Herstellung dezellularisierter menschlicher peripherer Nerventransplantate unter Verwendung von Natriumhydroxid und Natriumdeoxycholat

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte, alkalische Behandlung unterstützte Dekellularisierungsmethode, die eine Natriumhydroxid-Behandlung mit einem peristaltisch betriebenen Lösungsaustausch-System kombiniert, um dekellularisierte humane periphere Nerven-Transplantate mit effektiver Zellentfernung und Erhaltung der nativen Architektur der extrazellulären Matrix herzustellen.

Zusammenfassung

Verletzungen peripherer Nerven erfordern häufig Transplantationsmaterialien, die eine strukturelle Führung für die axonale Regeneration bieten. Obwohl die autologe Nerventransplantation weiterhin der klinische Goldstandard ist, ist ihr Einsatz durch Spenderstelle-Morbidität und begrenzte Gewebeverfügbarkeit eingeschränkt. Diese Einschränkungen haben das Interesse an dezellularisierten menschlichen peripheren Nerventransplantaten als alternatives Biomaterial für die Nervenregeneration verstärkt. Allerdings können gängige, auf Detergenzien basierende Dezellularisierungsprotokolle die Architektur der extrazellulären Matrix (ECM) stören und zytotoxische Rückstände hinterlassen, die die Transplantatqualität beeinträchtigen können. In diesem Artikel wird ein standardisiertes Protokoll zur Herstellung dezellularisierter menschlicher peripherer Nerventransplantate mithilfe eines alkalibasierten Dezellularisierungsansatzes beschrieben. Das Verfahren beginnt mit einer Natriumhydroxid (NaOH)-Behandlung, um eine effiziente Zellzerstörung zu ermöglichen, gefolgt von einem milden Schritt mit Natrium-Deoxycholat (SDC), der verbleibende zelluläre und immunogene Bestandteile entfernt, während die native ECM-Organisation erhalten bleibt. Diese Strategie begrenzt die Exposition gegenüber Detergenzien und unterstützt gleichzeitig die Erhaltung der nativen ECM-Architektur. Der Arbeitsablauf umfasst die Vorbereitung des Spender-Nervs, eine kontrollierte NaOH-Behandlung, eine anschließende milde SDC-Behandlung sowie eine ausgiebige Spülung unter kontinuierlichem Lösungsaustausch mittels eines peristaltischen Pumpensystems, um die Entfernung von Reststoffen der Verarbeitung zu erleichtern. Weitere nachfolgende Verarbeitungsschritte werden durchgeführt, um die strukturelle Integrität zu bewahren und die Transplantate für die endgültige Verpackung und Sterilisation vorzubereiten. Die Effizienz der Dezellularisierung wird durch histologische Analyse und Quantifizierung des verbleibenden DNA-Gehalts bewertet, und die Erhaltung der ECM-Struktur wird mittels Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Das Fehlen von SDC-Rückständen und die Biokompatibilität der verarbeiteten Transplantate wurden durch Zytotoxizitätstests bestätigt. Dieses Protokoll bietet einen praktischen Ansatz zur Herstellung dezellularisierter menschlicher peripherer Nerventransplantate für die Forschung zur Regeneration peripherer Nerven sowie für translationale Anwendungen.

Einleitung

Verletzungen peripherer Nerven können zu schweren Funktionsstörungen führen und stellen in der regenerativen Medizin und rekonstruktiven Chirurgie weiterhin eine bedeutende klinische Herausforderung dar. Die Regeneration segmentaler Nervendefekte erfordert Transplantatmaterialien, die nicht nur die Verletzungsstelle überbrücken, sondern auch strukturelle Führungsstrukturen und biochemische Signale bereitstellen, um die axonale Regeneration und Reinnervation zu unterstützen. Die autologe Nervenverpflanzung gilt weithin als klinischer Goldstandard, da sie die native Architektur der extrazellulären Matrix (ECM) erhält und ein unterstützendes Mikroumfeld für die Nervenregeneration bietet^1,2. Ihre klinische Anwendung ist jedoch durch die begrenzte Verfügbarkeit von Spendergewebe, die Notwendigkeit zusätzlicher chirurgischer Eingriffe und die Morbidität an der Spenderstelle eingeschränkt^3,4. Diese Einschränkungen haben die Entwicklung alternativer Transplantatmaterialien vorangetrieben, insbesondere von dezellularisierten peripheren Nerventransplantaten, die die native ECM-Architektur beibehalten, während sie immunogene zelluläre Bestandteile minimieren^5,6,7,8.

Die Leistungsfähigkeit von dezellularisierten Nervenverpflanzungen hängt stark vom Dezellularisierungsprozess ab. Herkömmliche Methoden stützen sich typischerweise auf reinebasierte Reagenzien wie Triton X-100 und Natriumdesoxycholat (SDC), die zelluläre Bestandteile entfernen, indem sie Lipidmembranen lösen^9,10,11. Eine längere Exposition gegenüber diesen Reinigungsmitteln kann jedoch die Mikrostruktur der extrazellulären Matrix (ECM) stören und zytotoxische Rückstände hinterlassen, die die Zellviabilität und regenerative Ergebnisse negativ beeinflussen^12,13. Daher werden alternative Dezellularisierungsstrategien intensiv erforscht, die eine effiziente Entfernung von Zellen ermöglichen, während gleichzeitig die Integrität der ECM erhalten bleibt¹⁴. Die alkalische Dezellularisierung mit Natriumhydroxid (NaOH) hat sich als eine mögliche Alternative herauskristallisiert, da extreme pH-Bedingungen zelluläre Bestandteile, Nukleinsäuren und Lipide effizient abbauen können^15,16,17. Dennoch kann eine unkontrollierte Exposition gegenüber starken alkalischen Bedingungen die ECM-Integrität beeinträchtigen, was die Bedeutung präzise kontrollierter Verarbeitungsbedingungen unterstreicht^16,18.

Hier wird ein standardisiertes, alkalibegleitetes Dekellularisierungsprotokoll für humane periphere Nerventransplantate vorgestellt, das ein peristaltisch betriebenes System mit kontinuierlichem Lösungsaustausch integriert. Im Vergleich zu herkömmlichen statischen Tauchmethoden ermöglicht dieser dynamische Prozess einen kontinuierlichen Lösungsaustausch, wodurch die Entfernung zellulärer Trümmer und restlicher Verarbeitungsreagenzien erleichtert wird. Dieser Artikel bietet eine schrittweise visuelle Darstellung des gesamten Arbeitsablaufs, einschließlich der Vorbereitung des Spender-Nervs, der kontrollierten alkalibegleiteten Dekellularisierung und des kontinuierlichen Lösungsaustauschs mithilfe eines peristaltisch betriebenen Systems. Die resultierenden Transplantate wurden mittels histologischer Analyse, Quantifizierung des restlichen DNA-Gehalts und Rasterelektronenmikroskopie (REM) untersucht, um eine effiziente Dekellularisierung sowie die Erhaltung der ECM-Ultrastruktur zu bestätigen. Durch die klare Visualisierung kritischer technischer Schritte bietet dieser Artikel einen genau definierten Rahmen zur Herstellung dezellulierter Nerventransplantate und zur zukünftigen Skalierung des Verfahrens.

Protokoll

Donated human peripheral nerves were obtained from a U.S. tissue bank under an exclusive agreement with L&C BIO and in compliance with the regulations of the American Association of Tissue Banks (AATB) and the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Donor information, including age and sex, medical histories, and serological test results, was provided with the tissues and reviewed and approved by a certified medical director. Upon receipt, all tissues underwent incoming inspection, including verification of donor screening, serological testing, and testing for relevant pathogens; only tissues that met the predefined acceptance criteria were used in this study. All procedures involving human specimens were conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. As no human subjects were directly recruited or involved in this study, a separate Institutional Review Board (IRB) approval number was not issued.

1. Prepare the solutions (Day 1)

1. Prepare 0.25 N sodium hydroxide (NaOH) solution by dissolving 10 g of NaOH in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
2. Prepare 4% sodium deoxycholate (SDC) solution by dissolving 40 g of SDC in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
3. Transfer each prepared solution into sterile glass bottles.
   CAUTION: Handle sodium deoxycholate (SDC) inside a chemical fume hood. Wear appropriate personal protective equipment, including gloves, a laboratory coat, and eye protection, to prevent inhalation and skin contact.

2. Prepare the peripheral nerve segments for decellularization

1. Disinfect the outer surface of the packaged raw peripheral nerve and open the package aseptically.
2. Rinse the peripheral nerve several times with sterile distilled water.
3. Remove residual adipose tissue, connective tissue, unnecessary branches, and damaged nerve tissue using sterile scissors and forceps. Rinse the peripheral nerve again with sterile distilled water.
4. Cut the peripheral nerve into segments measuring 2–5 cm in length. Classify the prepared segments into three length groups: 2–3 cm, >3–4 cm, and >4–5 cm.
   NOTE: Process each length group separately because different IPA, NaOH, and SDC treatment durations are applied according to nerve segment length, as summarized in Table 1.

3. Set up the peristaltic pump system

1. Attach chemically resistant silicone tubing of sufficient length to both ends of the chromatography column.
2. Connect one end of the tubing to the peristaltic pump.
3. Connect the free ends of the tubing to a 1 L glass bottle containing isopropyl alcohol (IPA) using pump tubing to establish a closed-loop circulation system.
   NOTE: Secure all tubing connections firmly, as pressure and vibration from the peristaltic pump may cause the tubing to disconnect from the column or bottle.

4. Delipidize the peripheral nerve

NOTE: Unless otherwise indicated, perform all solution-exchange steps at room temperature (20–25 °C) using a peristaltic pump set to 90–186 mL/min, depending on the tubing configuration. Maintain the selected flow rate constant throughout each processing run.

1. Open one end of the chromatography column and partially fill the column with the IPA solution to ensure that the nerve tissue remains immersed immediately after insertion.
2. Using sterile forceps, gently grasp the outer tissue at one end of a single prepared peripheral nerve segment. Avoid directly compressing or grasping the main body of the nerve. Carefully lower the nerve segment into the solution within the column.
3. Using the forceps, gently straighten the nerve segment and position it longitudinally, parallel to the direction of fluid flow. Ensure that the segment is not folded, coiled, or pressed against the inner wall of the column or the outlet filter.
4. Close the column and position it at a slight upward incline toward the outlet, with the outlet placed slightly higher than the inlet. This orientation helps prevent the nerve segment from settling against either end filter, particularly the outlet filter.
   NOTE: Process one peripheral nerve segment per column per procedure. No additional physical fixation device is required. The natural buoyancy of the nerve tissue and the relatively gentle fluid flow help maintain the segment in a suspended and extended position. Inspect the tissue position during processing and gently reposition it with sterile forceps if it adheres to the column wall, filter, or itself.
5. Connect the IPA solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 1.5 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 2 h for segments measuring >3–4 cm, or 2.5 h for segments measuring >4–5 cm.
6. Drain the solution from the column.
7. Add 40 mL of sterile distilled water to the column. Gently invert or shake the column five times to wash the peripheral nerve.
8. Repeat steps 4.6 and 4.7 for a total of five washes.
9. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
   PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 5.1.
   NOTE: Minimize air bubbles inside the column to promote efficient solution exchange. Adjust the peripheral nerve segment as needed to keep it suspended in the solution and prevent it from adhering to the inner wall of the column or filter.

5. Perform the first decellularization (Day 2)

1. Connect the 0.25 N NaOH solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
2. Drain the solution from the column.
3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
   PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 6.1.

6. Perform the second decellularization (Day 3)

1. Connect the 4% (w/v) SDC solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
2. Drain the solution from the column.
3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
   PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 7.1.

7. Sterilize the decellularized peripheral nerve (Day 4)

1. Remove a small volume of distilled water from the column. Carefully retrieve the decellularized peripheral nerve while keeping it suspended in the remaining liquid.
2. Package the peripheral nerve together with sterile distilled water.
3. Sterilize the packaged peripheral nerve by gamma irradiation at a dose of 25 kGy.
   NOTE: Do not completely drain the distilled water from the column. Keep the nerve segment suspended in a sufficient volume of the remaining liquid to prevent it from adhering to the inner wall of the column and to facilitate gentle handling without allowing the liquid to overflow.

Ergebnisse

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing ...

Diskussion

Diese Studie stellt ein standardisiertes, alkalibasiertes Dekellularisierungsprotokoll zur Herstellung dezellulierter menschlicher peripherer Nerven-Transplantate für die Regeneration peripherer Nerven vor. Das Protokoll integriert eine Vorbehandlung des Spender-Nervs, eine kontrollierte chemische Dekellularisierung und ein peristaltisch betriebenes System zum Austausch der Lösungen in einen klar definierten Arbeitsablauf, wodurch eine effiziente Entfernung zellulärer und immunogener Komponenten ermöglicht wird, während ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
BT100-1L Mehrkanal-Peristaltikpumpe	Längere Pumpe	BT100-1L	Dient zur kontinuierlichen Zirkulation und Lösungsaustausch während der Entfettung, Entzellularisierung und der Waschschritte.
Econo-Column Chromatographiesäule, 2,5 × 10 cm	Bio-Rad	737-2512	Dient zum Halten von peripheren Nervensegmenten während des kontinuierlichen Lösungsaustauschs.
Isopropanol (IPA)	Daejeong Chemicals	5035-4410	Wird zur Entfettung von peripherem Nervengewebe verwendet.
Masterflex Tygon E-LFL Pumpe-Schlauch	Thermo Scientific	06440-16	Dient zum Anschließen der Peristaltikpumpe, der Chromatographiesäule und der Lösungsreservoirs für die kontinuierliche Lösungszirkulation.
Natriumdesoxycholat (SDC)	Sigma-Aldrich	30970-100G	Wird als Detergens im zweiten Entzellularisierungsschritt verwendet, um verbleibende zelluläre Bestandteile zu entfernen.
Natriumhydroxid, NaOH	Duksan	1636	Für die Zerstörung der Zellen.