zelllebensfähigkeit und die Sicherstellung eines reproduzierbaren Koloniewachstums. Mehrere Schritte im Protokoll sind entscheidend, um eine zuverlässige Koloniebildung bei der Arbeit mit patientenabgeleiteten Proben zu erreichen. Ein schnelles Auftauen von kryokonse...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine weiteren Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch einen Pilotzuschuss des Einstein-Rockefeller-CUNY Center for AIDS Research unterstützt, der von den National Institutes of Health (NIH) finanziert wurde: P30 AI124414. Die Einstein FACS Core Facility und die gemeinsame Nutzung der Instrumente wurden durch folgende NIH-Förderungen unterstützt: P30CA013330, S10OD026833 und S10OD032169.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Blunt-End 16 G needlesSTEMCELL Technologies28110für das Dispensieren und Beschichten von MethoCult-Medium
Cellometer Auto 2000Nexelcom Bioscience26407Zellzähler
CHT4 Counting Chambers (Zellzähl-Scheiben)RevvityCHT4-SD100-002Scheiben für Zellzähler
Dimethyl sulfoxideFisher BioreagentsBP231-100zur Arzneimittel-Rekonstitution und für Zelleinfriermedien
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD8537für Zellkultur
Ethanol 200 proofDecon Laboratories, Inc. 2701zur Sterilisation von Zellkulturoberflächen
EVOS M7000 Imaging-SystemThermoFisher ScientificAMF7000zur Kolonie- und Platten-Bildgebung
Fetal bovine serumBenchMark100-106Medium-Ergänzung für Zellkultur und Einfrieren
IMDM Modified Culture mediaCytivaSH30228.01angereichertes Kulturmedium, geeignet für die Handhabung von Patientenproben
LuerLok Tip 3 mL SpritzenBD309657zum Dispensieren und Beschichten von MethoCult-Medium
MethoCult H4435 EnrichedSTEMCELL Technologies04435methylcellulosebasiertes halbfestes Medium für Kolonie-Assays
Multiwell 6-Well PlattenFALCON353046zur Kolonie-Assay-Beschichten
Nikon Eclipse TS2FL Inverted Trinocular Phase Contrast Fluorescence MicroscopeCoastal Microscopes51623Zur Kolonie-Morphologie-Bildgebung und -Charakterisierung
Pen StrepGibco15140-122Antibiotika-Ergänzung für Zellkultur
pyrimethamineSigma-Aldrich46706FDA-zugelassenes Antifolat
UltraPure Destilliertes Wasser Invitrogen10977-015zur Kolonie-Assay-Beschichten
venetoclaxSelleck Chemical LLC 50-136-6419FDA-zugelassene Chemotherapie
ViaStain AOPI Staining SolutionRevvityCS2-0106Viabilitätsfärbung für Live-Zellzählung

Referenzen

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