Herstellung eines vertikal gestapelten Dentin-Pulpa-Komplex-Organ-on-a-Chip-Geräts unter Verwendung einer menschlichen Dentinscheibe

Zusammenfassung

Beschreibung der Herstellung und Zusammenstellung eines vertikal gestapelten Dentin-Pulpa-Komplexes auf einem Organ-auf-einem-Chip-Gerät, das eine humane Dentinscheibe und mittels Photolithographie hergestellte Mikrokanäle umfasst, gefolgt von der Besiedlung und Kultivierung mit dentalen Pulpastammzellen.

Zusammenfassung

Konventionelle präklinische Modelle, die in der zahnmedizinischen Forschung verwendet werden, einschließlich Tiermodelle und statischer Zellkulturen, weisen wichtige Einschränkungen bei der Reproduktion der physiologischen Bedingungen der Dentin-Pulpa-Grenzfläche sowie bei der Vorhersage menschlicher biologischer Reaktionen auf zahnmedizinische Biomaterialien auf. Die Organ-auf-einem-Chip-(OoC)-Technologie bietet einen alternativen Ansatz, indem sie die Rekonstruktion gewebespezifischer Mikroumgebungen in kontrollierten mikrofluidischen Systemen ermöglicht. Diese Arbeit beschreibt ein schrittweises Protokoll zur Herstellung und Montage eines Dentin-Pulpa-Komplex-OoC-Geräts, das eine humane Dentinscheibe in einer dreischichtigen polydimethylsiloxanbasierten (PDMS) mikrofluidischen Plattform integriert. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung der Dentinscheibe, die Herstellung mikrostrukturierter Formen mittels Photolithographie, das Gießen und Aushärten von PDMS, die plasmagestützte Verbindung der Schichten, die Gerätemontage, die Dichtheitsprüfung sowie die Besiedlung mit dentalen Pulsastammzellen unter statischen Kulturbedingungen. Kritische Herstellungsparameter, die die Geräteleistung beeinflussen, werden erörtert, darunter die Kontrolle der PDMS-Schichtdicke, die Plasmabehandlung der Oberfläche und die Integration der Dentinscheibe in das Gerät, um Leckagen zu minimieren. Die Zelladhäsion und -viabilität innerhalb des Geräts wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie und konfokaler Live/Dead-Färbung evaluiert. Beispiele für Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Integration der Dentinscheibe in die mikrofluidische Anordnung, die Aufrechterhaltung dichter Bedingungen sowie die Adhäsion vitaler dentaler Pulsastammzellen an der Dentinoberfläche. Dieses Protokoll stellt einen reproduzierbaren Ansatz zur Herstellung einer Dentin-Pulpa-Komplex-OoC-Plattform bereit, der zukünftige Untersuchungen zu zellulären Reaktionen auf zahnmedizinische Biomaterialien und mikroumgebungsbedingte Reize unterstützen könnte.

Einleitung

Die Tierversuchsforschung hat seit Langem maßgeblich zum Verständnis pathologischer und physiologischer Prozesse beigetragen und spielte eine zentrale Rolle in den frühen Phasen der Arzneimittelentwicklung¹. Im Laufe des 20. Jahrhunderts stieg die menschliche Lebenserwartung deutlich an, und obwohl nicht exakt quantifiziert werden kann, inwieweit diese Verbesserung allein auf Tierversuche zurückzuführen ist, wird allgemein anerkannt, dass viele moderne medizinische Therapien mithilfe von Tiermodellen entwickelt oder validiert wurden². Zu den bemerkenswerten Beispielen zählen die Entwicklung von Impfstoffen gegen Poliomyelitis, Masern und Hepatitis B, die Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von Penicillin sowie die Herstellung von Insulin. Im Bereich der zahnmedizinischen und biomaterialwissenschaftlichen Forschung waren diese Modelle entscheidend, um den Kariesprozess, die Biologie und Regeneration des Dentin-Pulpa-Komplexes sowie die Physiopathologie des parodontalen Gewebes zu untersuchen^3,4.

Trotz der umfangreichen Anwendung dieser Methoden weist die derzeitige Arzneimittelentwicklungs-Pipeline weiterhin hohe Fehlerraten auf, wobei viele Wirkstoffkandidaten in klinischen Studien scheitern, obwohl sie in präklinischen Laboruntersuchungen und Tiermodellen Wirksamkeit und Sicherheit gezeigt haben⁵. Diese Diskrepanz wird auf artspezifische Unterschiede zurückgeführt, die die übertragbare Vorhersagbarkeit von Tiermodellen aufgrund anatomischer, genetischer und physiologischer Differenzen zwischen den Arten einschränken können⁶. Zudem bleibt die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze zeitaufwändig und kostspielig⁷. Herkömmliche In-vitro-Modelle verwenden zudem überwiegend vereinfachte zweidimensionale (2D) Monolayer-Kulturen auf nichtphysiologischen Kunststoffuntergründen und können dadurch die biochemischen und physikalischen Reize, Zell-Zell-Interaktionen sowie die Signale der extrazellulären Matrix (ECM), wie sie in der menschlichen Mundhöhle vorkommen, nicht adäquat nachbilden^8,9. Obwohl 2D-Modelle bestimmte experimentelle Vorteile bieten, sind sie grundsätzlich nicht in der Lage, die komplexen Wechselwirkungen zwischen mehreren Komponenten gleichzeitig nachzuvollziehen, wie etwa Biofilme, Biomaterialien, Dentin und Pulpa-Zellen¹⁰. Folglich steigt das Interesse an der Entwicklung alternativer experimenteller Plattformen, die menschliche biologische Reaktionen genauer reproduzieren können. Im Jahr 2022 hob der FDA Modernization Act 2.0 die verpflichtende Tierversuchsanforderung im Zulassungsverfahren für Arzneimittel auf und anerkannte das Potenzial alternativer Plattformen, einschließlich Organ-auf-einem-Chip-(OoC-)Technologien, in der präklinischen Forschung¹¹.

Ein Organ-auf-einem-Chip (OoC) ist ein mikrofluidisches Gerät, das entwickelt wurde, um die Struktur, Funktion und Mikroumgebung einer bestimmten Organkomponente oder Gewebekomponente nachzubilden¹². Diese Geräte enthalten lebende Zellen und Gewebe, die in konstruierten Mikrokanälen kultiviert werden und wesentliche Aspekte der physiologischen Mikroumgebung replizieren, der Zellen in ihrer natürlichen Umgebung ausgesetzt sind. Über die strukturelle Nachbildung hinaus ermöglichen Mikrokanäle eine räumlich-zeitliche Kontrolle über die zelluläre Umgebung und unterstützen die Aufrechterhaltung gewebespezifischer Funktionen, wodurch experimentelle Bedingungen bereitgestellt werden, die der in-vivo-Physiologie möglicherweise näherkommen als konventionelle Kultursysteme¹². Von besonderer Bedeutung ist, dass Mikrokanäle in OoC-Geräten den kontrollierten Durchfluss des Kulturmediums ermöglichen, der Scherkräfte auf die angesiedelten Zellen ausübt¹³. Diese mechanischen Reize beeinflussen zelluläre Reaktionen wie Adhäsion, Proliferation, Migration, Genexpression und Zell-Zell-Interaktionen^14,15. Zusätzlich trägt der kontinuierliche Mediumfluss durch die Zufuhr von Nährstoffen und den Abtransport metabolischer Abfallprodukte zur Aufrechterhaltung der Mikroumgebung bei¹⁶. Darüber hinaus wurde berichtet, dass einige OoC-Plattformen im Vergleich zu konventionellen zweidimensionalen (2D) Kulturen eine verbesserte Kontrolle über parameterbezogene Auslesungen im Zusammenhang mit oxidativem Stress ermöglichen, einschließlich intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies und Zellviabilität, in dreidimensionalen (3D) on-chip-Modellen¹⁷. OoC-Systeme haben sich daher als vielversprechende Plattformen zur Untersuchung der Gewebephysiologie, von Biomaterial-Interaktionen und Krankheitsprozessen unter kontrollierten experimentellen Bedingungen etabliert¹⁸. In der zahnmedizinischen Forschung wurde die OoC-Technologie zunehmend zur Modellierung komplexer oraler Gewebeübergänge eingesetzt¹⁹. Frühe Zahn-auf-einem-Chip-Plattformen ahmten die Grenzfläche zwischen Biomaterial, Dentin und Pulpa nach²⁰, während fortgeschrittenere Versionen seitdem Gefäßstrukturen und trigeminale Innervation integriert haben, um die strukturelle und funktionelle Komplexität des Pulpa-Dentin-Komplexes realistischer abzubilden²¹. Über die Pulpa hinaus haben dreidimensionale Modelle unreifer Wurzelkanäle die Beurteilung von endodontischen Spüllösungen und angiogenetischem Auswachsen an Stammzellen der apikalen Papille ermöglicht^22,23. Auf der parodontalen Ebene wurden Zahnfleisch-auf-einem-Chip-Plattformen verwendet, um Wirt-Mikrobe-Interaktionen zu untersuchen und das immunmodulatorische Potenzial von Probiotika als therapeutische Wirkstoffe zu bewerten²⁴, während Parodontalband-auf-Chip-Geräte gezeigt haben, wie der interstitielle Flüssigkeitsstrom die Bildung vaskulärer Netzwerke und die osteogene Differenzierung von Parodontalband-Stammzell-Sphäroiden moduliert^25,26. Ergänzend zu diesen Modellen haben spezialisierte orale Mukosa-auf-einem-Chip- und Dentalimplantat-auf-einem-Chip-Systeme den Anwendungsbereich der zahnmedizinischen mikrofluidischen Forschung erweitert, indem sie Wirt-Material-Interaktionen sowie die Zytotoxizität von dentalen Monomeren unter physiologisch relevanten Bedingungen charakterisiert haben^27,28.

Während OoC-Systeme zunehmend in der zahnmedizinischen, oralen und kraniofazialen Forschung eingesetzt werden, bleibt die Weiterentwicklung hin zu Standardisierung und Reproduzierbarkeit der Herstellungsabläufe von großer Bedeutung. In der Literatur wurden bereits mehrere Zahn-auf-einem-Chip-Modelle beschrieben^20,29,30,31, die unterschiedliche Gerätekonfigurationen und experimentelle Anwendungen aufweisen. Unterschiede in der Gerätearchitektur, den Herstellungsverfahren, der Einbindung von Dentin sowie der Angabe experimenteller Parameter können jedoch die Reproduzierbarkeit und direkten Vergleich zwischen Studien einschränken. Insbesondere Abweichungen in der Geometrie der Mikrokanäle, den Strategien zur Integration von Dentin und den verwendeten Fertigungsmethoden können das biologische und mechanische Mikromilieu innerhalb des Geräts beeinflussen. Einige beschriebene Modelle integrieren Dentin, um Aspekte der Dentin-Pulpa-Grenzfläche nachzubilden^20,29,30, während andere alternative Konfigurationen verwenden³¹. Zudem weisen Herstellungsverfahren wie die Photolithographie, Laserschneiden, Mikrofräsen und 3D-Druck jeweils spezifische Vor- und Nachteile auf, abhängig vom geplanten Gerätedesign und der Anwendung. Ein weiterer entscheidender Faktor für die biologische Eignung ist die architektonische Ausrichtung des Geräts, insbesondere, ob die Kanäle und die Dentinscheibe in horizontaler oder vertikaler Anordnung vorliegen^19,32. Bei horizontal gestapelten Konfigurationen ermöglichen nebeneinander angeordnete Kompartimente eine laterale Kompartimentalisierung und die Echtzeit-Visualisierung von Zellen, wodurch sie sich besonders gut zur Modellierung von Geweben mit inhärent lateraler räumlicher Organisation eignen, wie beispielsweise dem parodontalen Komplex^24,32. Diese Bauform ist jedoch prinzipiell begrenzt, was die Nachbildung senkrechter biologischer Grenzflächen betrifft, wie etwa des Biomaterial-Dentin-Pulpa-Komplexes, da die laterale Anordnung der Kompartimente die in-vivo-Orientierung der Dentinbarriere zwischen Kavität und Pulpa nicht genau widerspiegelt^20,32. Vertikal gestapelte Konfigurationen beheben diese Einschränkungen, indem sie zwei Kompartimente entlang der y-Achse übereinander anordnen, getrennt durch eine native Dentinscheibe, wodurch gleichzeitig der molekulare Transport durch intaktes Dentin quantifiziert und die Reaktionen der Pulpa-Zellen in Echtzeit über das Ablaufmedium überwacht werden können³⁰. Eine bekannte Einschränkung dieser Anordnung betrifft jedoch die Querschnittsbildgebung der Dentin-Zell-Grenzfläche, da die Aufnahme von Querschnittsbildern der Dentin-Zell-Grenzfläche innerhalb derselben Fokusebene technisch anspruchsvoller ist als bei horizontal gestapelten Konfigurationen, bei denen Zellen und extrazelluläre Matrizes lateral angeordnet sind. Obwohl mehrere Dentin-Pulpa-Komplex-auf-einem-Chip-Modelle in der Literatur beschrieben wurden, verwenden die meisten eine horizontal gestapelte Konfiguration, bei der die Kompartimente innerhalb derselben Ebene nebeneinander liegen^10,20,21,29, während vergleichsweise wenige eine native Dentinscheibe in einer vertikal gestapelten Anordnung integriert haben³⁰. Dennoch behindern weiterhin Unterschiede in den Herstellungsansätzen und der Angabe von Parametern zwischen diesen Modellen die Reproduzierbarkeit und den Vergleich über verschiedene Studien hinweg³³. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, die methodische Reproduzierbarkeit zu verbessern, indem ein detailliertes Herstellungsprotokoll für ein vertikal gestapeltes Zahn-auf-einem-Chip-Gerät bereitgestellt wird, um so die breitere Anwendung dieser Plattform innerhalb der zahnmedizinischen Forschungsgemeinschaft zu fördern.

Diese Arbeit beschreibt eine schrittweise Herstellungs- und Montageanleitung für ein vertikal gestapeltes Dentin–Pulpa-Komplex-OoC-Gerät, das eine humane Dentinscheibe in einer dreischichtigen polydimethylsiloxanbasierten (PDMS) mikrofluidischen Plattform enthält, die mittels einer photolithographisch hergestellten Form gefertigt wird. Die Anleitung beschreibt außerdem das Ansäen und die Kultivierung von dentalen Pulsastammzellen innerhalb des Geräts unter statischen Bedingungen.

Protokoll

Die Studie wurde gemäß der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von dem Ethikkomitee der Universidad de La Frontera für Studien mit menschlichen Proben genehmigt.

1. Beschaffung der Dentinscheibe

HINWEIS: Bereiten Sie das Gerätedesign vor, bevor Sie mit dem Protokoll beginnen (Abbildung 1A–1C).

1. Sammlung und Lagerung von Zähnen
   1. Gesunde humane Molaren oder Prämolaren nach Einholung der informierten Zustimmung des Patienten sammeln.
   2. Alle Proben in einer 0,5%igen Chloraminlösung bei 4 °C lagern, um eine Dehydrierung des Dentins und eine Denaturierung von Proteinen zu verhindern.
   3. Die Chloraminlösung wöchentlich während der Lagerung erneuern.
2. Herstellung von Dentinscheiben
   1. Jeden Zahn mithilfe eines Hochgeschwindigkeitsinstrumentes, das mit 350.000 U/min betrieben wird und mit einem zylindrischen Diamantfräser (1 mm Durchmesser; Körnung 100–150 µm) ausgestattet ist, horizontal im mittleren Drittel der Krone abschneiden.
   2. Den Schnittvorgang unter kontinuierlicher Wasserirrigation mit etwa 50 mL/min durchführen.
   3. Den Schnitt im mittleren Drittel der Krone ansetzen, um die Pulpa und das an den okklusalen Rillen und Fissuren vorhandene Zahnschmelz zu vermeiden, um so eine Scheibe zu erhalten, die überwiegend aus Dentingewebe besteht.
      ACHTUNG: Den Zahnschnitt unter kontinuierlicher Irrigation durchführen und geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen, einschließlich Handschuhe, Maske und Schutzbrille.
3. Endbearbeitung der Dentinscheiben
   1. Die Dentinscheibe mit Schleifscheiben abnehmender Körnung polieren.
   2. Das Polieren fortsetzen, bis eine endgültige Dentindicke von etwa 0,8 mm (±± 0,3 mm) und laterale Abmessungen von etwa 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) erreicht sind (Abbildung 1D).
4. Lagerung der Dentinscheiben
   1. Die hergestellten Dentinscheiben bis zur Montage des OoC-Geräts in einer 0,5%igen Chloraminlösung bei 4 °C lagern.

Abbildung 1: Design und Herstellungsablauf des dentin–pulpa-Komplex-Organs-auf-einem-Chip (OoC)-Geräts. (A) Dreidimensionales Design des Geräts mit der dreischichtigen Architektur. (B) Draufsicht auf das Gerätedesign mit den wichtigsten Abmessungen. (C) Seitenansicht der dreischichtigen Gerätekonfiguration. (D) Repräsentativer Dentinscheibe mit einer ungefähren Dicke von 0,8 mm und lateralen Abmessungen von etwa 5 mm × 5 mm. (E) Silikon-Formwerkzeug, hergestellt mittels Photolithographie und verwendet zum Gießen der oberen und unteren Polydimethylsiloxan (PDMS)-Schichten. (F) Entfernung einer gehärteten PDMS-Schicht aus der Silikonform nach thermischer Polymerisation. (G) Plasma-Behandlung der PDMS-Oberfläche vor der Schichtenverbindung. (H) Fertiges dreischichtiges OoC-Gerät für den Dentin–Pulpa-Komplex, zusammengesetzt durch Plasma-Bonding und mit integrierter Dentin-Grenzfläche. (I) Zusammengebautes Gerät, angeschlossen an Schläuche zur Undichtigkeitsprüfung und Vorbereitung für mikrofluidische Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Herstellung des Dentin-Pulpa-Komplex-OoC-Geräts

1. Vorbereitung des Arbeitsplatzes und der Materialien
   1. Vorbereitung von Materialien und Geräten
      1. Bereiten Sie alle in der Tabelle der Materialien aufgeführten Materialien und Geräte vor Beginn der Geräteherstellung vor.
      2. Bereiten Sie Biopsiestanzen vor der Gerätemontage vor.
      3. Führen Sie alle Herstellungsschritte in einer sauberen, staubfreien Umgebung durch.
      4. Tragen Sie während der gesamten Geräteherstellung und -montage Handschuhe, Schutzbrille und geeignete persönliche Schutzausrüstung.
         HINWEIS: Bereiten Sie die durch Photolithographie hergestellte Form vor Beginn des Protokolls vor (Abbildung 1E).
2. Herstellung der mikrostrukturierten Form
   1. Vorbereitung des Siliziumwafers
      1. Stellen Sie die Form auf einem 4-Zoll-Wafer aus einseitig poliertem Silizium her (N-Typ, As-dotiert, CZ-Züchtungsmethode, <100>-Orientierung, 500 ±± 25 µm Dicke, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, spezifischer Widerstand 0,001–0,005 Ω·cm).
      2. Reinigen Sie den Wafer nacheinander jeweils 10 min unter Ultraschall in Aceton, Isopropanol und ultrareinem Wasser.
      3. Trocknen Sie den Wafer mit Druckluft.
      4. Backen Sie den Wafer 10 min auf einer Heizplatte bei 200 °C, um restliche Feuchtigkeit zu entfernen.
      5. Lassen Sie den Wafer auf Raumtemperatur (RT; 20 °C–25 °C) abkühlen.
   2. Oberflächenaktivierung und Beschichtung mit Photoresist
      1. Aktivieren Sie die Oberfläche des Siliziumwafers mithilfe eines Vakuum-Plasmareinigers, der mit Luftplasma auf Stufe 7 für 120 s betrieben wird.
      2. Tragen Sie den epoxidharzbasierten negativen Photoresist GM 1060 durch Schleuderbeschichtung bei 300 U/min für 10 s auf.
      3. Setzen Sie die Schleuderbeschichtung bei 565 U/min für 100 s und bei 965 U/min für 1 s mit einer Beschleunigung von 200 U/min/s fort.
      4. Lassen Sie den beschichteten Wafer 10 min ruhen.
      5. Führen Sie eine Vorwärmung bei 65 °C für 10 min durch.
      6. Setzen Sie die Vorwärmung bei 95 °C für 1 h fort.
      7. Lassen Sie den Wafer auf RT abkühlen.
   3. Belichtung und Entwicklung
      1. Belichten Sie den Photoresist mithilfe eines Direktlaser-Lithographiesystems mit einer Dosis von 1.950 mJ/cm².
      2. Führen Sie eine Nachwärmung bei 65 °C für 10 min durch.
      3. Setzen Sie die Nachwärmung bei 95 °C für 30 min fort.
      4. Lassen Sie den Wafer auf RT abkühlen.
      5. Lassen Sie den Wafer 10 min ruhen.
      6. Entwickeln Sie das Muster 4 min in PGMEA.
      7. Verlängern Sie die Entwicklung in 30-s-Intervallen, falls Reste des Photoresists verbleiben.
      8. Beenden Sie die Entwicklung durch Spülen mit Isopropanol.
      9. Trocknen Sie den Wafer mit Druckluft.
   4. Hartbacken
      1. Führen Sie ein Hartbacken bei 135 °C für 2 h durch.
      2. Erhalten Sie eine mikrostrukturierte Urform mit Mikrokanälen von 1 mm Breite und 50 µm Höhe.
3. Vorbereitung und Entgasung der PDMS-Mischung
   1. Vorbereitung der PDMS-Mischung
      1. Mischen Sie die PDMS-Grundmasse und den Härter im Gewichtsverhältnis 10:1.
      2. Rühren Sie die Mischung manuell mit einem Glasstab in einem Plastikbecher etwa 5 min lang um.
      3. Halten Sie während des Mischens langsame und kontinuierliche kreisförmige Bewegungen ein.
         HINWEIS: Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen während des Mischens.
   2. Entgasung
      1. Stellen Sie die PDMS-Mischung in einen Vakuum-Exsikkator, der an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist.
      2. Entgasen Sie die Mischung etwa 5 min bei ca. 700 mmHg.
      3. Lösen Sie das Vakuum kurzzeitig, damit Oberflächenblasen platzen können.
      4. Wenden Sie das Vakuum erneut an.
      5. Wiederholen Sie den Zyklus, bis keine sichtbaren Blasen mehr vorhanden sind.
         HINWEIS: Die gesamte Entgasungszeit beträgt typischerweise etwa 30 min.
4. Gießen von PDMS auf die Form
   1. Vorbereitung der Form
      1. Stellen Sie die Form auf eine ebene Fläche.
      2. Reinigen Sie die Form mit Druckluft.
      3. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit der strukturierten Oberfläche.
      4. Stellen Sie sicher, dass die Form frei von Staub und Verunreinigungen ist.
   2. Dosieren von PDMS
      1. Dosieren Sie etwa 8 g PDMS um die Dentinscheibe herum, um die Dentineinbettungsschicht herzustellen.
      2. Passen Sie die PDMS-Höhe an die Dicke der Dentinscheibe (0,8 ±± 0,3 mm) an.
      3. Verhindern Sie, dass PDMS die Dentinoberfläche bedeckt.
      4. Dosieren Sie etwa 0,26 g PDMS pro Formeinheit, um jede Mikrokanalschicht herzustellen.
      5. Klopfen Sie vorsichtig auf die Form oder bringen Sie Vibrationen an, um das Befüllen der Mikrostrukturen zu erleichtern.
      6. Lassen Sie das PDMS in die kleinsten Strukturen eindringen.
      7. Bedecken Sie die Form mit einem Deckel oder einer flachen Abdeckung, ohne die PDMS-Oberfläche zu berühren.
         HINWEIS: Die Dentineinbettungsschicht ist etwa 0,8 mm dick, und jede Mikrokanalschicht ist etwa 0,4 mm dick, was eine Gesamtdicke des Geräts von etwa 1,6 mm ergibt.
         HINWEIS: Passen Sie die Schichtdicke entsprechend der Arbeitsdistanz des konfokalen Objektivs an, wenn eine konfokale Bildgebung geplant ist.
5. Aushärten
   1. Stellen Sie die Formen in einen Ofen bei 50 °C.
   2. Härten Sie das PDMS 4 h lang aus.
6. Entfernen der PDMS-Schichten
   1. Entfernen der ausgehärteten PDMS-Schichten
      1. Lösen Sie die ausgehärteten PDMS-Schichten vorsichtig von der Form (Abbildung 1F).
      2. Behandeln Sie die PDMS-Schichten sorgfältig, um Beschädigungen der Mikrostrukturen zu vermeiden.
7. Verbindung der PDMS-Schichten und Herstellung der Ein- und Auslassöffnungen
   1. Herstellung der Ein- und Auslassöffnungen
      1. Erstellen Sie Perforationen an den vorgesehenen Ein- und Auslassstellen mithilfe einer 1-mm-Biopsiestanze.
      2. Richten Sie die Mikrokanalseite beim Stanzen nach oben aus.
         HINWEIS: Legen Sie die PDMS-Schicht auf eine Schneidematte, um strukturelle Beschädigungen zu vermeiden.
      3. Erstellen Sie zwei Perforationen in der oberen Schicht, die dem oberen Mikrokanal entsprechen.
   2. Reinigung der PDMS-Schichten
      1. Reinigen Sie die PDMS-Schichten mit Isopropylalkohol oder Ethanol.
      2. Entfernen Sie restliche Staubpartikel mit steriler Klebefolie.
      3. Stellen Sie sicher, dass alle Verbindungsoberflächen vor der Montage frei von Verunreinigungen sind.
   3. Plasmaaktivierung der PDMS-Oberflächen
      1. Positionieren Sie die obere und mittlere PDMS-Schicht für die Plasma-Behandlung (Abbildung 1G).
      2. Aktivieren Sie die Oberflächen mithilfe eines handgeführten Corona-Plasma-Behandlers mit einer Leistung von etwa 25 W und Umgebungsluft als Arbeitsgas.
      3. Halten Sie einen Arbeitsabstand von etwa 1 mm zwischen der Plasmaquelle und der PDMS-Oberfläche ein.
         ACHTUNG: Führen Sie die Plasma-Behandlung unter geeigneter Belüftung durch und vermeiden Sie direkte Exposition gegenüber ozonhaltigen Gasen, die durch das Plasma entstehen.
      4. Schalten Sie das Plasma-Behandlungsgerät ein und lassen Sie es 5 s stabilisieren.
      5. Überprüfen Sie, ob ein gleichmäßiger Plasmastrahl erzeugt wird, bevor Sie mit der Behandlung beginnen.
      6. Behandeln Sie die obere PDMS-Schicht 10 s lang mit kontinuierlicher Hin- und Herbewegung bei etwa 5 mm/s.
      7. Behandeln Sie die mittlere PDMS-Schicht 10 s lang mit derselben Bewegung und Distanz.
      8. Führen Sie unmittelbar vor der Verbindung eine zusätzliche 1-s-Plasma-Behandlung an der oberen Schicht durch.
   4. Verbindung der oberen und mittleren Schichten
      1. Richten Sie den oberen Mikrokanal unmittelbar nach der Plasma-Behandlung mit der Dentinscheibe aus.
      2. Verbinden Sie die obere und mittlere Schicht miteinander.
      3. Stellen Sie die verbundene Baugruppe 5 min lang in einen Ofen bei 75 °C.
      4. Verfestigen Sie die Verbindung während der Inkubation.
         HINWEIS: Die Dentinscheibe und der Mikrokanal sind mit bloßem Auge sichtbar und können ohne zusätzliche Ausrichtungshilfen ausgerichtet werden.
   5. Herstellung der Öffnungen für den unteren Mikrokanal
      1. Stanzen Sie zwei Perforationen, die dem unteren Mikrokanal entsprechen, durch die verbundene obere und mittlere Schicht.
      2. Führen Sie das Stanzen durch beide Schichten gleichzeitig durch, um eine korrekte Ausrichtung sicherzustellen.
         HINWEIS: Dieses Verfahren erzeugt vier Perforationen in der oberen Schicht und zwei Perforationen in der mittleren Schicht.
      3. Legen Sie die verbundene Baugruppe vor dem Stanzen auf eine feste Schneidematte.
      4. Üben Sie gleichmäßigen Druck in einer einzigen Bewegung aus.
         HINWEIS: Vermeiden Sie rotations- oder seitliche Kräfte, um das Risiko einer Delamination zu minimieren.
      5. Entfernen Sie Rückstände von den Perforationsstellen mit fusselfreier, steriler Gaze, die mit Isopropylalkohol angefeuchtet wurde.
      6. Untersuchen Sie die Perforationen und die umliegenden verbundenen Bereiche unter ausreichender Beleuchtung.
      7. Stellen Sie vor Fortsetzung sicher, dass keine Delamination, Risse oder unvollständige Perforationen vorliegen.
   6. Verbindung der unteren Schicht
      1. Behandeln Sie die untere Schicht wie in Schritt 2.7.4 beschrieben mit Plasma.
      2. Richten Sie die Ein- und Auslassöffnungen des unteren Mikrokanals mit den Perforationen in der oberen und mittleren Schicht aus.
      3. Verbinden Sie die untere Schicht, um die Gerätemontage abzuschließen.
         HINWEIS: Markieren Sie die Ein- und Auslassstellen auf der äußeren Oberfläche der unteren Schicht vor der Verbindung, um die Ausrichtung zu erleichtern.
         HINWEIS: Plasma-Kammern können laut Literatur eine stärkere Verbindung als Plasma-Stifte ermöglichen³⁶.
         HINWEIS: Das fertige Gerät besteht aus einer dreischichtigen mikrofluidischen Plattform mit einer Dentin-Grenzfläche (Abbildung 1H). Die untere Dentinoberfläche repräsentiert die Pulpa-Seite des Modells, während die obere Dentinoberfläche die koro­nale Seite darstellt, die dentalen Biomaterialien oder bakteriellen Präparaten ausgesetzt wird.
8. Lecktest des mikrofluidischen Geräts
   1. Inspektion des montierten Geräts
      1. Überprüfen Sie das montierte Gerät auf Fehlausrichtungen.
      2. Untersuchen Sie die Montage auf unvollständige Verbindung und sichtbare Leckagen.
   2. Lecktest
      1. Verbinden Sie 19G-Luer-Lock-Nadeln mit den Einlassöffnungen (Abbildung 1E).
      2. Verbinden Sie die Nadeln mit mikrofluidischen Pumpenschläuchen.
      3. Drücken Sie die Nadelschäfte vorsichtig in die gestanzten Öffnungen, um eine luftdichte Verbindung zu erzielen.
      4. Injizieren Sie steriles PBS oder Kulturmedium mit einer Flussrate von 10 µL/min.
      5. Halten Sie den Fluss mindestens 5 min lang aufrecht.
      6. Überprüfen Sie alle verbundenen Schnittstellen, Kanalränder und Grenzen der Dentinscheibe während des Flusses.
      7. Beobachten Sie das Gerät während und nach der Injektion unter ausreichender Beleuchtung.
      8. Stellen Sie sicher, dass keine Flüssigkeitsansammlung, Feuchtigkeit oder Tropfenbildung auftritt.
      9. Klassifizieren Sie das Gerät als dicht, wenn keine Leckage festgestellt wird.
      10. Entsorgen Sie Geräte mit Leckagen.
          HINWEIS: Führen Sie den Lecktest an jedem hergestellten Gerät vor der Zellseeding oder experimentellen Nutzung durch.
9. Sterilisation und Lagerung des mikrofluidischen Geräts
   1. Sterilisation
      1. Bestrahlen Sie die obere Oberfläche des montierten Geräts 30 min lang mit UV-Licht (254 nm) in einem laminaren Flusswerk.
      2. Bestrahlen Sie die untere Oberfläche weitere 30 min lang mit UV-Licht.
      3. Spülen Sie die Mikrokanäle 20 min lang mit 70 %igem Ethanol durch.
      4. Spülen Sie die Mikrokanäle dreimal mit steriler PBS, um restliches Ethanol zu entfernen.
   2. Lagerung
      1. Verwenden Sie das sterilisierte Gerät unmittelbar für Zellkulturversuche.
      2. Alternativ lagern Sie das Gerät in steriler PBS bei 4 °C in einem sterilen Behälter, bis zur Verwendung.
         ​ACHTUNG: Verwenden Sie nach der Gerätemontage keine Chlamin- oder andere Desinfektionslösungen, da PDMS diese Verbindungen aufnehmen kann und die Zellviabilität beeinträchtigt wird.

3. Beurteilung der Adhäsion und Vitalität von dentalen Pulpastammzellen

1. Präkonditionierung der Dentinoberfläche
   1. Injizieren Sie 10 % EDTA in das Gerät.
   2. Halten Sie den Kontakt zwischen der EDTA-Lösung und der Dentinoberfläche 15 min lang aufrecht.
   3. Injizieren Sie alle 3 Minuten 0,5 mL EDTA, um die Flüssigkeitsbewegung im Mikrokanal aufrechtzuerhalten.
   4. Spülen Sie die Dentinscheibe dreimal mit ultrareinem Wasser.
   5. Jede Waschung 5 min lang durchführen.
      HINWEIS: Die EDTA-Behandlung entfernt die Schmierschicht und legt die Dentin-Matrixproteine frei.
      ACHTUNG: EDTA-Lösungen unter Verwendung von Handschuhen und Schutzbrille handhaben, um Haut- und Augenreizungen zu vermeiden.
2. Aussaat von dentalen Pulpastammzellen
   1. Vermehrung von dentalen Pulpastammzellen
      1. Säen Sie dentale Pulpastammzellen in eine T75-Flasche mit einer Dichte von 1 × 10⁶ Zellen pro Kolben
      2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37°C und 5 % CO₂₂ bis eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht ist
      3. Die Zellen mit Trypsin lösen.
      4. Den Trypsin mit komplettem Kulturmedium neutralisieren.
      5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension, um ein Zellpellet zu erhalten.
      6. Beurteilen Sie die Zellviabilität mithilfe von Trypanblau.
      7. Verwenden Sie Zellsuspensionen mit einer Vitalität von ≥90 %.
   2. Herstellung der Zellsuspension
      1. Bereiten Sie eine vorgewärmte Zellsuspension vor bei 37°C.
      2. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 100.000 Zellen/mL im kompletten Kulturmedium ein.
      3. Bereiten Sie ein Endvolumen der Suspension von 1–2 mL vor.
         HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden Zellen der Passage 5 verwendet.
   3. Zellseeding
      1. Injizieren Sie die Zellsuspension in den Einlass des unteren Mikrokanals.
      2. Drehen Sie das Gerät nach der Zellseeding um.
         HINWEIS: Die Umkehrung des Geräts fördert die Sedimentation der Zellen in Richtung Dentinoberfläche und verbessert die Zelladhäsion.
   4. Inkubation
      1. Stellen Sie das umgekehrte Gerät in eine Petrischale.
      2. Geben Sie 1 mL Kulturmedium in die Petrischale, um Verdunstung zu minimieren.
      3. Inkubieren Sie das Gerät bei 37°C und 5 % CO₂₂ für 24 h.
      4. Halten Sie die statischen Kulturbedingungen während des gesamten Inkubationszeitraums aufrecht.
         HINWEIS: Eine Validierung des dynamischen Flusses wurde in der vorliegenden Studie nicht durchgeführt.
         HINWEIS: Das vorliegende Protokoll beschreibt statische Kulturbedingungen für die initiale Gerätevalidierung und die Beurteilung der Zelladhäsion.
   5. Erste Gerätevalidierung
      1. Beurteilung der Zelladhäsion mittels Rasterelektronenmikroskopie.
      2. Entnehmen Sie die Dentinscheibe durch Zerlegen des Geräts vor der Analyse.
3. Probenvorbereitung für die Rasterelektronenmikroskopie
   1. Probenentnahme und -wäschung
      1. Zerlegen Sie das Gerät nach 24-stündiger Inkubation.
      2. Entnehmen Sie die Dentinscheibe und überführen Sie sie in eine Kulturplatte oder eine Petrischale.
      3. Positionieren Sie die mit Zellen besiedelte Dentinoberfläche nach oben gerichtet.
      4. Spülen Sie die Dentinscheibe zweimal mit je 1 mL PBS.
   2. Fixierung
      1. Geben Sie 2 mL einer 2,5%igen Glutaraldehydlösung in 0,1 M Sørensen-Phosphatpuffer hinzu.
      2. Die Probe 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
         ACHTUNG: Glutaraldehyd ist toxisch und kann Haut-, Augen- und Atemwegsreizungen verursachen. Führen Sie Fixierungsarbeiten stets in einer chemischen Abzugshaube unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durch.
   3. Waschen nach der Fixierung
      1. Entfernen Sie die Glutaraldehydlösung.
      2. Spülen Sie die Dentinscheibe dreimal mit ultrareinem destilliertem Wasser bei Raumtemperatur.
   4. REM-Analyse
      1. Analysieren Sie die Proben mithilfe eines umweltgescannten Elektronenmikroskops.
      2. Betreiben Sie das Mikroskop unter Vakuumbedingungen mit niedrigem Druck (25 Pa).
      3. Verwenden Sie eine Beschleunigungsspannung von 10,0 kV und einen Arbeitsabstand von 7,0 mm.
      4. Bilder im Rückstreuelektronen-3D-Detektionsmodus (BSE-3D) aufnehmen.
      5. Bilder aufnehmen bei ×200-fache Vergrößerung (Abbildung 2A).
4. Beurteilung der Zellviabilität mittels konfokaler Mikroskopie
   1. Probenvorbereitung
      1. Säen und kultivieren Sie die Zellen wie in Schritt 3.2 beschrieben.
      2. Inkubieren Sie das Gerät 24 h bei 37°C und 5 % CO₂.
      3. Zerlegen Sie das Gerät und legen Sie die Dentinoberfläche frei.
      4. Überführen Sie die Dentinscheibe in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte, die vorgewärmtes HBSS enthält.⁺/+ ergänzt mit Ca²⁺ und Mg²⁺.
   2. Probenwäscherei
      1. Spülen Sie die Dentinscheibe zweimal mit HBSS⁺/⁺.
      2. Entfernen Sie vor der Färbung restliches Serum und Phenolrot.
         HINWEIS: Reste von Serum und Phenolrot können die Hintergrundautofluoreszenz erhöhen.
   3. Färbung lebender Zellen
      1. Bereiten Sie eine frische Arbeitslösung von Calcein AM zu 2 µM in HBSS⁺/⁺.
      2. Geben Sie ausreichend Färbelösung hinzu, um die Dentinoberfläche vollständig zu bedecken.
      3. Inkubieren Sie die Probe 20 min bei 37°C im Dunkeln.
      4. Entfernen Sie die Färbelösung nach der Inkubation.
   4. Färbung von toten Zellen
      1. Fügen Sie die working solution von Propidiumiodid (1–2 µg/mL in HBSS⁺/⁺).
      2. Inkubieren Sie die Probe 5–8 min bei 37°C im Dunkeln.
      3. Die Inkubationszeit darf 10 Minuten nicht überschreiten.
      4. Waschen Sie die Probe zweimal mit HBSS⁺/⁺.
      5. Halten Sie die Probe bis zur Bildgebung in Puffer untergetaucht.
   5. Aufnahme mittels konfokaler Mikroskopie
      1. Erwerben Sie konfokale Bilder innerhalb von 30 Minuten nach der Färbung.
      2. Nehmen Sie die Bilder nacheinander in den grünen und roten Kanälen auf.
      3. Verwenden λ_ex 490 nm und λ_em 515 nm für die Live-Cell-Bildgebung.
      4. Verwenden λ_ex 535 nm und λ_em 617 nm für die Bildgebung abgestorbener Zellen.
         ​HINWEIS: Fluoreszenzlösungen und gefärbte Proben während der Inkubation und der Bildgebung vor Lichteinwirkung schützen (Abbildung 2B).

Abbildung 2: Repräsentative Bewertung der Adhäsion und Vitalität von dentalen Pulpastammzellen im Dentin-Pulpa-Komplex-OoC-System. (A) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme, die adhärierte dentale Pulpastammzellen (weißer Stern) auf der Dentinoberfläche nach 24-stündiger statischer Kultur innerhalb des OoC-Systems zeigen. Nach 24-stündiger Kultur bedeckten adhärierte Zellen 54,35 ± 0,92 % der Dentinoberfläche, die dem Mikrokanal ausgesetzt war. Im mit PDMS bedeckten Dentinbereich (schwarzer Stern) wurden keine Zellen beobachtet, was auf eine wirksame Abdichtung zwischen den Systemschichten hinweist. Maßstabsbalken = 200 µm. (B) Konfokale Mikroskopieaufnahme, die lebende dentale Pulpastammzellen, grün gefärbt, zeigen, die nach 24-stündiger statischer Kultur an der Dentinoberfläche adhäriert sind (weiße Pfeile). Ebenso sind tote Zellen, rot gefärbt, sichtbar (blaue Pfeile). Maßstabsbalken = 50 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Herstellung des Zahn-auf-einem-Chip-Geräts folgte dem in Abbildung 1A–1I dargestellten Arbeitsablauf, einschließlich der Vorbereitung der Dentinscheibe (Abbildung 1D), der Herstellung der photolithographisch erzeugten Form (Abbildung 1E), des Entfernens der ausgehärteten PDMS-Schichten (Abbildung 1F), der Plasmabehandlung vor der Verbindung (Abbildung 1G), der Montage des endgültigen Geräts (Abbildung 1H) und der Anbindung des Geräts an die mikrofluidische Apparatur (Abbildung 1I). Das resultierende Gerät bestand aus einer dreischichtigen PDMS-Anordnung, in der die Dentinscheibe vollständig in die mittlere Schicht integriert war, wobei sich die oberen und unteren Mikrokanäle auf beiden Seiten der Dentinoberfläche befanden (Abbildung 1H).

Ein positives Ergebnis in diesem Stadium zeichnete sich durch das Fehlen sichtbarer Luftblasen oder Delamination sowie durch eine undichte Freisetzung von Flüssigkeit nach Injektion von PBS oder Kulturmedium durch die Einlassöffnungen aus (Abbildung 1I). Eine Fehlausrichtung der Mikrokanalöffnungen, eine unvollständige Plasma-Bindung oder Leckagen an der Dentin–PDMS-Grenzfläche deuteten auf einen fehlgeschlagenen Zusammenbau hin und erforderten die Wiederholung des Herstellungsverfahrens.

Insgesamt wurden 30 Geräte hergestellt, von denen etwa 20 % während der Herstellung oder der Prüfung versagten. Die Ausfälle waren hauptsächlich auf Flüssigkeitsaustritt jenseits der Mikrokanalgrenzen infolge unvollständiger Plasma-Bindung zurückzuführen, während ein geringerer Anteil der Ausfälle auf Delamination in anderen Bereichen des Geräts beruhte. Keine Ausfälle waren auf Leckagen an der Dentin–PDMS-Grenzfläche oder auf eine Fehlausrichtung der Einlass- und Auslassöffnungen des Mikrokanals zurückzuführen.

Nach 24-stündiger statischer Kultur wurde eine erfolgreiche Zellseeding durch das Vorhandensein von anhaftenden dentalen Pulpastammzellen mit fibroblastischem Erscheinungsbild auf der Dentinoberfläche bestätigt. Die Rasterelektronenmikroskopie ermöglichte die Beurteilung sowohl der Zelladhäsion als auch der Integrität des Geräts (Abbildung 2A). Gemäß dem vorliegenden Protokoll bedeckten die anhaftenden Zellen nach 24-stündiger Kultur 54,35 ± 0,92 % der Dentinoberfläche, die nach der Kultur dem Mikrokanal ausgesetzt war. Ein positives Ergebnis zeigte sich durch das Vorhandensein von anhaftenden Zellen ausschließlich im Bereich des Mikrokanals, während die durch PDMS bedeckte Dentinoberfläche frei von Zellanhängen blieb (Abbildung 2A). Diese räumliche Verteilung sprach für eine erfolgreiche Abdichtung zwischen den Gerätelagen und eine korrekte Gerätemontage. Umgekehrt deutete das Vorhandensein von Zellen außerhalb der Mikrokanalgrenzen auf eine Undichtigkeit hin und sollte als negatives Ergebnis betrachtet werden.

Die konfokale Mikroskopie unter Verwendung einer Live/Dead-Färbung ermöglichte die nichtdestruktive Beurteilung der Zellviabilität innerhalb des Geräts. Ein erfolgreicher Ausgang war gekennzeichnet durch ein Überwiegen lebensfähiger Zellen mit grüner Fluoreszenz und fibroblastärer Morphologie, wobei nur gelegentlich nicht lebensfähige Zellen rot angefärbt waren (Abbildung 2B). Im Gegensatz dazu würde ein hoher Anteil nicht lebensfähiger Zellen auf eine suboptimale Dentinvorbehandlung, unzureichendes Waschen oder ungeeignete Kulturbedingungen hindeuten.

Während der Protokolloptimierung wurde eine anfängliche Herstellungsstrategie evaluiert, bei der eine feste Form mit einer vordefinierten Aussparung verwendet wurde, um die Dentinscheibe in der mittleren PDMS-Schicht zu positionieren (Abbildung 3A). Obwohl dieser Ansatz die Platzierung der Scheibe standardisieren und Leckagen an der Grenzfläche zwischen Scheibe und PDMS verringern sollte, erwies er sich in der Praxis als ineffizient. Da der Bereich, der der Aussparung für die Dentinscheibe entsprach, manuell aus der gehärteten PDMS-Schicht ausgeschnitten werden musste, konnte eine präzise Anpassung zwischen den Rändern der Scheibe und den geschnittenen PDMS-Kanten nicht zuverlässig erreicht werden. Dies führte zu Zwischenraumspalten an der Grenzfläche, die in etwa 50 % der hergestellten Vorrichtungen zu Leckagen führten (Abbildung 3A).

Abbildung 3: Repräsentative Bilder, die nicht erfolgreiche Herstellungsansätze veranschaulichen, die während der Optimierung des Dentin–Pulpa-Komplex-OoC-Systems identifiziert wurden. (A) Silikonform mit festen Aussparungen, die für eine standardisierte Positionierung der Dentinscheiben konzipiert sind (weiße Pfeile). Aufgrund der inhärenten Variabilität der Abmessungen der Dentinscheiben, die sich aus der manuellen Probenvorbereitung ergibt, konnte keine zuverlässige Anpassung an die feste Geometrie der Form erreicht werden, was bei etwa 50 % der hergestellten Systeme zu Grenzflächenlücken und Leckagen führte. (B) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der Dentinoberfläche nach Auftrag eines Versiegelungsmaterials an der Grenzfläche zwischen Scheibe und PDMS. Exponiertes Dentin (schwarzer Stern) und Ablagerungen des Versiegelungsmaterials (weißer Stern) sind gekennzeichnet. Eine unbeabsichtigte Ausbreitung des Versiegelungsmaterials auf der Dentinoberfläche beeinträchtigte die Zelladhäsion und verringerte die verfügbare Oberfläche für die Zellkolonisation. Maßstabsbalken = 100 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Um diese Einschränkung zu beheben, wurde ein Dichtmaterial an der Grenzfläche zwischen Scheibe und PDMS aufgebracht. Dieser Ansatz brachte jedoch einen zusätzlichen Nachteil mit sich, da das Dichtmaterial auf die Dentinoberfläche übergriff und die Zelladhäsion in den bedeckten Bereichen verhinderte, wie mittels Rasterelektronenmikroskopie gezeigt wurde (Abbildung 3B). Diese suboptimalen Ergebnisse verdeutlichten zwei entscheidende Einschränkungen der ursprünglichen Herstellungsstrategie: eine unzureichende Anpassung zwischen der manuell ausgeschnittenen PDMS-Aussparung und der Dentinscheibe sowie eine verminderte Zelladhäsion, die mit dem Dichtmaterial assoziiert war.

Diskussion

Diese Studie beschreibt ein schrittweises Protokoll zur Herstellung eines vertikal gestapelten Zahn-auf-einem-Chip-Geräts, das Dentin und dentale Pulpastammzellen enthält, und zeigt repräsentative Zelladhäsion und Zellviabilität innerhalb des Geräts unter statischen Kulturbedingungen. Das Protokoll wurde entwickelt, um einen reproduzierbaren Arbeitsablauf für die Herstellung und Montage einer dentin-pulpa-Komplex-OoC-Plattform bereitzustellen, die für in-vitro-Untersuchungen der Dentin-Grenzfläche geeignet ist. Die Etablierung eines solchen Arbeitsablaufs ist besonders bedeutend, da unsere aktuelle systematische Übersichtsarbeit hervorhob, dass sich das Forschungsfeld mikrofluidischer Modelle für den Dentin-Pulpa-Komplex noch in einem frühen Entwicklungsstadium befindet, das durch eine hohe methodische Heterogenität in Bezug auf Gerätearchitektur und Materialien gekennzeichnet ist und dadurch die Reproduzierbarkeit und Standardisierung der derzeitigen Zahn-auf-einem-Chip-Modelle erheblich beeinträchtigt³⁴. Durch die Bereitstellung eines detaillierten und reproduzierbaren Protokolls behebt diese Studie diese Einschränkungen und leistet einen Beitrag zur Entwicklung besser definierter biologischer Modelle. Im weiteren Kontext der OoC-Entwicklung in der oralen Biologie haben França et al.¹⁵ das Feld mit einem mikrofluidischen Zahn-auf-einem-Chip-Modell, das Dentinscheiben und odontoblastenähnliche Zellen umfasst, maßgeblich vorangebracht, indem sie die Machbarkeit demonstrierten, die Dentin-Pulpa-Grenzfläche in einer dynamischen mikrofluidischen Umgebung nachzubilden, und die zytotoxische Reaktion auf zahnärztliche Materialien bewerteten. Seit diesem bahnbrechenden Beitrag wurden zunehmend mehr orale OoC-Plattformen in der Literatur beschrieben³⁴, die unterschiedliche Aspekte der Biologie des Zahngewebes, von Biomaterial-Interaktionen und der oralen Mikrobiologie adressieren und diesen Ansatz als aktives und schnell wachsendes Forschungsfeld etablieren. Das vorliegende Protokoll trägt zu diesem Forschungsfeld bei, indem es einen detaillierten und reproduzierbaren Herstellungsarbeitsablauf für eine vertikal gestapelte Zahn-auf-einem-Chip-Plattform bereitstellt, die für Forschungsgruppen mit standardmäßigen mikrofluidischen Fähigkeiten zugänglich ist.

Mehrere Schritte im Protokoll sind entscheidend für die erfolgreiche Herstellung und Leistungsfähigkeit des Geräts. Insbesondere das Gießen von PDMS auf die Form erfordert eine sorgfältige Kontrolle, um eine gleichmäßige Schichtdicke und eine korrekte Bildung der Mikrokanäle zu erreichen. Die Dicke der PDMS-Schichten sollte je nach geplanter nachgeschalteter Anwendung gewählt werden. Beispielsweise erfordert die konfokale Mikroskopie ausreichend dünne PDMS-Schichten, um die optische Visualisierung von Zellen, die an der Dentinoberfläche haften, zu ermöglichen. Dünnere Schichten können jedoch während der Herstellung und Montage schwieriger zu handhaben sein. Daher stellt die Optimierung der PDMS-Dicke ein wichtiges Gleichgewicht zwischen der Zugänglichkeit für die Bildgebung und der praktischen Handhabung während der Geräteherstellung dar. Außerdem war in der vorliegenden Studie die konfokale Mikroskopie intakter Geräte nicht möglich, da die PDMS-Schicht über den Zellen eine Dicke von 0,4 mm aufwies, was die Eindringtiefe des verfügbaren konfokalen Mikroskops (0,2 mm) überstieg. Folglich wurde die konfokale Bildgebung nach Demontage des Geräts und direkter Freilegung der Dentinoberfläche durchgeführt. Zudem war die Fluoreszenzmikroskopie bei diesem Gerät nicht anwendbar, da die inhärente Undurchsichtigkeit des Dentins eine direkte optische Visualisierung der an seiner Oberfläche haftenden Zellen verhinderte.

Diese Einschränkung ist besonders relevant für vertikal gestapelte OoC-Konfigurationen, bei denen der Mikrokanal, der die Zellen enthält, unterhalb der Dentinscheibe positioniert ist, wodurch der optische Zugang sowohl durch die überlagernde PDMS-Schicht als auch durch die Undurchsichtigkeit des Dentins selbst beeinträchtigt wird. Diese Einschränkung tritt bei horizontal gestapelten Chip-Designs nicht auf, bei denen die Mikrokanäle seitlich neben dem Dentin verlaufen statt darunter, wodurch ein direkter optischer Zugang zur zellbesiedelten Oberfläche ohne Störungen durch die Undurchsichtigkeit des Dentins oder die Dicke des PDMS ermöglicht wird. Die Wahl zwischen vertikalen und horizontalen Stapelkonfigurationen sollte daher nicht nur die fluidischen und biologischen Anforderungen berücksichtigen, sondern auch die in dem Labor verfügbaren Bildgebungsmodalitäten. In einem OoC-System spielt das Gerätedesign eine bedeutende Rolle, und das Mikromilieu muss so nah wie möglich an den in-vivo-Bedingungen gehalten werden. Wie die meisten Gewebe ist der Zahn mechanischen Reizen ausgesetzt und zeigt ein anisotropes Verhalten³⁵, was bedeutet, dass seine Eigenschaften je nach Richtung des angelegten Reizes variieren. Darüber hinaus bestehen histologische Unterschiede zwischen dem koronaren Bereich des Dentin-Pulpa-Komplexes, in dem Dentin und Odontoblasten vertikal angeordnet sind, und dem lateralen Bereich, in dem Odontoblasten neben dem Dentin liegen, mit bemerkenswerten Unterschieden in Zellzahl, Organisation und Ausrichtung der Dentinkanälchen. Ein vertikal gestapeltes Chip-Design bietet daher eine genauere anatomische Repräsentation von kariösen Läsionen und restaurativen Materialien, die den koronalen Bereich des Dentin-Pulpa-Komplexes betreffen.

Eine präzise Plasmabehandlung der Oberfläche ist entscheidend für eine erfolgreiche Bauteilmontage und bleibt eine der zentralen Herausforderungen in der Chip-Produktion³⁶. In dieser Studie trat Delamination bei 20 % der hergestellten Geräte auf. Dieses Ergebnis ist nicht unerwartet, da die PDMS–PDMS-Verbindung, die mit einem handgehaltenen Plasmastift erzielt wird – wie im vorliegenden Fall –, eine geringere Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies erzeugt als vakuumbasierte Plasma-Kammersysteme, die Sauerstoffkonzentrationen oberhalb des atmosphärischen Niveaus ermöglichen und folglich eine größere Anzahl kovalenter Oberflächengruppen für die Bindung erzeugen³⁶. Folglich ist die mit einem Plasmastift erzielte Bindungsstärke per se geringer und weniger reproduzierbar als die mit einer dedizierten Plasma-Kammer, was wahrscheinlich zur beobachteten Delaminationsrate beigetragen hat. Auch die Optimierung der Dentin-Integrationsstrategie erforderte mehrere Herstellungsiterationen, um einen engen Kontakt zwischen der Dentinscheibe und der mittleren PDMS-Schicht zu erreichen und dabei Leckagen zu minimieren. Ein erster Ansatz beinhaltete die Herstellung einer vordefinierten Aussparung in der mittleren Schicht zur Platzierung des Dentins; jedoch verhinderte das manuelle Ausarbeiten der Aussparung eine konsistente Anpassung zwischen der Dentinscheibe und den PDMS-Rändern, was zu Leckagen während der Injektion des Kulturmediums führte und eine Gesamterfolgsquote bei der Herstellung von etwa 50 % ergab.

Ein Gebisskleber wurde anschließend evaluiert, um die Abdichtung an der Grenzfläche zwischen Dentin und PDMS zu verbessern, doch die Rasterelektronenmikroskopie zeigte eine Störung der Zelladhäsion und eine verminderte Sichtbarkeit der Zellen auf der Dentinoberfläche. Daher wurde das endgültige Protokoll optimiert, indem die Dentinscheibe vor dem vorsichtigen Gießen von PDMS direkt in die Form platziert wurde, wodurch die Integration der Dentinscheibe in das Gerät verbessert und der Bedarf an zusätzlichen Dichtungsmaterialien verringert wurde. Dieser Ansatz beseitigte effektiv Leckagen an der Dentin–PDMS-Grenzfläche, indem ein enger und formtreuer Kontakt zwischen den Rändern der Dentinscheibe und dem umgebenden PDMS sichergestellt wurde, ohne auf sekundäre Dichtungsmittel angewiesen zu sein, die die Zelladhäsion an der Dentinoberfläche beeinträchtigen könnten. Es sollten auch mehrere Limitationen der vorliegenden Methode berücksichtigt werden. Die Herstellung mikrofluidischer Geräte bleibt teilweise von manuellen Handhabungsschritten abhängig, was Variabilität zwischen Geräten und Bedienern verursachen kann. Obwohl die Fotolithographie eine hohe Präzision und Reproduzierbarkeit bei der Herstellung von Mikrokanalgeometrien bietet, kann das Verfahren spezielle Ausrüstung und technisches Fachwissen erfordern. Alternative Herstellungsansätze, einschließlich dreidimensionaler Druckverfahren, könnten die Prototypenerstellung und Zugänglichkeit für einige Labore erleichtern; Faktoren wie Druckauflösung, restliche Monomere und die Biokompatibilität der Materialien erfordern jedoch eine sorgfältige Optimierung³⁷.

Die kontinuierliche Zufuhr von Medium versorgt die Zellen mit einer stabilen Umgebung und schützt sie vor der Anreicherung von Abfallstoffen oder einem Ungleichgewicht von Kalzium und Phosphat¹⁶. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Scherspannungen, die durch konstanten Fluss hervorgerufen werden, Mechanotransduktionsprozesse simulieren können, die ähnlichen Signalwegen wie in vivo entsprechen und entscheidende Faktoren für das Zellverhalten darstellen^38,39. Diese tragen zur Differenzierung und Reifung der Zellen bei und induzieren signifikante Veränderungen in der Zellmorphologie, Genexpression und Funktion³⁹. Die vorliegende Studie beschreibt die Herstellung und erste Validierung des Geräts und demonstriert die Zelladhäsion und -viabilität nach 24 h unter statischen Kulturbedingungen; daher wurden die Effekte des dynamischen Flusses nicht untersucht. Die Implementierung dynamischer Flussbedingungen stellt einen wichtigen Forschungsansatz für zukünftige Arbeiten dar und wird in nachfolgenden Untersuchungen adressiert. Das vorliegende Protokoll bietet einen reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Herstellung eines vertikal gestapelten dentin–Pulpa-Komplex-OoC-Geräts, das Dentin in einer dreischichtigen PDMS-Mikrofluidikplattform integriert. Mögliche Anwendungen des Modells umfassen die Untersuchung von Dentin–Biomaterial-Wechselwirkungen, zelluläre Reaktionen auf zahnärztliche Materialien sowie die in-vitro-Bewertung der Dentin–Pulpa-Grenzfläche unter kontrollierten experimentellen Bedingungen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biologische und chemische Materialien
Aceton	ExpertQ	SOLV 8	Reinigung von Siliziumwafern
Alpha-MEM-Kulturmedium	Cytiva	SH30265.02	Kulturmedium für dentalen Pulpa-Stammzellen
Chloramin (0,5 %)	Merck	7080-50-4	Lagerungslösung für Dentin-Scheiben
Dentale Pulpa-Stammzellen	Nicht zutreffend	Nicht zutreffend	Primäre Zellkultur. Siehe Schritte 3.2.1 und 3.2.2
EDTA (10 %)	Winkler	N2222158E	Entfernung der Verschmierungsschicht
Negatives, epoxidbasiertes Fotolack	Gersteltec	GM1060	Herstellung von Fotolithographieformen
Glutaraldehyd (2,5 %) in 0,1 M Sorensen’s Phosphatpuffer	Sigma-Aldrich	210908-06	Fixierung für REM
Gesunde menschliche Zähne (Molaren oder Prämolaren)	Nicht zutreffend	Nicht zutreffend	Menschliche Probe
Isopropanol	ExpertQ	SOLV 16	Waferreinigung, Entwicklungsstopp und PDMS-Reinigung
LIVE/DEAD-Vitalitätskit	Sigma-Aldrich	451	Fluoreszenzbasierte Vitalitätsfärbung
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)	Corning	46-013-CM	Spülen und Dichtheitsprüfung
PDMS-Basis und Härter (Polydimethylsiloxan)	Dow	Sylgard 184	Geräteherstellung
PGMEA	Sigma Aldrich	484431	Fotolackentwicklung
Trypanblau	Sigma Aldrich	T8154-100ml	Bewertung der Zellviabilität
Trypsin	Corning	25-053-CI	Zellablösung
Ultrapure Wasser	Cytiva	SH30529.01	Spüllösung
Verbrauchsmaterialien und Laborbedarf
Spritzenadeln 19G	Vmatic	VCB19050	Verbindung des Geräts mit Mikropumpe oder Spritze
Biopsiepunch (Durchmesser: 1 mm)	Harris Unicore	WHAWB100073	Herstellung von Ein- und Auslassöffnungen
Schneidematte	Nicecool	Nicht zutreffend	Oberflächenschutz beim Stanzen
Zahntechnische Polierscheiben (z. B. Sof-Lex)	3M	Sof-Lex	Polieren von Dentin
Weibliche Luer- auf konische Anschlüsse	Runze Fluidics	RH-M016	Schlauchverbindung
Glas- oder Kunststoffrührstab	Duran	Nicht zutreffend	PDMS-Mischen
Hypodermische Spritzen	Cranberry	pc-12246	Zellseeding und Dichtheitsprüfung
Keimfreie, fusselfreie Gazetücher	Linderson	Nicht zutreffend	Entfernung von Stanzrückständen
Männliche Luer-Anschlüsse	Runze Fluidics	RH-G016	Schlauchverbindung
Mischbehälter	Duran	Nicht zutreffend	PDMS-Herstellung
Petri-Schale (140 mm × 20 mm)	Deltalab	2000219	Zellkultur/Inkubation
Polytetrafluoroethylen-Unterlage	CCTVal	Nicht zutreffend	Herstellung der intermediären Dentinschicht
Siliziumwafer	Jiaozuo Commercial FineWin	Nicht zutreffend	Formherstellung
Silikonrohr	Runze Fluidics	96421	Fluidische Verbindung
T75-Flasche	Corning	353136	Vermehrung dentaler Pulpa-Stammzellen
Multiwell-Platte	SPL Life Sciences	30006	Vorbereitung für konfokale Färbung und Bildgebung
Geräte und Instrumente
Lufttrockner	METALPLAN	TITAN-040	Trocknung von Druckluft
Druckluftquelle	SCHULZ	CSD-18.1	Reinigung von Formen und Oberflächen
Konfokales Mikroskop	Olympus	Nicht zutreffend	Modell: FV1000
Direktes Laserlithographiesystem	Heidelberg	uPG 101	Belichtung des Fotolacks
Umweltrasterelektronenmikroskop	Hitachi	Nicht zutreffend	Modell: Quanta 400
Hochgeschwindigkeits-Winkelstück	Nakanishi	Nicht zutreffend	Modell: Pana-max2
Heizplatte	LabTech	EH20A Plus	Wafer- und Fotolackaushärtung
Laminar-Flow-Arbeitsplatz	BioBase	BBS8V1708313D	Sterilisation des Geräts
Mikrofluidikpumpe	New Era	Nicht zutreffend	Modell: 1002X-ES. Dichtheitsprüfung bei 10 µL/min
Mikrostrukturierte Form (hergestellt mittels Fotolithographie)	CCTVal	Nicht zutreffend	Siehe Schritt 2.2 für Spezifikationen zur Formherstellung
Ofen oder Inkubator	Memmert	UN110	PDMS-Aushärtung bei 50°C und Verbindungsfestigung bei 75°C
Vakuum-Plasma-Reinigungskammer	Fari Plasma	GD-5	Plasmaaktivierung des Wafer
Handheld-Corona-Plasma	Aurora Pro Scientific	APS-CD-20AC	Plasmaaktivierung von PDMS
Ultraschallbad	Elma Sonic	S 10 (H)	Waferreinigung
Vakuumkammer oder Exsikkator (250 mm)	Winglass	Nicht zutreffend	Entgasung von PDMS
Vakuumpumpe	ROCKER	300	Entgasung von PDMS