Optimiertes Reverse-Transfektionsprotokoll zur Übertragung von Telomerase-mRNA in früh-seneszente menschliche Fibroblasten

Sukanta Jash; John Sedivy

doi:10.3791/71538

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Methodenartikel

Optimiertes Reverse-Transfektionsprotokoll zur Übertragung von Telomerase-mRNA in früh-seneszente menschliche Fibroblasten

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DOI:

10.3791/71538

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18. August 2026

Sukanta Jash^*¹ , John Sedivy^*¹

¹Center on the Biology of Aging, and Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein optimiertes Reverse-Transfektionsprotokoll für die effiziente Übertragung von nucleosidmodifizierter humaner Telomerase-Reverser-Transkriptase-mRNA (hTERT-mRNA) in seneszente humane Fibroblasten vor. Die Vorbeschichtung von Kulturoberflächen mit hTERT-mRNA-Lipid-Komplexen verbessert die Aufnahme und ermöglicht die Aktivierung der Telomerase, die Verlängerung der Telomere und eine teilweise Verjüngung. Die Kulturen treten letztendlich erneut in Seneszenz oder Krise ein, ohne dass eine Immortalisierung erfolgt.

Zusammenfassung

Die zelluläre Seneszenz ist mit tiefgreifenden Veränderungen der zellulären Physiologie verbunden, darunter verminderte Membranfluidität, gestörter endosomaler Transport, reduzierte endozytotische Kapazität und erhöhte extrazelluläre RNase-Aktivität, die alle eine effiziente mRNA-Übertragung erschweren. Diese Barrieren haben die Anwendung von RNA-basierten Ansätzen in seneszenten Zellen begrenzt, insbesondere für die Abgabe großer therapeutischer Transkripte. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Reverse-Transfektionsmethode zur effizienten Übertragung modifizierter Boten-RNA (mRNA) in seneszente humane Fibroblasten. Obwohl hTERT-mRNA (humane Telomerase-Rücktranskriptase-mRNA) als Modelltranskript verwendet wurde, ist der Arbeitsablauf auf andere mRNA-Moleküle übertragbar. Im Gegensatz zu herkömmlichen Transfektionsmethoden, bei denen RNA-Lipid-Komplexe nach der Zellanheftung dem Kulturmedium zugegeben werden, erfolgt bei der Reverse-Transfektion die Ablagerung der Komplexe auf der Kulturoberfläche vor der Zellseeding, wodurch eine direkte Interaktion zwischen anheftenden Zellen und Transfektionskomplexen ermöglicht wird. Um die Transfektionseffizienz zu maximieren, beinhaltet das Protokoll nucleosidmodifizierte mRNA mit Pseudouridin und 5-Methylcytidin, verlängerte poly(A)-Schwänze, optimierte Komplexbildungszeiten, RNase-Hemmung, vorübergehende Erhöhung des endosomalen pH-Werts mittels Chloroquin, erhöhte Zellseedingdichte und verlängerte Inkubationszeiten. Mit diesem Ansatz wurden Transfektionseffizienzen von etwa 50–80 % in seneszenten Fibroblasten nach der Abgabe eines 5-kb-hTERT-mRNA-Transkripts erreicht. Die maximale Telomeraseaktivität wurde 24–48 Stunden nach der Transfektion nachgewiesen. Ein einzelner Transfektionszyklus führte zu messbarer Telomerelongation, während drei aufeinanderfolgende Transfektionen zu einer deutlichen, aber begrenzten Telomerverlängerung führten. Eine teilweise Umkehrung seneszenzassoziiierter Phänotypen war innerhalb von 72–96 Stunden nachweisbar, einschließlich verminderte Aktivität der seneszenzassoziierten β-Galactosidase, verringerte Expression von p16 und p21, Wiederherstellung der Zellmorphologie und Verlängerung der replikativen Lebensdauer. Die übertragene hTERT-mRNA wurde innerhalb von 72–96 Stunden abgebaut, und eine Immortalisierung wurde nicht beobachtet. Dieses Protokoll bietet einen praktikablen Ansatz für die transiente mRNA-Abgabe in seneszente Zellen und könnte auf eine breite Palette von Zelltypen und Spezies übertragbar sein.

Einleitung

Die Reverse-Transfektion stellt eine entscheidende methodische Anpassung für seneszente Zellen dar, die die grundlegenden Hindernisse überwindet, die diese Zellen gegenüber Standard-Transfektionsmethoden darstellen. Im Gegensatz zur Vorwärts-Transfektion, bei der Zellen vorab ausplattiert und zur Adhärenz gebracht werden, bevor Transfektionskomplexe hinzugefügt werden, erfolgt bei der Reverse-Transfektion das direkte Aufbringen von Zellen in Suspension auf vorab gebildete hTERT-mRNA-Lipid-Komplexe. Diese Technik erhöht die Transfektionseffizienz in seneszenten Zellen erheblich, indem die Exposition gegenüber den Transfektionskomplexen während der kritischen Anheftungsphase maximiert wird, in der das Membranremodeling am aktivsten ist.

Die zentrale konzeptionelle Neuerung des Protokolls besteht darin, seneszente Zellen als ein eigenständiges Problem der Substanzabgabe zu betrachten, nicht lediglich als schwer zu transfigierende Varianten junger Zellen. In der Seneszenz verändern globale Veränderungen in der Zusammensetzung der Membranlipide – einschließlich Phospholipide, Sphingolipide und Cholesterin – die Membranfluidität, Krümmung und Protein-Lipid-Wechselwirkungen und tragen gleichzeitig zum seneszenzassoziierten sekretorischen Phänotyp¹^,²^,³ bei. Seneszente Zellen zeigen außerdem eine verminderte clathrin- und caveolae-vermittelte Rezeptor-Endozytose sowie veränderte endozytotische Transportwege, verursacht unter anderem durch die Herunterregulation von Amphiphysin-1 und kompensatorische Veränderungen in der Expression von Caveolin, was die rezeptorvermittelte Aufnahme und Signalübertragung abschwächt⁴^,⁵^,⁶. Parallel dazu gerät die Rab7-regulierte Achse des späten Endosoms zum Lysosom und das umfassendere endosomale-autophagische-lysosomale (EAL) Netzwerk aus dem Gleichgewicht, wobei Rab7 als zentraler Regulator der endolysosomalen Reifung und der Fusion von Autophagosomen mit Lysosomen fungiert – Prozesse, die bei Alterung und Neurodegeneration gestört sind⁷.

Seneszente Zellen regulieren häufig mehrere Komponenten des lysosomalen Verarbeitungs- und Anpassungssystems (LYPAS) hoch, einschließlich der durch TFEB/TFE3 gesteuerten lysosomalen Biogenese und der chaperonvermittelten Autophagie, wodurch die lysosomale Masse zunimmt. Dennoch weisen einzelne Lysosomen häufig einen erhöhten luminalen pH-Wert, Schäden an der Membran und veränderte proteolytische Kapazität auf, was zu einer lysosomalen Dysfunktion beiträgt, obwohl ihre Häufigkeit zunimmt⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Insgesamt können diese Veränderungen interne Materialien effizienter in degradative endolysosomale Kompartimente lenken und erhöhen somit die Wahrscheinlichkeit, dass angelieferte RNA oder Proteine abgebaut werden, bevor eine produktive Freisetzung ins Zytoplasma erfolgen kann⁹^,¹⁰^,¹¹. Die Revers-Transfektion zielt direkt auf das früheste Zeitfenster ab, in dem Membranumgestaltungen während der Adhäsion stattfinden, und erzwingt einen anhaltenden, hochaffinen Kontakt zwischen Zellen und mRNA-Lipid-Komplexen, wodurch die beeinträchtigte stationäre Endozytose in vollständig adhärenten seneszenten Zellen zumindest teilweise umgangen wird⁴^,⁵^,⁶^,¹².

Auf der Ebene des RNA-Designs geht das Protokoll davon aus, dass in einem Alterungskontext eine einfache Baseline aus Kappe und Schwanz unzureichend ist: Eine vollständige Nukleosidmodifikation (beispielsweise Pseudouridin oder N1‑Methylpseudouridin in Kombination mit 5‑Methylcytidin) gilt als unabdingbar, um die Translation von der endosomalen Erkennung durch Toll-ähnliche Rezeptoren und der Induktion von Typ-I-Interferonen zu entkoppeln. Grundlegende Arbeiten zeigten, dass die Einbindung modifizierter Nukleoside in die RNA die Aktivierung von TLR3, TLR7 und TLR8 unterdrückt und die Zytokinproduktion dendritischer Zellen deutlich verringert, was eine mechanistische Grundlage für die verminderte angeborene Immunogenität aktueller, nukleosidmodifizierter mRNA-Plattformen liefert¹³. Neuere Übersichtsarbeiten zu mRNA–LNP-Impfstoffen und mRNA-basierten Arzneimitteln betonen das koordinierte Engineering der 5′-Kappe, der UTRs, der kodierenden Sequenz und des Poly(A)-Schwanzes, um die Stabilität und Translation in vivo zu erhöhen und gleichzeitig die Aktivierung des angeborenen Immunsystems zu minimieren¹⁴. Insbesondere hat sich die Länge und Architektur des Poly(A)-Schwanzes als entscheidender Faktor für Stabilität und translationelle Ausbeute von in vitro transkribierter mRNA herausgestellt, was längere oder gezielt konstruierte Poly(A)-Designs in therapeutischen mRNA-Molekülen motiviert¹⁵.

Darüber hinaus enthält das Protokoll ausdrücklich Schutzmaßnahmen gegen extrazelluläre und endosomale RNasen während der Komplexbildung und Aufnahme sowie ein definiertes Zeitfenster für den endosomalen Ausbruch unter Verwendung eines transienten lysosomotropen Wirkstoffs wie Chloroquin¹⁶^,¹⁷. Chloroquin wird seit langem als funktioneller Indikator für endosomale Barrieren eingesetzt und kann die Zielbindung und Stilllegung durch siRNA oder Antisense-Oligonukleotide erheblich verstärken, indem es die Destabilisierung der endosomalen Membran fördert und die Freisetzung der Nukleinsäurefracht in das Cytosol ermöglicht¹⁸. Gleichzeitig haben Live-Cell- und Super-Resolution-Aufnahmen von mittels LNP verabreichter mRNA gezeigt, dass die produktive Abgabe stark durch seltene Ausbruchereignisse aus frühen/recyclingfähigen Endosomen begrenzt ist, anstatt durch die initiale Aufnahme an sich, was die Bedeutung einer gezielten Konstruktion eines endosomalen Ausbruchsschritts für mRNA-Therapeutika unterstreicht¹⁹.

Zusammenfassend schaffen diese mit der Zellalterung assoziierten Veränderungen in der Membrandynamik, dem endozytotischen Transport, der lysosomalen Verarbeitung und der Aktivierung des angeborenen Immunsystems erhebliche Hindernisse für eine effiziente mRNA-Übertragung. Die hier beschriebene Reverse-Transfektionsstrategie wurde entwickelt, um diese Einschränkungen zu überwinden, indem optimiertes mRNA-Engineering, RNase-Schutz, verbesserter endosomaler Ausbruch und eine direkte Exposition der anheftenden Zellen gegenüber vorgebildeten mRNA-Lipid-Komplexen kombiniert werden. Obwohl hTERT-mRNA als Modellfracht verwendet wird, ist der Arbeitsablauf allgemein auf die Abgabe anderer großer therapeutischer mRNA-Transkripte in seneszente und schwer zu transfectierende Zellpopulationen anwendbar²⁰^,²¹^,²².

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Protokoll

1. In-vitro-Transkription von hTERT-mRNA

In-vitro-Transkription (IVT) mit ARCA und ΨUTP
1. Stellen Sie eine 20 µL IVT-Reaktion gemäß Tabelle 1 her. Skalieren Sie die Reaktion linear, wenn eine größere Ausbeute erforderlich ist.
2. Vermischen Sie alle Reaktionskomponenten mit Ausnahme der T7-RNA-Polymerase in einem RNase-freien Röhrchen. Fügen Sie zuletzt die T7-RNA-Polymerase hinzu, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz.
3. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C für 0,5–4 h.
  HINWEIS: Passen Sie die Inkubationszeit entsprechend der Länge der Vorlage an. Inkubieren Sie Reaktionen mit kürzeren Vorlagen (ca. 500 bp) etwa 30 Minuten lang und Reaktionen mit größeren Vorlagen (ca. 4 kb) 3–4 Stunden lang.
DNase-Behandlung
1. Geben Sie 1 µL RNase-freie DNase I direkt in die IVT-Reaktionsmischung.
2. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C für 15 min.
  HINWEIS: Die DNase-Behandlung sollte direkt in der IVT-Reaktion durchgeführt werden, ohne vorherige Reinigung der synthetisierten mRNA.
mRNA-Reinigung
1. Fügen Sie 115 µL nukleasefreies H₂O hinzu, um die Reaktionsmischung zu verdünnen.
2. Reinigen Sie die mRNA mithilfe eines RNA-Reinigungs-Kits gemäß den Herstelleranweisungen.
3. Eluieren Sie die gereinigte mRNA in 20–30 µL nukleasefreiem H₂O.
4. Bestimmen Sie die mRNA-Reinheit mittels Spektrophotometrie und überprüfen Sie die RNA-Integrität durch Elektrophorese in einem 1,0–1,5 %igen denaturierenden Agarosegel oder einem Polyacrylamidgel mit niedrigem Anteil.
Poly(A)-Tailing
1. Stellen Sie eine 50 µL Poly(A)-Tailing-Reaktion gemäß Tabelle 2 her. Mischen Sie die Reaktionskomponenten vorsichtig und inkubieren Sie bei 37 °C für 30–60 min.
  HINWEIS: Passen Sie die Inkubationszeit entsprechend der Menge an eingesetzter RNA an.
2. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 2 µL 0,5 M EDTA (pH 8,0).
Endgültige Reinigung und Qualitätskontrolle
1. Reinigen Sie die poly(A)-taillierte mRNA mithilfe eines RNA-Reinigungs-Kits gemäß den Herstelleranweisungen.
2. Eluieren Sie die gereinigte mRNA in 20–30 µL nukleasefreiem H₂O.
3. Beurteilen Sie die mRNA-Qualität vor der Transfektion
  1. Messen Sie die mRNA-Konzentration bei 260 nm und bestimmen Sie die Reinheit anhand der A260/A280- und A260/A230-Verhältnisse. Verwenden Sie mRNA-Präparationen mit A260/A280-Werten von etwa 2,0 und A260/A230-Werten über 2,0.
  2. Beurteilen Sie die mRNA-Integrität mittels Gelelektrophorese oder eines RNA-Analysesystems gemäß den Herstelleranweisungen.
  3. Bestätigen Sie die Länge des Poly(A)-Schwanzes durch RT-PCR oder Bioanalyzer-Analyse. Stellen Sie sicher, dass die Länge des Poly(A)-Schwanzes zwischen 120 und 200 Nukleotiden liegt.
  4. Portionieren Sie die gereinigte mRNA und lagern Sie die Aliquots bei −80 °C, um Freeze-Thaw-Zyklen zu minimieren.

2. Reverse Transfektion

Tag −1: Vorbereitung vor der Transfektion
1. Überprüfung des seneszenten Phänotyps
  1. Führen Sie eine seneszenzassoziierte β-Galactosidase-(SA-β-Gal)-Färbung an einer repräsentativen Zellprobe durch. Stellen Sie sicher, dass mehr als 70 % der Zellen positiv sind.
  2. Bestätigen Sie die Expression von Seneszenzmarkern (p16 und p21) mittels qRT-PCR oder Immunfluoreszenz.
  3. Bestimmen Sie die Zellviabilität und überprüfen Sie, dass diese über 90 % liegt.
2. Vorbereitung der Reagenzien
  1. Erwärmen Sie das komplette Kulturmedium auf 37 °C vor.
  2. Erwärmen Sie gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 37 °C vor.
  3. Bereiten Sie frisches Opti-MEM I-Medium vor.
    HINWEIS: Fügen Sie vor der Verwendung kein RNase-Inhibitor zu Opti-MEM I hinzu.
Tag 0: Transfektionstag
HINWEIS: Planen Sie etwa 3 Stunden von der Reagenzvorbereitung bis zur Inkubation der transfizierten Zellen ein.
1. Vorbereitung der hTERT-mRNA
  1. Tauen Sie die hTERT-mRNA auf Eis auf. Messen Sie die mRNA-Konzentration und verwenden Sie Präparationen mit Konzentrationen zwischen 0,5 und 1,0 µg/µL.
  2. Verdünnen Sie die gewünschte Menge an hTERT-mRNA in Opti-MEM I entsprechend dem verwendeten Kulturformat (Tabelle 3). Fügen Sie RNase-Inhibitor bis zu einer Endkonzentration von 0,5–1,0 U/µL hinzu und mischen Sie vorsichtig.
  3. Bewahren Sie die verdünnte mRNA bis zur Komplexbildung auf Eis auf.
    HINWEIS: Fügen Sie den RNase-Inhibitor unmittelbar vor der Verwendung hinzu. Lagern Sie die mRNA nicht mit RNase-Inhibitor, da dessen Aktivität nach dem Einfrieren abnimmt.
2. Vorbereitung des Transfektionsreagenzes
  1. Mischen Sie 6,0 µL Transfektionsreagenz mit 100 µL Opti-MEM I in einem sterilen, RNase-freien Röhrchen. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren.
  2. Inkubieren Sie die Mischung 5 Minuten bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Bei großen hTERT-mRNA-Konstrukten (~5 kb) optimieren Sie das Verhältnis Reagenz zu mRNA zwischen 0,4 und 0,6 µL Reagenz pro 100 ng mRNA.
3. Bildung der mRNA-Lipid-Komplexe
  1. Geben Sie die verdünnte hTERT-mRNA-Lösung (100 µL) zur verdünnten Transfektionsreagenz-Lösung (106 µL). Mischen Sie vorsichtig durch 5–6-maliges Pipettieren.
  2. Inkubieren Sie die Mischung 15–20 Minuten bei Raumtemperatur.
  3. Überschreiten Sie nicht eine Komplexbildungszeit von 30 Minuten.
  4. Überprüfen Sie die erfolgreiche Komplexbildung anhand des leicht trüben Aussehens der Lösung.
    HINWEIS: Führen Sie während der Komplexbildung die Zellvorbereitung durch.
4. Vorbereitung der Zellen für die Reverse Transfektion
  1. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den seneszenten Zellkulturen.
  2. Waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmtem PBS (2 mL pro Vertiefung einer 6-Loch-Platte).
  3. Geben Sie 500 µL 0,05 %igem Trypsin-EDTA pro Vertiefung hinzu.
  4. Inkubieren Sie die Zellen 3–5 Minuten bei 37 °C.
  5. Neutralisieren Sie das Trypsin mit 3 mL komplettem Medium, das Serum enthält.
  6. Titrieren Sie die Zellen vorsichtig, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.
  7. Bestimmen Sie die Zellanzahl mittels eines Hämozytometers oder automatischen Zellzählgeräts.
  8. Bereiten Sie eine Suspension mit 2,0–2,5 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in komplettem Medium vor.
    HINWEIS: Vermeiden Sie eine verlängerte Trypsinbehandlung, da seneszente Zellen sehr empfindlich gegenüber mechanischem Stress sind. Halten Sie die Zellen in Suspension; plattieren Sie sie nicht vor der Reverse Transfektion vorab.
5. Reverse Transfektion
  1. Vorbereitung der Kulturplatte
    1. Geben Sie 500 µL 0,01 %igem Poly-L-Lysin in jede Vertiefung einer 6-Loch-Platte und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.
    2. Aspirieren Sie die Beschichtungslösung unmittelbar vor der Verwendung.
    3. Geben Sie 200 µL des hTERT-mRNA-Lipid-Komplexes in die Mitte jeder Vertiefung.
    4. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO₂.
      HINWEIS: Führen Sie die Plattenbeschichtung parallel zur Komplexbildung und Zellvorbereitung durch.
  2. Vorbereitung der Zellsuspension
    1. Suspendieren Sie 2,0–2,5 × 10⁵ Zellen in 1800 µL antibiotikafreiem komplettem Medium.
    2. Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig, um eine homogene Einzelzell-Suspension zu erhalten.
      HINWEIS: Verwenden Sie während der Transfektion antibiotikafreies Medium.
  3. Aussaat der Zellen auf die Komplexe
    1. Geben Sie 1800 µL der Zellsuspension direkt auf die vorgebildeten hTERT-mRNA-Lipid-Komplexe.
    2. Kippen Sie die Platte vorsichtig 2–3 Mal in jede Richtung, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
      HINWEIS: Pipettieren Sie die Suspension nach Zugabe der Zellen nicht erneut, da dies die mRNA-Lipid-Komplexe stören könnte.
  4. Inkubation der Zellen
    1. Inkubieren Sie die Zellen 6–8 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
    2. Überwachen Sie die Zellanheftung mittels Lichtmikroskopie 2–3 Stunden nach der Transfektion.
    3. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind und mit der Anheftung an die Kulturoberfläche beginnen.
      HINWEIS: Eine übermäßige Anzahl an schwebenden Zellen oder zellulärem Detritus kann auf transfektionsassoziierte Zytotoxizität hindeuten.

3. Minderung der Zytotoxizität

Verkürzen Sie die Transfektionszeit auf 48 h, wenn der Zellverlust 20 % überschreitet.
Vergesellschaften Sie die Kulturen während der Transfektionsphase mit 10 µM ROCK-Inhibitor Y-27632, um die Zellüberlebensrate zu verbessern.
Entfernen Sie nach 6–8 h Transfektion vorsichtig das Transfektionsmedium, wobei teilweise angeheftete Zellen so wenig wie möglich gestört werden sollen. Lassen Sie etwa 100 µL Restmedium in jedem Wells.
Geben Sie 1 mL frisches, vorgewärmtes komplettes Wachstumsmedium mit 15 % FBS zu jedem Well hinzu.
Fügen Sie Chloroquin unmittelbar nach dem Mediumwechsel bis zu einer Endkonzentration von 10–20 µM hinzu.
Inkubieren Sie die Kulturen zusätzlich 2 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
Ersetzen Sie das Chloroquin-haltige Medium durch frisches komplettes Wachstumsmedium.
Stellen Sie die Kulturen zur weiteren Zellvermehrung in den Inkubator zurück.
ANMERKUNG: Überwachen Sie während der Erholungsphase die Zellmorphologie und -viabilität. Starke Zellablösung oder Zerfall können auf eine transfektionsassoziierte Zytotoxizität hindeuten.

4. Nachtransfektionsanalyse

Beurteilen Sie die TERT-Proteinexpression 24–48 h nach der Transfektion.
Messen Sie die TERT-Proteinmengen mittels Western Blot oder Immunfluoreszenz-Färbung gemäß standardmäßiger Laborverfahren.
Bestimmen Sie die Telomerase-Aktivität im gleichen Zeitraum unter Verwendung eines geeigneten Telomerase-Aktivitäts-Assays.
ANMERKUNG: Die Telomerase-Aktivität nimmt typischerweise nach 48 h ab, da die transient übermittelte hTERT-mRNA abgebaut wird.
Analysieren Sie die Telomerlänge 48–72 h nach der Transfektion mittels monochromem multiplex-quantitativer PCR (MMqPCR) oder einer vergleichbaren Methode zur Telomerlängenbestimmung.
ANMERKUNG: Nach erfolgreicher hTERT-mRNA-Übertragung kann eine messbare Verlängerung der Telomere beobachtet werden.
Untersuchen Sie sieben Tage nach der Transfektion seneszenzassoziierte und Verjüngung assoziierte Phänotypen
1. Messen Sie die Aktivität der seneszenzassoziierten β-Galactosidase (SA-β-Gal).
2. Bestimmen Sie die Expressionsmengen von p16 und p21.
3. Analysieren Sie die Ki67-Expression.
4. Untersuchen Sie die zelluläre Morphologie mittels Lichtmikroskopie.
  ANMERKUNG: Vergleichen Sie behandelte Kulturen mit unbehandelten oder mock-transfizierten, seneszenten Kontrollen, um Veränderungen in seneszenzassoziierten Phänotypen und proliferativen Eigenschaften zu beurteilen.

5. Protokoll mit wiederholter Dosierung (optional)

Führen Sie die erste Transfektion wie in den Abschnitten 2–4 beschrieben durch.
Wiederholen Sie die Transfektionen nach folgendem Zeitplan: Tag 0: Erste Transfektion; Tag 5: Zweite Transfektion; Tag 10–12: Dritte Transfektion.
Kultivieren Sie die Zellen als anhaftende Zellkulturen und verzichten Sie vor nachfolgenden Transfektionen auf eine Behandlung mit Trypsin.
Stellen Sie frische hTERT-mRNA–Lipid-Komplexe wie in den Abschnitten 2.2.1–2.2.3 beschrieben her.
Entfernen Sie das Kulturmedium aus jedem Wells mittels Absaugung.
Geben Sie 200 µL der hTERT-mRNA–Lipid-Komplexe direkt in jedes Wells.
Fügen Sie unmittelbar nach der Zugabe der Komplexe 800 µL frisches, komplettes F-10-Medium hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen 4–6 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
Ersetzen Sie das Transfektionsmedium durch frisches, komplettes Medium.
HINWEIS: Beschränken Sie die Behandlung auf maximal drei Transfektionszyklen, um eine akkumulative, mit der Transfektion assoziierte Zytotoxizität zu minimieren.

6. Protokoll zur transienten Transfektion (2 µg/mL, 6-Loch-Format)

Tag −1: Zellansaat
1. Lösen Sie seneszente oder früh-seneszente Fibroblasten mit 0,05 % Trypsin-EDTA ab.
2. Neutralisieren Sie das Trypsin mit komplettem Kulturmedium.
3. Bestimmen Sie die Zellanzahl und -viabilität.
4. Säen Sie die Zellen in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 2,0–2,5 × 10⁵ Zellen pro Well aus.
5. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂, bis sie eine Konfluenz von etwa 60–80 % erreichen.
Tag 0: Herstellung der hTERT-mRNA–Reagenz-Komplexe
1. Tauen Sie eine Portion nucleosidmodifizierter hTERT-mRNA auf Eis auf.
2. Verdünnen Sie die hTERT-mRNA in Opti-MEM auf eine Endkonzentration von 2 µg/mL in einem sterilen, RNase-freien Röhrchen (Röhrchen A).
3. Geben Sie RNase-Inhibitor zu Röhrchen A, um eine Endkonzentration von 0,5–1,0 U/µL zu erreichen, und mischen Sie vorsichtig.
4. Verdünnen Sie das Transfektionsreagenz in Opti-MEM in einem zweiten RNase-freien Röhrchen (Röhrchen B) mit 0,4–0,6 µL Reagenz pro 100 ng mRNA.
5. Geben Sie den Inhalt von Röhrchen B tropfenweise unter leichtem Mischen zu Röhrchen A.
6. Inkubieren Sie das Gemisch 15–20 Minuten bei Raumtemperatur.
Tag 0: Vorwärts-Transfektion
1. Überprüfen Sie, ob die Zellen eine Konfluenz von 60–80 % aufweisen und eine gesunde Morphologie zeigen.
2. Aspirieren Sie das Kulturmedium ab.
3. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1–2 mL vorgewärmtem PBS.
4. Geben Sie 0,5 mL vorgewärmtes komplettes oder serumreduziertes Medium in jedes Well.
5. Fügen Sie optional Chloroquin hinzu, um eine Endkonzentration von 10–20 µM zu erreichen.
6. Geben Sie 0,5 mL der in Schritt 6.2.6 hergestellten hTERT-mRNA–Reagenz-Komplexe in jedes Well.
7. Wippen Sie die Platte vorsichtig, um die Komplexe gleichmäßig zu verteilen.
8. Inkubieren Sie die Zellen 4–6 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
  HINWEIS: Verlängern Sie die Inkubationszeit bei Bedarf auf 6–8 Stunden für seneszente Zellen.
9. Aspirieren Sie das Transfektionsmedium ab.
10. Geben Sie 2,0 mL frisches komplettes Medium in jedes Well.
11. Führen Sie die Analysen nach der Transfektion gemäß Abschnitt 4 durch.
  HINWEIS: Verwenden Sie dieselbe hTERT-mRNA-Charge, dasselbe Transfektionsreagenz und die gleiche nominelle Dosis, wenn Vorwärts- und Rückwärts-Transfektionsbedingungen verglichen werden.

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Ergebnisse

Das d2EGFP-T2A-hTERT modRNA wurde als hybride offene Leserahmen konstruiert, bei dem ein destabilisiertes EGFP (d2EGFP)-Reporterprotein über ein selbstspaltendes T2A-Peptid mit dem humanen TERT verknüpft ist. Die vollständigen Nukleotid- und Proteinsequenzen aller Konstrukte sind in Supplementärdatei 1 enthalten. Die kodierende Sequenz war flankiert von einer synthetischen 5′-unübersetzten Region (UTR) und der 3′-UTR des humanen β-Globins, um die Translations-Effizienz und mRNA-Stabilität zu erhöhen (

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Diskussion

Diese Studie betrachtet zelluläre Seneszenz als eigenständiges Problem der Substanzabgabe und nicht als geringfügige Variante der proliferativen Physiologie, und entwickelt eine auf die biophysikalischen und immunologischen Gegebenheiten des seneszenten Zustands zugeschnittene Transfektionsstrategie mittels Telomerase-mRNA. Seneszente Zellen weisen versteifte, cholesterolreiche Membranen und eine verminderte endozytotische Aktivität auf, was eine erhebliche Hürde für eine effiziente Nukleinsäureabgabe darstellt. Durch An...

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Offenlegungen

J.M.S. ist Mitbegründer und Vorsitzender des wissenschaftlichen Beirats von Transposon Therapeutics.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH) P01 AG051449, R01 AG016694 und R01 AG078925 an JS unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ham's F-10 Nährstoffmischung	Thermo Fisher	11550043	Zellkulturmedium.
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA-Cap-Struktur-Analogon	New England Biolab	S1411L	Bei den meisten RNAs erhöht die Cap-Struktur die Stabilität, verringert die Anfälligkeit für Exonuklease-Abbau und fördert die Bildung von mRNA-Initiationskomplexen.
5-Methyl-Cytidin-5´-Triphosphat (5-Methyl-CTP)	New England Biolab	N0432S	Modifizierte NTPs werden häufig zur Verringerung der Immunogenität bei in-vitro-Transkriptions-RNAs verwendet.
6-Loch-Platte	Corning	351146	Zum Kultivieren und Behandeln mittlerer bis großer Volumina von adhärenten oder suspendierten Zellen unter unabhängigen experimentellen Bedingungen.
Anti-Ki67-Antikörper (SP6)	abcam	ab16667	Ki67 wird hauptsächlich in proliferierenden Zellen exprimiert.
Cellular Senescence Assay Kit (SA-beta-gal-Färbung)	cellbiolabs	CBA-230	Identifizierung seneszenter Zellen mittels SA-β-Gal-Färbung
DNA LoBind 0,5-ml-Röhrchen	Eppendorf	022431005	Zur effizienten Rückgewinnung von DNA und RNA ohne Verluste
DNA LoBind 1,5-ml-Röhrchen	Eppendorf	22431021	Zur effizienten Rückgewinnung von DNA und RNA ohne Verluste
DNase I, RNase-frei (1 U/μL)	Thermo Fisher	EN0521	DNase I, RNase-frei ist eine Endonuklease, die ein- und doppelsträngige DNA verdaut.
E. coli Poly(A)-Polymerase	New England Biolab	M0276S	In Escherichia coli fungiert Poly(A)-Polymerase I (PAP I) hauptsächlich als Katalysator für die templateunabhängige Anlagerung von Adenosinmonophosphat-(AMP-)Resten an das 3'-Ende von RNA-Molekülen.
Fötales Rinderserum	Thermo Fisher	A5256701	Zusatz für Zellkulturmedien
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit	New England Biolab	E2065S	Der HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (mit Anhängung) dient der schnellen Herstellung von ARCA-gecappten und poly(A)-schwanztragenden mRNA-Molekülen in vitro. Gecappte mRNAs werden durch ko-transkriptionelle Einbindung des Anti-Reverse-Cap-Analogs (ARCA) unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase synthetisiert.
HiScribe T7 mRNA Kit mit CleanCap Reagenz AG	New England Biolab	E2080S	Die HiScribe T7 mRNA Kits mit CleanCap Reagenz AG ermöglichen die schnelle und effiziente Herstellung eines oder mehrerer Transkripte mit typischen Ausbeuten von ≥90 μg pro Reaktion,
LongAmp Hot Start Taq DNA-Polymerase	New England Biolab	M0534S	Die LongAmp Hot Start Taq DNA-Polymerase zeichnet sich durch außergewöhnliche Leistung bei langen Amplifikaten aus.
M-MuLV Reverse Transkriptase	New England Biolab	M0253L	Die M-MuLV Reverse Transkriptase synthetisiert einen komplementären DNA-Strang, ausgehend von einem Primer, wobei entweder RNA (cDNA-Synthese) oder Einzelstrang-DNA als Vorlage dient.
Monarch Spin RNA Cleanup Kit (50 μg)	New England Biolab	T2040L	Die Hauptfunktion des Monarch® Spin RNA Cleanup Kit (50 μg) besteht darin, bis zu 50 μg hochwertige RNA aus enzymatischen Reaktionen oder Extraktionsgemischen zu reinigen und zu konzentrieren.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolab	E2621L	Der NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix ermöglicht die nahtlose Assemblierung mehrerer DNA-Fragmente unabhängig von Fragmentlänge oder Endkompatibilität. Er ist nützlich für die synthetische Biologie sowie für den Ein-Schritt-Klonierung mehrerer Fragmente aufgrund seiner einfachen Handhabung, Flexibilität und des einfachen Master-Mix-Formats.
Opti-MEM – Medium mit reduziertem Serumgehalt	Thermo Fisher	31985070	Zur Maximierung der Transfektionseffizienz während der Bildung von Lipid-Ladungs-Träger-Komplexen. Es dient als optimiertes, chemisch definiertes Umfeld, das die Vitalität von Säugerzellen hoch hält und gleichzeitig den Bedarf an Standardserumzusätzen reduziert.
PBS, pH 7,4	Thermo Fisher	10010023	Die primäre Funktion von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,4 besteht darin, einen stabilen pH-Wert und osmotischen Ausgleich für Säugerzellen und biologische Moleküle aufrechtzuerhalten.
PCR-Streifen	Thermo Fisher	AB0776	Die primäre Funktion von PCR-Streifenröhrchen (üblicherweise im 8- oder 12-Streifen-Format) besteht darin, Reaktionen mit geringen Flüssigkeitsvolumina während des Hochdurchsatz-Thermocyclings zu halten.
Poly-L-Lysin-Hydrobromid	Millipore Sigma	P4707-50ML	Die primäre Funktion von Poly-L-Lysin (PLL)-Hydrobromid zur Zelladhärenz besteht darin, negativ geladene feste Oberflächen (wie Glas oder Kunststoff) zu beschichten, um ein stark haftendes, positiv geladenes Substrat zu erzeugen.
Pseudouridin-5´-Triphosphat (Pseudo-UTP- ΨUTP)	New England Biolab	N0433S	Pseudouridin-5´-Triphosphat (Pseudo-UTP) wird häufig zur Verringerung der Immunogenität bei in-vitro-Transkriptions-RNAs verwendet.
Ribonukleotid-Lösungsset	New England Biolab	N0450L	Vier getrennte Lösungen von ATP, GTP, CTP und UTP
ROCK-Inhibitor Y-27632 (Dihydrochlorid)	Stem cell technologies	72302	Y-27632 ist ein zellpenetrabler, hochpotenter und selektiver Inhibitor der Rho-assoziierten, coiled-coil-haltigen Proteinkinase (ROCK). Y-27632 hemmt sowohl ROCK1 (Ki = 220 nM) als auch ROCK2 (Ki = 300 nM), indem es mit ATP um die Bindung an die katalytische Stelle konkurriert
RT-PCR-Reinstwasser	Thermo Fisher	AM9935	Die primäre Funktion von RT-PCR-Reinstwasser (häufig als nukleasefreies Wasser gekennzeichnet) besteht darin, als ultrareines Lösungsmittel für empfindliche enzymatische Assays zu dienen, bei denen jegliche Kontamination die Probe abbauen oder die Amplifikation hemmen würde.
SUPERase·In RNase-Inhibitor	Thermo Fisher	AM2694	SUPERase In RNase-Inhibitor ist ein proteinbasierter, nichtmenschlichen Ursprungs stammender Inhibitor, der die häufigsten und problematischsten RNasen, einschließlich RNase A, B, C, 1 und T1, nichtkovalent bindet und hemmt.
SYBR Green I Nukleinsäure-Gel-Färbemittel	Thermo Fisher	S7563	Die primäre Funktion des SYBR™ Green I Nukleinsäure-Gel-Färbemittels besteht darin, doppelsträngige DNA (dsDNA) in Agarose- oder Polyacrylamidgelen sichtbar zu machen und zu quantifizieren.
TransIT-mRNA Transfektionskit	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	Ein Transfektionsreagenz mit hoher Effizienz und geringer Toxizität für große RNA-Moleküle
TRAPeze Telomerase-Detektionskit	Millipore Sigma	S7700	Der TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol)-Assay ist eine weit verbreitete und empfindliche PCR-basierte Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung der Telomeraseaktivität in Säugerzellen und Gewebeproben. Er umfasst drei Hauptschritte: die Verlängerung telomerer Wiederholungen durch Telomerase, die Amplifikation dieser Produkte mittels PCR und anschließend die Detektion.
Trypsin-EDTA (0,05 %), Phenolrot	Thermo Fisher	25300054	Zum Ablösen adhärenter Säugerzellen von Kulturgefäßen während des routinemäßigen Zellpassagierens (Subkultivierung) und zur Ernte.

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Optimiertes Reverse-Transfektionsprotokoll zur Übertragung von Telomerase-mRNA in früh-seneszente menschliche Fibroblasten

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