Ein auf Ferrikammoniumcitrat basierendes Modell der Eisenüberlastung mit ferroptosassoziierten Anzeigen in C2C12-Myoblasten

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein schnelles, auf Eisenüberladung basierendes Eisenüberlastungsmodell mit ferrikem Ammoniumcitrat in C2C12-Myoblasten, das Eisenbelastung, ferroptosassoziierte molekulare Veränderungen und einen frühen ferrostatinsensitiven Verlust der Lebensfähigkeit verursacht.

Zusammenfassung

Ferroptose ist eine eisenabhängige Form des regulierten Zelltodes, die mit Alterung und degenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht wird. Wir haben zuvor festgestellt, dass gealterte Muskelstammzellen intrazelluläres Eisen ansammeln und bei der Aktivierung ferroptotisch sterben. Hier beschreiben wir ein einfaches In-vitro-Modell, das Ferrikammoniumcitrat verwendet, um Eisenüberladung in murinen C2C12-Myoblasten zu erzeugen. Die Behandlung mit Ferrikammoniumcitrat erhöhte die intrazelluläre Eisenbelastung, was durch erhöhte Ferritin-Schwer- und Leichtketten-Transkripte, erhöhte Ferritinproteine und verbesserte Signale eines lebendzelligen labilen Eisenfarbemittels zeigt. Die Exposition gegenüber Ferrikammoniumcitrat (FAC) führte ebenfalls zu molekularen Veränderungen im Zusammenhang mit der Ferroptose, darunter erhöhte Expression von Slc40a1 und Hmox1 sowie reduziertes Glutathionperoxidase-4-Protein. Der FAC-assoziierte Rückgang der Glutathionperoxidase 4 wurde teilweise durch Deferoxamin umgekehrt. Nach 12 Stunden verringerte das zytotoxische Ferrikammoniumcitrat die Zelllebensfähigkeit, und dieser Effekt wurde durch Ferrostatin-1 gerettet, was mit einer ferroptosesensitiven Komponente des Zelltodes übereinstimmt. Zu späteren Zeitpunkten begrenzen erhöhte Variabilität und ein reduzierter Assay-Dynamikbereich die Interpretierbarkeit von Viabilitätsmessungen. Dieses Protokoll bietet somit ein schnelles und skalierbares Modell der mit Ferrikammoniumcitrat vermittelten Eisenladung, das zur Untersuchung ferroptoseassoziierter Reaktionen und zur Erprobung eisen- oder ferroptose-modifizierender Interventionen in Muskelzellen verwendet werden kann.

Einleitung

Ferroptose ist eine Form des regulierten Zelltodes (RCD), die sich molekular von anderen RCD unterscheidet. Es wurde erstmals mit Erastin entdeckt, einem tödlichen kleinen Molekül, das selektiv für RAS (Rattensarkom) ist und nachweislich nicht-apoptotischen Zelltod^verursacht. In ihrer bahnbrechenden Arbeit beschrieben Dixon et al. seinen Mechanismus erstmals als eisenabhängig und prägten so den Begriff Ferroptose, was "Fall (Tod) durch Eisen¹" bedeutet. Molekular äußert sich die Ferroptose als übermäßige Eisenansammlung, erhöhte Lipidperoxidation und eine Ansammlung reaktiver Sauerstoffspezies, was zum^Zelltod führt. Sie unterscheidet sich einzigartig von oxidativem Stress und anderen Formen von RCD durch ihre Unabhängigkeit von der Caspase-Aktivierung, ein Markenzeichen der Apoptose, sowie das Fehlen phosphorylierter rezeptor-interagierender Proteinkinase 3 (RIPK3) und gemischter Kinase-Domänen-ähnlicher Pseudokinase (MLKL), die nur bei Nekrotose³ zu beobachten sind. Darüber hinaus kann die Ferroptose auch mit den Lipidantioxidantien Ferrostatin-1 und Liproxstatin-1 sowie dem Eisenchelator-Deferoxamin⁴ gelindert werden. Obwohl Ferroptose anderen Arten von RCD ähnelt, da alle letztlich zum Zellabsterben führen, unterscheidet sich ihre Präsentation mechanistisch von anderen Formen der RCD.

Die Erforschung der Ferroptose hat in den letzten zehn Jahren an Bedeutung gewonnen, hauptsächlich aufgrund kontinuierlicher Bemühungen auf dem Feld, neue Markenzeichen zu identifizieren und neue Werkzeuge zu entwickeln, um ihre zugrunde liegenden Mechanismen und ihren Beitrag zur menschlichen Krankheit^zu untersuchen. Eine aktuelle Evidenz legt nahe, dass Eisenüberlastung und Ferroptose wenig untersuchte Faktoren für altersbedingte Gebrechlichkeit und Sarkopenie ^6,7,8 sind. Wir haben kürzlich gezeigt, dass gealterte Muskelstammzellen (MuSCs) besonders anfällig für ferroptotische Todesfälle sind, die durch chronische Entzündungen verursacht werden, die ein antioxidatives genetisches Programm durch epigenetische Silencing⁹ unterdrücken. Wir fanden heraus, dass gealterte MuSCs eine abweichende Menge an intrazellulärem elementarem Eisen ansammeln, etwa 30-mal höher als ihre adulten Pendants. Obwohl Ferroptose mit Krankheiten in mehreren Organen und Geweben in Verbindung gebracht wird – vor allem altersbedingten – bleibt ihre physiologische Rolle unklar und erfordert weitere Untersuchungen.

Während unsere vorherige Studie zeigte, dass gealterte MuSCs bei der Aktivierung auf ferroptotisches Tod sensibilisiert sind, bleibt der spezifische Beitrag der Eisenbelastung zu diesem Phänotyp noch zu klären. Hier etablieren wir ein einfaches Modell der Eisenüberladung in C2C12-Myoblasten, die mit Ferrikammoniumcitrat (FAC) behandelt wurden, und fragen, ob überschüssiges Eisen ausreicht, um ferroptosassoziierte molekulare Veränderungen und ferrostatin-sensitiven Lebensfähigkeitsverlust zu verursachen. C2C12-Zellen bieten ein pflegeleichtes, skalierbares und leicht verfügbares Mausmuskel-Vorläufersystem¹⁰. Wir erwarten, dass dieser Ansatz eine praktische Grundlage bieten wird, um eisengetriebene Stressreaktionen in Muskelzellen zu untersuchen und Interventionen zu testen, die ferroptoseassoziierte Phänotypen verändern.

Protokoll

1. Vorbereitung von C2C12-Zellen

1. Auftauzellen
   HINWEIS: Alle Gewebekulturschritte sollten in einem sterilen Biosicherheitsschrank durchgeführt werden.
   1. Bereiten Sie ein konisches Rohr vor, das 9 ml warmes, vollständiges Medium enthält (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit hohem Glukose- und Pyruvatgehalte + 10 % fetalem Rinderserum + 1 % Pen/Streptokokken).
   2. Tauen Sie ein Ampullchen gefrorener C2C12-Zellen (~1 Million) auf, indem Sie 800 μL vorgewärmtes vollständiges Medium aus dem Hauptmedium zum Fläschchen hinzufügen. Pipete langsam auf und ab.
   3. Sobald das dem Auftaufläschchen gegebene Medium kalt ist, entferne es und gib es in das konische Rohr. Ersetze sie durch das gleiche Volumen warmes Medium aus der Röhre. Pipettiere weiter auf und ab und tausche das Medium, bis die eingefrorenen Zellen wieder suspendiert sind.
   4. Pipettieren Sie den Inhalt der Phiole in das konische Rohr des Mediums. Umdrehen, um zu mischen, und dann den Inhalt in eine 10 cm große, mit Zellkulturbehandlung behandelte Schale geben. Inkubiere bei 37 °C für 4 Stunden.
   5. Untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzugehen, dass sie angeheftet sind. Angeschlossene Cells erscheinen verlängert, während schwebende Zellen kreisförmig sind und sich bewegen, wenn sich die Platte bewegt.
      HINWEIS: Vorausgesetzt, die gepanzerten Zellen sind gesund, sollten die meisten von ihnen verbunden sein.
   6. Aspiriere das Medium, um abgestorbene Zellen und Ablagerungen zu entfernen. Ersetzen Sie durch 10 ml warmes Komplettmedium und zurück in den Inkubator. Lassen Sie sie über Nacht brüten oder bis die Platte 80 % Konfluenz erreicht.
2. Auszaat von C2C12-Zellen zur Eisenbehandlung
   1. Sobald die gewünschte Konfluenz erreicht ist, wird das Zellmedium abgezogen. Fügen Sie der Platte tropfweise 2 ml PBS hinzu, um sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist; Aspirieren.
   2. Gib 2 ml 0,25 % Trypsin zu den Zellen. Inkubieren Sie bei 37 °C für 5–10 Minuten oder bis die Zellen abgelöst werden. Nach der Ablösung erscheinen die Zellen unter dem Mikroskop kreisförmig, und das Trypsin sowie die Zellsuspension sind trüb und verdickt.
   3. Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 8 ml warmes komplettes DMEM hinzufügen. Verwenden Sie eine serologische Pipet, um die Lösung gründlich zu vermischen und den Teller zu waschen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches Rohr.
   4. Wenden Sie das Rohr vorsichtig 3–5 Mal um. Entnehmen Sie das passende Volumen und zählen Sie die Zellen mit der bevorzugten Methode (Zellzähler, Hämozytometer usw.).
   5. Stellen Sie eine Zellsuspension an, die ausreichend ist, um die gewünschte Anzahl von Bohrungen/Platten für n = 3 für jede Bedingung zu säen: 10 cm Platte (für Western Blot): 100.000 Zellen/Platte, 6-Bohrloch-Platte (für qPCR): 50.000 Zellen/Bohrloch, 96-Bohrloch-Platte (für labiles Eisen und Lumineszenzfärbung): 1.000 Zellen pro Bohrloch. Lassen Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C inkubieren.
3. Anwendung von Eisenbehandlung auf Samenzellen
   1. Am Tag der Behandlung wird Eisenammoniumcitrat hinzugefügt (FAC; Formel = C₆H₁₁FeNO₇⁺³; MW = 265 g/mol) zum Abschluss des DMEM bei folgenden Konzentrationen unter sterilen Bedingungen: Schwer: 180 μM (0,0477 mg/mL), Zytotoxisch: 1.800 μM (0,477 mg/mL).
      HINWEIS: Erwägen Sie auch, Kontrollen hinzuzufügen, darunter, aber nicht beschränkt auf Vehikel, schweres + 150 μM Deferoxamin (ein Eisenchelator), Vehikel + 150 μM Deferoxamin und/oder Vehikel + RSL3 (ein Ferroptose-Induzator; positive Kontrolle). Außerdem ist es erwähnenswert, dass DMEM zu Beginn eine kleine Menge Eisen(III) Nitrat-Nonahydrat, einer Quelle für Eisen, enthalten kann. Der Leser soll die oben empfohlenen FAC-Konzentrationen als zusätzlich zu allen bereits vorhandenen Eiseneisen interpretieren, das bereits im Vehikelkulturmedium vorhanden ist.
   2. Invertieren zum Mixen, bis der FAC im vollständigen Medium aufgelöst wird.
      HINWEIS: Da FAC wasserlöslich ist, sind weder DMSO noch zusätzliches Lösungsmittel erforderlich. Die Zugabe von FAC kann den pH-Wert der Lösung verändern, daher wird bei einer drastischen Farbveränderung des Mediums empfohlen, den pH-Wert zu messen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten, wenn behandeltes Medium in die Kultur gegeben wird.
   3. Sauge das Medium von den Zellen ab. Fügen Sie den Behandlungsbedingungen das gleiche Volumen an eisenhaltigem Vollmedium hinzu und unbehandelte Komplettmedien in die Fahrzeugbrunnen/Platten. Inkubieren Sie bei 37 °C für die gewünschte Behandlungsdauer, bevor mit dem gewünschten Test fortgesetzt wird: Labile Eisen-Analyse: 2 Stunden FAC-Behandlung, qPCR und Western Blot: 12–24 Stunden FAC-Behandlung, Lumineszenz-Assay: 12 Stunden FAC-Behandlung.

2. qPCR

1. Isolierung von mRNA für qPCR
   VORSICHT: Das RNA-Extraktionsreagenz und das Chloroform stellen Atemwegsgefahren dar. Nur in einer Abzugshaube mit geeigneter PSA (Laborkittel, chemikalienresistente Einweghandschuhe und Augenschutz) zu behandeln.
   1. An der Werkbank werden Medien aus den Zellen aspiriert. Wasche die Zellen zweimal mit sterilem PBS und sauge die restliche Flüssigkeit gründlich ab.
   2. In einer Abzugshaube wird das RNA-Extraktionsreagenz in folgenden Volumina zu den Zellen gegeben: 6-Well-Platte: 250 μL/Bohrloch, 10 cm Schale: 1 mL/Schale.
   3. Arbeiten Sie auf Eis in der Abzughaube und verwenden Sie einen Zellschaber zum Vorsichtsabkratzen der lysierten Zellen. Achte darauf, alle Teile der Platte gründlich abzukratzen, um die RNA-Ausbeute zu maximieren.
   4. Pipettieren Sie das Lysat in sterile, vorgekühlte, RNAse-freie Mikrofugeröhren. Lass sie 5 Minuten bei Zimmertemperatur stehen.
   5. Für jeden mL des Extraktionsreagens gibt man 200 μL Chloroform INNERHALB EINER DAMPFHAUBE. Schütteln Sie die Proben kräftig mindestens 30 Sekunden, um das Extraktionsreagenz und Chloroform zu kombinieren. Lass sie 5 Minuten bei Zimmertemperatur stehen.
      HINWEIS: Nach Ablauf der Zeit erfolgt die Phasentrennung, wobei die klare wässrige Phase (die die RNA enthält) obendrauf liegt.
   6. Zentrifugiere Proben für 15 Minuten bei 12.000 × g bei 4 °C. Beschrifte in der Zwischenzeit neue autoklavierte Röhren und gib 500 μL (pro ml Extraktionsreagenz) Isopropanol zu Röhren auf Eis.
   7. Übertragen Sie nur die wässrige Phase in jede entsprechende Röhre. Vorsichtig durch Umkehrung verrühren und dann 10 Minuten bei Zimmertemperatur stehen lassen. Wenn eine geringe Ausbeute erwartet wird, fügen Sie 2 μL GlycoBlue hinzu, um das Pellet zu visualisieren.
   8. Zentrifugiere 15 Minuten bei 12.000 × g bei 4 °C.
      HINWEIS: Präzipitierte RNA kann am Boden des Röhrchens sichtbar sein.
   9. Gieße vorsichtig überschüssiges Isopropanol in einen dafür vorgesehenen Abfallbecher. Fügen Sie 1 ml molekulare, 100 % Ethanol tropfweise in das Rohr hinzu und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu lösen. Zentrifugiere für 5 Minuten bei 7.500 × g bei 4 °C.
   10. Ethanol ausgießen. Invertiere die Röhrchen und lass die Kappe offen über einem Papiertuch. Lassen Sie das Pellet trocknen, bis es tröpfchenfrei ist (~15–30 Min).
       HINWEIS: Das Pellet kann durchsichtig werden, wenn kein GlycoBlue hinzugefügt wurde.
   11. Die Kugel wird in 25 μL sterlem, RNAse-freiem Wasser wieder suspendiert. Quantifizieren Sie die RNA-Konzentration mittels UV-sichtbarer Spektrophotometrie. Normalisieren Sie auf eine gleichmäßige Konzentration über Proben, die maximal 1 μg RNA in 16 μL pro Probe zulässt.
2. Synthese von cDNA für qPCR
   HINWEIS: Schließen Sie alle Schritte auf dem Eis ab, um die RNA/cDNA-Ausbeute zu maximieren.
   1. Tauproben. Wasche den Arbeitsbereich mit einem RNAse-Reiniger.
   2. Fügen Sie 1 μg RNA aus jeder Probe zu einem entsprechenden PCR-Streifenröhrchen hinzu.
   3. Gib 4 μL der cDNA-Mischung zu jedem Röhrchen. Bei Bedarf werden Sie steriles Wasser hinzugefügt, um ein Gesamtvolumen von 20 μL zu erreichen. Die Mischungen werden unter folgenden Thermocycler-Parametern verwendet: 25 °C für 5 Minuten, 42 °C für 30 Minuten, 85 °C für 5 Minuten, 4 °C unendlich.
3. Ausführen von qPCR
   1. Verdünnen Sie cDNA 1:10 in sterilem Wasser, bevor Sie weitere Reaktionen durchführen.
      HINWEIS: cDNA kann bei -20 °C für 1 Monat oder -80 °C für 6 Monate eingefroren werden.
   2. Verdünne Primer auf eine Konzentration von 10 μM mit sterilem Wasser. Fügen Sie die richtigen Kontroll- und/oder Housekeeping-Gene hinzu (z. B . B2M, TBP1).
   3. Erstellen Sie Master-Mixe für jedes Housekeeping-Gen und Gen von Interesse, sodass genügend Reaktionsmischung vorhanden ist, um jede DNA-Bedingung im Dreifach auszuführen. Das Master-Mix-Rezept (pro Reaktion) lautet wie folgt: 2x PCR-Mischung: 10 μL, Vorwärtsprimer (10 μM): 1 μL, Rückwärtsprimer (10 μM): 1 μL, steriles Wasser: 8 μL.
   4. Setzen Sie eine qPCR-Reaktionsplatte in einen 96-gut gekühlten Metallblock. Fügen Sie 5 μL verdünnte cDNA zu jedem Probenbrunnen und 20 μL des Reaktionsmaster-Mixes zu jedem Bohrloch hinzu. Inspizieren Sie jeden Brunnen, um sicherzustellen, dass alle das gleiche Volumen erhalten, decken Sie die Platte mit einem Plattenversiegelungsmittel ab und verwenden Sie ein flachkantiges Werkzeug, um die Blasen zu glätten.
   5. Zentrifugiere die Platte bei 1.000 × g und 4 °C für 1 Minute. Stellen Sie die Platte in eine qPCR-Maschine und stellen Sie sicher, dass sie in der richtigen Ausrichtung geladen ist.
   6. In der qPCR-Software werden für jedes Bohrloch Proben- und Genidentitäten zugewiesen. Überlege, eine Vorlage zu erstellen, wenn du mehrere Replikate mit demselben Setup ausführen möchtest.
   7. Führen Sie das qPCR-Programm (Dauer: ~1:36 H) aus, das in Tabelle 1 dargestellt ist.
   8. Exportiere die Ergebnisse als . CSV oder . XLSX-Datei. Wenn die verwendete qPCR-Maschine dem Benutzer erlaubt, die exportierten Werte auszuwählen, prüfen Sie, ob die CT-Werte in der exportierten Datei enthalten sind.
   9. Verwenden Sie die durchschnittlichen CT-Werte für jede Erkrankung und jedes interessierte Gen – im Vergleich zu den CT-Werten der Housekeeping-Gene in der entsprechenden Erkrankung –, um die Faltenänderung jedes Gens zu berechnen. Normalisiere die Faltänderung des Fahrzeugzustands auf 1,0.

3. Western Blot

1. Isolierung von Proteinen für Western Blot
   HINWEIS: Führen Sie alle Schritte auf Eis durch, um den Proteinertrag zu maximieren.
   1. In einem Biosicherheitsschrank sollte man das Kulturmedium absaugen. Spüle die Zellen mit genug kaltem PBS, um den Boden der Kulturplatte abzudecken. Aspirieren, dann wiederholen.
   2. Fügen Sie RIPA-Puffer hinzu, ergänzt mit Proteaseinhibitor- und Phosphataseinhibitor-Cocktails, um den Abbau von Proteinen zu verhindern. Verwenden Sie 75 μL RIPA-Lösung für die Kultivierung in einer 6-Well-Platte oder 200 μL RIPA-Lösung in einer 10-cm-Platte.
   3. Beim Arbeiten auf Eis verwenden Sie einen Zellschaber, um die lysierten Stellen vorsichtig von der Platte zu lösen. Achte besonders darauf, Zellen aus allen Teilen der Platte, einschließlich der Ränder, zu entfernen. Die Lösung wird klar und etwas zähflüssig erscheinen.
   4. Pipettiere die RIPA-Zellen-Suspension in gekühlte Mikrofuge-Röhren. Zentrifugieren Sie die Proben für 10 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C. Übertragen Sie das Supernatant (das Proteinlysat) in ein vorgekühltes Rohr. Wirf das Pellet weg.
   5. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration durch einen Bradford- oder BCA-Test. Normalisiere Proben auf 1 μg/μL in Proteasen- und Phosphataseinhibitor-Cocktail-angereichertem Reinwasser auf Eis.
   6. Verdünnen Sie Lysate in Laemmli-Puffer, um sicherzustellen, dass die endgültigen Proteinkonzentrationen über die Proben verteilt sind. Lysate 10 Minuten bei 95 °C kochen, um das Protein zu denaturieren. Für die besten Ergebnisse verwenden Sie sofort nach der Vorbereitung Western Blotting. Ansonsten sollten Proteine in Laemmli kurzfristig bei -20 °C (≤ 1 Monat) oder bei -80 °C langfristig gelagert werden.
2. Herstellung von Acrylamidgels für SDS-PAGE
   VORSICHT: Acrylamid ist ein Neurotoxin und sollte nur mit geeigneter PSA (Laborkittel, chemikalienresistente Handschuhe und Augenschutz) behandelt werden.
   1. Bestimmen Sie die interessanten Proteine und deren Größe durch Konsultieren Sie die Firmenwebsite der zu verwendenden Antikörper/Ies. Verwenden Sie die vorhergesagte Größe der interessierten Proteine, um zu bestimmen, wie viel Acrylamid das Gel(e) haben sollten.
      HINWEIS: 10%-15% Acrylamid funktionieren gut für die meisten Molekulargewichte.
   2. Bauen Sie den Gelgussstand und den Rahmen gemäß den Anweisungen des Herstellers zusammen.
   3. Für das auflösende Gel kombinieren Sie Acrylamid, steriles Wasser, 1,5 M Tris/HCl pH8,8-Puffer und 10 % Natriumdodecylsulfat in einem konischen Röhrchen in den passenden Volumina für die Anzahl und den Prozentsatz des herzustellenden Acrylamids der herzustellenden Gele gemäß Tabelle 2, die die für zwei Gele benötigten Komponenten auflistet. Mischen Sie durch Inversion.
   4. Fügen Sie 10% Ammoniumpersulfatlösung hinzu und TEMED in die Mischung. Invertieren, um zu mischen.
   5. Gib die Lösung sofort in den Gelgussrahmen und fülle ein, bis das Volumen der Lösung im Gelgussrahmen knapp unter der Menge liegt, die benötigt wird, um den Boden des Kamms zu erreichen, falls der Kamm eingesetzt wird.
   6. Fügen Sie sofort 100–200 μL reines Ethanol tropfweise auf das Härtungsgel hinzu. Wenn Proteinlysate aufgetaut und/oder denaturiert werden müssen, sollte dies während dieser Inkubationszeit abgeschlossen werden. Tauproteine auf Eis auf.
      HINWEIS: Dadurch wird die Lösung verteilt, sodass das Gel nicht ungleichmäßig aushärtet.
   7. Nach dem Aushärten gieße ich das Ethanol ab. Für das Stapelgel kombinieren Sie Acrylamid, steriles Wasser, 0,5 M Tris/HCl pH6,8-Puffer und 10 % Natriumdodecylsulfat in einem konischen Rohr in den passenden Volumina für die Anzahl und den Prozentsatz des herzustellenden Acrylamids der zu erzeugenden Gele gemäß Tabelle 2, die die für zwei Gele benötigten Komponenten auflistet. Mischen Sie durch Inversion.
   8. Gib die 10%ige Ammoniumpersulfatlösung hinzu und TEMED in die Mischung. Mischen Sie durch Inversion.
   9. Gib die Stapellösung sofort in den Gelgussrahmen, bis das Volumen den oberen Bereich erreicht. Gib den Gelkamm direkt nach dem Eingießen des Gels hinzu. Lassen Sie es ~1 Stunde ruhen oder bis sich die Form der Brunnen nicht ändert, wenn der Gelgussstand leicht geschaukelt wird.
3. Ladegele
   1. Füllen Sie die Elektrophorese-Kammer(n) mit einem Laufpuffer bis zur passenden Fülllinie für die Anzahl der zu laufenden Gele.
   2. Übertragen Sie den Gelrahmen mit den noch darin befindlichen Kämmen in die Elektrophoresekammer. Füge mehr Laufpuffer in den Raum zwischen den Gels hinzu, bis das Reservoir voll ist. Ziehe die Kämme vorsichtig aus den getauchten Gels heraus.
   3. Pipettieren Sie 5–10 μL Leiter in einen Brunnen jedes Gels.
   4. Pipett 5–20 μL extrahiertes Protein und Laemmli-Pufferproben in jedes Bohrloch. Fügen Sie 5–10 μL eines 1x Laemmli-Puffers zu beliebigen leeren Bohrlöchern hinzu.
      HINWEIS: Das von Ihnen hinzugefügte Volumen könnte eine Optimierung erfordern, basierend auf der Prävalenz des betreffenden Proteins und/oder der Wirksamkeit der Antikörper(n).
4. SDS-PAGE betreiben
   1. Verbinden Sie die Elektrophoresekammer mit einem Strompaket. Eingestellt auf 150 V für 45 Minuten.
      HINWEIS: Je nach Aufbau kann mehr Zeit oder eine höhere Spannung für eine vollständige Migration erforderlich sein, daher sollten Sie bei Bedarf anpassen.
   2. Sobald das Protein bis zum Ende des Gels gewandert ist (wo sich Gelcaster und Gelrahmen am unteren Rand des Geräts treffen), stoppen Sie den Lauf und schalten Sie das Power Pack aus.
5. Abschluss des Proteintransfers
   HINWEIS: Dieser Abschnitt wurde mit einem schnellen Proteintransferapparat entwickelt.
   1. Gieße den Transferpuffer in eine Gelschale. Fügen Sie einen Transferstapel hinzu, gefolgt von einer Nitrocellulosemembran und einem weiteren Transferstapel zur Flüssigkeit, um ein Sandwich mit der Membran in der Mitte zu bilden. Stellen Sie sicher, dass der Sandwich-Stapel vollständig im Transferpuffer eingetaucht ist.
   2. Schalten Sie das Rapid Protein Transfer Apparat ein und wählen Sie das richtige Protokoll für die Anzahl der Gele und die Größe des betreffenden Proteins.
      HINWEIS: 1,3 A und 25 V für 10 Minuten haben sich als gut erwiesen, aber eine Optimierung könnte erforderlich sein.
   3. Entfernen Sie den oberen Transferstapel mit der Pinzette und lassen Sie überschüssige Flüssigkeit in die Gelschale laufen. Bewegen Sie den Stapel zum Proteintransferapparat und legen Sie ihn so flach und gerade wie möglich; Verwenden Sie eine Walze oder ein konisches Rohr, um eventuelle Falten zu glätten. Wiederhole das mit der Membran.
   4. Verwenden Sie ein stumpfes Werkzeug, um die obere und untere Hälfte des Gussrahmens vorsichtig zu trennen. Übertragen Sie das Gel auf die Membran im Proteintransferapparat.
   5. Verwenden Sie eine Pinzette, um den restlichen Transferstapel vom Gel-Tablett zu heben. Lasse überschüssige Flüssigkeit ab und lege sie dann auf die Membran und den anderen Stapel. Schließe die Gelbox und führe das Programm aus.
6. Blockieren und Färben mit Antikörpern
   1. Öffne die Gelbox und benutze eine Pinzette, um den obersten Stapel zu entfernen, dann hebe das Gel ab. Bestätigen Sie, dass sich Bänder von der Leiter auf der Membran befinden. Schneide die Membran so, dass sie nur den gewünschten Größenbereich berücksichtigt.
   2. Übertragen Sie die Membran in eine saubere Fleckbox. Füge 5 ml Blockpuffer hinzu, also genug, um die Membran zu bedecken. Blocken unter Raumtemperatur 1 Stunde Rührung.
   3. Bereiten Sie sich währenddessen auf die Antikörperfärbung vor, indem Sie die empfohlene Konzentration der primären Antikörper zu 5 ml 2% Rinderserumalbumin im Waschpuffer pro Membran hinzufügen. Färbe auch für Haushaltsprotein(e) (z. B. GAPDH, β-Aktin).
   4. Entfernen Sie es aus dem Rühren und gießen Sie den Blockpuffer ab. Fügen Sie 5 ml der primären Antikörperlösung hinzu. Inkubieren Sie nachts in Dunkelheit unter Bewegung bei 4 °C (~12–16 H).
      HINWEIS: Zukünftig sollten alle Schritte im Dunkeln abgeschlossen werden.
   5. Wasche die Membran 3 x 5 Minuten unter Rührung bei Raumtemperatur mit einem Waschpuffer.
   6. Fügen Sie die empfohlene Konzentration des sekundären Antikörpers zu 5 % BSA im Waschpuffer hinzu. Bereiten Sie für jede Membran 5 ml Lösung vor.
   7. Gieße den überschüssigen Waschpuffer ab. Gib 5 ml sekundäre Antikörperlösung zu jedem Blot. Inkubieren Sie 1 Stunde lang im Dunkeln unter Rührung bei Raumtemperatur.
   8. Wasche die Membran 3 x 10 Minuten unter Rührung bei Raumtemperatur mit einem Waschpuffer. Bild sofort.
7. Erkennung und Analyse von interessanten Proteinen
   1. Bildproteine mit der bevorzugten Plattform.
   2. Verwenden Sie ImageJ oder eine andere Plattform, um die Intensität jedes Interessenbands zu quantifizieren.

4. Labile Eisenfarbstoff-Prüfung

1. Labile Eisenfarbung
   1. Vollständige Sektion 1 komplettiert und Zellen in einer 96-Well-Platte unter Eisenbehandlung für 2 Stunden aussäen. Stellen Sie sicher, dass es für jede Eisenbehandlungsbedingung mindestens drei Bohrlöcher gibt, sowie negative (Vehikel; Kulturmedium + 150 μM des Eisenchelator-Deferoxamin) und positive (Kulturmedium + 180 μM FAC + labile Eisenfarbstoff-Kobehandlung) Kontrollen.
   2. Bereiten Sie eine ausreichende Verdünnung von 1:200 der 1 mM großen Lagerlösung des labilen Eisenfarbstoffs in serumfreiem Medium vor, sodass für jede Probenbohrung 200 μL erreicht wird.
   3. Aspiriere über das Kulturmedium. Zweimal mit PBS waschen.
   4. Gib die Färbelösung zu jedem Brunnen und brüte sie 1 Stunde bei 37 °C.
   5. Waschen Sie einmal mit PBS. Ersetzen Sie sie durch PBS.
   6. Bilde die Zellen mit dem fernroten Kanal eines Fluoreszenzmikroskops (646/662 nm). Speichere und exportiere die Bilder als . TIF-Akten.
2. Färbungsanalyse
   1. Öffnen Sie die Bilder in ImageJ.
   2. Öffnen Sie das Messfenster , indem Sie m drücken. Innerhalb des Messfensters , unter Ergebnisse | Setze Maße, wähle Fläche, integrierte Dichte und mittlere Grauwerte. Wählen Sie OK aus.
   3. Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug , um jede Zelle im Bild zu zeichnen. Drücken Sie nach jeder Zelle m, um die Messungen zum Messfenster hinzuzufügen.
   4. Sobald alle Zellen im Bild quantifiziert sind, kopieren und fügen Sie alle Werte in eine Tabelle ein. Verwenden Sie das Kreiswerkzeug, um mindestens drei Hintergrundmessungen in Bereichen durchzuführen, die nicht von Zellen belegt sind.
   5. Verwenden Sie folgende Formel, um die korrigierte totale Zellfluoreszenz (CTCF) für jede Zelle zu berechnen:
      CTCF = integrierte Dichte – (Fläche der ausgewählten Zelle x mittlerer Grauwert der Hintergrundlesungen)
   6. Vergleichen Sie die CTCF-Werte der eisenbehandelten Zellen mit denen der Vehikelzellen. Ein erhöhter CTCF deutet auf erhöhte labile Eisenwerte hin.

5. Zelllumineszenz-Assay

1. Behandlung von Zellen für den Lumineszenz-Test
   1. Füllen Sie Abschnitt 1 aus und stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Bohrlöcher für jede Bedingung, die Sie einbeziehen möchten, mit n = 3 übereinstimmt. Fügen Sie mindestens drei zellfreie (nur vollständige Medien) Kontrollbrunnen hinzu. Insgesamt sollten 100 μL Zellen und Medien zu jedem Bohrloch hinzugefügt werden.
   2. Nach der Inkubation unbehandelter Zellen über Nacht wenden Sie Behandlungen und Kontrollen nach Belieben an. Stellen Sie sicher, dass Sie eine Vehikelbedingung (unbehandelt), Bedingungen mit nur FAC, zytotoxisch + 10 μM Ferrostatin-1 (ein antiferroptotisches Mittel), Vehikel + 1 μM RSL3 und/oder Vehikel + 10 μM Ferrostatin-1 + 1 μM RSL3 angeben. Inkubieren Sie für die gewünschte Dauer (12–24 Stunden, um die Behandlungseffekte zu maximieren und übermäßigen Zelltod zu verhindern).
2. Abschluss des Lumineszenztests
   1. Nach der Behandlung der Zellen tauen Sie die Leuchtpufferkomponenten auf Raumtemperatur auf. Kombinieren Sie die benötigten Komponenten und lagern Sie sie im Dunkeln, bis sie einsatzbereit sind. Siehe Kit-Anweisungen zu Anforderungen an die Temperaturspeicherung.
   2. Nachdem die Zellen die Behandlung abgeschlossen haben, folgen Sie den Anweisungen des Kits zur Zellbehandlung.
      HINWEIS: Dies wird wahrscheinlich die Raumtemperatur-Gleichstellung umfassen, gefolgt von der Hinzufügung des Lumineszenzpuffers und einer abschließenden, kurzen Inkubationszeit bei Raumtemperatur. Sobald der Lumineszenzpuffer hinzugefügt ist, sollten alle Schritte im Dunkeln ausgeführt werden.
   3. Die Lumineszenz werden mit einem Plattenleser oder einem ähnlichen Gerät vervollständigt und aufgezeichnet.
      HINWEIS: Für dieses Protokoll wurde eine Integrationszeit von 0,3 s verwendet.
   4. Normalisieren Sie die Lumineszenzwerte der experimentellen Wells auf die durchschnittliche Lumineszenz der zellfreien Kontrollwellen.
      HINWEIS: Höhere Lumineszenzwerte deuten auf eine höhere Anzahl lebender Zellen hin.

Ergebnisse

Basierend auf früheren Arbeiten von uns und anderen stellten wir die Hypothese auf, dass eine Erhöhung des extrazellulären Eisens eine intrazelluläre Eisenüberlastung in Mausmuskelzellen verursachen und es uns ermöglichen würde, nachgeschaltete ferroptosassoziierte Reaktionen zu überwachen. Deshalb entwickelten wir den in Abbildung 1 beschriebenen C2C12-Workflow, bei dem Zellen je nach nachgelagertem Test 2–24 Stunden bestimmten Konzentrationen von Eisenammoniumcitrat ausgesetzt waren.

Der erste Schritt zur Validierung unseres Modells bestand darin zu bestätigen, dass FAC in die Zellen eindringen kann. Anhand der in Tabelle 3 beschriebenen validierten Primer führten wir qPCR sowohl für die schwere als auch die leichte Ferritinkette durch und stellten fest, dass eine steigende Eisenzufuhr mit erhöhten Ferritin-mRNA-Spiegeln korrelierte (Abbildung 2A,B). Auf Proteinebene war ein ähnlicher Anstieg der Ferritinwerte mit steigender FAC-Konzentration sichtbar, obwohl dies nicht dosisabhängig zu sein schien (Abbildung 2C). Ähnlich zeigte die Färbung lebender, FAC-behandelter C2C12-Zellen, dass diejenigen, die mit einer zytotoxischen Eisendosis behandelt wurden – sowie Zellen, die gleichzeitig mit der schweren Dosis und labiler Eisenfarbung als positive Kontrolle behandelt wurden – visuell und quantitativ eine erhöhte Eisenspeicherung im Vergleich zu unbehandelten Zellen und denen, die nur dem Eisenchelator-Deferoxamin ausgesetzt waren (DFO; Abbildung 2D). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das durch FAC in die Zellmedien eingeführte Eisen tatsächlich in die Zellen eindringt.

Nachdem festgestellt wurde, dass FAC die intrazelluläre Eisenbelastung erhöht, wollten wir als Nächstes feststellen, ob eine Eisenüberladung mit molekularen und funktionellen Veränderungen einhergeht, die mit der Ferroptose einhergehen. FAC erhöhte die Expression von Slc40a1 (Ferroportin) (Abbildung 3A) und erhöhte Hmox1 (Abbildung 3B). FAC verringerte außerdem das GPX4-Protein, und diese Reduktion wurde teilweise durch Deferoxamin rückgängig gemacht (Abbildung 3C). Die Behandlung mit RSL3 führte zu einer ähnlichen Reduktion von GPX4, wodurch die FAC-Reaktion in einen breiteren, ferroptosassoziierten molekularen Kontext eingeordnet wurde. Funktional reduzierte eine zytotoxische FAC-Dosis die lumineszenzbasierte Viabilität nach 12 Stunden, und dieser frühe Verlust wurde durch Ferrostatin-1 gerettet (Abbildung 3D). Im Gegensatz dazu wird bei 24 Stunden der Abstand zwischen den Bedingungen weniger ausgeprägt und variabler (Abbildung 3E). Während mit Ferrostatin-1 behandelte Proben im Vergleich zum zytotoxischen FAC allein erhöht bleiben, ist der gesamte Dynamikbereich des Tests zu diesem späteren Zeitpunkt reduziert. Zusammen zeigen diese Daten, dass die FAC-Behandlung zu einer Eisenüberlastung, ferroptoseassoziierten molekularen Veränderungen und einer zeitabhängigen, ferrostatinsensitiven Reduktion der Lebensfähigkeit in C2C12-Zellen führt.

Abbildung 1: Grafische Abstraktion des Eisenüberlastungsmodells. In diesem Modell werden C2C12-Zellen ausgesät und über Nacht inkubiert, bevor sie mit verschiedenen physiologisch signifikanten Dosen eisenhaltigen Kulturmediums und direkter molekularer Analyse inkubiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Erhöhte labile Eisenspeicherung und Ferritinsynthese nach der Zugabe von Ferrikammoniumcitrat. mRNA-Spiegel von (A) Ferritin-Schwerketten- und (B)-Ferritin-Leichtkettenniveau steigen mit der Zugabe von Ferrikammoniumcitrat in das System. (C) Die FTH1-Proteinwerte steigen mit der Zugabe von Eiseneisen. (D) Erhöhung der labilen Eisenwerte in C2C12-Zellen, die mit Eiseneisen behandelt wurden, bevor und gleichzeitig mit der Färbung mit einem weitroten labilen Eisenfarbstoff behandelt wurde, im Vergleich zur Kontrolle von Vehikel + Deferoxamin. Die Kobehandlungsbedingung weist auf eine gleichzeitige Behandlung mit Kulturmedium + 180 μM FAC + labile Eisenfarbe hin. Fehlerbalken sind +/- SD. Abkürzungen: FTH1 = Ferritin-Schwerkette; FTL1 = Ferritin-Leichtkette; DFO = Deferoxamin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Ferroptosassoziierte molekulare Veränderungen und eine zeitabhängige Verringerung der Zellviabilität nach FAC-Addition. mRNA-Spiegel von (A) Ferroportin (Slc40a1) und (B) Hmox1 steigen nach der FAC-Behandlung. (C) Das GPX4-Protein nimmt nach der FAC-Behandlung und in Anwesenheit des positiven Kontroll-RSL3 ab; Deferoxamin kehrt teilweise den FAC-assoziierten Rückgang von GPX4 um. (D) Lumineszenz von C2C12-Zellen nach 12-stündiger Behandlung mit FAC, RSL3 und/oder Ferrostatin-1, normalisiert auf zellfreie (nur Medien) Brunnen. (E) Normalisierte Lumineszenz behandelter C2C12-Zellen nach 24 Stunden Behandlung mit FAC, RSL3 und/oder Ferrostatin-1. Die Fehlerbalken sind +/- SD. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Halt-Phase
1	Erhöhen Sie die Temperatur auf 50 °C bei 1,6 °C/s, halten Sie sie 2 Minuten
2	Erhöhen Sie auf 95 °C bei 1,6 °C/s, halten Sie 10 Minuten
PCR-Stufe (Lauf x 40)
1	15 Sekunden bei 95 °C halten
2	Reduzieren Sie die Temperatur auf 60 °C bei 1,6 °C/s, halten Sie 1 Minute
Schmelzkurvenstadium
1	Erhöhen Sie auf 95 °C bei 1,6 °C/s, halten Sie 15 Sekunden
2	Reduzieren Sie die Temperatur auf 60 °C bei 1,6 °C/s, halten Sie 1 Minute
3	Erhöhen Sie auf 95 °C bei 0,15 °C/s, halten Sie 1 Sekunde

Tabelle 1: qPCR-Programm (Dauer: ~1:36 H) in Protokollabschnitt 2.

	Auflösungsgel			Stapelgel
Komponente	10%	12.50%	15%
Acrylamid (mL)	5.6	6.9	8.3	0.65
Steriles Wasser (mL)	6.9	5.3	3.9	3.05
Tris/HCl, 1,5 m pH 8,8 (mL)	4.2			-
Tris/HCl, 0,5 M pH 6,8 (mL)	-			1.25
10 % Natriumdodecylsulfat (μL)	166			50
0,1 g/mL Ammoniumpersulfat (μL)	80			25
TEMED	8.3			5

Tabelle 2: Zusammenfassung der Komponenten und Volumina, die für den erfolgreichen Aufbau von Auflösungs- und Stapelgels für Western Blot erforderlich sind. Die bereitgestellten Volumina reichen für zwei Gels aus und können entsprechend skaliert werden. Die Prozentsätze geben die Menge an Acrylamid in der Mischung an.  HINWEIS: APS und TEMED sollten zuletzt und nur nach dem Gussbereitschaft hinzugefügt werden, da sie den Gelpolymerisationsprozess auslösen.

Gen-Ziel	Gen-Symbol	Funktion	Arten	Vorwärtssequenz	Rückwärtssequenz
Beta-2-Mikroglobulin	B2m	Putzgenen	Maus	TCACACTGAA TTCACCCCCA	TCACATGTCT CGATCCCAGT
TATA-Boxbindungsprotein	TBP	Putzgenen	Maus	CAGATGTGC GTCAGGCGTT	CCATGAAATAGT GATGCTGGGCAC
Ferritin-schwere Kette	Fth1	Untereinheit des Eisenspeicherproteins Ferritin	Maus	TGGCTCTGAA GAACTTTGCCA	TCATCACGGTC TGGTTTCTTTA
Ferritin-Leichtkette	FTL1	Untereinheit des Eisenspeicherproteins Ferritin	Maus	AATGGGGTAAA ACCCAGGAGG	AGGAAGTCACA GAGATGAGGGT
Hämoxygenase 1	Hmox1	Wandelt Biliverdin in Anwesenheit von Häm, CO2 und Eisen in Bilirubin um; Hohe Werte sind bei der Ferroptose vorhanden	Maus	CTAGCCTGGT GCAAGATACTG	TGTCTGGGAT GAGCTAGTGC
Ferroportin 1	Slc40a1	Transportiert überschüssiges Eisen aus den Zellen	Maus	GCTGCTAGAA TCGGTCTTTGG	TGGAGTTCTG CACACCATTGA

Tabelle 3: Liste validierter qPCR-Primer für Eisentransport- und Ferroptosegene von Interesse. Primer sind mausspezifisch, da sie in mRNA verwendet werden, die von C2C12-Zellen stammt.

Diskussion

Ziel dieser Studie war es, ein praktisches in-vitro-Modell der Eisenüberlastung bei Mausmuskelvorläufern zu etablieren und Bedingungen zu definieren, unter denen ferroptosassoziierte Reaktionen zuverlässig nachgewiesen werden können. Mit diesem Workflow zeigen wir, dass die Behandlung mit Ferrikammoniumcitrat zu einer robusten intrazellulären Eisenansammlung führt, begleitet von erhöhter Ferritinexpression und erhöhtem labilem Eisensignal. Die Eisenbelastung ist zudem mit molekularen Veränderungen verbunden, die mit ferroptosebedingtem Stress übereinstimmen, einschließlich erhöhter Expression von Slc40a1 und Hmox1 sowie einer verringerten GPX4-Proteinmenge. Funktional bewirkt die zytotoxische FAC-Exposition eine Verringerung der Zelllebensfähigkeit, die durch Ferrostatin-1 zu frühen Zeitpunkten gerettet wird, wodurch das Vorhandensein einer ferroptosesensitiven Komponente unterstützt wird, die zum beobachteten Zelltod beiträgt.

Eisendosis und Behandlungsdauer sind entscheidende Parameter, die die Interpretierbarkeit dieses Systems direkt beeinflussen. In unseren Händen bieten frühe Zeitpunkte (etwa 12 Uhr) die klarste Trennung zwischen den Zuständen, sodass Ferrostatin-1 FAC-induzierte Zytotoxizität auf reproduzierbare Weise retten kann. Zu späteren Zeitpunkten (z. B. 24 Stunden) nimmt die Gesamtlebensfähigkeit ab und die Variabilität steigt je nach Bedingungen, was den Dynamikbereich des Assays verringert. Dies entspricht kumulativem Zellverlust und Anpassung der überlebenden Population, wie etwa einer erhöhten antioxidativen Kapazität oder veränderter Eisenhandhabung.

Die Verabreichung von eisenhaltigem Eisen (Fe³⁺) anstelle von eisenhaltigem Eisen (Fe²⁺) sowie die Konzentration des verabreichten Eisens und die Behandlungsdauer sind ebenfalls entscheidende Aspekte des Protokolls. Die Verwendung von Eiseneisen ist unerlässlich, da Eiseneisen leicht vom Transferrin aufgenommen wird, dem Haupttransporter, der für den Import von Eiseneisen¹¹ verantwortlich ist. Obwohl eisenhaltiges Eisen von anderen Transportern aufgenommen werden kann (insbesondere dem divalenten Metalltransporter DMT1), schien in diesem Zusammenhang Eiseneisen effektiver integriert zu werden als^{Eiseneisen-12}. Die für dieses Protokoll ausgewählten FAC-Konzentrationen wurden aufgrund ihrer physiologischen Relevanz und Verwendung in früheren ähnlichen Modellen^{ausgewählt 13,14}. Die Dauer der Eisenbehandlung, 24 Stunden, basierte ebenfalls auf ähnlichen Modellen von uns und anderen. In einigen Kontexten (insbesondere bei labilen Eisenfärbungen und Zelllumineszenztests) erwies sich jedoch die Behandlungsdauer von 24 Stunden als zu lang. In diesen Fällen führte eine 24-Stunden-Behandlung zu einem so bedeutenden Zelltod, dass aufgrund der Zerstörung des zellulären Materials keine Schlussfolgerungen gezogen werden konnten. Zum Beispiel ist RSL3 ein so potentes Lipidperoxidationsmittel, dass eine Behandlungsdauer von 12 Stunden ausreichte, um eine Lipidperoxidation zu induzieren und gleichzeitig sicherzustellen, dass die Auswirkungen einer Eisenüberladung sichtbar waren (Abbildung 3C-E). Zusätzlich wurden die Zellen für den labilen Eisenfarbstoff nur für eine Dauer von 2 Stunden mit FAC behandelt, bevor sie gefärbt wurden (nach dem Versuch, nach 2, 4 und 24 Stunden Eisenbehandlungen zu färben), um die anfängliche Reaktion auf eine Eisenüberladung zu erfassen, bevor eine übermäßige Zellzerstörung auftreten konnte (Abbildung 2D). Insgesamt scheint es, dass Veränderungen auf Gen- und Proteinebene am besten nach 12–24 Stunden Eisenbehandlung gemessen wurden, vermutlich weil diese Veränderungen länger dauern, bis sich die Zellen auswirken, während die Färbung am besten nach einer kürzeren Behandlungsdauer erfolgen sollte.

Andere haben ähnliche Modelle entwickelt. Eine Gruppe erstellte ein eisenhaltig behandeltes C2C12-Modell, um die Rolle der p53-Slc7a11-Achse bei der Ferroptose zu untersuchen. Sie stellten fest, dass die Behandlung mit Eiseneisen über 48 Stunden die Lipidperoxidation erhöhte und die Slc7a11-Spiegel senkte, was auf Ferroptose¹³ hindeutete. Ein weiteres ähnliches Modell – diesmal mit ferrosulfat-behandelten C2C12-Zellen zur Untersuchung der Beziehung zwischen dem Akt-FoxO3-E3-Omniquitin-Ligase-Weg und der Ferroptose – beinhaltete eine Behandlung mit Eisen über 4 Stunden^{und 14} Stunden. Ein gemeinsamer Faden zwischen diesen ist, dass sie eine Eisenbehandlung von C2C12-Zellen beinhalten, die zu Myotuben differenziert wurden, anstatt in ihrem eher stammzellartigen Myoblastzustand zu bleiben. Dies macht unser System besonders relevant für die zuvor beobachtete Eisenansammlung in MuSCs.

Obwohl die Methode eine einfache Methode ist, um die Auswirkungen einer Eisenüberlastung auf Muskeln in vitro zu untersuchen, hat sie Einschränkungen, da sie bisher nur im Zusammenhang mit C2C12-Zellen eingesetzt wurde. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Muskelstammzellen während des Alterns anfällig für Eisenüberlastung sind, was darauf hindeutet, dass eine ähnliche Methode in diesem Zusammenhang sinnvoll sein könnte⁹.

Zusammengenommen zeigt dieses Modell, dass eine Eisenüberladung ausreicht, um eine reproduzierbare Reihe ferrotoptosassoziierter molekularer Veränderungen und eine ferrostatin-sensitive Reduktion der Lebensfähigkeit in C2C12-Zellen zu induzieren. Während zusätzliche orthogonale Tests die Zelltodklassifikation in bestimmten Kontexten weiter verfeinern können, stimmen die hier beobachteten kombinierten molekularen und pharmakologischen Reaktionen mit ferroptosassoziiertem Zellstress überein. Wir erwarten, dass dieser Ansatz mechanistische Studien zur Eisendysregulation bei Muskelalterung und -erkrankungen erleichtern wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 kb Protein Ladder, 500 µL size	Bio-Rad	1610374	Bei -20 °C lagern. Auf Eis auftauen.
15 mL Centrifuge Tubes CS500	Avantor/VWR	89039-664
30% Acrylamid/Bisphosphat-Lösung, 29:1, 500 mL Größe	Bio-Rad	1610156	Ist ein Neurotoxin. Nur bei angemessenem PSA (Laborkittel, Handschuhe, Augenschutz) handhaben.
5425 / 5425 R Mikrozentrifuge	Eppendorf	05-414-052
5910 Ri Zentrifuge	Eppendorf	05-414-459PM2
96-Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165305
Ammoniumpersulfat, 10 g	Bio-Rad	1610700	Polymerisationsmittel für Acrylamid-Gel-Casting als 10%ige Gewichts/Volumen-Lösung in sterilem Wasser. Pulver ist raumtemperaturstabil, aber die Lösung sollte langfristig bei -20 °C und kurzfristig bei 4 °C gelagert werden.
Anti-GAPDH, Maus-Antikörper, 100 µg Größe	Thermo Fisher Scientific	AM4300	Bei einer Konzentration von 1:2000 in 2% BSA + Waschpuffer verwenden. Läuft bei 37 kDa.
BCA Protein Assay Kit mit verdünnungsfreien BSA Protein Standards	Thermo Fisher Scientific	A55865	Befolgen Sie die Herstelleranweisungen zur Verwendung. Beachten Sie, dass die Standards nach dem ersten Gebrauch bei 4 °C aufbewahrt werden müssen.
Beta Actin Loading Control Monoclonal Antibody (BA3R), DyLight 800 4X PEG	Thermo Fisher Scientific	MA515739D800	Bei einer Konzentration von 1:1000 in 2% BSA + Waschpuffer verwenden. Läuft bei 42 kDa.
BioLite 6 Well Multidish Zellkultur-behandelte Oberfläche	Thermo Fisher Scientific	130184
Blot Box, Schwarz, 9x6,5 cm, 5/pk	Fisher Scientific	501870983
Bromophenolblau	Sigma-Aldrich	B0126	Zur Herstellung des Laemmli-Puffers verwenden.
BSA, fest, 100 g	Fisher Scientific	BP9703100	Bei 4 °C lagern.
C2C12 Zellen	ATCC	CRL-1772	In der Dampfphase von flüssigem Stickstoff lagern.
cDNA Supermix QScript 500 Reaktionen	Avantor/VWR	101414-108	Bei -20 °C lagern. Auf Eis auftauen.
Zellheber, 100pk	Fisher Scientific	8100240	Da sie größer sind, zur Extraktion von Zellen aus 10 cm und größeren Schalen verwenden.
Zellschaber, 10 Zoll Griff, 100pk	Fisher Scientific	08-100-241	Da sie einen kleinen Kopf haben, sind sie am besten geeignet, um Zellen aus Multi-Well-Platten zu entfernen.
CellTiter-Glo Luminoszenz-Zellviabilitäts-Kit, 10 mL	Promega	G7570
Chloroform, 99,9%	Thermo Fisher Scientific	610281000	Nur in einer Abzugshaube verwenden und Abfälle in einem separaten Behälter entsorgen.
COMPLETE EDTA-freie Protease-Inhibitor-Tabletten	Sigma-Aldrich	4693132001	1 Tablette in 500 µL sterilem Wasser auflösen, um eine 100fache Lösung herzustellen.
CO2 100-120 V Inkubator	Binder	9640-0002	Modellversion CBS 170-120 V. Für Zellkultur verwenden.
Deferoxaminmesylat, 50 mg	Fisher Scientific	5764/50	DFO ist ein Eisenchelator, daher verringert dessen Zugabe zu Zellen den Eisengehalt. In Wasser auflösen, um eine Stammkonzentration von 1 M zu erhalten.
Dimethylsulfoxid, 100 mL	Fisher Scientific	D5879-100ML	Bei labilem Eisen-Färben und Rekonstitution verwenden.
DMEM, hohe Glukose, Pyruvat, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11995065
Dylight 680 konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen IgG (H&L)	Thermo Fisher Scientific	35568	Zu 5% BSA in Waschpuffer im Verhältnis 1:5000 hinzufügen.
DyLight 800 4× PEG konjugiertes Ziegen-anti-Maus IgG (H&L) Sekundärantikörper	Thermo Fisher Scientific	SA535521	Zu 5% BSA in Waschpuffer im Verhältnis 1:5000 hinzufügen.
Easypet 3 1-Kanal Pipettenhilfe	Eppendorf	4430000018
Far-red Labile Fe2+ Dye	Sigma-Aldrich	SCT037	Stammlösung herstellen, indem 50 µL DMSO zu einem Raumtemperaturaliquot hinzugefügt werden. Lichtempfindlich. Stammkonzentration: 1 mM
Ferric Ammoniumcitrat, 500 g	MP Biomedicals	158040
Ferrostatin 10 mg	Fisher Scientific	502259214	Sequestriert Lipidperoxidationsnebenprodukte und hemmt in vitro Ferroptose. In DMSO auflösen, um eine Stammkonzentration von 10 mM zu erhalten.
Fetal Bovine Serum, Premium Plus, Flasche, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A5669701	Zur Ergänzung von DMEM für C2C12 Zellkultur verwenden. In einem Verhältnis von 10% zum Volumen hinzugefügt.
Flex-Tube 1,5 mL PCR clean, farblos, 500 Stk.	Eppendorf	22364120
FTH1 (D1D4) Kaninchen mAb 100 µL	Cell Signaling Technology	4393	Bei einer Konzentration von 1:1000 in 2% BSA + Waschpuffer verwenden. Läuft bei ~20 kDa.
Glycerol, ultrarein	Thermo Fisher Scientific	15514011	Bei der Herstellung von 6x Laemmli-Puffer verwenden.
GlycoBlue Coprecipitant (15 mg/mL), 300 μL	Thermo Fisher Scientific	AM9515	Zur Visualisierung des Pellets während der RNA-Reinigung verwenden.
Image-iT Lipid Peroxidation Kit	Thermo Fisher Scientific	C10445	Bereit zur Verwendung. Lichtempfindlich. Stammkonzentration: 10 mM
ImageJ Software	National Institutes of Health