Optimiertes Reverse-Transfektionsprotokoll zur Übertragung von Telomerase-mRNA in früh-seneszente menschliche Fibroblasten

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt ein optimiertes Reverse-Transfektionsprotokoll für die effiziente Übertragung von nucleosidmodifizierter humaner Telomerase-Reverser-Transkriptase-mRNA (hTERT-mRNA) in seneszente humane Fibroblasten vor. Die Vorbeschichtung von Kulturoberflächen mit hTERT-mRNA-Lipid-Komplexen verbessert die Aufnahme und ermöglicht die Aktivierung der Telomerase, die Verlängerung der Telomere und eine teilweise Verjüngung. Die Kulturen treten letztendlich erneut in Seneszenz oder Krise ein, ohne dass eine Immortalisierung erfolgt.

Zusammenfassung

Die zelluläre Seneszenz ist mit tiefgreifenden Veränderungen der zellulären Physiologie verbunden, darunter verminderte Membranfluidität, gestörter endosomaler Transport, reduzierte endozytotische Kapazität und erhöhte extrazelluläre RNase-Aktivität, die alle eine effiziente mRNA-Übertragung erschweren. Diese Barrieren haben die Anwendung von RNA-basierten Ansätzen in seneszenten Zellen begrenzt, insbesondere für die Abgabe großer therapeutischer Transkripte. Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Reverse-Transfektionsmethode zur effizienten Übertragung modifizierter Boten-RNA (mRNA) in seneszente humane Fibroblasten. Obwohl hTERT-mRNA (humane Telomerase-Rücktranskriptase-mRNA) als Modelltranskript verwendet wurde, ist der Arbeitsablauf auf andere mRNA-Moleküle übertragbar. Im Gegensatz zu herkömmlichen Transfektionsmethoden, bei denen RNA-Lipid-Komplexe nach der Zellanheftung dem Kulturmedium zugegeben werden, erfolgt bei der Reverse-Transfektion die Ablagerung der Komplexe auf der Kulturoberfläche vor der Zellseeding, wodurch eine direkte Interaktion zwischen anheftenden Zellen und Transfektionskomplexen ermöglicht wird. Um die Transfektionseffizienz zu maximieren, beinhaltet das Protokoll nucleosidmodifizierte mRNA mit Pseudouridin und 5-Methylcytidin, verlängerte poly(A)-Schwänze, optimierte Komplexbildungszeiten, RNase-Hemmung, vorübergehende Erhöhung des endosomalen pH-Werts mittels Chloroquin, erhöhte Zellseedingdichte und verlängerte Inkubationszeiten. Mit diesem Ansatz wurden Transfektionseffizienzen von etwa 50–80 % in seneszenten Fibroblasten nach der Abgabe eines 5-kb-hTERT-mRNA-Transkripts erreicht. Die maximale Telomeraseaktivität wurde 24–48 Stunden nach der Transfektion nachgewiesen. Ein einzelner Transfektionszyklus führte zu messbarer Telomerelongation, während drei aufeinanderfolgende Transfektionen zu einer deutlichen, aber begrenzten Telomerverlängerung führten. Eine teilweise Umkehrung seneszenzassoziiierter Phänotypen war innerhalb von 72–96 Stunden nachweisbar, einschließlich verminderte Aktivität der seneszenzassoziierten β-Galactosidase, verringerte Expression von p16 und p21, Wiederherstellung der Zellmorphologie und Verlängerung der replikativen Lebensdauer. Die übertragene hTERT-mRNA wurde innerhalb von 72–96 Stunden abgebaut, und eine Immortalisierung wurde nicht beobachtet. Dieses Protokoll bietet einen praktikablen Ansatz für die transiente mRNA-Abgabe in seneszente Zellen und könnte auf eine breite Palette von Zelltypen und Spezies übertragbar sein.

Einleitung

Die Reverse-Transfektion stellt eine entscheidende methodische Anpassung für seneszente Zellen dar, die die grundlegenden Hindernisse überwindet, die diese Zellen gegenüber Standard-Transfektionsmethoden darstellen. Im Gegensatz zur Vorwärts-Transfektion, bei der Zellen vorab ausplattiert und zur Adhärenz gebracht werden, bevor Transfektionskomplexe hinzugefügt werden, erfolgt bei der Reverse-Transfektion das direkte Aufbringen von Zellen in Suspension auf vorab gebildete hTERT-mRNA-Lipid-Komplexe. Diese Technik erhöht die Transfektionseffizienz in seneszenten Zellen erheblich, indem die Exposition gegenüber den Transfektionskomplexen während der kritischen Anheftungsphase maximiert wird, in der das Membranremodeling am aktivsten ist.

Die zentrale konzeptionelle Neuerung des Protokolls besteht darin, seneszente Zellen als ein eigenständiges Problem der Substanzabgabe zu betrachten, nicht lediglich als schwer zu transfigierende Varianten junger Zellen. In der Seneszenz verändern globale Veränderungen in der Zusammensetzung der Membranlipide – einschließlich Phospholipide, Sphingolipide und Cholesterin – die Membranfluidität, Krümmung und Protein-Lipid-Wechselwirkungen und tragen gleichzeitig zum seneszenzassoziierten sekretorischen Phänotyp^1,2,3 bei. Seneszente Zellen zeigen außerdem eine verminderte clathrin- und caveolae-vermittelte Rezeptor-Endozytose sowie veränderte endozytotische Transportwege, verursacht unter anderem durch die Herunterregulation von Amphiphysin-1 und kompensatorische Veränderungen in der Expression von Caveolin, was die rezeptorvermittelte Aufnahme und Signalübertragung abschwächt^4,5,6. Parallel dazu gerät die Rab7-regulierte Achse des späten Endosoms zum Lysosom und das umfassendere endosomale-autophagische-lysosomale (EAL) Netzwerk aus dem Gleichgewicht, wobei Rab7 als zentraler Regulator der endolysosomalen Reifung und der Fusion von Autophagosomen mit Lysosomen fungiert – Prozesse, die bei Alterung und Neurodegeneration gestört sind⁷.

Seneszente Zellen regulieren häufig mehrere Komponenten des lysosomalen Verarbeitungs- und Anpassungssystems (LYPAS) hoch, einschließlich der durch TFEB/TFE3 gesteuerten lysosomalen Biogenese und der chaperonvermittelten Autophagie, wodurch die lysosomale Masse zunimmt. Dennoch weisen einzelne Lysosomen häufig einen erhöhten luminalen pH-Wert, Schäden an der Membran und veränderte proteolytische Kapazität auf, was zu einer lysosomalen Dysfunktion beiträgt, obwohl ihre Häufigkeit zunimmt^8,9,10,11. Insgesamt können diese Veränderungen interne Materialien effizienter in degradative endolysosomale Kompartimente lenken und erhöhen somit die Wahrscheinlichkeit, dass angelieferte RNA oder Proteine abgebaut werden, bevor eine produktive Freisetzung ins Zytoplasma erfolgen kann^9,10,11. Die Revers-Transfektion zielt direkt auf das früheste Zeitfenster ab, in dem Membranumgestaltungen während der Adhäsion stattfinden, und erzwingt einen anhaltenden, hochaffinen Kontakt zwischen Zellen und mRNA-Lipid-Komplexen, wodurch die beeinträchtigte stationäre Endozytose in vollständig adhärenten seneszenten Zellen zumindest teilweise umgangen wird^4,5,6,12.

Auf der Ebene des RNA-Designs geht das Protokoll davon aus, dass in einem Alterungskontext eine einfache Baseline aus Kappe und Schwanz unzureichend ist: Eine vollständige Nukleosidmodifikation (beispielsweise Pseudouridin oder N1‑Methylpseudouridin in Kombination mit 5‑Methylcytidin) gilt als unabdingbar, um die Translation von der endosomalen Erkennung durch Toll-ähnliche Rezeptoren und der Induktion von Typ-I-Interferonen zu entkoppeln. Grundlegende Arbeiten zeigten, dass die Einbindung modifizierter Nukleoside in die RNA die Aktivierung von TLR3, TLR7 und TLR8 unterdrückt und die Zytokinproduktion dendritischer Zellen deutlich verringert, was eine mechanistische Grundlage für die verminderte angeborene Immunogenität aktueller, nukleosidmodifizierter mRNA-Plattformen liefert¹³. Neuere Übersichtsarbeiten zu mRNA–LNP-Impfstoffen und mRNA-basierten Arzneimitteln betonen das koordinierte Engineering der 5′-Kappe, der UTRs, der kodierenden Sequenz und des Poly(A)-Schwanzes, um die Stabilität und Translation in vivo zu erhöhen und gleichzeitig die Aktivierung des angeborenen Immunsystems zu minimieren¹⁴. Insbesondere hat sich die Länge und Architektur des Poly(A)-Schwanzes als entscheidender Faktor für Stabilität und translationelle Ausbeute von in vitro transkribierter mRNA herausgestellt, was längere oder gezielt konstruierte Poly(A)-Designs in therapeutischen mRNA-Molekülen motiviert¹⁵.

Darüber hinaus enthält das Protokoll ausdrücklich Schutzmaßnahmen gegen extrazelluläre und endosomale RNasen während der Komplexbildung und Aufnahme sowie ein definiertes Zeitfenster für den endosomalen Ausbruch unter Verwendung eines transienten lysosomotropen Wirkstoffs wie Chloroquin^16,17. Chloroquin wird seit langem als funktioneller Indikator für endosomale Barrieren eingesetzt und kann die Zielbindung und Stilllegung durch siRNA oder Antisense-Oligonukleotide erheblich verstärken, indem es die Destabilisierung der endosomalen Membran fördert und die Freisetzung der Nukleinsäurefracht in das Cytosol ermöglicht¹⁸. Gleichzeitig haben Live-Cell- und Super-Resolution-Aufnahmen von mittels LNP verabreichter mRNA gezeigt, dass die produktive Abgabe stark durch seltene Ausbruchereignisse aus frühen/recyclingfähigen Endosomen begrenzt ist, anstatt durch die initiale Aufnahme an sich, was die Bedeutung einer gezielten Konstruktion eines endosomalen Ausbruchsschritts für mRNA-Therapeutika unterstreicht¹⁹.

Zusammenfassend schaffen diese mit der Zellalterung assoziierten Veränderungen in der Membrandynamik, dem endozytotischen Transport, der lysosomalen Verarbeitung und der Aktivierung des angeborenen Immunsystems erhebliche Hindernisse für eine effiziente mRNA-Übertragung. Die hier beschriebene Reverse-Transfektionsstrategie wurde entwickelt, um diese Einschränkungen zu überwinden, indem optimiertes mRNA-Engineering, RNase-Schutz, verbesserter endosomaler Ausbruch und eine direkte Exposition der anheftenden Zellen gegenüber vorgebildeten mRNA-Lipid-Komplexen kombiniert werden. Obwohl hTERT-mRNA als Modellfracht verwendet wird, ist der Arbeitsablauf allgemein auf die Abgabe anderer großer therapeutischer mRNA-Transkripte in seneszente und schwer zu transfectierende Zellpopulationen anwendbar^20,21,22.

Protokoll

1. In-vitro-Transkription von hTERT-mRNA

1. In-vitro-Transkription (IVT) mit ARCA und ΨUTP
   1. Stellen Sie eine 20 µL IVT-Reaktion gemäß Tabelle 1 her. Skalieren Sie die Reaktion linear, wenn eine größere Ausbeute erforderlich ist.
   2. Vermischen Sie alle Reaktionskomponenten mit Ausnahme der T7-RNA-Polymerase in einem RNase-freien Röhrchen. Fügen Sie zuletzt die T7-RNA-Polymerase hinzu, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz.
   3. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C für 0,5–4 h.
      HINWEIS: Passen Sie die Inkubationszeit entsprechend der Länge der Vorlage an. Inkubieren Sie Reaktionen mit kürzeren Vorlagen (ca. 500 bp) etwa 30 Minuten lang und Reaktionen mit größeren Vorlagen (ca. 4 kb) 3–4 Stunden lang.
2. DNase-Behandlung
   1. Geben Sie 1 µL RNase-freie DNase I direkt in die IVT-Reaktionsmischung.
   2. Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 °C für 15 min.
      HINWEIS: Die DNase-Behandlung sollte direkt in der IVT-Reaktion durchgeführt werden, ohne vorherige Reinigung der synthetisierten mRNA.
3. mRNA-Reinigung
   1. Fügen Sie 115 µL nukleasefreies H₂O hinzu, um die Reaktionsmischung zu verdünnen.
   2. Reinigen Sie die mRNA mithilfe eines RNA-Reinigungs-Kits gemäß den Herstelleranweisungen.
   3. Eluieren Sie die gereinigte mRNA in 20–30 µL nukleasefreiem H₂O.
   4. Bestimmen Sie die mRNA-Reinheit mittels Spektrophotometrie und überprüfen Sie die RNA-Integrität durch Elektrophorese in einem 1,0–1,5 %igen denaturierenden Agarosegel oder einem Polyacrylamidgel mit niedrigem Anteil.
4. Poly(A)-Tailing
   1. Stellen Sie eine 50 µL Poly(A)-Tailing-Reaktion gemäß Tabelle 2 her. Mischen Sie die Reaktionskomponenten vorsichtig und inkubieren Sie bei 37 °C für 30–60 min.
      HINWEIS: Passen Sie die Inkubationszeit entsprechend der Menge an eingesetzter RNA an.
   2. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 2 µL 0,5 M EDTA (pH 8,0).
5. Endgültige Reinigung und Qualitätskontrolle
   1. Reinigen Sie die poly(A)-taillierte mRNA mithilfe eines RNA-Reinigungs-Kits gemäß den Herstelleranweisungen.
   2. Eluieren Sie die gereinigte mRNA in 20–30 µL nukleasefreiem H₂O.
   3. Beurteilen Sie die mRNA-Qualität vor der Transfektion
      1. Messen Sie die mRNA-Konzentration bei 260 nm und bestimmen Sie die Reinheit anhand der A260/A280- und A260/A230-Verhältnisse. Verwenden Sie mRNA-Präparationen mit A260/A280-Werten von etwa 2,0 und A260/A230-Werten über 2,0.
      2. Beurteilen Sie die mRNA-Integrität mittels Gelelektrophorese oder eines RNA-Analysesystems gemäß den Herstelleranweisungen.
      3. Bestätigen Sie die Länge des Poly(A)-Schwanzes durch RT-PCR oder Bioanalyzer-Analyse. Stellen Sie sicher, dass die Länge des Poly(A)-Schwanzes zwischen 120 und 200 Nukleotiden liegt.
      4. Portionieren Sie die gereinigte mRNA und lagern Sie die Aliquots bei −80 °C, um Freeze-Thaw-Zyklen zu minimieren.

2. Reverse Transfektion

1. Tag −1: Vorbereitung vor der Transfektion
   1. Überprüfung des seneszenten Phänotyps
      1. Führen Sie eine seneszenzassoziierte β-Galactosidase-(SA-β-Gal)-Färbung an einer repräsentativen Zellprobe durch. Stellen Sie sicher, dass mehr als 70 % der Zellen positiv sind.
      2. Bestätigen Sie die Expression von Seneszenzmarkern (p16 und p21) mittels qRT-PCR oder Immunfluoreszenz.
      3. Bestimmen Sie die Zellviabilität und überprüfen Sie, dass diese über 90 % liegt.
   2. Vorbereitung der Reagenzien
      1. Erwärmen Sie das komplette Kulturmedium auf 37 °C vor.
      2. Erwärmen Sie gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 37 °C vor.
      3. Bereiten Sie frisches Opti-MEM I-Medium vor.
         HINWEIS: Fügen Sie vor der Verwendung kein RNase-Inhibitor zu Opti-MEM I hinzu.
2. Tag 0: Transfektionstag
   HINWEIS: Planen Sie etwa 3 Stunden von der Reagenzvorbereitung bis zur Inkubation der transfizierten Zellen ein.
   1. Vorbereitung der hTERT-mRNA
      1. Tauen Sie die hTERT-mRNA auf Eis auf. Messen Sie die mRNA-Konzentration und verwenden Sie Präparationen mit Konzentrationen zwischen 0,5 und 1,0 µg/µL.
      2. Verdünnen Sie die gewünschte Menge an hTERT-mRNA in Opti-MEM I entsprechend dem verwendeten Kulturformat (Tabelle 3). Fügen Sie RNase-Inhibitor bis zu einer Endkonzentration von 0,5–1,0 U/µL hinzu und mischen Sie vorsichtig.
      3. Bewahren Sie die verdünnte mRNA bis zur Komplexbildung auf Eis auf.
         HINWEIS: Fügen Sie den RNase-Inhibitor unmittelbar vor der Verwendung hinzu. Lagern Sie die mRNA nicht mit RNase-Inhibitor, da dessen Aktivität nach dem Einfrieren abnimmt.
   2. Vorbereitung des Transfektionsreagenzes
      1. Mischen Sie 6,0 µL Transfektionsreagenz mit 100 µL Opti-MEM I in einem sterilen, RNase-freien Röhrchen. Mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren.
      2. Inkubieren Sie die Mischung 5 Minuten bei Raumtemperatur.
         HINWEIS: Bei großen hTERT-mRNA-Konstrukten (~5 kb) optimieren Sie das Verhältnis Reagenz zu mRNA zwischen 0,4 und 0,6 µL Reagenz pro 100 ng mRNA.
   3. Bildung der mRNA-Lipid-Komplexe
      1. Geben Sie die verdünnte hTERT-mRNA-Lösung (100 µL) zur verdünnten Transfektionsreagenz-Lösung (106 µL). Mischen Sie vorsichtig durch 5–6-maliges Pipettieren.
      2. Inkubieren Sie die Mischung 15–20 Minuten bei Raumtemperatur.
      3. Überschreiten Sie nicht eine Komplexbildungszeit von 30 Minuten.
      4. Überprüfen Sie die erfolgreiche Komplexbildung anhand des leicht trüben Aussehens der Lösung.
         HINWEIS: Führen Sie während der Komplexbildung die Zellvorbereitung durch.
   4. Vorbereitung der Zellen für die Reverse Transfektion
      1. Aspirieren Sie das Kulturmedium aus den seneszenten Zellkulturen.
      2. Waschen Sie die Zellen einmal mit vorgewärmtem PBS (2 mL pro Vertiefung einer 6-Loch-Platte).
      3. Geben Sie 500 µL 0,05 %igem Trypsin-EDTA pro Vertiefung hinzu.
      4. Inkubieren Sie die Zellen 3–5 Minuten bei 37 °C.
      5. Neutralisieren Sie das Trypsin mit 3 mL komplettem Medium, das Serum enthält.
      6. Titrieren Sie die Zellen vorsichtig, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten.
      7. Bestimmen Sie die Zellanzahl mittels eines Hämozytometers oder automatischen Zellzählgeräts.
      8. Bereiten Sie eine Suspension mit 2,0–2,5 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in komplettem Medium vor.
         HINWEIS: Vermeiden Sie eine verlängerte Trypsinbehandlung, da seneszente Zellen sehr empfindlich gegenüber mechanischem Stress sind. Halten Sie die Zellen in Suspension; plattieren Sie sie nicht vor der Reverse Transfektion vorab.
   5. Reverse Transfektion
      1. Vorbereitung der Kulturplatte
         1. Geben Sie 500 µL 0,01 %igem Poly-L-Lysin in jede Vertiefung einer 6-Loch-Platte und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.
         2. Aspirieren Sie die Beschichtungslösung unmittelbar vor der Verwendung.
         3. Geben Sie 200 µL des hTERT-mRNA-Lipid-Komplexes in die Mitte jeder Vertiefung.
         4. Inkubieren Sie die Platte 30 Minuten bei 37 °C und 5 % CO₂.
            HINWEIS: Führen Sie die Plattenbeschichtung parallel zur Komplexbildung und Zellvorbereitung durch.
      2. Vorbereitung der Zellsuspension
         1. Suspendieren Sie 2,0–2,5 × 10⁵ Zellen in 1800 µL antibiotikafreiem komplettem Medium.
         2. Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig, um eine homogene Einzelzell-Suspension zu erhalten.
            HINWEIS: Verwenden Sie während der Transfektion antibiotikafreies Medium.
      3. Aussaat der Zellen auf die Komplexe
         1. Geben Sie 1800 µL der Zellsuspension direkt auf die vorgebildeten hTERT-mRNA-Lipid-Komplexe.
         2. Kippen Sie die Platte vorsichtig 2–3 Mal in jede Richtung, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
            HINWEIS: Pipettieren Sie die Suspension nach Zugabe der Zellen nicht erneut, da dies die mRNA-Lipid-Komplexe stören könnte.
      4. Inkubation der Zellen
         1. Inkubieren Sie die Zellen 6–8 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
         2. Überwachen Sie die Zellanheftung mittels Lichtmikroskopie 2–3 Stunden nach der Transfektion.
         3. Stellen Sie sicher, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind und mit der Anheftung an die Kulturoberfläche beginnen.
            HINWEIS: Eine übermäßige Anzahl an schwebenden Zellen oder zellulärem Detritus kann auf transfektionsassoziierte Zytotoxizität hindeuten.

3. Minderung der Zytotoxizität

1. Verkürzen Sie die Transfektionszeit auf 48 h, wenn der Zellverlust 20 % überschreitet.
2. Vergesellschaften Sie die Kulturen während der Transfektionsphase mit 10 µM ROCK-Inhibitor Y-27632, um die Zellüberlebensrate zu verbessern.
3. Entfernen Sie nach 6–8 h Transfektion vorsichtig das Transfektionsmedium, wobei teilweise angeheftete Zellen so wenig wie möglich gestört werden sollen. Lassen Sie etwa 100 µL Restmedium in jedem Wells.
4. Geben Sie 1 mL frisches, vorgewärmtes komplettes Wachstumsmedium mit 15 % FBS zu jedem Well hinzu.
5. Fügen Sie Chloroquin unmittelbar nach dem Mediumwechsel bis zu einer Endkonzentration von 10–20 µM hinzu.
6. Inkubieren Sie die Kulturen zusätzlich 2 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
7. Ersetzen Sie das Chloroquin-haltige Medium durch frisches komplettes Wachstumsmedium.
8. Stellen Sie die Kulturen zur weiteren Zellvermehrung in den Inkubator zurück.
   ANMERKUNG: Überwachen Sie während der Erholungsphase die Zellmorphologie und -viabilität. Starke Zellablösung oder Zerfall können auf eine transfektionsassoziierte Zytotoxizität hindeuten.

4. Nachtransfektionsanalyse

1. Beurteilen Sie die TERT-Proteinexpression 24–48 h nach der Transfektion.
2. Messen Sie die TERT-Proteinmengen mittels Western Blot oder Immunfluoreszenz-Färbung gemäß standardmäßiger Laborverfahren.
3. Bestimmen Sie die Telomerase-Aktivität im gleichen Zeitraum unter Verwendung eines geeigneten Telomerase-Aktivitäts-Assays.
   ANMERKUNG: Die Telomerase-Aktivität nimmt typischerweise nach 48 h ab, da die transient übermittelte hTERT-mRNA abgebaut wird.
4. Analysieren Sie die Telomerlänge 48–72 h nach der Transfektion mittels monochromem multiplex-quantitativer PCR (MMqPCR) oder einer vergleichbaren Methode zur Telomerlängenbestimmung.
   ANMERKUNG: Nach erfolgreicher hTERT-mRNA-Übertragung kann eine messbare Verlängerung der Telomere beobachtet werden.
5. Untersuchen Sie sieben Tage nach der Transfektion seneszenzassoziierte und Verjüngung assoziierte Phänotypen
   1. Messen Sie die Aktivität der seneszenzassoziierten β-Galactosidase (SA-β-Gal).
   2. Bestimmen Sie die Expressionsmengen von p16 und p21.
   3. Analysieren Sie die Ki67-Expression.
   4. Untersuchen Sie die zelluläre Morphologie mittels Lichtmikroskopie.
      ANMERKUNG: Vergleichen Sie behandelte Kulturen mit unbehandelten oder mock-transfizierten, seneszenten Kontrollen, um Veränderungen in seneszenzassoziierten Phänotypen und proliferativen Eigenschaften zu beurteilen.

5. Protokoll mit wiederholter Dosierung (optional)

1. Führen Sie die erste Transfektion wie in den Abschnitten 2–4 beschrieben durch.
2. Wiederholen Sie die Transfektionen nach folgendem Zeitplan: Tag 0: Erste Transfektion; Tag 5: Zweite Transfektion; Tag 10–12: Dritte Transfektion.
3. Kultivieren Sie die Zellen als anhaftende Zellkulturen und verzichten Sie vor nachfolgenden Transfektionen auf eine Behandlung mit Trypsin.
4. Stellen Sie frische hTERT-mRNA–Lipid-Komplexe wie in den Abschnitten 2.2.1–2.2.3 beschrieben her.
5. Entfernen Sie das Kulturmedium aus jedem Wells mittels Absaugung.
6. Geben Sie 200 µL der hTERT-mRNA–Lipid-Komplexe direkt in jedes Wells.
7. Fügen Sie unmittelbar nach der Zugabe der Komplexe 800 µL frisches, komplettes F-10-Medium hinzu.
8. Inkubieren Sie die Zellen 4–6 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
9. Ersetzen Sie das Transfektionsmedium durch frisches, komplettes Medium.
   HINWEIS: Beschränken Sie die Behandlung auf maximal drei Transfektionszyklen, um eine akkumulative, mit der Transfektion assoziierte Zytotoxizität zu minimieren.

6. Protokoll zur transienten Transfektion (2 µg/mL, 6-Loch-Format)

1. Tag −1: Zellansaat
   1. Lösen Sie seneszente oder früh-seneszente Fibroblasten mit 0,05 % Trypsin-EDTA ab.
   2. Neutralisieren Sie das Trypsin mit komplettem Kulturmedium.
   3. Bestimmen Sie die Zellanzahl und -viabilität.
   4. Säen Sie die Zellen in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 2,0–2,5 × 10⁵ Zellen pro Well aus.
   5. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂, bis sie eine Konfluenz von etwa 60–80 % erreichen.
2. Tag 0: Herstellung der hTERT-mRNA–Reagenz-Komplexe
   1. Tauen Sie eine Portion nucleosidmodifizierter hTERT-mRNA auf Eis auf.
   2. Verdünnen Sie die hTERT-mRNA in Opti-MEM auf eine Endkonzentration von 2 µg/mL in einem sterilen, RNase-freien Röhrchen (Röhrchen A).
   3. Geben Sie RNase-Inhibitor zu Röhrchen A, um eine Endkonzentration von 0,5–1,0 U/µL zu erreichen, und mischen Sie vorsichtig.
   4. Verdünnen Sie das Transfektionsreagenz in Opti-MEM in einem zweiten RNase-freien Röhrchen (Röhrchen B) mit 0,4–0,6 µL Reagenz pro 100 ng mRNA.
   5. Geben Sie den Inhalt von Röhrchen B tropfenweise unter leichtem Mischen zu Röhrchen A.
   6. Inkubieren Sie das Gemisch 15–20 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Tag 0: Vorwärts-Transfektion
   1. Überprüfen Sie, ob die Zellen eine Konfluenz von 60–80 % aufweisen und eine gesunde Morphologie zeigen.
   2. Aspirieren Sie das Kulturmedium ab.
   3. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1–2 mL vorgewärmtem PBS.
   4. Geben Sie 0,5 mL vorgewärmtes komplettes oder serumreduziertes Medium in jedes Well.
   5. Fügen Sie optional Chloroquin hinzu, um eine Endkonzentration von 10–20 µM zu erreichen.
   6. Geben Sie 0,5 mL der in Schritt 6.2.6 hergestellten hTERT-mRNA–Reagenz-Komplexe in jedes Well.
   7. Wippen Sie die Platte vorsichtig, um die Komplexe gleichmäßig zu verteilen.
   8. Inkubieren Sie die Zellen 4–6 Stunden bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂.
      ​HINWEIS: Verlängern Sie die Inkubationszeit bei Bedarf auf 6–8 Stunden für seneszente Zellen.
   9. Aspirieren Sie das Transfektionsmedium ab.
   10. Geben Sie 2,0 mL frisches komplettes Medium in jedes Well.
   11. Führen Sie die Analysen nach der Transfektion gemäß Abschnitt 4 durch.
       HINWEIS: Verwenden Sie dieselbe hTERT-mRNA-Charge, dasselbe Transfektionsreagenz und die gleiche nominelle Dosis, wenn Vorwärts- und Rückwärts-Transfektionsbedingungen verglichen werden.

Ergebnisse

Das d2EGFP-T2A-hTERT modRNA wurde als hybride offene Leserahmen konstruiert, bei dem ein destabilisiertes EGFP (d2EGFP)-Reporterprotein über ein selbstspaltendes T2A-Peptid mit dem humanen TERT verknüpft war. Die vollständigen Nukleotid- und Proteinsequenzen aller Konstrukte sind in Supplementärdatei 1 enthalten. Die kodierende Sequenz war flankiert von einer synthetischen 5′-unübersetzten Region (UTR) und der 3′-UTR des humanen β-Globins, um die Translations-Effizienz und mRNA-Stabilität zu erhöhen (Abbildung 1A). Die Expressionskassette enthielt außerdem eine synthetische Enzymstabilisierungssequenz (Es) und eine synthetische Transkriptionsverstärkersequenz (TEs), die darauf ausgelegt waren, die Prozessivität der T7-Polymerase zu verbessern und eine vorzeitige Transkriptionsbeendigung zu reduzieren. Nach dem Klonieren stromabwärts eines T7-Promotors wurde die in vitro-Transkription unter Verwendung eines Anti-Reverse-Cap-Analogs (ARCA) und modifizierter Nukleotide (m5CTP und ΨUTP) durchgeführt, gefolgt von einer enzymatischen Poly(A)-Anhängung (ca. 120–200 nt), um kapazitiertes, polyadenyliertes, hochintegrales d2EGFP-T2A-hTERT modRNA herzustellen (Abbildung 1A).

Die automatisierte elektrophoretische RNA-Analyse bestätigte eine effiziente Synthese des Transkripts und zeigte eine vorherrschende RNA-Spezies der erwarteten Größe mit minimalen Abbauprodukten über mehrere Eingabemengen hinweg, was mit einer erfolgreichen Erzeugung von vollständiger modRNA übereinstimmt (Abbildung 1B). Nach der Transfektion früh seneszenter LF1-Fibroblasten mit 2 µg/mL d2EGFP-T2A-hTERT modRNA war das hTERT-Protein innerhalb von 24 Stunden nachweisbar und blieb über 48–96 Stunden erhöht, was auf eine anhaltende Translation des synthetischen Transkripts hindeutet (Abbildung 1C). Die Analyse des gekoppelten d2EGFP-Reporters zeigte nach Reverse-Transfektion eine starke Fluoreszenz, während nach Forward-Transfektion deutlich geringere Fluoreszenz beobachtet wurde (Abbildung 1D,E). Diese Ergebnisse deuten auf eine verbesserte Zufuhr und Expression von hTERT modRNA mittels Reverse-Transfektionsansatz in früh seneszenten LF1-Fibroblasten hin.

Wiederholte Vorwärts-Transfektion (FT) von früh-seneszenten LF1-Fibroblasten mit d2EGFP-T2A-hTERT modRNA im Abstand von 5 Tagen führte im Vergleich zu mock-transfizierten Kontrollen zu einem progressiven Anstieg der durchschnittlichen Telomerlänge (rT/S), gemessen mittels monochromer multiplexer quantitativer PCR (MMqPCR) (Abbildung 2A). Das rT/S-Verhältnis stieg nach jedem FT-Zyklus an, wobei die statistische Signifikanz sich von *P < 0,05 auf **P < 0,01 verbesserte.

Die Anwendung des gleichen Dosierungsschemas mittels Reverse-Transfektion (RT) führte zu einer stärkeren Zunahme der Telomerlänge. Das rT/S-Verhältnis stieg nach jedem RT-Zyklus an und erreichte im Vergleich zu mock-transfizierten Kontrollen hochsignifikante Unterschiede (*P < 0,05 bis ****P < 0,0001) (Abbildung 2B). Ein direkter Vergleich von FT und RT nach drei Behandlungszyklen zeigte, dass beide Ansätze die rT/S-Werte im Vergleich zu mock-transfizierten Kontrollen signifikant erhöhten; RT bewirkte jedoch unter identischen Dosierungs- und Zeitbedingungen eine stärkere Zunahme als FT (*P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001) (Abbildung 2C).

Die Langzeit-Wachstumsanalyse zeigte weiterhin, dass die wiederholte Applikation von hTERT modRNA die replikative Lebensdauer verlängerte (Abbildung 2D). Zellen, die ein, zwei oder drei Behandlungszyklen erhielten, wiesen eine progressiv höhere kumulative Anzahl an Populationverdopplungen im Vergleich zu mock-transfizierten Kontrollen auf. Kulturen, die drei Runden einer hTERT modRNA-Behandlung erhielten, insbesondere mittels RT, zeigten über einen Zeitraum von etwa 250 Tagen die stärkste Abweichung von den Wachstumskurven der Kontrollen (bis zu ****P < 0,0001). Die Berechnungen der Populationverdopplungen sind in Zusatzdatei 2 dargestellt.

Frühseneszente LF1-Fibroblasten, die mit d2EGFP-T2A-hTERT modRNA transfiziert wurden, zeigten 48 h nach der Transfektion ein starkes TRAP-Laddering-Muster, während Zellen, die mit Mock- oder eGFP-modRNA behandelt wurden, lediglich ein Hintergrundsignal aufwiesen, was darauf hindeutet, dass die Telomeraseaktivität auf der exogenen Expression von hTERT beruhte (Abbildung 3A). Eine Vorbehandlung mit Hitze beseitigte das Laddering-Muster und bestätigte somit die Spezifität des Assays (Abbildung 3B).

Die Zeitverlaufsanalyse zeigte, dass die Telomerase-Aktivität zwischen 24 und 48 Stunden nach der Transfektion ihren Höhepunkt erreichte und anschließend abnahm, wobei sie bis 72–96 Stunden wieder nahezu Ausgangswerten entsprach (Abbildung 3C). Eine Erhöhung der hTERT modRNA-Konzentration von 50 auf 3.000 ng/mL führte zu einer entsprechenden Zunahme der TRAP-Signalintensität, was eine dosisabhängige Aktivierung der Telomerase belegt (Abbildung 3D).

Die funktionelle Analyse unter Verwendung von Wildtyp-, katalytisch inaktiven (CI) und nukleärer Lokalisierungssignal-defizienten (ΔNLS) hTERT-Konstrukten zeigte, dass ausschließlich der Wildtyp-hTERT eine starke Telomeraseaktivität erzeugte. Beide Varianten, CI und ΔNLS, induzierten trotz vergleichbarer Transfektionsbedingungen keine vergleichbare Aktivität (Abbildung 3E). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen ergab die MMqPCR-Analyse einen deutlichen Anstieg der durchschnittlichen Telomerlänge (rT/S ≈ 1,4) nur in Zellen, die Wildtyp-hTERT modRNA erhielten. Zellen, die CI-hTERT, ΔNLS-hTERT oder eine Scheinbehandlung erhielten, blieben nahe den Ausgangswerten (rT/S ≈ 0,3; ****P < 0,0001) (Abbildung 3F).

Drei aufeinanderfolgende Runden der Revers-Transfektion mit hTERT modRNA im Abstand von fünf Tagen verringerten den Anteil an seneszenzassoziierten β-Galactosidase-positiven Zellen signifikant. Der Prozentsatz positiver Zellen sank von etwa 85 % in den mit Mock behandelten Kulturen auf etwa 40 % in den mit hTERT behandelten Kulturen 15 Tage nach der letzten Transfektion (***P < 0,001) (Abbildung 4A).

Die konfokale Immunfärbung zeigte eine erhöhte Ki67-Expression in Zellen, die drei Runden einer hTERT-Rückwärtstransfektion erhalten hatten, verglichen mit mock-behandelten Kontrollen, was auf eine gesteigerte proliferative Aktivität hindeutet (Abbildung 4B). Die RT-qPCR-Analyse zeigte zudem eine verminderte Expression der seneszenzassoziierten Marker p16 und p21 nach hTERT-Behandlung. Im Vergleich zu mock-behandelten frühseneszenten Zellen sank die p16-Expression von etwa 2,3-fach auf 0,7-fach und die p21-Expression von etwa 11-fach auf 6-fach (**P < 0,01; ****P < 0,0001) (Abbildung 4C,D). Abbildung S1 zeigt weiterhin, dass die Behandlung mit Chloroquin (CQ) oder Y-27632 allein die Expression von p16 oder p21 in mock-transfizierten Zellen nicht signifikant veränderte. Im Gegensatz dazu führte die Kombination von CQ und Y-27632 während dreier Runden der hTERT-Rückwärtstransfektion im Vergleich zur alleinigen hTERT-Rückwärtstransfektion oder zur Anwendung jedes einzelnen Wirkstoffs zu der stärksten Reduktion der Expression sowohl von p16 als auch von p21, während die Einzelwirkstoffbehandlung mittlere Effekte zeigte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die kombinierte Anwendung von CQ und Y-27632 die Reduktion der seneszenzassoziierten Markerexpression nach der Rückwärtstransfektion mit hTERT-mRNA verstärkt. Insgesamt zeigen diese Befunde, dass wiederholte Rückwärtstransfektion mit hTERT-mRNA eine Verlängerung der Telomere, eine Verringerung seneszenzassoziierte Marker und eine Verbesserung proliferativer Eigenschaften in frühseneszenten LF1-Fibroblasten bewirkt.

Abbildung 1: Design, Synthese und funktionelle Validierung von d2EGFP‑T2A‑hTERT-mRNA in früh-seneszenten LF1-Fibroblasten. (A) Schematisches Design des hybriden hTERT-mRNA-Konstrukts, das die über das T2A-Peptid verknüpfte d2EGFP-Kassette zur gleichzeitigen Expression von hTERT und destabilisiertem EGFP enthält. Der d2EGFP-T2A-hTERT-ORF ist flankiert vom 3’ UTR des menschlichen β-Globin-Gens (HBB) und dem synthetischen 5’ UTR. Die mRNA wurde unter Verwendung modifizierter Nukleotide synthetisiert, und schließlich wurde ein Poly(A)-Schwanz hinzugefügt. (B) Effiziente Synthese von d2EGFP-T2A-hTERT-mRNA mit hoher Integrität mittels in-vitro-Transkription, analysiert durch automatisierte elektrophoretische RNA-Analyse. (C) Zeitverlaufsanalyse der hTERT-Proteinexpression mittels einer kapillarbasierten, automatisierten Immunoassay-Methode nach Transfektion von 2 µg/mL d2EGFP-T2A-hTERT-mRNA. (D) Die Effizienz und Expression nach Transfektion von d2EGFP-T2A-hTERT-mRNA, bewertet anhand der EGFP-Expression bei Vorwärts- (FT) und Rückwärts-Transfektion (RT), wurden in früh-seneszenten primären diploiden Fibroblasten (LF1) untersucht. Maßstabsbalken = 10 µm. (E) Quantifizierung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) des eGFP-Signals nach Vorwärts- oder Rückwärts-Transfektion. Insgesamt wurden 20 Einzelbilder für jede Bedingung analysiert, jeweils aus 4 verschiedenen Bereichen von 5 biologischen Wiederholungen. Die Daten zeigen Mittelwerte ± SD. **P < 0,01; bewertet mittels ungepaarten t-Tests mit Welchs Korrektur. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Dynamik der Telomerlänge und proliferatives Lebenslimit nach wiederholter Vorwärts- versus Rückwärts-Transfektion mit hTERT-mRNA in früh-seneszenten LF1-Fibroblasten. (A) Die durchschnittlichen Telomerlängen (rT/S) wurden mittels Telomere MMqPCR bestimmt. Früh-seneszente Fibroblasten wurden dreimal hintereinander im Abstand von fünf Tagen ab der Bevölkerungsverdopplung (PD) Nr. 76 mit d2EGFP-T2A-hTERT-mRNA vorwärts transfiziert (FT). Der Fehlerbalken zeigt den Standardfehler des Mittelwerts (SEM); n = 5 biologische Wiederholungen; *P < 0,05, **P < 0,01 im Vergleich zu Zellen, die nur mit Mock behandelt wurden. (B) Ähnlich wie in (A) wurde rT/S bewertet, wenn früh-seneszente Zellen dreimal hintereinander im Abstand von fünf Tagen ab PD Nr. 76 wiederholt (RT) mit d2EGFP-T2A-hTERT-mRNA transfiziert wurden. Der Fehlerbalken repräsentiert SEM; n = 7 biologische Wiederholungen; *P < 0,05, ****P < 0,0001 im Vergleich zu Zellen, die ausschließlich mit Mock behandelt wurden. (C) Vergleich der durchschnittlichen Telomerlänge (rT/S) nach drei aufeinanderfolgenden Vorwärts- und Rückwärts-Transfektionen im Abstand von fünf Tagen oder nur Mock. Der Fehlerbalken repräsentiert SEM; n = 10 biologische Wiederholungen; *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. (D) Wachstumskurven von LF1-Fibroblasten, die einmal, zweimal oder dreimal hintereinander im Abstand von fünf Tagen ab PD 76 mit 2 µg/ml d2EGFP-T2A-hTERT-mRNA oder nur mit Mock transfiziert wurden. Schwarze Pfeile zeigen die Zeitpunkte der Behandlung an. Die Wachstumskurven wurden dreimal repliziert, wobei jede Population in dreifacher Ausführung kultiviert wurde. Jeweils drei technische Wiederholungen pro biologischer Probe; die Daten stellen Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) dar. *P < 0,05, **P < 0,01; ****P < 0,0001, bewertet mittels Brown-Forsythe- und Welch’s ANOVA-Test Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Katalytisch aktive, nuklear lokalisierte hTERT-mRNA verursacht einen vorübergehenden, dosisabhängigen Anstieg der Telomeraseaktivität, der allein ausreicht, um eine messbare Verlängerung der Telomere in früh-seneszenten LF1-Fibroblasten zu fördern. (A) Zellen im frühen Seneszenzstadium wurden mit Mock-, eGFP- oder d2EGFP-T2A-hTERT-mRNA transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurde das Zelllysat von 20.000 Zellen hergestellt und dem TRAP-Assay unterzogen. Die Reaktionsprodukte wurden in einem nativen PAGE aufgetrennt und mit SYBR Green angefärbt. (B) Wärmebedingte Inaktivierung der Telomerase, gemessen mittels TRAP-Assay. (C) Die Analyse der Telomeraseaktivität über die Zeit in früh-seneszenten LF1-Zellen nach hTERT-mRNA-Transfektion zeigte, dass die Aktivität innerhalb von 72 h auf den Ausgangswert zurückkehrte, was auf eine vorübergehende Enzymaktivierung hindeutet. (D) Früh-seneszente LF1-Zellen erhielten unterschiedliche Mengen an d2EGFP-T2A-hTERT-mRNA (0–3.000 ng/mL), wobei die Telomeraseaktivität proportional zur Dosis anstieg. (E) Die Zugabe von 2 µg/ml TERT erhöhte die Telomeraseaktivität in früh-seneszenten LF1-Zellen. ΔNLS verstärkte die Telomeraseaktivität teilweise, ohne eine Telomerelongation auszulösen, da es im Zytoplasma wirkt, aber nicht in den Zellkern transloziert, während die katalytisch inaktive (CI) TERT-mRNA diesen Effekt nicht hervorrief, was auf unterschiedliche funktionelle Ergebnisse hinweist. (F) Wirkung der funktionalen TERT-, nukleären Lokalisierungssignal-defizienten (ΔNLS)- und katalytisch inaktiven (CI) TERT-Rücktransfektion auf die durchschnittliche Telomerlänge (rT/S) früh-seneszenter LF1-Zellen, was die Bedeutung der nuklear lokalisierten, katalytisch aktiven TERT für die Telomerverlängerung unterstreicht. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an; n = 7 biologische Wiederholungen; ****P < 0,0001 im Vergleich zu Zellen, die nur mit Mock-Behandlung versorgt wurden, bewertet mittels einfaktorieller ANOVA mit Welch-Korrektur. RTA%-Relative Telomeraseaktivität (% der Kontrolle) ist am unteren Rand jedes Lanes angegeben. Das Verhältnis der Intensitätswerte der TRAP-Probeläufe und des ITAS-Bandes (internen Kontrolle – IC) wurde für jeden Lane nach folgender Formel berechnet: Aktivität _normalisiert = Läuferintensität / IC-Intensität, und jede Probe wurde als Prozentsatz relativ zur positiven Kontrolle normalisiert (positive Kontrolle; H1299, 2.500 Zellen) unter Verwendung der folgenden Formel: Relative Aktivität (%) = Aktivität _normalisiert (Probe) / Aktivität _normalisiert (Referenz). Hintergrundsubtraktion wurde in jedem Schritt angewendet. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: Optimierte hTERT-mRNA-Rücktransfektion kehrt teilweise altersassoziierte Phänotypen um und stellt proliferative Marker in frühseneszenten LF1-Fibroblasten wieder her. (A) Repräsentative Bilder von β-Gal-exprimierenden frühseneszenten LF1-Zellen nach modifizierter hTERT-mRNA-Transfektion, dreimal nacheinander im Abstand von 5 Tagen. Maßstabsbalken = 100 µm. Die β-Gal-Expression wurde 15 Tage nach der letzten Transfektion analysiert. Die Experimente wurden dreimal durchgeführt, wobei jeweils >100 Zellen pro Probe manuell ausgewertet wurden. (B) Repräsentative konfokale Bilder (20fache Vergrößerung) von frühseneszenten LF1-Zellen, angefärbt mit dem Proliferationsmarker Ki67. Maßstabsbalken = 100 µm. Signifikante Zunahme der Ki-67-Expression nach drei Runden Rücktransfektion mit hTERT. Der Anteil Ki67-positiver Kerne nimmt signifikant nach 3× hTERT (RT) zu. Das Diagramm zeigt den Mittelwert ± SD der Anzahl Ki67-positiver Kerne, normiert auf die Mock-transfizierte Bedingung. Für jede Bedingung wurden insgesamt 18 Bilder untersucht, wobei 6 verschiedene Felder aus jedem biologischen Replikat ausgewählt wurden, insgesamt n = 3 biologische Replikate. ****P < 0,0001. (C) Expression von Seneszenzmarkern nach 3× hTERT-vermittelter partieller Verjüngung, gemessen mittels RT-qPCR (n = 6). Alle Daten zeigen Mittelwerte ± SD. **P < 0,01; ****P < 0,0001, bewertet mittels ungepaarten t-Test mit Welch-Korrektur. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Komponente	Volumen/Endkonzentration
PCR-Vorlage-DNA	200 –1000 ng
10× IVT-Puffer	2 μL
ATP (100 mM)	2 μL (10 mM endgültig)
GTP (100 mM)	1,5 μL (7,5 mM endgültig)
CTP (100 mM)	2 μL (10 mM endgültig)
m1Ψ-5′-TP (100 mM)	2 μL (10 mM endgültig) (Sie können die Einlagerung von Pseudo-UTP erhöhen, indem Sie normales UTP im Verhältnis 1:4 bis 2:2 (m1Ψ-5′-TP:UTP) hinzufügen.)
ARCA (10 mM)	4 μL (2 mM endgültig)
RNase-Inhibitor (40 U/μL)	0,5 μL (20 U)
T7-RNA-Polymerase (50 U/μL)	2 μL (100 U)
Nukleasefreies H₂O	20 μL

Tabelle 1: Zusammensetzung der In-vitro-Transkriptionsreaktion (IVT) zur Synthese von nucleosidmodifizierter hTERT-mRNA. Die verwendeten Reaktionskomponenten und Endmengen für die ARCA-geskappte IVT-Synthese sind aufgeführt.

Komponente	Volumen/Endkonzentration
Reinigtes mRNA, bis zu 5 μg	≤20 μL
10× Poly(A)-Schwanz-Puffer	5 μL
ATP (10 mM)	5 μL (1 mM Endkonzentration) (Obwohl es bereits im Puffer enthalten ist, trägt die zusätzliche Zugabe zur Stabilisierung des Poly-A-Schwanzes bei.)
Poly(A)-Polymerase (5 U/μL)	1 μL (5 U)
Nukleasefreies H₂O	zur Gesamtvolumina von 50 μL

Tabelle 2: Zusammensetzung der Poly(A)-Schwanz-Reaktion zur posttranskriptionellen Modifizierung von hTERT-mRNA. Reagenzvolumina und Reaktionsbedingungen zur Erzeugung eines 120–200 Nukleotide langen Poly(A)-Schwanzes sind dargestellt.

Parameter	12-Loch-Format	6-Loch-Format
Wachstumsfläche	~3,8 cm²	~9,5 cm²
Medium pro Loch	1,0 mL	2,0 mL
Anzahl der ausgesäten Zellen	5× 104–6,5× 104 Zellen/ml	2,0–2,5 × 10⁵
Durchschnittliche Zellanzahl (bei 100 % Konfluenz)	5,7× 104–7,2× 104 Zellen/ml	2,9–3 × 10⁵
Menge der mRNA-Transfektion	750–1000 ng	2000–3500 ng
mRNA-Transfektionsreagenz	1,5–3,0 µL	4,75–7 µL
Endvolumen aus mRNA + Transfektionsreagenz in Opti-MEM	50 µL	200 µL

Tabelle 3: Empfohlene Transfektionsparameter für die hTERT-mRNA-Übertragung in 6-Well- und 12-Well-Kulturformaten. Zellansaatdichten, mRNA-Mengen, Volumina des Transfektionsreagenz und Volumina zur Komplexbildung, die bei Vorwärts- und Rückwärts-Transfektionsexperimenten verwendet werden, sind zusammengefasst.

Zusatzabbildung 1: Wirkung von Chloroquin und Y-27632 auf die seneszenzassoziierte Expression von p16 und p21 nach wiederholter reverser Transfektion mit hTERT-mRNA. (AQuantitative RT-PCR-Analyse der p16-mRNA-Expression in mock-behandelten und 3× hTERT rückwärtstransfizierte (RT) LF1-Fibroblasten nach Behandlung mit Chloroquin (CQ), Y-27632 oder der Kombination beider, wie angegeben.B) Quantitative RT-PCR-Analyse der p21-mRNA-Expression unter denselben experimentellen Bedingungen. Die Transkriptmengen wurden auf RpL13a normalisiert und im Verhältnis zu jungen Kontrollzellen (PD#12) angegeben. Jeder Datenpunkt repräsentiert biologische Wiederholungen. Die Daten zeigen Mittelwerte ± SD aus n = 2 biologischen Wiederholungen mit jeweils 5 technischen Wiederholungen pro biologischer Wiederholung. Die statistische Signifikanz ist in der Abbildung angegeben; ns, nicht signifikant. *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0,0001, wie durch Brown-Forsythe- und Welch-ANOVA bestimmt. Abkürzungen: CQ, Chloroquin; RT, reverse Transfektion; Y-27632, Rho-assoziierte Proteinkinase (ROCK)-Inhibitor.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 1: DNA- und Proteinsequenzen von hTERT-Expressionskonstrukten.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 2: Berechnung der Bevölkerungsverdopplung (PD). Die Bevölkerungsverdopplungen (PD) wurden mit der Formel PD = log₂ (Nf/N₀) berechnet, wobei N₀ die Anzahl der ausgesäten Zellen und Nf die Anzahl der gewonnenen lebensfähigen Zellen ist. Die kumulative PD wurde durch Summierung der PD-Werte über alle Passagen hinweg bestimmt.Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Diese Studie betrachtet zelluläre Seneszenz als eigenständiges Problem der Substanzabgabe und nicht als geringfügige Variante der proliferativen Physiologie, und entwickelt eine auf die biophysikalischen und immunologischen Gegebenheiten des seneszenten Zustands zugeschnittene Transfektionsstrategie mittels Telomerase-mRNA. Seneszente Zellen weisen versteifte, cholesterolreiche Membranen und eine verminderte endozytotische Aktivität auf, was eine erhebliche Hürde für eine effiziente Nukleinsäureabgabe darstellt. Durch Anwendung eines Reverse-Transfektionsansatzes nutzt dieses Protokoll die vorübergehende Adhäsionsphase aus, in der seneszente Zellen eine Umgestaltung ihrer Membran durchlaufen und eine erhöhte Membranplastizität zeigen, wodurch der Kontakt zwischen Zelle und Komplex mit einer Phase verbesserter Aufnahmefähigkeit synchronisiert wird^3,4. Repräsentative Ergebnisse zeigen, dass diese Strategie die Abgabe und Expression von hTERT-modRNA im Vergleich zur konventionellen Vorwärts-Transfektion verbessert, was zu einer stärkeren Verlängerung der Telomere und ausgeprägteren mit Rejuvenation assoziierten Phänotypen führt.

Ein zentrales Merkmal der Methode ist eine mehrschichtige mRNA-Engineering-Strategie, die darauf abzielt, drei wesentliche Barrieren in seneszenten Zellen zu überwinden: erhöhte angeborene Immunsignale, verstärkten RNA-Abbau und eingeschränkte Translationskapazität^23,24,25. Die Einbindung von Pseudouridin und 5-Methylcytidin verringert die Aktivierung der TLR3-, TLR7/8- und RIG-I-Signalwege, während gleichzeitig die Transkriptstabilität und Translationswirksamkeit verbessert werden^13,26. ARCA-Kappung und Optimierung des Poly(A)-Schwanzes tragen zusätzlich zur Stabilisierung des Transkripts und zur Steigerung der Translationseffizienz bei und ermöglichen so eine starke, aber vorübergehende Expression von hTERT. In Übereinstimmung mit früheren Studien unterstützen diese Modifikationen eine effiziente Telomerase-Expression, während sie die mit der exogenen RNA-Übertragung assoziierte Aktivierung des angeborenen Immunsystems minimieren.

Das Protokoll berücksichtigt außerdem die RNase-reiche extrazelluläre Umgebung, die für seneszente Kulturen charakteristisch ist²⁷. Der Schutz der RNA wird durch Nukleosidmodifikation, die Bildung von Lipidkomplexen und die unmittelbare Zugabe eines RNase-Inhibitors vor der Transfektion verbessert. Zusätzlich wird der Zeitpunkt der Revers-Transfektion an die langsamere Anheftungskinetik seneszenter Zellen angepasst, wodurch eine längere Interaktion zwischen den Zellen und den mRNA-Lipid-Komplexen während der Zelladhäsion ermöglicht wird. Diese Modifikationen erhöhen gemeinsam die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Aufnahme des Cargos in einer Zellpopulation, die ansonsten schwer zu transfizieren ist.

Der endosomale Ausbruch stellt eine zweite entscheidende Engstelle für die mRNA-Übertragung in seneszenten Zellen dar. Seneszente Zellen weisen einen erhöhten lysosomalen Gehalt sowie eine verstärkte Weiterleitung endozytisch aufgenommener Substanzen zu degradierten Kompartimenten auf^17,28. Eine vorübergehende Behandlung mit Chloroquin während der frühen posttransfektionalen Phase verbessert die funktionelle Übertragung, indem sie den endosomalen Ausbruch fördert und den lysosomalen Abbau der internalisierten mRNA verringert. Obwohl die optimale Dosis und Einwirkdauer je nach Zelltyp variieren können, zeigen die hier vorgestellten Ergebnisse, dass die Verbesserung des endosomalen Ausbruchs die Übertragungseffizienz in seneszenten Fibroblasten erheblich steigert.

Auf funktioneller Ebene führte die wiederholte Gabe von hTERT-ModRNA zu kumulativen Zunahmen der relativen Telomerlänge, verlängerte die replikative Lebensdauer und verringerte mehrere mit der Seneszenz assoziierte Phänotypen. Zellen, die wiederholt mit hTERT behandelt wurden, wiesen eine verminderte SA-β-Gal-Aktivität, eine reduzierte Expression von p16 und p21, eine erhöhte Ki67-Expression sowie eine verbesserte proliferative Kapazität im Vergleich zu Mock-transfizierten Kontrollen auf. Wichtig ist, dass die Telomeraseaktivität vorübergehend blieb und innerhalb weniger Tage nach der Transfektion wieder auf nahezu Ausgangswerte zurückkehrte. Dieses vorübergehende Expressionsprofil vermeidet eine dauerhafte genetische Modifikation, liefert aber dennoch ausreichend Telomeraseaktivität, um messbare biologische Effekte hervorzurufen. Es sollte jedoch beachtet werden, dass relative Telomerlängenmessungen mittels MMqPCR keine direkte Quantifizierung einer absoluten Telomerverlängerung ermöglichen. Zukünftige Studien, die die Analyse terminaler Restriktionsfragmente, quantitative fluoreszenzbasierende in-situ-Hybridisierung, Flow-FISH oder TeSLA-Methoden einbeziehen, werden eine präzisere Beurteilung der Telomerlängendynamik nach der Gabe von hTERT-mRNA ermöglichen.

Mehrere Einschränkungen verdienen Beachtung. Seneszente Zellpopulationen sind von Natur aus heterogen und können je nach Methode der Seneszenzinduktion, Spenderquelle und Kulturgeschichte unterschiedlich auf die mRNA-Übertragung ansprechen. Folglich können sich die Transfektionseffizienz und die Ergebnisse der Verjüngung zwischen experimentellen Systemen unterscheiden. Darüber hinaus befasst sich die Reaktivierung der Telomerase hauptsächlich mit den telomerabhängigen Aspekten des zellulären Alterns und korrigiert nicht direkt alle Merkmale der Seneszenz. Alterungsassoziierte Veränderungen wie epigenetische Drift, mitochondriale Dysfunktion, veränderte Proteostase und chronische entzündliche Signalgebung können trotz erfolgreicher Verlängerung der Telomere bestehen bleiben^29,30. Daher sollte dieses Protokoll als gezieltes Werkzeug zum Studium und teilweisen Umkehren telomergetriebener Seneszenz betrachtet werden, nicht jedoch als umfassende Verjüngungsstrategie.

Die in diesem Protokoll beschriebenen Parameter dienen als praktische Richtlinien für seneszente humane Zellen und wurden durch schrittweise Optimierung unter Berücksichtigung veröffentlichter Studien und experimenteller Erfahrungen entwickelt. Faktoren wie Zelldichte, Verhältnis von Transfektionsreagenz zu mRNA, Komplexbildungszeit und Bedingungen des endosomalen Ausstiegs müssen möglicherweise an einzelne Zelltypen und experimentelle Bedingungen angepasst werden. Die angegebenen Bedingungen sollten daher als Ausgangspunkt für die Optimierung und nicht als universell anwendbare Endpunkte betrachtet werden.

Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen reproduzierbaren Rahmen zur gezielten Abgabe modifizierter hTERT-mRNA in seneszente humane Zellen mittels einer Reverse-Transfektionsstrategie, die an die physiologischen Eigenschaften der Seneszenz angepasst ist. Der Ansatz ermöglicht eine vorübergehende Reaktivierung der Telomerase, messbare Verlängerung der Telomere, eine Ausdehnung der replikativen Lebensdauer sowie eine teilweise Umkehr seneszenzassoziiierter Phänotypen. Künftige Studien sollten die Anwendbarkeit dieser Strategie auf weitere seneszente Zelltypen überprüfen, Kombinationsansätze mit komplementären Verjüngungsinterventionen untersuchen und die Übertragung auf in vivo-Abgabesysteme erforschen. Damit stellt diese Methode ein wertvolles Werkzeug zur Erforschung der Telomerbiologie, zellulärer Verjüngung und der Mechanismen der Seneszenz in der Alternsforschung dar.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ham's F-10 Nährstoffmischung	Thermo Fisher	11550043	Zellkulturmedium.
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA-Cap-Struktur-Analogon	New England Biolab	S1411L	Bei den meisten RNAs erhöht die Cap-Struktur die Stabilität, verringert die Anfälligkeit für Exonuklease-Abbau und fördert die Bildung von mRNA-Initiationskomplexen.
5-Methyl-Cytidin-5´-Triphosphat (5-Methyl-CTP)	New England Biolab	N0432S	Modifizierte NTPs werden häufig zur Verringerung der Immunogenität bei in-vitro-Transkriptions-RNAs verwendet.
6-Loch-Platte	Corning	351146	Zum Kultivieren und Behandeln mittlerer bis großer Volumina von adhärenten oder suspendierten Zellen unter unabhängigen experimentellen Bedingungen.
Anti-Ki67-Antikörper (SP6)	abcam	ab16667	Ki67 wird hauptsächlich in proliferierenden Zellen exprimiert.
Cellular Senescence Assay Kit (SA-beta-gal-Färbung)	cellbiolabs	CBA-230	Identifizierung seneszenter Zellen mittels SA-β-Gal-Färbung
DNA LoBind 0,5-ml-Röhrchen	Eppendorf	022431005	Zur effizienten Rückgewinnung von DNA und RNA ohne Verluste
DNA LoBind 1,5-ml-Röhrchen	Eppendorf	22431021	Zur effizienten Rückgewinnung von DNA und RNA ohne Verluste
DNase I, RNase-frei (1 U/μL)	Thermo Fisher	EN0521	DNase I, RNase-frei ist eine Endonuklease, die ein- und doppelsträngige DNA verdaut.
E. coli Poly(A)-Polymerase	New England Biolab	M0276S	In Escherichia coli fungiert Poly(A)-Polymerase I (PAP I) hauptsächlich als Katalysator für die templateunabhängige Anlagerung von Adenosinmonophosphat-(AMP-)Resten an das 3'-Ende von RNA-Molekülen.
Fötales Rinderserum	Thermo Fisher	A5256701	Zusatz für Zellkulturmedien
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit	New England Biolab	E2065S	Der HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (mit Anhängung) dient der schnellen Herstellung von ARCA-gecappten und poly(A)-schwanztragenden mRNA-Molekülen in vitro. Gecappte mRNAs werden durch ko-transkriptionelle Einbindung des Anti-Reverse-Cap-Analogs (ARCA) unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase synthetisiert.
HiScribe T7 mRNA Kit mit CleanCap Reagenz AG	New England Biolab	E2080S	Die HiScribe T7 mRNA Kits mit CleanCap Reagenz AG ermöglichen die schnelle und effiziente Herstellung eines oder mehrerer Transkripte mit typischen Ausbeuten von ≥90 μg pro Reaktion,
LongAmp Hot Start Taq DNA-Polymerase	New England Biolab	M0534S	Die LongAmp Hot Start Taq DNA-Polymerase zeichnet sich durch außergewöhnliche Leistung bei langen Amplifikaten aus.
M-MuLV Reverse Transkriptase	New England Biolab	M0253L	Die M-MuLV Reverse Transkriptase synthetisiert einen komplementären DNA-Strang, ausgehend von einem Primer, wobei entweder RNA (cDNA-Synthese) oder Einzelstrang-DNA als Vorlage dient.
Monarch Spin RNA Cleanup Kit (50 μg)	New England Biolab	T2040L	Die Hauptfunktion des Monarch® Spin RNA Cleanup Kit (50 μg) besteht darin, bis zu 50 μg hochwertige RNA aus enzymatischen Reaktionen oder Extraktionsgemischen zu reinigen und zu konzentrieren.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolab	E2621L	Der NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix ermöglicht die nahtlose Assemblierung mehrerer DNA-Fragmente unabhängig von Fragmentlänge oder Endkompatibilität. Er ist nützlich für die synthetische Biologie sowie für den Ein-Schritt-Klonierung mehrerer Fragmente aufgrund seiner einfachen Handhabung, Flexibilität und des einfachen Master-Mix-Formats.
Opti-MEM – Medium mit reduziertem Serumgehalt	Thermo Fisher	31985070	Zur Maximierung der Transfektionseffizienz während der Bildung von Lipid-Ladungs-Träger-Komplexen. Es dient als optimiertes, chemisch definiertes Umfeld, das die Vitalität von Säugerzellen hoch hält und gleichzeitig den Bedarf an Standardserumzusätzen reduziert.
PBS, pH 7,4	Thermo Fisher	10010023	Die primäre Funktion von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,4 besteht darin, einen stabilen pH-Wert und osmotischen Ausgleich für Säugerzellen und biologische Moleküle aufrechtzuerhalten.
PCR-Streifen	Thermo Fisher	AB0776	Die primäre Funktion von PCR-Streifenröhrchen (üblicherweise im 8- oder 12-Streifen-Format) besteht darin, Reaktionen mit geringen Flüssigkeitsvolumina während des Hochdurchsatz-Thermocyclings zu halten.
Poly-L-Lysin-Hydrobromid	Millipore Sigma	P4707-50ML	Die primäre Funktion von Poly-L-Lysin (PLL)-Hydrobromid zur Zelladhärenz besteht darin, negativ geladene feste Oberflächen (wie Glas oder Kunststoff) zu beschichten, um ein stark haftendes, positiv geladenes Substrat zu erzeugen.
Pseudouridin-5´-Triphosphat (Pseudo-UTP- ΨUTP)	New England Biolab	N0433S	Pseudouridin-5´-Triphosphat (Pseudo-UTP) wird häufig zur Verringerung der Immunogenität bei in-vitro-Transkriptions-RNAs verwendet.
Ribonukleotid-Lösungsset	New England Biolab	N0450L	Vier getrennte Lösungen von ATP, GTP, CTP und UTP
ROCK-Inhibitor Y-27632 (Dihydrochlorid)	Stem cell technologies	72302	Y-27632 ist ein zellpenetrabler, hochpotenter und selektiver Inhibitor der Rho-assoziierten, coiled-coil-haltigen Proteinkinase (ROCK). Y-27632 hemmt sowohl ROCK1 (Ki = 220 nM) als auch ROCK2 (Ki = 300 nM), indem es mit ATP um die Bindung an die katalytische Stelle konkurriert
RT-PCR-Reinstwasser	Thermo Fisher	AM9935	Die primäre Funktion von RT-PCR-Reinstwasser (häufig als nukleasefreies Wasser gekennzeichnet) besteht darin, als ultrareines Lösungsmittel für empfindliche enzymatische Assays zu dienen, bei denen jegliche Kontamination die Probe abbauen oder die Amplifikation hemmen würde.
SUPERase·In RNase-Inhibitor	Thermo Fisher	AM2694	SUPERase In RNase-Inhibitor ist ein proteinbasierter, nichtmenschlichen Ursprungs stammender Inhibitor, der die häufigsten und problematischsten RNasen, einschließlich RNase A, B, C, 1 und T1, nichtkovalent bindet und hemmt.
SYBR Green I Nukleinsäure-Gel-Färbemittel	Thermo Fisher	S7563	Die primäre Funktion des SYBR™ Green I Nukleinsäure-Gel-Färbemittels besteht darin, doppelsträngige DNA (dsDNA) in Agarose- oder Polyacrylamidgelen sichtbar zu machen und zu quantifizieren.
TransIT-mRNA Transfektionskit	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	Ein Transfektionsreagenz mit hoher Effizienz und geringer Toxizität für große RNA-Moleküle
TRAPeze Telomerase-Detektionskit	Millipore Sigma	S7700	Der TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol)-Assay ist eine weit verbreitete und empfindliche PCR-basierte Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung der Telomeraseaktivität in Säugerzellen und Gewebeproben. Er umfasst drei Hauptschritte: die Verlängerung telomerer Wiederholungen durch Telomerase, die Amplifikation dieser Produkte mittels PCR und anschließend die Detektion.
Trypsin-EDTA (0,05 %), Phenolrot	Thermo Fisher	25300054	Zum Ablösen adhärenter Säugerzellen von Kulturgefäßen während des routinemäßigen Zellpassagierens (Subkultivierung) und zur Ernte.