Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Herstellung eines vertikal gestapelten Dentin-Pulpa-Komplex-Organ-on-a-Chip-Geräts unter Verwendung einer menschlichen Dentinscheibe

110 Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/71713

⸱

14. August 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Beschreibung der Herstellung und Zusammenstellung eines vertikal gestapelten Dentin-Pulpa-Komplexes auf einem Organ-auf-einem-Chip-Gerät, das eine humane Dentinscheibe und mittels Photolithographie hergestellte Mikrokanäle umfasst, gefolgt von der Besiedlung und Kultivierung mit dentalen Pulpastammzellen.

Zusammenfassung

Konventionelle präklinische Modelle, die in der zahnmedizinischen Forschung verwendet werden, einschließlich Tiermodelle und statischer Zellkulturen, weisen wichtige Einschränkungen bei der Reproduktion der physiologischen Bedingungen der Dentin-Pulpa-Grenzfläche sowie bei der Vorhersage menschlicher biologischer Reaktionen auf zahnmedizinische Biomaterialien auf. Die Organ-auf-einem-Chip-(OoC)-Technologie bietet einen alternativen Ansatz, indem sie die Rekonstruktion gewebespezifischer Mikroumgebungen in kontrollierten mikrofluidischen Systemen ermöglicht. Diese Arbeit beschreibt ein schrittweises Protokoll zur Herstellung und Montage eines Dentin-Pulpa-Komplex-OoC-Geräts, das eine humane Dentinscheibe in einer dreischichtigen polydimethylsiloxanbasierten (PDMS) mikrofluidischen Plattform integriert. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung der Dentinscheibe, die Herstellung mikrostrukturierter Formen mittels Photolithographie, das Gießen und Aushärten von PDMS, die plasmagestützte Verbindung der Schichten, die Gerätemontage, die Dichtheitsprüfung sowie die Besiedlung mit dentalen Pulsastammzellen unter statischen Kulturbedingungen. Kritische Herstellungsparameter, die die Geräteleistung beeinflussen, werden erörtert, darunter die Kontrolle der PDMS-Schichtdicke, die Plasmabehandlung der Oberfläche und die Integration der Dentinscheibe in das Gerät, um Leckagen zu minimieren. Die Zelladhäsion und -viabilität innerhalb des Geräts wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie und konfokaler Live/Dead-Färbung evaluiert. Beispiele für Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Integration der Dentinscheibe in die mikrofluidische Anordnung, die Aufrechterhaltung dichter Bedingungen sowie die Adhäsion vitaler dentaler Pulsastammzellen an der Dentinoberfläche. Dieses Protokoll stellt einen reproduzierbaren Ansatz zur Herstellung einer Dentin-Pulpa-Komplex-OoC-Plattform bereit, der zukünftige Untersuchungen zu zellulären Reaktionen auf zahnmedizinische Biomaterialien und mikroumgebungsbedingte Reize unterstützen könnte.

Einleitung

Die Tierversuchsforschung hat seit Langem maßgeblich zum Verständnis pathologischer und physiologischer Prozesse beigetragen und spielte eine zentrale Rolle in den frühen Phasen der Arzneimittelentwicklung1. Im Laufe des 20. Jahrhunderts stieg die menschliche Lebenserwartung deutlich an, und obwohl nicht exakt quantifiziert werden kann, inwieweit diese Verbesserung allein auf Tierversuche zurückzuführen ist, wird allgemein anerkannt, dass viele moderne medizinische Therapien mithilfe von Tiermodellen entwickelt oder validiert wurden2. Zu den bemerkenswerten Beispielen zählen die Entwicklung von Impfstoffen gegen Poliomyelitis, Masern und Hepatitis B, die Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von Penicillin sowie die Herstellung von Insulin. Im Bereich der zahnmedizinischen und biomaterialwissenschaftlichen Forschung waren diese Modelle entscheidend, um den Kariesprozess, die Biologie und Regeneration des Dentin-Pulpa-Komplexes sowie die Physiopathologie des parodontalen Gewebes zu untersuchen3,4.

Trotz der umfangreichen Anwendung dieser Methoden weist die derzeitige Arzneimittelentwicklungs-Pipeline weiterhin hohe Fehlerraten auf, wobei viele Wirkstoffkandidaten in klinischen Studien scheitern, obwohl sie in präklinischen Laboruntersuchungen und Tiermodellen Wirksamkeit und Sicherheit gezeigt haben5. Diese Diskrepanz wird auf artspezifische Unterschiede zurückgeführt, die die übertragbare Vorhersagbarkeit von Tiermodellen aufgrund anatomischer, genetischer und physiologischer Differenzen zwischen den Arten einschränken können6. Zudem bleibt die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze zeitaufwändig und kostspielig7. Herkömmliche In-vitro-Modelle verwenden zudem überwiegend vereinfachte zweidimensionale (2D) Monolayer-Kulturen auf nichtphysiologischen Kunststoffuntergründen und können dadurch die biochemischen und physikalischen Reize, Zell-Zell-Interaktionen sowie die Signale der extrazellulären Matrix (ECM), wie sie in der menschlichen Mundhöhle vorkommen, nicht adäquat nachbilden8,9. Obwohl 2D-Modelle bestimmte experimentelle Vorteile bieten, sind sie grundsätzlich nicht in der Lage, die komplexen Wechselwirkungen zwischen mehreren Komponenten gleichzeitig nachzuvollziehen, wie etwa Biofilme, Biomaterialien, Dentin und Pulpa-Zellen10. Folglich steigt das Interesse an der Entwicklung alternativer experimenteller Plattformen, die menschliche biologische Reaktionen genauer reproduzieren können. Im Jahr 2022 hob der FDA Modernization Act 2.0 die verpflichtende Tierversuchsanforderung im Zulassungsverfahren für Arzneimittel auf und anerkannte das Potenzial alternativer Plattformen, einschließlich Organ-auf-einem-Chip-(OoC-)Technologien, in der präklinischen Forschung11.

Ein Organ-auf-einem-Chip (OoC) ist ein mikrofluidisches Gerät, das entwickelt wurde, um die Struktur, Funktion und Mikroumgebung einer bestimmten Organkomponente oder Gewebekomponente nachzubilden12. Diese Geräte enthalten lebende Zellen und Gewebe, die in konstruierten Mikrokanälen kultiviert werden und wesentliche Aspekte der physiologischen Mikroumgebung replizieren, der Zellen in ihrer natürlichen Umgebung ausgesetzt sind. Über die strukturelle Nachbildung hinaus ermöglichen Mikrokanäle eine räumlich-zeitliche Kontrolle über die zelluläre Umgebung und unterstützen die Aufrechterhaltung gewebespezifischer Funktionen, wodurch experimentelle Bedingungen bereitgestellt werden, die der in-vivo-Physiologie möglicherweise näherkommen als konventionelle Kultursysteme12. Von besonderer Bedeutung ist, dass Mikrokanäle in OoC-Geräten den kontrollierten Durchfluss des Kulturmediums ermöglichen, der Scherkräfte auf die angesiedelten Zellen ausübt13. Diese mechanischen Reize beeinflussen zelluläre Reaktionen wie Adhäsion, Proliferation, Migration, Genexpression und Zell-Zell-Interaktionen14,15. Zusätzlich trägt der kontinuierliche Mediumfluss durch die Zufuhr von Nährstoffen und den Abtransport metabolischer Abfallprodukte zur Aufrechterhaltung der Mikroumgebung bei16. Darüber hinaus wurde berichtet, dass einige OoC-Plattformen im Vergleich zu konventionellen zweidimensionalen (2D) Kulturen eine verbesserte Kontrolle über parameterbezogene Auslesungen im Zusammenhang mit oxidativem Stress ermöglichen, einschließlich intrazellulärer reaktiver Sauerstoffspezies und Zellviabilität, in dreidimensionalen (3D) on-chip-Modellen17. OoC-Systeme haben sich daher als vielversprechende Plattformen zur Untersuchung der Gewebephysiologie, von Biomaterial-Interaktionen und Krankheitsprozessen unter kontrollierten experimentellen Bedingungen etabliert18. In der zahnmedizinischen Forschung wurde die OoC-Technologie zunehmend zur Modellierung komplexer oraler Gewebeübergänge eingesetzt19. Frühe Zahn-auf-einem-Chip-Plattformen ahmten die Grenzfläche zwischen Biomaterial, Dentin und Pulpa nach20, während fortgeschrittenere Versionen seitdem Gefäßstrukturen und trigeminale Innervation integriert haben, um die strukturelle und funktionelle Komplexität des Pulpa-Dentin-Komplexes realistischer abzubilden21. Über die Pulpa hinaus haben dreidimensionale Modelle unreifer Wurzelkanäle die Beurteilung von endodontischen Spüllösungen und angiogenetischem Auswachsen an Stammzellen der apikalen Papille ermöglicht22,23. Auf der parodontalen Ebene wurden Zahnfleisch-auf-einem-Chip-Plattformen verwendet, um Wirt-Mikrobe-Interaktionen zu untersuchen und das immunmodulatorische Potenzial von Probiotika als therapeutische Wirkstoffe zu bewerten24, während Parodontalband-auf-Chip-Geräte gezeigt haben, wie der interstitielle Flüssigkeitsstrom die Bildung vaskulärer Netzwerke und die osteogene Differenzierung von Parodontalband-Stammzell-Sphäroiden moduliert25,26. Ergänzend zu diesen Modellen haben spezialisierte orale Mukosa-auf-einem-Chip- und Dentalimplantat-auf-einem-Chip-Systeme den Anwendungsbereich der zahnmedizinischen mikrofluidischen Forschung erweitert, indem sie Wirt-Material-Interaktionen sowie die Zytotoxizität von dentalen Monomeren unter physiologisch relevanten Bedingungen charakterisiert haben27,28.

Während OoC-Systeme zunehmend in der zahnmedizinischen, oralen und kraniofazialen Forschung eingesetzt werden, bleibt die Weiterentwicklung hin zu Standardisierung und Reproduzierbarkeit der Herstellungsabläufe von großer Bedeutung. In der Literatur wurden bereits mehrere Zahn-auf-einem-Chip-Modelle beschrieben20,29,30,31, die unterschiedliche Gerätekonfigurationen und experimentelle Anwendungen aufweisen. Unterschiede in der Gerätearchitektur, den Herstellungsverfahren, der Einbindung von Dentin sowie der Angabe experimenteller Parameter können jedoch die Reproduzierbarkeit und direkten Vergleich zwischen Studien einschränken. Insbesondere Abweichungen in der Geometrie der Mikrokanäle, den Strategien zur Integration von Dentin und den verwendeten Fertigungsmethoden können das biologische und mechanische Mikromilieu innerhalb des Geräts beeinflussen. Einige beschriebene Modelle integrieren Dentin, um Aspekte der Dentin-Pulpa-Grenzfläche nachzubilden20,29,30, während andere alternative Konfigurationen verwenden31. Zudem weisen Herstellungsverfahren wie die Photolithographie, Laserschneiden, Mikrofräsen und 3D-Druck jeweils spezifische Vor- und Nachteile auf, abhängig vom geplanten Gerätedesign und der Anwendung. Ein weiterer entscheidender Faktor für die biologische Eignung ist die architektonische Ausrichtung des Geräts, insbesondere, ob die Kanäle und die Dentinscheibe in horizontaler oder vertikaler Anordnung vorliegen19,32. Bei horizontal gestapelten Konfigurationen ermöglichen nebeneinander angeordnete Kompartimente eine laterale Kompartimentalisierung und die Echtzeit-Visualisierung von Zellen, wodurch sie sich besonders gut zur Modellierung von Geweben mit inhärent lateraler räumlicher Organisation eignen, wie beispielsweise dem parodontalen Komplex24,32. Diese Bauform ist jedoch prinzipiell begrenzt, was die Nachbildung senkrechter biologischer Grenzflächen betrifft, wie etwa des Biomaterial-Dentin-Pulpa-Komplexes, da die laterale Anordnung der Kompartimente die in-vivo-Orientierung der Dentinbarriere zwischen Kavität und Pulpa nicht genau widerspiegelt20,32. Vertikal gestapelte Konfigurationen beheben diese Einschränkungen, indem sie zwei Kompartimente entlang der y-Achse übereinander anordnen, getrennt durch eine native Dentinscheibe, wodurch gleichzeitig der molekulare Transport durch intaktes Dentin quantifiziert und die Reaktionen der Pulpa-Zellen in Echtzeit über das Ablaufmedium überwacht werden können30. Eine bekannte Einschränkung dieser Anordnung betrifft jedoch die Querschnittsbildgebung der Dentin-Zell-Grenzfläche, da die Aufnahme von Querschnittsbildern der Dentin-Zell-Grenzfläche innerhalb derselben Fokusebene technisch anspruchsvoller ist als bei horizontal gestapelten Konfigurationen, bei denen Zellen und extrazelluläre Matrizes lateral angeordnet sind. Obwohl mehrere Dentin-Pulpa-Komplex-auf-einem-Chip-Modelle in der Literatur beschrieben wurden, verwenden die meisten eine horizontal gestapelte Konfiguration, bei der die Kompartimente innerhalb derselben Ebene nebeneinander liegen10,20,21,29, während vergleichsweise wenige eine native Dentinscheibe in einer vertikal gestapelten Anordnung integriert haben30. Dennoch behindern weiterhin Unterschiede in den Herstellungsansätzen und der Angabe von Parametern zwischen diesen Modellen die Reproduzierbarkeit und den Vergleich über verschiedene Studien hinweg33. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, die methodische Reproduzierbarkeit zu verbessern, indem ein detailliertes Herstellungsprotokoll für ein vertikal gestapeltes Zahn-auf-einem-Chip-Gerät bereitgestellt wird, um so die breitere Anwendung dieser Plattform innerhalb der zahnmedizinischen Forschungsgemeinschaft zu fördern.

Diese Arbeit beschreibt eine schrittweise Herstellungs- und Montageanleitung für ein vertikal gestapeltes Dentin–Pulpa-Komplex-OoC-Gerät, das eine humane Dentinscheibe in einer dreischichtigen polydimethylsiloxanbasierten (PDMS) mikrofluidischen Plattform enthält, die mittels einer photolithographisch hergestellten Form gefertigt wird. Die Anleitung beschreibt außerdem das Ansäen und die Kultivierung von dentalen Pulsastammzellen innerhalb des Geräts unter statischen Bedingungen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von dem Ethikkomitee der Universidad de La Frontera für Studien mit menschlichen Proben genehmigt.

1. Gewinnung der Dentinscheibe

HINWEIS: Bereiten Sie den Geräteentwurf vor Beginn des Protokolls vor (Abbildung 1A–1C).

  1. Sammlung und Lagerung von Zähnen
    1. Gesunde menschliche Molaren oder Prämolaren sammeln, nachdem eine informierte Einwilligung des Patienten vorliegt.
    2. Alle Proben in 0,5 %iger Chloraminlösung bei 4 °C aufbewahren, um eine Austrocknung des Dentins und eine Denaturierung von Proteinen zu verhindern.
    3. Die Chloraminlösung wöchentlich während der Lagerung erneuern.
  2. Herstellung von Dentinscheiben
    1. Jeden Zahn horizontal im mittleren Drittel der Krone mit einem Hochgeschwindigkeitsstück, das mit 350.000 U/min arbeitet und mit einem zylindrischen Diamantfräser (1 mm Durchmesser; Körnung 100–150 µm) ausgestattet ist, durchtrennen.
    2. Die Durchtrennung unter kontinuierlicher Wasserirrigation mit etwa 50 mL/min durchführen.
    3. Den Schnitt im mittleren Drittel der Krone ansetzen, um die Pulpa und den im okklusalen Bereich der Fissuren und Gräben vorhandenen Zahnschmelz zu vermeiden, um so eine Scheibe zu erhalten, die überwiegend aus Dentingewebe besteht.
      ACHTUNG: Die Zahndurchtrennung unter kontinuierlicher Spülung durchführen und geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen, einschließlich Handschuhe, Maske und Schutzbrille.
  3. Nachbearbeitung der Dentinscheiben
    1. Die Dentinscheibe mit Schleifscheiben abnehmender Körnung polieren.
    2. Das Polieren fortsetzen, bis eine endgültige Dentinstärke von etwa 0,8 mm (± 0,3 mm) und laterale Abmessungen von etwa 5 mm × 5 mm (± 0,3 mm) erreicht sind (Abbildung 1D).
  4. Lagerung der Dentinscheiben
    1. Die hergestellten Dentinscheiben bis zur Montage im OoC-Gerät in 0,5 %iger Chloraminlösung bei 4 °C lagern.

Schema der Montage eines mikrofluidischen Geräts; Fertigungsstufen mit Pinzette, Lochwerkzeug und Flüssigkeitsführung.
Abbildung 1: Design- und Fertigungsablauf des dentin–Pulpa-Komplex-Organs-auf-einem-Chip (OoC)-Geräts. (A) Dreidimensionales Design des Geräts mit Darstellung der dreischichtigen Architektur. (B) Draufsicht auf das Gerätedesign mit den wichtigsten Abmessungen. (C) Seitenansicht der dreischichtigen Gerätekonfiguration. (D) Repräsentative Dentinscheibe mit einer Dicke von etwa 0,8 mm und lateralen Abmessungen von ungefähr 5 mm × 5 mm. (E) Silikon-Formwerkzeug, hergestellt mittels Photolithographie, zur Gießung der oberen und unteren Polydimethylsiloxan-(PDMS-)Schichten. (F) Entfernung einer gehärteten PDMS-Schicht aus der Silikonform nach thermischer Polymerisation. (G) Plasma-Behandlung der PDMS-Oberfläche vor der Schichtenverbindung. (H) Fertiges dreischichtiges OoC-Gerät für den Dentin–Pulpa-Komplex, zusammengesetzt durch Plasmaverbindung und unter Einbindung der Dentin-Grenzfläche. (I) Assembliertes Gerät, angeschlossen an Schläuche zur Undichtigkeitsprüfung und Vorbereitung mikrofluidischer Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

2. Herstellung des Dentin–Pulpa-Komplex-OoC-Geräts

  1. Vorbereitung des Arbeitsplatzes und der Materialien
    1. Vorbereitung der Materialien und Geräte
      1. Bereiten Sie alle in der Tabelle der Materialien aufgeführten Materialien und Geräte vor Beginn der Geräteherstellung vor.
      2. Bereiten Sie die Biopsiebohrer vor der Gerätemontage vor.
      3. Führen Sie alle Herstellungsschritte in einer sauberen, staubfreien Umgebung durch.
      4. Tragen Sie während der gesamten Geräteherstellung und -montage Handschuhe, Schutzbrille und geeignete persönliche Schutzausrüstung.
        HINWEIS: Bereiten Sie die durch Photolithographie hergestellte Form vor Beginn des Protokolls vor (Abbildung 1E).
  2. Herstellung der mikrostrukturierten Form
    1. Vorbereitung des Silizium-Wafers
      1. Stellen Sie die Form auf einem 4-Zoll-Wafer aus einseitig poliertem Silizium her (N-Typ, As-dotiert, CZ-Züchtungsmethode, <100> Orientierung, 500 ±± 25 µm Dicke, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, Widerstand 0,001–0,005 Ω·cm).
      2. Reinigen Sie den Wafer nacheinander 10 min lang in Aceton, Isopropanol und ultrareinem Wasser unter Ultraschallbehandlung.
      3. Trocknen Sie den Wafer mit Druckluft.
      4. Backen Sie den Wafer 10 min lang auf einer Heizplatte bei 200 °C, um restliche Feuchtigkeit zu entfernen.
      5. Lassen Sie den Wafer auf Raumtemperatur (RT; 20 °C–25 °C) abkühlen.
    2. Oberflächenaktivierung und Photoresist-Beschichtung
      1. Aktivieren Sie die Oberfläche des Silizium-Wafers mit einem Vakuum-Plasmareiniger, der mit Luftplasma auf Stufe 7 für 120 s betrieben wird.
      2. Tragen Sie den epoxybasierten negativen Photoresist GM 1060 durch Spin-Beschichtung bei 300 U/min für 10 s auf.
      3. Fahren Sie mit der Spin-Beschichtung bei 565 U/min für 100 s und 965 U/min für 1 s mit einer Beschleunigung von 200 U/min/s fort.
      4. Lassen Sie den beschichteten Wafer 10 min ruhen.
      5. Führen Sie ein Vorbacken bei 65 °C für 10 min durch.
      6. Fahren Sie das Vorbacken bei 95 °C für 1 h fort.
      7. Lassen Sie den Wafer auf RT abkühlen.
    3. Belichtung und Entwicklung
      1. Belichten Sie den Photoresist mit einem Direktlaser-Lithographiesystem mit einer Dosis von 1.950 mJ/cm2.
      2. Führen Sie ein Nachbacken bei 65 °C für 10 min durch.
      3. Fahren Sie das Nachbacken bei 95 °C für 30 min fort.
      4. Lassen Sie den Wafer auf RT abkühlen.
      5. Lassen Sie den Wafer 10 min ruhen.
      6. Entwickeln Sie das Muster 4 min lang in PGMEA.
      7. Verlängern Sie die Entwicklung in 30-s-Intervallen, falls Reste des Photoresists verbleiben.
      8. Beenden Sie die Entwicklung durch Spülen mit Isopropanol.
      9. Trocknen Sie den Wafer mit Druckluft.
    4. Endbacken
      1. Führen Sie ein Endbacken bei 135 °C für 2 h durch.
      2. Erhalten Sie eine mikrostrukturierte Urform mit Mikrokanälen von 1 mm Breite und 50 µm Höhe.
  3. Vorbereitung und Entgasung der PDMS-Mischung
    1. Vorbereitung der PDMS-Mischung
      1. Mischen Sie die PDMS-Grundmasse und den Härter im Gewichtsverhältnis 10:1.
      2. Rühren Sie die Mischung etwa 5 min lang manuell mit einem Glasstab in einem Plastikbecher um.
      3. Halten Sie während des Mischens langsame und kontinuierliche Kreisbewegungen ein.
        HINWEIS: Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen während des Mischens.
    2. Entgasung
      1. Stellen Sie die PDMS-Mischung in einen Vakuum-Exsikkator, der an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist.
      2. Entgasen Sie die Mischung etwa 5 min lang bei ca. 700 mmHg.
      3. Lösen Sie das Vakuum kurzzeitig, damit Oberflächenblasen platzen können.
      4. Wenden Sie das Vakuum erneut an.
      5. Wiederholen Sie den Zyklus, bis keine sichtbaren Blasen mehr vorhanden sind.
        HINWEIS: Die gesamte Entgasungszeit beträgt typischerweise etwa 30 min.
  4. Gießen von PDMS auf die Form
    1. Vorbereitung der Form
      1. Stellen Sie die Form auf eine ebene Fläche.
      2. Reinigen Sie die Form mit Druckluft.
      3. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit der strukturierten Oberfläche.
      4. Stellen Sie sicher, dass die Form frei von Staub und Verunreinigungen ist.
    2. Dosieren von PDMS
      1. Dosieren Sie etwa 8 g PDMS um die Dentinscheibe herum, um die Dentin-Einbettungsschicht herzustellen.
      2. Passen Sie die PDMS-Höhe an die Dicke der Dentinscheibe (0,8 ±± 0,3 mm) an.
      3. Verhindern Sie, dass PDMS die Dentin-Oberfläche bedeckt.
      4. Dosieren Sie etwa 0,26 g PDMS pro Formeinheit, um jede Mikrokanalschicht herzustellen.
      5. Klopfen Sie vorsichtig auf die Form oder erzeugen Sie Vibrationen, um das Befüllen der Mikrostrukturen zu erleichtern.
      6. Lassen Sie das PDMS in die kleinsten Strukturen eindringen.
      7. Bedecken Sie die Form mit einem Deckel oder einer flachen Abdeckung, ohne die PDMS-Oberfläche zu berühren.
        HINWEIS: Die Dentin-Einbettungsschicht ist etwa 0,8 mm dick, und jede Mikrokanalschicht ist etwa 0,4 mm dick, was eine Gesamtdicke des Geräts von etwa 1,6 mm ergibt.
        HINWEIS: Passen Sie die Schichtdicke entsprechend der Arbeitsdistanz des konfokalen Objektivs an, wenn konfokale Bildgebung geplant ist.
  5. Aushärtung
    1. Stellen Sie die Formen in einen Ofen bei 50 °C.
    2. Härten Sie das PDMS 4 h lang aus.
  6. Entfernung der PDMS-Schichten
    1. Entfernung des ausgehärteten PDMS
      1. Lösen Sie die ausgehärteten PDMS-Schichten vorsichtig von der Form ab (Abbildung 1F).
      2. Handhaben Sie die PDMS-Schichten sorgfältig, um Beschädigungen der Mikrostrukturen zu vermeiden.
  7. Verbindung der PDMS-Schichten und Herstellung der Einlass- und Auslassöffnungen
    1. Herstellung der Einlass- und Auslassöffnungen
      1. Erzeugen Sie Perforationen an den vorgesehenen Ein- und Auslasspositionen mithilfe eines 1-mm-Biopsiebohrers.
      2. Richten Sie die Mikrokanalseite nach oben, während Sie bohren.
        HINWEIS: Legen Sie die PDMS-Schicht auf eine Schneidematte, um strukturelle Schäden zu vermeiden.
      3. Erzeugen Sie zwei Perforationen in der oberen Schicht, die dem oberen Mikrokanal entsprechen.
    2. Reinigung der PDMS-Schichten
      1. Reinigen Sie die PDMS-Schichten mit Isopropanol oder Ethanol.
      2. Entfernen Sie restliche Staubpartikel mit steriler Klebefolie.
      3. Stellen Sie vor der Montage sicher, dass alle Verbindungsoberflächen frei von Verunreinigungen sind.
    3. Plasmaaktivierung der PDMS-Oberflächen
      1. Positionieren Sie die obere und mittlere PDMS-Schicht für die Plasma-Behandlung (Abbildung 1G).
      2. Aktivieren Sie die Oberflächen mit einem handgeführten Corona-Plasma-Behandler, der mit Umgebungsluft als Arbeitsgas bei etwa 25 W betrieben wird.
      3. Halten Sie einen Abstand von etwa 1 mm zwischen Plasmaquelle und PDMS-Oberfläche ein.
        ACHTUNG: Führen Sie die Plasma-Behandlung unter geeigneter Belüftung durch und vermeiden Sie direkten Kontakt mit dem plasmagebildeten Ozon.
      4. Schalten Sie das Plasma-Behandlungsgerät ein und lassen Sie es 5 s lang stabilisieren.
      5. Stellen Sie vor der Behandlung sicher, dass ein gleichmäßiger Plasmastrahl erzeugt wird.
      6. Behandeln Sie die obere PDMS-Schicht 10 s lang mit kontinuierlicher Hin- und Herbewegung bei etwa 5 mm/s.
      7. Behandeln Sie die mittlere PDMS-Schicht 10 s lang mit gleicher Bewegung und Distanz.
      8. Führen Sie unmittelbar vor der Verbindung eine zusätzliche 1-s-Plasma-Behandlung an der oberen Schicht durch.
    4. Verbindung der oberen und mittleren Schichten
      1. Richten Sie den oberen Mikrokanal unmittelbar nach der Plasma-Behandlung mit der Dentinscheibe aus.
      2. Verbinden Sie die obere und mittlere Schicht miteinander.
      3. Stellen Sie die verbundene Baugruppe 5 min lang in einen Ofen bei 75 °C.
      4. Stabilisieren Sie die Verbindung während der Inkubation.
        HINWEIS: Die Dentinscheibe und der Mikrokanal sind mit bloßem Auge sichtbar und können ohne zusätzliche Ausrichtungshilfen ausgerichtet werden.
    5. Herstellung der Öffnungen für den unteren Mikrokanal
      1. Stanzen Sie zwei Perforationen, die dem unteren Mikrokanal entsprechen, durch die verbundene obere und mittlere Schicht.
      2. Stanzen Sie durch beide Schichten gleichzeitig, um die Ausrichtung sicherzustellen.
        HINWEIS: Dieses Verfahren erzeugt vier Perforationen in der oberen Schicht und zwei Perforationen in der mittleren Schicht.
      3. Legen Sie die verbundene Baugruppe vor dem Stanzen auf eine feste Schneidematte.
      4. Üben Sie gleichmäßigen Druck in einer einzigen Bewegung aus.
        HINWEIS: Vermeiden Sie rotierende oder seitliche Kräfte, um das Delaminierungsrisiko zu minimieren.
      5. Entfernen Sie Rückstände an den Perforationsstellen mit steriler, fusselfreier Gazetupfer, die mit Isopropanol angefeuchtet wurden.
      6. Untersuchen Sie die Perforationen und umgebenden verbundenen Bereiche unter ausreichender Beleuchtung.
      7. Stellen Sie vor Fortsetzung sicher, dass keine Delamination, Risse oder unvollständige Perforationen vorliegen.
    6. Verbindung der unteren Schicht
      1. Behandeln Sie die untere Schicht wie in Schritt 2.7.4 beschrieben mit Plasma.
      2. Richten Sie die Ein- und Auslassöffnungen des unteren Mikrokanals mit den Perforationen in der oberen und mittleren Schicht aus.
      3. Verbinden Sie die untere Schicht, um die Gerätemontage abzuschließen.
        HINWEIS: Markieren Sie die Positionen von Ein- und Auslass an der äußeren Oberfläche der unteren Schicht vor der Verbindung, um die Ausrichtung zu erleichtern.
        HINWEIS: Plasma-Kammern können laut Literatur eine stärkere Verbindung als Plasma-Stifte ermöglichen36.
        HINWEIS: Das fertige Gerät besteht aus einer dreischichtigen mikrofluidischen Plattform mit einer Dentin-Grenzfläche (Abbildung 1H). Die untere Dentin-Oberfläche repräsentiert die Pulpa-Seite des Modells, während die obere Dentin-Oberfläche die koronale Seite für die Exposition gegenüber dentalen Biomaterialien oder Bakterienpräparationen darstellt.
  8. Lecktest des mikrofluidischen Geräts
    1. Inspektion des montierten Geräts
      1. Prüfen Sie das montierte Gerät auf Fehlausrichtungen.
      2. Untersuchen Sie die Montage auf unvollständige Verbindung und sichtbare Lecks.
    2. Lecktest
      1. Verbinden Sie 19G Luer-Lock-Nadeln mit den Einlassöffnungen (Abbildung 1E).
      2. Verbinden Sie die Nadeln mit mikrofluidischen Pumpenschläuchen.
      3. Drücken Sie die Nadelspitzen vorsichtig in die gestanzten Öffnungen, um eine luftdichte Verbindung zu erzielen.
      4. Injizieren Sie steriles PBS oder Kulturmedium mit einer Flussrate von 10 µL/min.
      5. Halten Sie den Fluss mindestens 5 min lang aufrecht.
      6. Untersuchen Sie während des Flusses alle verbundenen Schnittstellen, Kanalränder und Ränder der Dentinscheibe.
      7. Beobachten Sie das Gerät während und nach der Injektion unter ausreichender Beleuchtung.
      8. Stellen Sie sicher, dass keine Flüssigkeitsansammlung, Feuchtigkeit oder Tropfenbildung auftritt.
      9. Klassifizieren Sie das Gerät als dicht, wenn kein Leck festgestellt wird.
      10. Entsorgen Sie Geräte mit Leckagen.
        HINWEIS: Führen Sie den Lecktest an jedem hergestellten Gerät vor der Zellbesiedlung oder experimentellen Nutzung durch.
  9. Sterilisation und Lagerung des mikrofluidischen Geräts
    1. Sterilisation
      1. Bestrahlen Sie die obere Oberfläche des montierten Geräts 30 min lang mit UV-Licht (254 nm) in einem laminaren Flusswerk.
      2. Bestrahlen Sie die untere Oberfläche weitere 30 min lang mit UV-Licht.
      3. Spülen Sie die Mikrokanäle 20 min lang mit 70 %igem Ethanol durch.
      4. Waschen Sie die Mikrokanäle dreimal mit steriler PBS, um restliches Ethanol zu entfernen.
    2. Lagerung
      1. Verwenden Sie das sterilisierte Gerät unmittelbar für Zellkulturversuche.
      2. Alternativ lagern Sie das Gerät in steriler PBS bei 4 °C in einem sterilen Behälter, bis zur Verwendung.
        ​ACHTUNG: Verwenden Sie nach der Gerätemontage keine Chlamin- oder andere Desinfektionslösungen, da PDMS diese Verbindungen aufnehmen könnte und die Zellviabilität beeinträchtigt werden könnte.

3. Beurteilung der Adhäsion und Vitalität von dentalen Pulpastammzellen

  1. Präkonditionierung der Dentinoberfläche
    1. Injizieren Sie 10 % EDTA in das Gerät.
    2. Den Kontakt zwischen der EDTA-Lösung und der Dentinoberfläche 15 min lang aufrechterhalten.
    3. Injizieren Sie alle 3 Minuten 0,5 mL EDTA, um die Flüssigkeitsbewegung innerhalb des Mikrokanals aufrechtzuerhalten.
    4. Den Dentinscheiben dreimal mit ultrareinem Wasser waschen.
    5. Führen Sie jeden Waschschritt 5 min lang durch.
      HINWEIS: Die Behandlung mit EDTA entfernt die Schmierschicht und exponiert Dentin-Matrixproteine.
      ACHTUNG: EDTA-Lösungen unter Verwendung von Handschuhen und Schutzbrille handhaben, um Haut- und Augenreizungen zu vermeiden.
  2. Aussaat von dentalen Pulpastammzellen
    1. Expansion von dentalen Pulpastammzellen
      1. Säen Sie dentale Pulpastammzellen in einer T75-Flasche mit einer Dichte von 1 × 106 Zellen pro Kolben
      2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37°C und 5 % CO2 bis eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht ist
      3. Die Zellen mit Trypsin lösen.
      4. Den Trypsin mit vollständigem Kulturmedium neutralisieren.
      5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension, um ein Zellpellet zu erhalten.
      6. Beurteilen Sie die Zellviabilität mithilfe von Trypanblau.
      7. Verwenden Sie Zellsuspensionen mit einer Vitalität von ≥90 %.
    2. Herstellung der Zellsuspension
      1. Bereiten Sie eine vorerwärmte Zellsuspension vor bei 37°C.
      2. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 100.000 Zellen/mL im vollständigen Kulturmedium ein.
      3. Bereiten Sie ein Endvolumen der Suspension von 1–2 mL vor.
        HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden Zellen der Passage 5 verwendet.
    3. Zellseeding
      1. Injizieren Sie die Zellsuspension in die Einlassöffnung des unteren Mikrokanals.
      2. Drehen Sie das Gerät nach der Zellansaat um.
        HINWEIS: Die Umkehrung des Geräts fördert die Sedimentation der Zellen in Richtung der Dentinoberfläche und verbessert die Zelladhäsion.
    4. Inkubation
      1. Stellen Sie das umgedrehte Gerät in eine Petrischale.
      2. Geben Sie 1 mL Kulturmedium in die Petrischale, um Verdunstung zu minimieren.
      3. Inkubieren Sie das Gerät bei 37°C und 5 % CO2 für 24 h.
      4. Halten Sie die statischen Kulturbedingungen während des gesamten Inkubationszeitraums aufrecht.
        HINWEIS: Eine Validierung des dynamischen Flusses wurde in der vorliegenden Studie nicht durchgeführt.
        HINWEIS: Das vorliegende Protokoll beschreibt statische Kulturbedingungen für die initiale Validierung des Geräts und die Beurteilung der Zelladhäsion.
    5. Erste Gerätevalidierung
      1. Beurteilen Sie die Zelladhäsion mittels Rasterelektronenmikroskopie.
      2. Entnehmen Sie die Dentinscheibe durch Zerlegen des Geräts vor der Analyse.
  3. Präparation von Proben für die Rasterelektronenmikroskopie
    1. Probenentnahme und -wäschung
      1. Zerlegen Sie das Gerät nach 24-stündiger Inkubation.
      2. Holen Sie die Dentinscheibe heraus und überführen Sie sie in eine Kulturplatte oder eine Petrischale.
      3. Positionieren Sie die mit Zellen besiedelte Dentinoberfläche mit der Zellseite nach oben.
      4. Spülen Sie die Dentinscheibe zweimal mit jeweils 1 mL PBS.
    2. Fixierung
      1. Geben Sie 2 mL einer 2,5 %igen Glutaraldehyd-Lösung in 0,1 M Sorensen-Phosphatpuffer hinzu.
      2. Die Probe 30 min bei RT inkubieren.
        ACHTUNG: Glutaraldehyd ist toxisch und kann Haut-, Augen- und Atemwegsreizungen verursachen. Die Fixierungsprozeduren müssen unter einer chemischen Abzugshaube und unter Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.
    3. Waschen nach der Fixierung
      1. Entfernen Sie die Glutaraldehydlösung.
      2. Den Dentinscheiben dreimal mit ultrareinem destilliertem Wasser bei Raumtemperatur waschen.
    4. REM-Analyse
      1. Analysieren Sie die Proben mit einem umweltselektiven Rasterelektronenmikroskop.
      2. Betreiben Sie das Mikroskop unter Niedervakuumbedingungen (25 Pa).
      3. Verwenden Sie eine Beschleunigungsspannung von 10,0 kV und einen Arbeitsabstand von 7,0 mm.
      4. Erwerben Sie Bilder im Rückstreuelektronen-3D-Erkennungsmodus (BSE-3D).
      5. Bildaufnahme mit 200-facher Vergrößerung (Abbildung 2A).
  4. Beurteilung der Zellviabilität mittels konfokaler Mikroskopie
    1. Probenvorbereitung
      1. Säen und kultivieren Sie die Zellen wie in Schritt 3.2 beschrieben.
      2. Inkubieren Sie das Gerät 24 h bei 37°C und 5 % CO2.
      3. Zerlegen Sie das Gerät und legen Sie die Dentinoberfläche frei.
      4. Überführen Sie die Dentinscheibe in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte, die mit vorgewärmtem HBSS gefüllt ist.+/+ ergänzt mit Ca2+ und Mg2+.
    2. Probenwäscherei
      1. Spülen Sie die Dentinscheibe zweimal mit HBSS+/+.
      2. Entfernen Sie vor der Färbung restliches Serum und Phenolrot.
        HINWEIS: Restserum und Phenolrot können die Hintergrundautofluoreszenz erhöhen.
    3. Färbung lebender Zellen
      1. Bereiten Sie eine frische Arbeitslösung von Calcein AM zu 2 µM in HBSS+/+.
      2. Geben Sie ausreichend Färbelösung hinzu, um die Dentinoberfläche vollständig zu bedecken.
      3. Inkubieren Sie die Probe 20 min bei 37°C im Dunkeln.
      4. Entfernen Sie die Färbelösung nach der Inkubation.
    4. Färbung von toten Zellen
      1. Fügen Sie die working solution von Propidiumiodid (1–2 µg/mL in HBSS+/+).
      2. Inkubieren Sie die Probe 5–8 min bei 37°C im Dunkeln.
      3. Die Inkubationszeit darf 10 Minuten nicht überschreiten.
      4. Die Probe zweimal mit HBSS waschen+/+.
      5. Halten Sie die Probe bis zur Bildgebung in Puffer untergetaucht.
    5. Aufnahme mittels konfokaler Mikroskopie
      1. Erhalten Sie die konfokalen Bilder innerhalb von 30 Minuten nach der Färbung.
      2. Nehmen Sie die Bilder nacheinander in den grünen und roten Kanälen auf.
      3. Verwenden Sie λBeispiel 490 nm und λem 515 nm für die Live-Cell-Bildgebung.
      4. Verwenden Sie λBeispiel 535 nm und λem 617 nm für die Bildgebung von abgestorbenen Zellen.
        HINWEIS: Fluoreszenzfarbstoff-Lösungen und gefärbte Proben während der Inkubation und Bildgebung vor Lichteinwirkung schützen (Abbildung 2B).

Vergleich der Elektronenmikroskopie und der Fluoreszenzmikroskopie, Analyse zellulärer Strukturen
Abbildung 2: Repräsentative Bewertung der Adhäsion und Vitalität von dentalen Pulpastammzellen im Dentin-Pulpa-Komplex-OoC-System. (A) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme, die adhärierte dentale Pulpastammzellen (weißer Stern) auf der Dentinoberfläche nach 24-stündiger statischer Kultur innerhalb des OoC-Systems zeigen. Nach 24-stündiger Kultur bedeckten adhärierte Zellen 54,35 ± 0,92 % der dem Mikrokanal ausgesetzten Dentinoberfläche. Im mit PDMS bedeckten Dentinbereich sind keine Zellen zu erkennen (schwarzer Stern), was auf eine wirksame Abdichtung zwischen den Systemschichten hinweist. Maßstabsbalken = 200 µm. (B) Konfokale Mikroskopieaufnahme, die lebensfähige, grün angefärbte dentale Pulpastammzellen zeigen, die nach 24-stündiger statischer Kultur an der Dentinoberfläche adhäriert sind (weiße Pfeile). Auch nicht lebensfähige, rot angefärbte Zellen sind sichtbar (blaue Pfeile). Maßstabsbalken = 50 µm. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die erfolgreiche Herstellung des Zahn-auf-einem-Chip-Geräts folgte dem in Abbildung 1A–1I dargestellten Arbeitsablauf, einschließlich der Vorbereitung der Dentinscheibe (Abbildung 1D), der Herstellung der photolithographisch erzeugten Form (Abbildung 1E), der Entfernung der ausgehärteten PDMS-Schichten (Abbildung 1F), der Plasmaaktivierung vor der Verbindung (Abbild...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Diese Studie beschreibt ein schrittweises Protokoll zur Herstellung eines vertikal gestapelten Zahn-auf-einem-Chip-Geräts, das Dentin und dentale Pulpastammzellen enthält, und zeigt repräsentative Zelladhäsion und Zellviabilität innerhalb des Geräts unter statischen Kulturbedingungen. Das Protokoll wurde entwickelt, um einen reproduzierbaren Arbeitsablauf für die Herstellung und Montage einer dentin-pulpa-Komplex-OoC-Plattform bereitzustellen, die für in-vitro-Untersuchungen der Dentin-Grenzfläche geeignet ist. Die Etabl...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren geben keine konkurrierenden finanziellen Interessen an und haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Projekt DIM24-0004 und das Projekt PP24-0031 der Dirección de Investigación der Universidad de La Frontera; FONDECYT Regular Nr. 1260116; sowie FONDECYT de Iniciación Nr. 11230701 der Nationalen Agentur für Forschung und Entwicklung (ANID), Chile.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Biologische und chemische Materialien
AcetonExpertQSOLV 8Reinigung von Siliziumwafern
Alpha-MEM-KulturmediumCytivaSH30265.02Kulturmedium für dentalen Pulpa-Stammzellen
Chloramin (0,5 %)Merck7080-50-4Lagerungslösung für Dentin-Scheiben
Dentale Pulpa-StammzellenNicht zutreffendNicht zutreffendPrimäre Zellkultur. Siehe Schritte 3.2.1 und 3.2.2
EDTA (10 %)WinklerN2222158EEntfernung der Verschmierungsschicht
Negatives, epoxidbasiertes FotolackGersteltecGM1060Herstellung von Fotolithographieformen
Glutaraldehyd (2,5 %) in 0,1 M Sorensen’s PhosphatpufferSigma-Aldrich210908-06Fixierung für REM
Gesunde menschliche Zähne (Molaren oder Prämolaren)Nicht zutreffendNicht zutreffendMenschliche Probe
IsopropanolExpertQSOLV 16Waferreinigung, Entwicklungsstopp und PDMS-Reinigung
LIVE/DEAD-VitalitätskitSigma-Aldrich451Fluoreszenzbasierte Vitalitätsfärbung 
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)Corning46-013-CMSpülen und Dichtheitsprüfung
PDMS-Basis und Härter (Polydimethylsiloxan)DowSylgard 184Geräteherstellung
PGMEASigma Aldrich484431Fotolackentwicklung
TrypanblauSigma Aldrich T8154-100mlBewertung der Zellviabilität
TrypsinCorning25-053-CIZellablösung
Ultrapure WasserCytivaSH30529.01Spüllösung
Verbrauchsmaterialien und Laborbedarf
Spritzenadeln 19GVmaticVCB19050Verbindung des Geräts mit Mikropumpe oder Spritze
Biopsiepunch (Durchmesser: 1 mm)Harris UnicoreWHAWB100073Herstellung von Ein- und Auslassöffnungen
SchneidematteNicecoolNicht zutreffendOberflächenschutz beim Stanzen
Zahntechnische Polierscheiben (z. B. Sof-Lex)3MSof-LexPolieren von Dentin
Weibliche Luer- auf konische AnschlüsseRunze FluidicsRH-M016Schlauchverbindung
Glas- oder KunststoffrührstabDuranNicht zutreffendPDMS-Mischen
Hypodermische SpritzenCranberrypc-12246Zellseeding und Dichtheitsprüfung
Keimfreie, fusselfreie GazetücherLindersonNicht zutreffendEntfernung von Stanzrückständen
Männliche Luer-AnschlüsseRunze FluidicsRH-G016Schlauchverbindung
MischbehälterDuranNicht zutreffendPDMS-Herstellung
Petri-Schale (140 mm × 20 mm)Deltalab2000219Zellkultur/Inkubation
Polytetrafluoroethylen-UnterlageCCTValNicht zutreffendHerstellung der intermediären Dentinschicht
SiliziumwaferJiaozuo Commercial FineWinNicht zutreffendFormherstellung
SilikonrohrRunze Fluidics96421Fluidische Verbindung
T75-FlascheCorning 353136Vermehrung dentaler Pulpa-Stammzellen
Multiwell-PlatteSPL Life Sciences30006Vorbereitung für konfokale Färbung und Bildgebung
Geräte und Instrumente
LufttrocknerMETALPLANTITAN-040Trocknung von Druckluft
DruckluftquelleSCHULZCSD-18.1Reinigung von Formen und Oberflächen
Konfokales MikroskopOlympusNicht zutreffendModell: FV1000
Direktes LaserlithographiesystemHeidelberguPG 101Belichtung des Fotolacks
UmweltrasterelektronenmikroskopHitachiNicht zutreffendModell: Quanta 400 
Hochgeschwindigkeits-WinkelstückNakanishiNicht zutreffendModell: Pana-max2
HeizplatteLabTechEH20A PlusWafer- und Fotolackaushärtung
Laminar-Flow-ArbeitsplatzBioBaseBBS8V1708313DSterilisation des Geräts
MikrofluidikpumpeNew EraNicht zutreffendModell: 1002X-ES. Dichtheitsprüfung bei 10 µL/min
Mikrostrukturierte Form (hergestellt mittels Fotolithographie)CCTValNicht zutreffendSiehe Schritt 2.2 für Spezifikationen zur Formherstellung
Ofen oder InkubatorMemmertUN110PDMS-Aushärtung bei 50°C und Verbindungsfestigung bei 75°C
Vakuum-Plasma-ReinigungskammerFari PlasmaGD-5Plasmaaktivierung des Wafer
Handheld-Corona-Plasma Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACPlasmaaktivierung von PDMS
UltraschallbadElma SonicS 10 (H)Waferreinigung
Vakuumkammer oder Exsikkator (250 mm)WinglassNicht zutreffendEntgasung von PDMS
VakuumpumpeROCKER300Entgasung von PDMS

Referenzen

  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Organ on a Chipmikrofluidisches BauteilPDMS Gie enPhotolithografiePlasma Oberfl chenbehandlungdentale PulpastammzellenZelladh sionkonfokale Mikroskopie

Dieser Artikel wurde veröffentlicht

Video demnächst verfügbar

Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.