SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology): Eine integrierte Computerplattform zur Optimierung des Kryo-Elektronenmikroskopie-Arbeitsablaufs

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert einen schrittweise Cryo-Elektronenmikroskopie-Workflow mit einer integrierten Softwareplattform (SMART), die Datenerfassung, dreidimensionale Rekonstruktion und den Aufbau atomarer Modelle in einer einzigen browserbasierten Schnittstelle verbindet. Als repräsentatives Beispiel wird die menschliche TRPML1-Struktur mit einer Auflösung von 2,38 Å bestimmt.

Zusammenfassung

Die Kryoelektronenmikroskopie (Kryo-EM) ist zu einem zentralen Werkzeug in der Strukturbiologie geworden, doch erfordern aktuelle Arbeitsabläufe typischerweise mehrere spezialisierte Softwarepakete für Datenerfassung, dreidimensionale (3D) Rekonstruktion und den Bau atomarer Modelle, was zu fragmentierten Pipelines und häufigen manuellen Eingriffen führt. Hier präsentieren wir SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology), eine integrierte Softwareplattform, die drei Module kombiniert – DataSmart für automatisierte Datenerfassung, CryoSmart für Bildverarbeitung und 3D-Rekonstruktion sowie ModelSmart für den Deep-Learning-basierten atomaren Modellbau – in einer einheitlichen, browserzugänglichen Schnittstelle. Dieses Protokoll bietet Schritt-für-Schritt-Anweisungen zum Betrieb aller drei Module. Der Arbeitsablauf umfasst automatisierte Probennavigation und Datenerfassung, Bewegungskorrektur, Kontrastübertragungsfunktion (CTF)-Schätzung, Partikelauswahl, zweidimensionale (2D) Klassifikation, 3D-Verfeinerung, Kartenverbesserung und Generierung atomarer Modelle. Als repräsentatives Beispiel haben wir den vollständigen Workflow angewandt, um die Struktur des menschlichen TRPML1, eines Ca²⁺-permeablen lysosomalen Kationenkanals, zu bestimmen und eine globale Auflösung von 2,38 Å durch goldstandardmäßige Fourierschalenkorrelation (FSC) beim 0,143-Kriterium erreicht zu haben. Alle drei Module (DataSmart, CryoSmart und ModelSmart) wurden sequentiell auf denselben TRPML1-Datensatz innerhalb dieser Studie angewendet. Das Protokoll ist so konzipiert, dass es für Nutzer mit unterschiedlichen Erfahrungsstufen in Kryo-EM zugänglich ist.

Einleitung

Kryo-Elektronenmikroskopie: Technologische Evolution und biologische Auswirkungen. Die Bestimmung der dreidimensionalen Proteinstruktur bleibt eine zentrale Herausforderung in der Molekularbiologie, da die biologische Funktion eng mit der räumlichen Anordnung der Aminosäurereste verknüpft ist. Die Aufklärung dieser strukturellen Konfigurationen ist unerlässlich, um enzymatische Mechanismen, Ligandenwechselwirkungen und zelluläre Signalwege in atomarer Auflösung zu entschlüsseln. Dieses Imperativ hat bahnbrechende Entwicklungen im Bereich Kryo-EM vorangetrieben, das sich als weit verbreitete Methode der strukturellen Biologie^{etabliert hat.}

Die Cryo-EM-Einzelteilchenanalyse (SPA) dient als leistungsstarker Ansatz, um biologische Erkenntnisse über verschiedene Probentypen hinweg zu gewinnen, indem hochauflösende Strukturen isolierter Komplexe aufgelöst^{werden 3}. Dazu gehören Viren, Membranproteine, helikale Baugruppen und andere dynamische und heterogene makromolekulare Komplexe, die ein breites Spektrum an Molekülgrößen abdecken – von etwa 50 kDa bis zu Dutzenden Megadaltons.

Cryo-EM SPA hat sich als Eckpfeiler-Technik zur Auflösung der dreidimensionalen (3D-)Architekturen biologischer Makromoleküle etabliert und umfasst drei voneinander abhängige Rechenphasen: Datenerfassung, 3D-Rekonstruktion und Aufbau atomarer Modelle (Abbildung 1).

Während der Datenerfassung werden vitrifizierte Proben unter niedrigen Dosierungsbedingungen abgebildet, um mikroskopische Filme zu erzeugen, die Tausende von Partikelprojektionen in nahezu natürlichen Zuständen aufnehmen. Diese Rohdatensätze werden anschließend durch iterative Ausrichtungs- und Klassifikationsalgorithmen verarbeitet, um volumetrische Dichtekarten zu rekonstruieren. Schließlich werden atomare Modelle gebaut und verfeinert, um der Dichte gerecht zu werden, wodurch molekulare Wechselwirkungen mit nahezu atomarer Auflösung aufgeklärt werden.

Die obige Analyse zeigt, dass die Ausgabe von Kryo-EM lediglich den Ausgangspunkt der strukturellen Pipeline darstellt. Die Umwandlung dieser Rohdaten in interpretierbare atomare Modelle erfordert eine Kaskade spezialisierter computergestützter Softwaretools. So dient Software als entscheidende Brücke, um Rohdaten in atomare Modelle umzuwandeln.

Fragmentiertes Kryo-EM-Softwareökosystem: Aktuelle Werkzeuge und Einschränkungen. Moderne Kryo-EM-Workflows basieren auf einem Flickenteppich spezialisierter Softwarewerkzeuge, die jeweils diskrete Stufen abdecken:

Datenerfassung. Obwohl zahlreiche Kryo-EM-Datenerfassungssoftwarepakete öffentlich verfügbar sind – darunter Leginon ^4,5, SerialEM⁶, UCSFImage4⁷, TFS EPU ^8,9, Gatan Latitude, JEOL JADAS¹⁰ und Auto-EMation¹¹ –, liefern diese Tools überwiegend Rohfilmdaten mit begrenzten Nachbearbeitungsmöglichkeiten. Kritische Workflow-Schritte wie Parametersetzung und Vorlagenanpassung erfordern weiterhin arbeitsintensive manuelle Operationen und erfordern oft zu viele Parameter pro Datensatz. Diese Abhängigkeit von Experteneingriffen bringt Reproduzierbarkeitsprobleme und Workflow-Ineffizienzen mit sich, insbesondere in Hochdurchsatzszenarien.

3D-Rekonstruktion. Cryo-EM hat bedeutende Fortschritte in der 3D-Rekonstruktionssoftware erlebt, die eine nahezu atomare Auflösung biologischer Makromoleküle ermöglicht. Zu den am weitesten verbreiteten Werkzeugen zählen RELION, cryoSPARC und EMAN2, die jeweils unterschiedliche Vorteile und Einschränkungen bieten. RELION verwendet einen bayesschen Ansatz zur iterativen Verfeinerung, zeichnet sich durch die Verarbeitung heterogener Datensätze aus und erreicht hochauflösende Rekonstruktionen¹². Allerdings erfordern die Rechenintensität und die steile Lernkurve oft ein Experteneingreifen. cryoSPARC, das GPU-Beschleunigung und Deep Learning nutzt, reduziert die Verarbeitungszeit erheblich und ist benutzerfreundlich¹³. EMAN2 bietet eine umfassende Suite für Partikelpicking und 3D-Rekonstruktion, erfordert jedoch umfangreiche manuelle Abstimmung und bietet keine Echtzeit-Feedback-Funktionen¹⁴. Obwohl diese Werkzeuge in bestimmten Bereichen der 3D-Rekonstruktion hervorragend sind, bleiben sie auf einzelne Funktionen beschränkt und fehlen Integration mit der Datenerfassung im obersten Bereich oder der atomaren Modellierung. Beispielsweise erfordern RELION und cryoSPARC manuelle Datenübertragung von Mikroskopsteuerungssoftware, was Ineffizienzen und potenzielle Fehler verursacht. Zudem bietet keines dieser Tools eine Echtzeit-Qualitätsbewertung während der Datenerhebung oder beim nahtlosen Übergang zum Aufbau atomarer Modelle, was zu fragmentierten Arbeitsabläufen führt, die Durchsatz und Reproduzierbarkeit beeinträchtigen.

Die letzte Rechenstufe in der kryo-EM-basierten Strukturbestimmung ist der Aufbau atomarer Modelle, bei dem molekulare Koordinaten iterativ in rekonstruierte Dichtekarten eingefügt werden, um atomare Wechselwirkungen zu erläutern.

Während konventionelle Modellbauansätze physikbasierte Energieminimierungsalgorithmen verwenden – die elektrostatische Potentiale, van-der-Waals-Wechselwirkungen und Einschränkungen der kovalenten Bindungsgeometrie einbeziehen –, sind sie stark auf manuelle Eingriffe für die Erstmodellplatzierung, Dichteinterpretation und stereochemische Validierung angewiesen 15,16,17,18. Diese Abhängigkeit von Expertenkuratierung begrenzt nicht nur den Durchsatz, sondern führt auch zu subjektiven Verzerrungen, insbesondere in niedrigauflösenden Systemen (< 4 Å), in denen Dichtemerkmale mehrdeutig sind.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben sich Deep-Learning-(DL)-basierte Methoden als transformative Lösungen etabliert, die neuronale Netze nutzen, um die Feature-Extraktion, Modellinitialisierung und -verfeinerung zu automatisieren. Diese Ansätze zeigen eine verbesserte Leistung beim Umgang mit verrauschten oder unvollständigen Dichtekarten und reduzieren manuelle Eingriffe erheblich, wie aktuelle Benchmarks zeigen, die 40–60 % Reduktionen der benutzerabhängigen Schritte im Vergleich zu herkömmlichen Pipelines^zeigen.

Diese Methoden erfordern jedoch in der Regel den Export von Dichtekarten aus 3D-Rekonstruktionssoftware und den Import in Modellbausysteme. Vor dem Import können zusätzliche Vorverarbeitungsschritte – oft mit Drittanbieter-Tools – notwendig sein, um die Dichtekarten zu optimieren. Dieser fragmentierte Arbeitsablauf erfordert wiederholte Datenübertragungen und Formatkonvertierungen, was zu Ineffizienzen führt. Zudem müssen die Forscher bei unzufriedenstellenden Modellbauergebnissen zur Neuberechnung zur Rekonstruktionsphase zurückkehren, gefolgt von einer weiteren Runde des Modellbaus und der Validierung. Solche iterativen Zyklen beeinträchtigen erheblich den Durchsatz und die operative Effizienz von Kryo-EM-Strukturbestimmungspipelines.

1.3 SMART: Eine integrierte Lösung für End-to-End-Kryo-EM

Trotz bedeutender Fortschritte im Kryo-EM-SPA behindert das Fehlen vollständig integrierter rechnergestützter Lösungen weiterhin sein Potenzial für Hochdurchsatz-Strukturbiologie. Bestehende Softwarepakete sind zwar hervorragend darin, isolierte Workflow-Komponenten wie Datenerfassung oder 3D-Rekonstruktion zu automatisieren, aber es schaffen es nicht, kritische Lücken zwischen roher Mikrographensammlung, Dichtekartenverfeinerung und Atommodellbau zu überbrücken. Diese Fragmentierung erfordert manuelle Datenübertragung, Formatkonvertierungen und redundante Parameterabstimmung, was zu Ineffizienzen führt, die sich mit der Datensatzgröße verstärken.

Um diese Einschränkungen zu beheben, präsentieren wir die integrierte Cryo-EM-Workflow-Plattform, eine integrierte Computerplattform, die die gesamte Cryo-EM-SPA-Pipeline zu einem kohäsiven, KI-gesteuerten Workflow vereint. Die integrierte Plattform integriert drei Kernmodule: DataSmart (automatisierte Datenerfassung), CryoSmart (3D-Rekonstruktion mit hybriden neuronalen Netzwerken) und ModelSmart (Deep-Learning-basierte atomare Modellierung).

Die drei Rechenmodule der Plattform sind über einen standardisierten Datenstrom miteinander verbunden, was einen optimierten Datenfluss ermöglicht, bei dem die Ausgabe eines Moduls Parameteranpassungen in nachfolgenden Verarbeitungsschritten unterstützen kann. Diese Integration zielt darauf ab, die Anzahl manueller Schritte und Datenübertragungen, die in herkömmlichen Kryo-EM-Arbeitsabläufen erforderlich sind, zu reduzieren und so die Zugänglichkeit und Effizienz für strukturelle biologische Labore zu verbessern.

Protokoll

Die Expi293F-Zelllinie, die zur Proteinexpression für das humane TRPML1-Protein verwendet wird, wurde von der Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd gekauft (Katalognummer: SC0236058). Die Identität der Zelllinie wurde ordnungsgemäß durch Short Tandem Repeat (STR)-Profilierung authentifiziert (Supplementary File 1).

Ethische Aussage
Diese Studie umfasste weder menschliche Teilnehmer, Tiere noch direkt von Menschen oder Tieren entnommene Proben. Das humane TRPML1-Protein wurde durch rekombinante Expression produziert und in vitro gereinigt. Die Expi293F-Zelllinie, die zur Expression rekombinanter Proteine verwendet wird, ist eine kommerziell erhältliche, etablierte unsterbliche Zelllinie. Daher waren keine institutionelle ethische Zustimmung und schriftliche informierte Zustimmung erforderlich.

HINWEIS: Die integrierte Cryo-EM-Workflow-Plattform ist in drei Kernmodule gegliedert: ein automatisiertes Datenerfassungsmodul, ein hybrides neuronales Netzwerk-fähiges 3D-Rekonstruktionsmodul und ein auf Deep Learning basierendes atomare Modellierungsmodul, wobei die Daten als Kommunikationsschnittstelle zwischen diesen Softwarekomponenten dienen, wie in Abbildung 2 dargestellt. Das integrierte Cryo-EM-Workflow-Plattformsystem verwendet eine Browser-Server-(B/S)-Architektur, die es den Nutzern ermöglicht, alle Operationen über eine Weboberfläche durchzuführen und so Benutzerfreundlichkeit und betriebliche Zugänglichkeit sicherzustellen.

1. Automatisierte Datenerfassung

HINWEIS: Die integrierte Cryo-EM-Workflow-Plattform besteht aus drei Kernmodulen: einem automatisierten Datenerfassungsmodul, einem hybriden neuronalen Netzwerk-fähigen 3D-Rekonstruktionsmodul und einem Deep-Learning-basierten atomaren Modellierungsmodul. Daten dienen als Kommunikationsschnittstelle zwischen diesen Softwarekomponenten (Abbildung 2). Das System verwendet eine Browser-Server-(B/S)-Architektur, die alle Operationen über eine Weboberfläche ermöglicht.

1. Projektinitialisierung
   1. Erstellen Sie ein neues Projekt in einer automatisierten Datenerfassungsmodul-Softwareplattform.
   2. Wählen Sie die Option aus, Konfigurationseinstellungen von einem aktuellen Projekt zu übernehmen, falls gewünscht. Verwenden Sie die übernommenen Parameter für die Einrichtung des Elektronenmikroskops wieder, anstatt eine neue Konfiguration zu erstellen.
2. Beam-Shift-Inspektion
   HINWEIS: Führen Sie die Strahlverschiebungsanpassung innerhalb der Transmissionselektronenmikroskop-(TEM)-Steuerungssoftware durch.
   1. Niedrige Vergrößerungsprüfung (Atlas und GridSquare)
      1. Öffnen Sie das Screening-Modul . Nehmen Sie Bilder mit den Atlas - und GridSquare-Vergrößerungen auf.
      2. Überprüfen Sie, dass die Bilder richtig beleuchtet und frei von Strahlverschiebung sind. Stellen Sie sicher, dass das Bildzentrum nicht über den Gitterbalken liegt.
   2. Vergrößerungsprüfung der Datenerfassung
      1. Erwache Bilder mit der Datenerfassungsvergrößerung (z. B. 60K oder 100K). Bewerten Sie die Ausrichtung des Strahls.
      2. Korrigieren Sie die Strahlverschiebung, bevor Sie fortfahren, falls die Bildaufnahme fehlschlägt oder eine signifikante Strahlverschiebung festgestellt wird.
   3. Loch-Euzentrische Vergrößerungsprüfung
      1. Mach Bilder mit der Loch-/euzentrischen Vergrößerung (typischerweise 8K). Passen Sie die Strahlverschiebung an, bis der Beleuchtungspunkt zentriert ist, falls der Strahl nicht zentriert ist.
      2. Ändern Sie die Blendenposition nicht. Überprüfen Sie, ob die Blendengröße mit der bei der Datenerfassung verwendeten Blendenöffnung übereinstimmt.
3. Z-Höhenverstellung
   1. Auto-euzentrisch Anpassung
      1. Navigieren Sie zur Screening-Seite . Stelle die Bühne in einen sauberen Bereich mit Kohlefilm an der Loch-/Euzentrischen Vergrößerung. Öffnen Sie das Auto-Eucentric-Modul auf der AutoFunction-Seite .
      2. Klicke auf Start. Beobachte das Logpanel auf Rückmeldungen. Gehen Sie in einen anderen Bereich und wiederholen Sie das Verfahren, wenn die Operation fehlschlägt.
   2. Autofokus-Einstellung
      1. Öffnen Sie das AutoFocus-Modul auf der AutoFunction-Seite . Klicke auf Start.
      2. Sehen Sie sich die Lognachrichten an. Passen Sie die Parameter wie angegeben an oder wiederholen Sie Abschnitt 1.3.1, falls der Autofokus ausfällt.
4. Vergrößerungsprüfung
   1. Ausrichtungsinspektion
      1. Finden Sie ein erkennbares Merkmal bei der Datenvergrößerung und machen Sie ein Bild. Nehmen Sie ein Bild mit der Vergrößerung Hole/EucentricHeight auf.
      2. Vergleichen Sie die zentralen Bereiche beider Bilder. Fahren Sie mit der Kalibrierung fort, wenn eine Fehlstellung zwischen den Daten- und Lochvergrößerungen festgestellt wird.
      3. Überprüfen Sie die Ausrichtung zwischen den Vergrößerungen des Lochs und des Rasterquadrats, wenn die Vergrößerungen der Daten und des Lochs ausgerichtet sind. Fahren Sie ohne Kalibrierung fort, wenn alle Vergrößerungsstufen ausgerichtet sind.
   2. Vergrößerungsverschiebungskalibrierung
      1. Navigiere zur Kalibrierungsseite . Öffnen Sie das Vergrößerungsverschiebungsmodul . Beginnen Sie mit der Datenvergrößerung oder der niedrigsten falsch ausgerichteten Vergrößerung.
      2. Nehmen Sie ein Bild mit hoher Vergrößerung auf, das ein besonderes Merkmal enthält. Nehmen Sie ein entsprechendes Bild mit niedriger Vergrößerung auf. Bewerten Sie die Verschiebung zwischen den beiden Bildern.
      3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Stelle, die dem Feature-Center im Bild mit niedriger Vergrößerung entspricht. Hier Bewegen auswählen. Erfassen Sie das Bild mit hoher Vergrößerung erneut und überprüfen Sie die Ausrichtung.
      4. Wiederholen Sie die Anpassung, falls nötig. Klicken Sie auf Weiter, um nach der Ausrichtung zum nächsten Vergrößerungspaar zu gelangen. Wiederholen Sie das Kalibrierungsverfahren für alle verbleibenden falsch ausgerichteten Vergrößerungspaare.
5. Vorbereitung auf die Datenerhebung
   1. Atlas-Erfassung, Quadratauswahl, Quadratbildgebung und Lochauswahl durchführen
      1. Öffne das Atlas-Modul . Lassen Sie das Kachelfeld leer, um alle 81 Kacheln zu erhalten, oder geben Sie die gewünschte Anzahl der Kacheln ein, um sie zu erwerben.
      2. Navigiere zur Quadratauswahl-Oberfläche . Rechtsklick, um geeignete Quadrate auszuwählen.
      3. Navigieren Sie zur Seite zur Lochauswahl . Klicken Sie auf Alles vorbereiten. Überwachen Sie das Logbuchfenster, bis die Bildaufnahme abgeschlossen ist.
      4. Wählen Sie ein aufgenommenes quadratisches Bild aus der Bildliste aus. Verwenden Sie die Funktion "Löcher suchen ", um die automatische Lochauswahl durchzuführen, wenn die Löcher deutlich sichtbar sind.
         VORSICHT: Die automatische Locherkennung kann bei Gittern mit dickem Eis oder Oberflächenkontamination versagen. Überprüfen Sie die erkannten Löcher vor der Erfassung visuell und verwenden Sie die halbautomatisierte Lochauswahlmethode, wenn die automatische Detektion unzuverlässig ist.
      5. Verwenden Sie die Saatgut-basierte Auswahlfunktion , wenn dickes Eis oder Kontamination eine zuverlässige automatische Auswahl verhindert (Abbildung 3).
         1. Wählen Sie ein zentrales Loch aus. Wählen Sie zwei benachbarte Löcher aus, die einen rechten Winkel bilden.
         2. Wählen Sie zwei entfernte Löcher entlang der von dem zweiten und dritten Loch definierten Richtungen aus.
         3. Klicken Sie auf Absenden. Aktiviere "Alle bewegen ", wenn du ein anderes Feld verarbeitest. Zieh eines der fünf Saatlöcher zu einem freien Loch. Klicken Sie auf Absenden.
   2. Vorlagendefinition
      1. Navigiere zur Seite Vorlagendefinition . Klicken Sie auf Erwerben , um ein Bild zu erhalten. Überprüfen Sie, ob das Bild ein vollständiges Loch enthält.
      2. Rechtsklicke auf den Zielbereich und wähle MoveStageTo, falls ein vollständiges Loch nicht sichtbar ist. Erwarb das Vorlagenbild erneut. Gib die Bildposition und den Autofokus-Standort an, indem du die entsprechenden Marker ziehst.
      3. Hier kommt die Anzahl der Rahmen pro Loch ins Spiel. Geben Sie den gewünschten Defokusswert ein (z. B. −1,5 μm). Verifizieren Sie alle Erfassungsparameter (Abbildung 4).
6. Beam-Shift-Re-Check
   1. Wiederholen Sie Abschnitt 1.2 nach Abschluss aller Vorbereitungsverfahren.
7. Astigmatismus und Komakorrektur
   1. Astigmatismuskorrektur
      1. Stelle die Bühne in einen Bereich für saubere Kohlefolie. Stellen Sie die Höhe mit AutoFocus auf den gewünschten Defokus-Wert ein (z. B. −1,5 μm). Öffnen Sie das Autostigmate-Modul auf der AutoFunction-Seite .
      2. Klicke auf Start. Überwachen Sie die Ctffind-Ausgabe im Log-Panel. Überprüfe die Werte für Astigmatismus und Vorsatzanpassung. Wiederholen Sie den Eingriff an einem anderen Ort, wenn die Astigmatisierung weiterhin hoch bleibt.
   2. Koma-Korrektur
      1. Öffne das Autocoma-Modul , wenn die Ergebnisse von Autostigmate nach mehreren Versuchen weiterhin suboptimal bleiben. Klicke auf Start.
8. Automatisierte Datenerhebung
   1. Navigiere zur AutoCollect-Seite . Klicke auf Start. Erlauben Sie dem System, AutoEmissions - und AutoZLP-Kalibrierungen automatisch durchzuführen.
   2. Erfassen Sie Daten mit den in den Einstellungen Screening, Data Acquisition und Preparation definierten Parametern. Überwachen Sie den automatisierten Inkassoprozess (Abbildung 5).
      PAUSENPUNKT: Nach Abschluss der Datenerhebung können die aufgenommenen Filmstapel gespeichert und das Protokoll später in der Bildverarbeitungsphase fortgesetzt werden, ohne die nachgelagerten Ergebnisse zu beeinträchtigen.
9. Sofortige Fernüberwachung
   1. Überwachen Sie den Fortschritt der Sammlung mit dem Fernüberwachungsmodul. Überprüfen Sie Echtzeit-Bewegungskorrekturergebnisse, die mit MotionCor2²³ erzeugt wurden. Überprüfe Echtzeit-Astigmatismus und defokussiere Messungen.
   2. Teilen Sie die Überwachungs-URL mit autorisierten Nutzern. Greifen Sie von einem Computer oder Mobilgerät aus auf Sammlungsstatus und Datenqualität zu. Betrachten Sie ein Beispiel für eine Fernüberwachungsfunktion in Abbildung 6.

2. Dreidimensionale Rekonstruktion

HINWEIS: Verwenden Sie das 3D-Rekonstruktionsmodul, um dreidimensionale Rekonstruktionen aus zuvor aufgenommenen Bilddatensätzen durchzuführen. Der Workflow umfasst Projekterstellung, Mikrographenimport, Kontrastübertragungsfunktion (CTF)-Schätzung, Partikelauswahl, Partikelextraktion, 2D-Klassifikation, anfängliche Modellgenerierung und 3D-Verfeinerung (Abbildung 7).

1. Projektgründung
   1. Navigiere zur Startseite des 3D-Rekonstruktionsmoduls. Klicken Sie auf Projekte, um die Projektmanagementseite zu öffnen. Klicken Sie auf NEUES PROJEKT.
   2. Geben Sie den Projektnamen ein und geben Sie den Speicherort an. Klicken Sie auf PROJEKT ERSTELLEN. Klicken Sie neben dem neu erstellten Projekt auf Öffnen . Klicken Sie auf NEUES Experiment, um ein neues Experiment zu erstellen.
      HINWEIS: Ein Projekt stellt eine gesamte Datenverarbeitungssitzung dar, während ein Experiment einen individuellen Verarbeitungsworkflow innerhalb eines Projekts darstellt. Mehrere Experimente können in einem einzigen Projekt erstellt werden.
2. Dateien importieren
   1. Klicken Sie auf Neuer Job. Wählen Sie Import und klicken Sie auf Erstellen. Wählen Sie den entsprechenden Dateityp aus. Importiere die .mrc-Dateien, die während der Datenerfassung generiert wurden. Hier kommen die Pixelgröße, die Beschleunigungsspannung und die Anzahl der CPUs ins Spiel. Klicke auf Warteschlange-Job.
      HINWEIS: Um einen laufenden Auftrag zu beenden, klicken Sie auf Töten und dann auf Löschen , um den Auftrag in den Bauzustand zurückzuversetzen. Für abgeschlossene oder in der Warteschlange stehende Aufträge klicken Sie auf Löschen , um den Jobstatus zurückzusetzen.
3. CTF-Schätzung
   1. Klicken Sie auf Neuer Job. Wählen Sie CTF-Schätzung und klicken Sie auf Erstellen.
      HINWEIS: Das 3D-Rekonstruktionsmodul unterstützt mehrere CTF-Schätzungsalgorithmen. Dieses Protokoll verwendet CTFFIND4.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Verbinden " für Belichtungen. Wählen Sie die importierten Mikroaufnahmen aus. Setze den Amplitudenkontrast auf 0,1, die minimale Anpassungsauflösung auf 30 Å. maximale Anpassungsauflösung auf 4 Å, den minimalen Defokussierungssuchwert auf 5.000 Å, den maximalen Defokussierungswert auf 50.000 Å und den Defokuss-Suchschritt auf 500 Å.
   3. Klicke auf Warteschlange-Job.
4. Manuelles Partikelpicking
   1. Klicken Sie auf Neuer Job. Wählen Sie Partikelpflücken und dann Blob Picker. Klicken Sie auf Erstellen. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Verbinden" für Mikroaufnahmen (Belichtungen).
   2. Wählen Sie die importierten Mikroaufnahmen aus. Geben Sie die erforderlichen Parameter ein. Klicke auf Warteschlange-Job. Untersuchen Sie 3–4 repräsentative Mikrographen. Wähle Partikel mit der linken Maustaste aus.
   3. Deaktiviere Partikel mit der rechten Maustaste. Bestimmen Sie den Durchmesserbereich der Teilchen aus den ausgewählten Partikeln. Klick Fertig ausgewählt! Teilchen extrahieren.
      HINWEIS: Missen Sie die Partikel von mindestens drei Mikrographen.
5. Blob Picker
   1. Klicken Sie auf Neuer Job. Wählen Sie Partikelpflücken und dann Blob Picker. Klicken Sie auf Erstellen. Verbinden Sie die Mikrographen-(Expositions-)Eingabe.
   2. Wählen Sie die importierten Mikroaufnahmen aus. Geben Sie die erforderlichen Parameter ein. Klicke auf Warteschlange-Job.
6. Partikelpicks inspizieren
   1. Klicken Sie auf Neuer Job. Wählen Sie Partikelpicks inspizieren. Klicken Sie auf Erstellen. Verbinden Sie die Mikrographen-(Expositions-)Eingabe. Verbinde die Particle-Eingabe.
   2. Wählen Sie die entsprechenden Dateien aus. Geben Sie die erforderlichen Parameter ein. Klicke auf Warteschlange-Job. Untersuchen Sie 3–4 repräsentative Bilder nach Abschluss der Arbeit.
   3. Überprüfen Sie die korrekte Partikelauswahl. Klick Fertig ausgewählt! Ausgabestandorte.
7. Partikel aus Mikrographen extrahieren
   1. Klicken Sie auf Neuer Job. Wählen Sie Extrakt aus Mikrographen aus. Klicken Sie auf Erstellen. Verbinden Sie die Mikrographen-(Expositions-)Eingabe. Verbinde die Particle-Eingabe. Wählen Sie die entsprechenden Dateien aus.
   2. Stellen Sie die Größe der Extraktionsbox auf das 2–3-fache des Partikeldurchmessers ein. Verwenden Sie für TRPML1 eine Extraktionsbox mit 400 Pixeln. Stellen Sie die Fourier-Crop-Größe auf ein Viertel bis die Hälfte der Extraktionsboxgröße ein.
   3. Verwenden Sie für TRPML1 eine Fourier-Crop-Größe von 100 Pixeln. Klicke auf Warteschlange-Job.
      HINWEIS: Die Verringerung der Fourier-Crop-Größe verringert die GPU-Rechennachfrage.
8. Zweidimensionale Klassifikation
   1. Klicken Sie auf Neuer Job. Wählen Sie 2D-Klassifikation. Klicken Sie auf Erstellen. Verbinde die Particle-Eingabe.
   2. Importiere den Partikelstapel. Geben Sie die erforderlichen Parameter ein. Klicke auf Warteschlange-Job.
      HINWEIS: Wählen Sie 50–200 Klassen aus. Verwenden Sie weniger Klassen für kleinere Datensätze und mehr Klassen für größere Datensätze.
9. Ausgewählte zweidimensionale Klassen
   1. Klicken Sie auf Neuer Job. Wählen Sie 2D-Klassen aus. Klicken Sie auf Erstellen. Verbinde die Particle-Eingabe. Verbinde die Eingabe der Vorlagen.
   2. Importiere die erforderlichen Dateien. Klicke auf Warteschlange-Job. Warte, bis der Job in den Wartezustand kommt. Klicken Sie auf Warten.
   3. Wählen Sie klare und klar definierte 2D-Klassen aus. Klicken Sie auf Fertig.
10. Erste Modellgenerierung
    1. Klicken Sie auf Neuer Job. Wählen Sie Abinit-Rekonstruktion. Verbinde die Particle-Eingabe. Importiere die ausgewählten Partikel.
    2. Hier kommt die Anzahl der Anfangsklassen ins Spiel. Hier kommt der Symmetrieparameter ins Spiel. Klicke auf Warteschlange-Job.
11. Heterogene Verfeinerung
    HINWEIS: Verwenden Sie heterogene Verfeinerung für heterogene Proben und homogene Verfeinerung für homogene Proben.
    1. Klicken Sie auf Neuer Job. Erstellen Sie einen Auftrag für heterogene Verfeinerung . Verbinde die Particle-Eingabe. Verbinde den Lautstärkeeingang.
    2. Wählen Sie die entsprechenden Dateien aus. Hier kommen die Verfeinerungsparameter ins Spiel. Spezifizieren Sie die entsprechende Symmetrie (z. B. C1). Klicke auf Warteschlange-Job.
12. Homogene Verfeinerung
    1. Klicken Sie auf Neuer Job. Erstelle einen Homogeneous Refinement-Job . Verbinde die Particle-Eingabe. Verbinde den Lautstärkeeingang.
    2. Optional den Maskeneingang verbinden. Importiere den Partikelstapel und die leistungsfähigste Volumenklasse aus dem vorherigen Verfeinerungsschritt. Geben Sie die erforderlichen Parameter ein.
    3. Spezifizieren Sie die passende Symmetrie (z. B. O oder C1). Klicke auf Warteschlange-Job. Klicken Sie auf Ausgabe nach Abschluss der Aufgabe. Untersuchen Sie die rekonstruierte Dichtekarte in der Browseroberfläche (Abbildung 8).
13. Kartenverbesserung
    HINWEIS: Map Enhancer verwendet DeepEMhancer²⁴. Verwende wann immer möglich Halbkarten. Posttranslationale Modifikationen und Ligandmoleküle wurden im DeepEMhancer-Trainingsset nicht enthalten und werden möglicherweise nicht genau verbessert. Map Enhancer führt lokale Schärfung, automatisiertes Maskieren und Entschärfen durch.
    1. Klicken Sie auf Neuer Job. Erstelle einen Map Enhancer-Job . Importiere das während der homogene Verfeinerung erzeugte Volumen.
    2. Importiere die entsprechende Maske. Importiere Kartendateien über die Option Map Data Path, falls erforderlich. Führe den Auftrag aus.

3. Eine auf Deep Learning basierende atomare Modellierung

HINWEIS: Ein auf Deep Learning basierendes atomare Modellierungsmodul basiert auf dem zuvor entwickelten SMARTFold-Framework²⁵ und unterstützt den Aufbau atomarer Modelle für Proteine und Nukleinsäuren (RNA/DNA) aus Kryo-EM-Dichtekarten.

1. Starten Sie ein auf Deep Learning basierendes atomare Modellierungsmodul
   1. Melden Sie sich in ein auf Deep Learning basierendes atomare Modellierungsmodulsystem an. Öffnen Sie die Benutzeroberfläche zur Aufgabenabgabe. Lade die Kryo-EM-Dichtekarte im linken Panel hoch.
   2. Gib die erforderlichen Eingabeparameter ein. Reichen Sie die Modelaufgabe ein.
2. Laden Sie die Cryo-EM-Dichtekarte hoch
   1. Laden Sie die Dichtekarte im .mrc-, .ccp4- oder .map-Format hoch. Überprüfen Sie, dass die Dateigröße unter 100 MB liegt.
      HINWEIS: Wenn die Dichtekarte 100 MB überschreitet, reduzieren Sie die Dateigröße vor dem Hochladen.
      1. Schneiden Sie die Dichtekarte mit UCSF ChimeraX²⁶ mit dem Befehl: Volume Zone auf die gewünschte Region zu. Sample die Karte auf eine größere Pixelgröße.
      2. Trage eine weiche Maske auf, um Lösungsmittelbereiche zu entfernen.
         HINWEIS: Überprüfen Sie die Dichtekarte vor dem Hochladen, um eine optimale Modellleistung sicherzustellen und das Risiko von Verarbeitungsfehlern zu verringern.
3. Inspizieren und bereiten Sie die Dichtekarte vor
   1. Führen Sie Dichtekartenzuschneiden durch. Für diesen Crop wird die Dichte abgebildet, um unnötige Bereiche zu entfernen. Überprüfen Sie, dass die beschnittene Karte nur die Region enthält, die für den Modellbau erforderlich ist.
      HINWEIS: Das Zuschneiden reduziert die Dateigröße und hilft, Speicherüberlauf während der Modellerstellung zu verhindern.
   2. Dann prüfe die Spiegelinversion. Inspizieren Sie die Dichteabbildung auf mögliche Spiegelinversionen. Untersuchen Sie α-helikale Regionen auf der Karte. Überprüfen Sie, dass α-Helices eine rechtshändige Anordnung aufweisen und sich gegen den Uhrzeigersinn nach oben spiralieren. Wenden Sie die Dichtekarte um, wenn eine gespiegelte Struktur erkannt wird.
4. Lade die Sequenzdatei hoch
   1. Lade die entsprechende Sequenzdatei hoch. Alternativ kann man die Sequenz manuell eingeben. Geben Sie alle Protein- oder Nukleinsäuresequenzen an, die in der Rekonstruktion enthalten sind.
   2. Spezifizieren Sie heteromere oder homomere Sequenzinformationen, wenn anwendbar. Gib den Proteinnamen ein, falls gewünscht (optionaler Schritt).
5. Gib die Map-Auflösung an. Hier kommt die berichtete Auflösung der Kryo-EM-Dichtekarte ins Spiel. Wählen Sie die Rechenpartition aus. Wählen Sie den GPU-Rechenknoten aus, der für die Modellgenerierung verwendet werden soll.
6. Um CPU-Ressourcen anzugeben, geben Sie die Anzahl der zuweisenden CPUs ein. Überschreiten Sie nicht acht CPUs. Überprüfen Sie alle hochgeladenen Dateien und Parameter. Klicken Sie auf SENDEN, um die Modellgenerierung zu starten.
7. Untersuchen Sie das vorhergesagte atomare Modell
   1. Öffne nach Abschluss der Arbeit das interaktive Visualisierungsfenster. Drehen Sie das Modell, um strukturelle Merkmale zu inspizieren. Zoomen Sie ein und aus, um lokale und globale strukturelle Details zu untersuchen.
   2. Inspizieren Sie das Modell aus mehreren Orientierungen. Bewerten Sie die Modellqualität, die räumliche Konformation und die Merkmale auf atomarer Ebene. Verwenden Sie das generierte Modell für die nachgelagerte Analyse und Validierung.
   3. Siehe Abbildung 9 für ein Beispiel der Visualisierungsoberfläche.

Ergebnisse

TRPML1, auch bekannt als Mucolipin-1 (MCOLN1), ist ein lysosomaler Kationenkanal, der für die Aufrechterhaltung der ionischen Homöostase, die Regulierung des vesikulären Verkehrs und die Unterstützung der Autophagie in Säugetierzellen^{unerlässlich ist 27,28}. Die Funktionsstörung von TRPML1 durch genetische Mutationen wird direkt mit Mukolipidose Typ IV in Verbindung gebracht, einer schweren neurodegenerativen lysosomalen Speicherstörung, die durch abnormale Neuroe...

Diskussion

Die strukturelle Bestimmung biologischer Makromoleküle mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) erfordert zwangsläufig einen langwierigen, mehrstufigen Arbeitsablauf, der eine enge Integration von Rechengeräten und die Abhängigkeit von Experteneingriffen erfordert. Die integrierte Plattform adressiert diese Herausforderung, indem sie Datenerfassung, 3D-Rekonstruktion und atomare Modellierung in einem einzigen, vertikal integrierten Rahmen vereint – ein Schritt hin zu effizienteren Cr...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	3D-Rekonstruktionsmodul der SMART-Plattform; hybrides, neuronales Netzwerk
Kryoelektronenmikroskop	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	Zum Datenerwerb verwendet; mit Energiefilter ausgestattet
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Automatisiertes Datenerfassungsmodul der SMART-Plattform
DeepEMhancer	Open source	V0.17	Deep Learning-basierte Kryo-EM-Volumennachbearbeitung; integriert in CryoSmart Map Enhancer
Direktelektronendetektor	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	Kamera zur Filmaufzeichnung
Raster	Quantifoil	Au R1.2,1.3	Kryo-EM-Probenraster
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Deep Learning-basiertes Atommodellierungsmodul der SMART-Plattform; erweitert das SMARTFold-Framework
SMART-Plattform	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Integrierte Kryo-EM-Plattform; Browser-Server (B/S) Architektur; enthält DataSmart, CryoSmart und ModelSmart Module
TEM-Steuerungssoftware	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	Elektronenmikroskop-Steuerungssoftware für Strahlverschiebungsanpassung
Topaz	Open source	V 2.5	Deep Learning-basiertes Partikelauswahl-Tool; als Plug-in in CryoSmart integriert
TRPML1-Proteinproben	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	Human TRPML1 (Mucolipin-1); im eigenen Protein- und Kristallographie-Abteilung hergestellt
Vitrifizierungsvorrichtung	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	Für die Kryo-EM-Probenvorbereitung
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Allgemeines Software für Anzeige, Analyse und mehr
SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Integrierte Kryo-EM-Workflow-Plattform
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Deep-Learning-Framework, das ModelSmart zugrunde liegt
Leginon	National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM)	RRID:SCR_016731	Automatisierte Kryo-EM-Datenerwerbssoftware
SerialEM	University of Colorado	RRID:SCR_017293	Automatisierte TEM/Kryo-EM-Erwerbssoftware
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	Automatisierte Kryo-EM-Datenerfassungssoftware
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	Multi-Grid automatisierte Kryo-EM-Erfassung
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	Elektronenmikroskopie-Erfassungssoftware
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	Automatisiertes Kryo-EM-Erfassungssystem
Auto-EMation	Tsinghua University	N/A	Automatisierte Kryo-EM-Erwerbssoftware
RELION	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016274	Bayes'sche Kryo-EM-Rekonstruktionssoftware
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	Kryo-EM-Bildverarbeitung und -Rekonstruktion
EMAN2	Baylor College of Medicine	RRID:SCR_017270	Kryo-EM-Bildverarbeitungssuite
CTFFIND4	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016732	CTF Schätzungssoftware
Gctf	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016500	GPU-beschleunigte CTF-Schätzung
MotionCor2	Howard Hughes Medical Institute / UCSF	RRID:SCR_016499	Bewegungskorrektursoftware
DeepEMhancer	Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	Deep Learning-basierte Kryo-EM-Kartenverbesserung
Topaz	University of California Berkeley	RRID:SCR_018037	Deep Learning-basierte Partikelauswahl
UCSF ChimeraX	University of California San Francisco	RRID:SCR_015872	Software für Molekülvisualisierung
CTFFIND4	Grigorieff Lab	RRID:SCR_016732	CTF-Anpassung, die im CryoSmart-Workflow verwendet wird
EMDB-8840	Electron Microscopy Data Bank	Accession: EMD-8840	Human TRPML1 Referenzkarte
EMPIAR-10204	Electron Microscopy Public Image Archive	Accession: EMPIAR-10204	β-Galaktosidase Benchmark-Datensatz
Transmissionselektronenmikroskop (TEM)	Nicht spezifiziert	N/A	Verwendet für die Kryo-EM-Datenerwerbung
FEI Tecnai Elektronenmikroskop	FEI (jetzt Thermo Fisher Scientific)	Nicht spezifiziert	In der zitierten Arbeitsabläufen erwähnt
Energiefilter	Nicht spezifiziert	N/A	Während der automatischen Erfassung verwendet
GPU-Computing-Knoten	Nicht spezifiziert	N/A	Verwendet für ModelSmart-Berechnungen