Methodenartikel

Herstellung dezellularisierter menschlicher peripherer Nerventransplantate unter Verwendung von Natriumhydroxid und Natriumdeoxycholat

22 Ansichten

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DOI:

10.3791/71578

⸱

1. September 2026

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte, alkalische Behandlung unterstützte Dekellularisierungsmethode, die eine Natriumhydroxid-Behandlung mit einem peristaltisch betriebenen Lösungsaustausch-System kombiniert, um dekellularisierte humane periphere Nerven-Transplantate mit effektiver Zellentfernung und Erhaltung der nativen Architektur der extrazellulären Matrix herzustellen.

Zusammenfassung

Verletzungen peripherer Nerven erfordern häufig Transplantationsmaterialien, die eine strukturelle Führung für die axonale Regeneration bieten. Obwohl die autologe Nerventransplantation weiterhin der klinische Goldstandard ist, ist ihr Einsatz durch Spenderstelle-Morbidität und begrenzte Gewebeverfügbarkeit eingeschränkt. Diese Einschränkungen haben das Interesse an dezellularisierten menschlichen peripheren Nerventransplantaten als alternatives Biomaterial für die Nervenregeneration verstärkt. Allerdings können gängige, auf Detergenzien basierende Dezellularisierungsprotokolle die Architektur der extrazellulären Matrix (ECM) stören und zytotoxische Rückstände hinterlassen, die die Transplantatqualität beeinträchtigen können. In diesem Artikel wird ein standardisiertes Protokoll zur Herstellung dezellularisierter menschlicher peripherer Nerventransplantate mithilfe eines alkalibasierten Dezellularisierungsansatzes beschrieben. Das Verfahren beginnt mit einer Natriumhydroxid (NaOH)-Behandlung, um eine effiziente Zellzerstörung zu ermöglichen, gefolgt von einem milden Schritt mit Natrium-Deoxycholat (SDC), der verbleibende zelluläre und immunogene Bestandteile entfernt, während die native ECM-Organisation erhalten bleibt. Diese Strategie begrenzt die Exposition gegenüber Detergenzien und unterstützt gleichzeitig die Erhaltung der nativen ECM-Architektur. Der Arbeitsablauf umfasst die Vorbereitung des Spender-Nervs, eine kontrollierte NaOH-Behandlung, eine anschließende milde SDC-Behandlung sowie eine ausgiebige Spülung unter kontinuierlichem Lösungsaustausch mittels eines peristaltischen Pumpensystems, um die Entfernung von Reststoffen der Verarbeitung zu erleichtern. Weitere nachfolgende Verarbeitungsschritte werden durchgeführt, um die strukturelle Integrität zu bewahren und die Transplantate für die endgültige Verpackung und Sterilisation vorzubereiten. Die Effizienz der Dezellularisierung wird durch histologische Analyse und Quantifizierung des verbleibenden DNA-Gehalts bewertet, und die Erhaltung der ECM-Struktur wird mittels Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Das Fehlen von SDC-Rückständen und die Biokompatibilität der verarbeiteten Transplantate wurden durch Zytotoxizitätstests bestätigt. Dieses Protokoll bietet einen praktischen Ansatz zur Herstellung dezellularisierter menschlicher peripherer Nerventransplantate für die Forschung zur Regeneration peripherer Nerven sowie für translationale Anwendungen.

Einleitung

Verletzungen peripherer Nerven können zu schweren Funktionsstörungen führen und stellen in der regenerativen Medizin und rekonstruktiven Chirurgie weiterhin eine bedeutende klinische Herausforderung dar. Die Regeneration segmentaler Nervendefekte erfordert Transplantatmaterialien, die nicht nur die Verletzungsstelle überbrücken, sondern auch strukturelle Führungsstrukturen und biochemische Signale bereitstellen, um die axonale Regeneration und Reinnervation zu unterstützen. Die autologe Nervenverpflanzung gilt weithin als klinischer Goldstandard, da sie die native Architektur der extrazellulären Matrix (ECM) erhält und ein unterstützendes Mikroumfeld für die Nervenregeneration bietet1,2. Ihre klinische Anwendung ist jedoch durch die begrenzte Verfügbarkeit von Spendergewebe, die Notwendigkeit zusätzlicher chirurgischer Eingriffe und die Morbidität an der Spenderstelle eingeschränkt3,4. Diese Einschränkungen haben die Entwicklung alternativer Transplantatmaterialien vorangetrieben, insbesondere von dezellularisierten peripheren Nerventransplantaten, die die native ECM-Architektur beibehalten, während sie immunogene zelluläre Bestandteile minimieren5,6,7,8.

Die Leistungsfähigkeit von dezellularisierten Nervenverpflanzungen hängt stark vom Dezellularisierungsprozess ab. Herkömmliche Methoden stützen sich typischerweise auf reinebasierte Reagenzien wie Triton X-100 und Natriumdesoxycholat (SDC), die zelluläre Bestandteile entfernen, indem sie Lipidmembranen lösen9,10,11. Eine längere Exposition gegenüber diesen Reinigungsmitteln kann jedoch die Mikrostruktur der extrazellulären Matrix (ECM) stören und zytotoxische Rückstände hinterlassen, die die Zellviabilität und regenerative Ergebnisse negativ beeinflussen12,13. Daher werden alternative Dezellularisierungsstrategien intensiv erforscht, die eine effiziente Entfernung von Zellen ermöglichen, während gleichzeitig die Integrität der ECM erhalten bleibt14. Die alkalische Dezellularisierung mit Natriumhydroxid (NaOH) hat sich als eine mögliche Alternative herauskristallisiert, da extreme pH-Bedingungen zelluläre Bestandteile, Nukleinsäuren und Lipide effizient abbauen können15,16,17. Dennoch kann eine unkontrollierte Exposition gegenüber starken alkalischen Bedingungen die ECM-Integrität beeinträchtigen, was die Bedeutung präzise kontrollierter Verarbeitungsbedingungen unterstreicht16,18.

Hier wird ein standardisiertes, alkalibegleitetes Dekellularisierungsprotokoll für humane periphere Nerventransplantate vorgestellt, das ein peristaltisch betriebenes System mit kontinuierlichem Lösungsaustausch integriert. Im Vergleich zu herkömmlichen statischen Tauchmethoden ermöglicht dieser dynamische Prozess einen kontinuierlichen Lösungsaustausch, wodurch die Entfernung zellulärer Trümmer und restlicher Verarbeitungsreagenzien erleichtert wird. Dieser Artikel bietet eine schrittweise visuelle Darstellung des gesamten Arbeitsablaufs, einschließlich der Vorbereitung des Spender-Nervs, der kontrollierten alkalibegleiteten Dekellularisierung und des kontinuierlichen Lösungsaustauschs mithilfe eines peristaltisch betriebenen Systems. Die resultierenden Transplantate wurden mittels histologischer Analyse, Quantifizierung des restlichen DNA-Gehalts und Rasterelektronenmikroskopie (REM) untersucht, um eine effiziente Dekellularisierung sowie die Erhaltung der ECM-Ultrastruktur zu bestätigen. Durch die klare Visualisierung kritischer technischer Schritte bietet dieser Artikel einen genau definierten Rahmen zur Herstellung dezellulierter Nerventransplantate und zur zukünftigen Skalierung des Verfahrens.

Protokoll

Donated human peripheral nerves were obtained from a U.S. tissue bank under an exclusive agreement with L&C BIO and in compliance with the regulations of the American Association of Tissue Banks (AATB) and the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Donor information, including age and sex, medical histories, and serological test results, was provided with the tissues and reviewed and approved by a certified medical director. Upon receipt, all tissues underwent incoming inspection, including verification of donor screening, serological testing, and testing for relevant pathogens; only tissues that met the predefined acceptance criteria were used in this study. All procedures involving human specimens were conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. As no human subjects were directly recruited or involved in this study, a separate Institutional Review Board (IRB) approval number was not issued.

1. Prepare the solutions (Day 1)

  1. Prepare 0.25 N sodium hydroxide (NaOH) solution by dissolving 10 g of NaOH in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  2. Prepare 4% sodium deoxycholate (SDC) solution by dissolving 40 g of SDC in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  3. Transfer each prepared solution into sterile glass bottles.
    CAUTION: Handle sodium deoxycholate (SDC) inside a chemical fume hood. Wear appropriate personal protective equipment, including gloves, a laboratory coat, and eye protection, to prevent inhalation and skin contact.

2. Prepare the peripheral nerve segments for decellularization

  1. Disinfect the outer surface of the packaged raw peripheral nerve and open the package aseptically.
  2. Rinse the peripheral nerve several times with sterile distilled water.
  3. Remove residual adipose tissue, connective tissue, unnecessary branches, and damaged nerve tissue using sterile scissors and forceps. Rinse the peripheral nerve again with sterile distilled water.
  4. Cut the peripheral nerve into segments measuring 2–5 cm in length. Classify the prepared segments into three length groups: 2–3 cm, >3–4 cm, and >4–5 cm.
    NOTE: Process each length group separately because different IPA, NaOH, and SDC treatment durations are applied according to nerve segment length, as summarized in Table 1.

3. Set up the peristaltic pump system

  1. Attach chemically resistant silicone tubing of sufficient length to both ends of the chromatography column.
  2. Connect one end of the tubing to the peristaltic pump.
  3. Connect the free ends of the tubing to a 1 L glass bottle containing isopropyl alcohol (IPA) using pump tubing to establish a closed-loop circulation system.
    NOTE: Secure all tubing connections firmly, as pressure and vibration from the peristaltic pump may cause the tubing to disconnect from the column or bottle.

4. Delipidize the peripheral nerve

NOTE: Unless otherwise indicated, perform all solution-exchange steps at room temperature (20–25 °C) using a peristaltic pump set to 90–186 mL/min, depending on the tubing configuration. Maintain the selected flow rate constant throughout each processing run.

  1. Open one end of the chromatography column and partially fill the column with the IPA solution to ensure that the nerve tissue remains immersed immediately after insertion.
  2. Using sterile forceps, gently grasp the outer tissue at one end of a single prepared peripheral nerve segment. Avoid directly compressing or grasping the main body of the nerve. Carefully lower the nerve segment into the solution within the column.
  3. Using the forceps, gently straighten the nerve segment and position it longitudinally, parallel to the direction of fluid flow. Ensure that the segment is not folded, coiled, or pressed against the inner wall of the column or the outlet filter.
  4. Close the column and position it at a slight upward incline toward the outlet, with the outlet placed slightly higher than the inlet. This orientation helps prevent the nerve segment from settling against either end filter, particularly the outlet filter.
    NOTE: Process one peripheral nerve segment per column per procedure. No additional physical fixation device is required. The natural buoyancy of the nerve tissue and the relatively gentle fluid flow help maintain the segment in a suspended and extended position. Inspect the tissue position during processing and gently reposition it with sterile forceps if it adheres to the column wall, filter, or itself.
  5. Connect the IPA solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 1.5 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 2 h for segments measuring >3–4 cm, or 2.5 h for segments measuring >4–5 cm.
  6. Drain the solution from the column.
  7. Add 40 mL of sterile distilled water to the column. Gently invert or shake the column five times to wash the peripheral nerve.
  8. Repeat steps 4.6 and 4.7 for a total of five washes.
  9. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 5.1.
    NOTE: Minimize air bubbles inside the column to promote efficient solution exchange. Adjust the peripheral nerve segment as needed to keep it suspended in the solution and prevent it from adhering to the inner wall of the column or filter.

5. Perform the first decellularization (Day 2)

  1. Connect the 0.25 N NaOH solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 6.1.

6. Perform the second decellularization (Day 3)

  1. Connect the 4% (w/v) SDC solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 7.1.

7. Sterilize the decellularized peripheral nerve (Day 4)

  1. Remove a small volume of distilled water from the column. Carefully retrieve the decellularized peripheral nerve while keeping it suspended in the remaining liquid.
  2. Package the peripheral nerve together with sterile distilled water.
  3. Sterilize the packaged peripheral nerve by gamma irradiation at a dose of 25 kGy.
    NOTE: Do not completely drain the distilled water from the column. Keep the nerve segment suspended in a sufficient volume of the remaining liquid to prevent it from adhering to the inner wall of the column and to facilitate gentle handling without allowing the liquid to overflow.

Ergebnisse

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing is shown in Figure 2A. Trimming and segmenting of the nerve were illustrated in Figure 2B–D. After completion of the process, the peripheral nerve maintained its overall morphology without visible structural disruption (Figure 2E).

Histological evaluation of the decellularization is shown in Figure 3. Hematoxylin and eosin (H&E) staining of the native peripheral nerve revealed abundant nuclei, whereas nuclei were largely absent in the decellularized samples (Figure 3A). Quantification of residual DNA, expressed as ng DNA/mg of dry tissue, demonstrated a substantial reduction in DNA content following decellularization (Figure 3B).

Ultrastructural analysis using scanning electron microscopy (SEM) is presented in Figure 4. The fibrous organization of the extracellular matrix (ECM) remained clearly visible after decellularization, indicating preservation of the native ECM architecture (Figure 4).

Assessment of residual detergent and cytocompatibility is shown in Figure 5. Residual SDC levels were minimal following the washing steps (Figure 5A). Cytotoxicity testing showed no significant cytotoxic response in cultured cells exposed to the decellularized peripheral nerve grafts (Figure 5B).

figure-results-1
Figure 1: Schematic workflow for the preparation of decellularized human peripheral nerve grafts. Donated human peripheral nerve segments are first prepared by trimming and segmenting to remove surrounding connective tissue. The nerve segments then undergo delipidization using IPA-based solution exchange (Day 1). Sequential decellularization is performed using NaOH (Day 2) and SDC (Day 3) under continuous solution exchange in a peristaltic pump-driven system. The processed grafts are subsequently packaged and sterilized (Day 4) to obtain decellularized peripheral nerve grafts. Abbreviations: IPA = isopropanol; NaOH = sodium hydroxide; SDC = sodium deoxycholate. Please click here to view a larger version of this figure.

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Figure 2: Representative images of the peripheral nerve processing workflow. (A) Peristaltic pump-driven solution exchange system used for delipidization, decellularization, and washing. (B) Donated human peripheral nerve before trimming. (C) Peripheral nerve during trimming. (D) Peripheral nerve after trimming and segmenting. (E) Peripheral nerve after completion of the entire decellularization process. Please click here to view a larger version of this figure.

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Figure 3: Evaluation of decellularization efficiency. (A) Representative hematoxylin and eosin (H&E)-stained images of native and decellularized human peripheral nerve tissues showing reduced cellular components after decellularization. Scale bars = 100 µm. (B) Quantification of residual DNA content in native and decellularized nerve tissues, expressed as ng DNA/mg of dry tissue. Data are presented as mean ± SD (n = 3). *p < 0.05. Please click here to view a larger version of this figure.

figure-results-4
Figure 4: Scanning electron microscopy (SEM) analysis of nerve microarchitecture. Representative SEM images of native (left) and decellularized (right) human peripheral nerve tissues showing preserved extracellular matrix architecture following the decellularization process. Scale bars = 2 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

figure-results-5
Figure 5: Evaluation of residual detergent and cytotoxicity. (A) Chromatograms of the SDC standard (left) and extracts from decellularized nerve grafts (right) used to assess residual detergent. The red box indicates the region corresponding to the SDC retention time (~3.2 min). (B) Cytotoxicity assessment of extracts from decellularized nerve grafts using L929 fibroblasts following ISO 10993-5 guidelines. Representative images after 48 h incubation show the reagent control, extract from decellularized nerve grafts, negative control, and positive control groups. Scale bars = 50 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Nerve segment length (cm)IPA treatment (h)NaOH treatment (h)SDC treatment (h)
2–31.566
>3–4288
>4–52.51010

Table 1: Length-specific processing durations for peripheral nerve segments within the range evaluated in this study.

Diskussion

Diese Studie stellt ein standardisiertes, alkalibasiertes Dekellularisierungsprotokoll zur Herstellung dezellulierter menschlicher peripherer Nerven-Transplantate für die Regeneration peripherer Nerven vor. Das Protokoll integriert eine Vorbehandlung des Spender-Nervs, eine kontrollierte chemische Dekellularisierung und ein peristaltisch betriebenes System zum Austausch der Lösungen in einen klar definierten Arbeitsablauf, wodurch eine effiziente Entfernung zellulärer und immunogener Komponenten ermöglicht wird, während die native ECM-Architektur erhalten bleibt.

Ein zentrales Merkmal dieser Methode ist die Kombination einer alkalischen Behandlung mit einer reduzierten Detergenzexposition. Herkömmliche, auf Detergenzien basierende Protokolle, wie das Sondell-Verfahren (3 % Triton X-100 und 4 % SDC) und die Hudson-Methode (Sulfobetain-10, Sulfobetain-16 und Triton X-200), setzen auf lang andauernde, mehrstufige Detergenzbehandlungen, um eine wirksame Entzellularisierung zu erreichen9,10. Obwohl diese Ansätze zelluläre Bestandteile effektiv entfernen, kann eine längere Detergenzexposition die Integrität der extrazellulären Matrix (ECM) beeinträchtigen und zu einer zelltoxischen Wirkung durch rückständige Detergenzien beitragen19,20,21. Im Gegensatz dazu verwendet das vorliegende Protokoll NaOH, um die Entfernung zellulärer Komponenten zu verbessern, gleichzeitig aber die SDC-Exposition zu begrenzen, wodurch die gesamte Detergenzbelastung verringert und die Erhaltung der nativen ECM-Architektur gefördert wird.

Ein weiterer kritischer Aspekt dieses Protokolls ist das peristaltisch pumpengestützte System zum Austausch von Lösungen. Im Gegensatz zu Perfusionsverfahren, die einen inneren Druck auf das Gewebe ausüben und das Risiko einer strukturellen Beschädigung bergen21, ermöglicht dieses System einen kontinuierlichen, kontrollierten Austausch der Lösung innerhalb einer Chromatographiesäule. Die Wirksamkeit dieses Ansatzes wird durch mehrere analytische Ergebnisse belegt. Die histologische Analyse und Quantifizierung der verbleibenden DNA bestätigten eine effiziente Entfernung zellulärer Bestandteile, während die REM-Analyse die Erhaltung der nativen ECM-Architektur zeigte. Zusätzlich unterstützten niedrige Restmengen an SDC sowie günstige Ergebnisse zur Zytokompatibilität die Biokompatibilität des resultierenden Transplantats. Insgesamt legen diese Befunde nahe, dass das Protokoll ein Gleichgewicht zwischen effektiver Entzellularisierung und struktureller Erhaltung erreicht.

Mehrere technische Schritte sind entscheidend, um die prozedurale Variabilität zu minimieren und kontrollierte Verarbeitungsbedingungen aufrechtzuerhalten. Erstens ist eine sorgfältige Handhabung des Nervensegments während des Beschneidens, Transfers und Waschens unerlässlich. Peripheres Nervengewebe ist mechanisch empfindlich, und übermäßiger Druck, Faltenbildung oder Zugbelastung können die innere Struktur beschädigen und die Erhaltung der extrazellulären Matrix (ECM) beeinträchtigen19,20. Daher sollte das Gewebe während des gesamten Verfahrens feucht gehalten und schonend behandelt werden. Zweitens ist ein gleichmäßiger Lösungsaustausch innerhalb der Säule ein entscheidender Faktor für die Prozessleistung. Luftblasen innerhalb der Säule sollten minimiert werden, und das Gewebe sollte vollständig in der Lösung eingetaucht und suspendiert bleiben, anstatt an der Säulenwand oder am Filter zu haften. Eine Gewebeadhäsion kann zu einem ungleichmäßigen Lösungsaustausch führen, die Wascheffizienz verringern und eine inkonsistente Exposition gegenüber den Verarbeitungsreagenzien verursachen21,22. Drittens muss das peristaltisch betriebene System während des gesamten Verfahrens stabil arbeiten. Ein kontinuierlicher Durchfluss ist für Delipidisierung, Entzellularisierung und Waschen erforderlich; daher sollten alle Schlauchverbindungen sicher befestigt sein, um ein Lösen durch pumpenbedingten Druck oder Vibrationen zu verhindern. Während der Probengewinnung sollte ein vollständiges Abtropfen der Säule vermieden werden. Die Aufrechterhaltung eines ausreichenden Flüssigkeitsvolumens hilft, Gewebeadhäsion zu verhindern und ermöglicht eine schonende Handhabung während der Sammlung.

Nervensegmente mit einer Länge von 2–3 cm wurden jeweils 1,5, 6 und 6 h mit IPA, NaOH und SDC bearbeitet. Segmentlängen von >3–4 cm wurden jeweils 2, 8 und 8 h bearbeitet, während Segmentlängen von >4–5 cm jeweils 2,5, 10 und 10 h bearbeitet wurden. Somit variierten die Behandlungsdauern zwischen 1,5 und 2,5 h für die Entfettung mit IPA und zwischen 6 und 10 h für jeden Entzellularisierungsschritt. Alle übrigen Verarbeitungsparameter, einschließlich Reagenzkonzentrationen, Lösungsvolumina und Waschverfahren, wurden über alle Längengruppen hinweg konstant gehalten. Abhängig von der Schlauchkonfiguration wurde die Flussrate innerhalb des vorgegebenen Bereichs eingestellt und während jedes Verarbeitungsdurchlaufs konstant beibehalten. Die längenabhängigen Verarbeitungsbedingungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Anpassungen basierend auf Nervendurchmesser, Dicke, faszikulärer Struktur oder zellulärer und matrixbedingter Zusammensetzung wurden nicht systematisch untersucht und erfordern weitere Forschung23,24. Für Hochskalierungsanwendungen könnte ein mehrkanaliges peristaltisches Pumpensystem die Durchsatzleistung verbessern; dabei sollten jedoch die einheitlichen Flussbedingungen über alle Kanäle hinweg sorgfältig überprüft werden, um eine homogene Verarbeitung sicherzustellen.

Es verbleiben mehrere Überlegungen zur weiteren Optimierung. Obwohl dieses Protokoll die gesamte Detergenzbelastung erheblich reduziert, wird SDC dennoch verwendet, und zukünftige Verbesserungen könnten darauf abzielen, die Verwendung von Detergenzien zu minimieren oder zu ersetzen, während gleichzeitig die Effizienz der Entzellerung und die Erhaltung der extrazellulären Matrix (ECM) gewährleistet bleibt25,26. Zusätzlich ist peripheres Nervengewebe aufgrund von Variationen in der fasikulären Struktur, des Durchmessers, der Dicke sowie der zellulären und matrixmäßigen Zusammensetzung von Natur aus schwer standardisierbar23,24. Bei der großtechnischen Herstellung können diese Unterschiede zusammen mit Variationen in der Gewebeladung und den Strömungsbedingungen zur Variabilität von Charge zu Charge beitragen. Die Reproduzierbarkeit zwischen Spendern und zwischen Chargen wurde in der vorliegenden Studie jedoch nicht systematisch evaluiert. Daher werden weitere Validierungen unter Verwendung von Geweben mehrerer Spender und unabhängiger Herstellungschargen notwendig sein, um geeignete Kriterien für die Gewebeakzeptanz festzulegen, die Verfahren zu standardisieren und die Reproduzierbarkeit der Chargen sicherzustellen.

Eine weitere Einschränkung betrifft die Länge des Transplantats. Die regenerative Leistungsfähigkeit nimmt mit zunehmender Transplantatlänge ab, und diese längenabhängige Einschränkung kann bei azellulären Nervenallotransplantaten stärker ausgeprägt sein als bei Autotransplantaten3,27. Da azelluläre Nervenallotransplantate über keine lebensfähigen, ortsansässigen Schwann-Zellen verfügen, ist ihre Fähigkeit zur Unterstützung der axonalen Regeneration auf die Migration und Proliferation von Wirts-Schwann-Zellen angewiesen27. Saheb-Al-Zamani et al. berichteten, dass eine eingeschränkte Regeneration in langen azellulären Nervenallotransplantaten mit einer erhöhten Seneszenz der Schwann-Zellen assoziiert war27.

Trotzdem zeigte eine frühere in vivo-Studie, dass mit NaOH behandelte, dezellularisierte humane Nerventransplantate eine funktionelle und strukturelle Regeneration ermöglichten, die der von Autotransplantaten in einem 15-mm-Defekt des Nervus ischiadicus beim Kaninchen vergleichbar war28. Contreras et al. demonstrierten zudem axonale Regeneration und funktionelle Erholung mittels eines dezellularisierten Nervenallotransplantats über einen 70-mm-Defekt des Nervus peroneus bei Schafen29. Diese Studien untermauern das regenerative Potenzial dezellularisierter Nerventransplantate, obwohl eine weitere Bewertung von Transplantaten, die mit dem vorliegenden Protokoll hergestellt wurden, über klinisch relevante Transplantatlängen hinweg erforderlich ist. Autotransplantate sind außerdem durch die Verfügbarkeit des Spenderervens begrenzt und erfordern ein zusätzliches Gewinnungsverfahren, das zu einem zweiten Operationsort und Morbidität an der Spenderstelle führt4. Acelluläre Nervenallotransplantate könnten daher eine klinisch relevante Alternative darstellen, wenn ausreichend autologes Gewebe nicht verfügbar ist oder die Entnahme des Spenderervens unpraktisch ist.

Zusammenfassend bietet dieses Protokoll einen praktischen und anpassungsfähigen Rahmen zur Herstellung dezellularisierter peripherer Nerven-Transplantate. Der Schwerpunkt auf reduzierter Detergenzexposition, kontrolliertem Lösungsaustausch und Prozessstandardisierung unterstützt sowohl Forschungsanwendungen als auch eine mögliche translationale Nutzung bei der Regeneration peripherer Nerven. Künftige Studien sollten sich auf die weitere Entwicklung detergentfreier Ansätze, die Skalierbarkeit des Systems sowie eine umfassende in vivo-Bewertung der regenerativen Leistung konzentrieren.

Offenlegungen

Die Autoren geben keine Interessenkonflikte an.

Danksagungen

This work was supported by the Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) grant funded by the Korea Government (MOTIE) (P0011947, Korea-Czech Bilateral Co-funding R&D Projects).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BT100-1L Mehrkanal-PeristaltikpumpeLängere PumpeBT100-1LDient zur kontinuierlichen Zirkulation und Lösungsaustausch während der Entfettung, Entzellularisierung und der Waschschritte.
Econo-Column Chromatographiesäule, 2,5 × 10 cmBio-Rad737-2512Dient zum Halten von peripheren Nervensegmenten während des kontinuierlichen Lösungsaustauschs.
Isopropanol (IPA)Daejeong Chemicals5035-4410Wird zur Entfettung von peripherem Nervengewebe verwendet.
Masterflex Tygon E-LFL Pumpe-SchlauchThermo Scientific06440-16Dient zum Anschließen der Peristaltikpumpe, der Chromatographiesäule und der Lösungsreservoirs für die kontinuierliche Lösungszirkulation.
Natriumdesoxycholat (SDC)Sigma-Aldrich30970-100GWird als Detergens im zweiten Entzellularisierungsschritt verwendet, um verbleibende zelluläre Bestandteile zu entfernen.
Natriumhydroxid, NaOHDuksan1636Für die Zerstörung der Zellen.

Referenzen

  1. Kornfeld T, Vogt PM, Radtke C. Nerve grafting for peripheral nerve injuries with extended defect sizes. Wien Med Wochenschr. 2019;169(9):240-251.
  2. Siemionow M, Brzezicki G. Current techniques and concepts in peripheral nerve repair. Int Rev Neurobiol. 2009;87:141-172.
  3. Hoben GM, et al. Increasing nerve autograft length increases senescence and reduces regeneration. Plast Reconstr Surg. 2018;142(4):952-963.
  4. Gaudin R, et al. Approaches to peripheral nerve repair: Generations of biomaterial conduits yielding to replacing autologous nerve grafts in craniomaxillofacial surgery. Biomed Res Int. 2016;2016:3856262.
  5. Lans J, et al. A systematic review and meta-analysis of nerve gap repair: Comparative effectiveness of allografts, autografts, and conduits. Plast Reconstr Surg. 2023;151(5):814e-827e.
  6. Huang H, et al. A comparative study of acellular nerve xenografts and allografts in repairing rat facial nerve defects. Mol Med Rep. 2015;12(4):6330-6336.
  7. Rana D, et al. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 2017;11(4):942-965.
  8. Zhang Y, et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2010;31(20):5312-5324.
  9. Sondell M, Lundborg G, Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction. Brain Res. 1998;795(1-2):44-54.
  10. Hudson TW, et al. Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration. Tissue Eng. 2004;10(11-12):1641-1651.
  11. Rinker B, et al. Use of processed nerve allografts to repair nerve injuries greater than 25 mm in the hand. Ann Plast Surg. 2017;78(6 Suppl):S292-S295.
  12. Zvarova B, et al. Residual detergent detection method for nondestructive cytocompatibility evaluation of decellularized whole lung scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 2016;22(5):418-428.
  13. Fox DA, Epstein ML, Bass P. Surfactants selectively ablate enteric neurons of the rat jejunum. J Pharmacol Exp Ther. 1983;227(2):538-544.
  14. Singh G, et al. Impact of various detergent-based immersion and perfusion decellularization strategies on the novel caprine pancreas derived extracellular matrix scaffold. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1253804.
  15. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006;27(19):3675-3683.
  16. Tsuchiya T, et al. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 2014;20(12):1028-1036.
  17. Sengyoku H, et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 2018;14(2):94-106.
  18. Jones EM, Cochrane CA, Percival SL. The effect of pH on the extracellular matrix and biofilms. Adv Wound Care (New Rochelle). 2015;4(7):431-439.
  19. Nieto-Nicolau N, et al. Effective decellularization of human nerve matrix for regenerative medicine with a novel protocol. Cell Tissue Res. 2021;384(1):167-177.
  20. Philips C, et al. Qualitative and quantitative evaluation of a novel detergent-based method for decellularization of peripheral nerves. Ann Biomed Eng. 2018;46(11):1921-1937.
  21. Wüthrich T, et al. Development of vascularized nerve scaffold using perfusion-decellularization and recellularization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;117:111311.
  22. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011;32(12):3233-3243.
  23. Hopf A, et al. Optimized decellularization protocol for large peripheral nerve segments: Towards personalized nerve bioengineering. Bioengineering (Basel). 2022;9(9):412.
  24. Penkert G. Anatomy of the peripheral nerve system. In: Focal Peripheral Neuropathies: Imaging, Neurological, and Neurosurgical Approaches. Springer; 2014:3-9.
  25. Vasudevan S, et al. Detergent-free decellularized nerve grafts for long-gap peripheral nerve reconstruction. Plast Reconstr Surg Glob Open. 2014;2(8):e201.
  26. García-García ÓD, et al. Comprehensive ex vivo and in vivo preclinical evaluation of novel chemoenzymatic decellularized peripheral nerve allografts. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1162684.
  27. Saheb-Al-Zamani M, et al. Limited regeneration in long acellular nerve allografts is associated with increased Schwann cell senescence. Exp Neurol. 2013;247:165-177.
  28. Kim S, et al. Enhancing peripheral nerve regeneration through NaOH-based decellularization of human nerve tissue. Bioeng Transl Med. 2025;10(6):e70072.
  29. Contreras E, et al. Repair of long nerve defects with a new decellularized nerve graft in rats and in sheep. Cells. 2022;11(24):4074.

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