Methodenartikel

Herstellung und Charakterisierung von auflösbaren, mit 3BDO beladenen Mikronadel-Pflastern zur Förderung des Haarwachstums bei C57BL/6-Mäusen

74 Ansichten

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DOI:

10.3791/71814

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25. August 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Stomatology, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung, Charakterisierung und Anwendung von mit 3BDO beladenen auflösbaren Mikronadel-Pflastern für die transdermale Arzneimittelabgabe in einem Maus-Modell der Haarregeneration.

Zusammenfassung

Konventionelle Behandlungen der androgenetischen Alopezie (AGA) weisen Einschränkungen auf, was alternative Abgabestrategien erforderlich macht. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung, Charakterisierung und Anwendung von mit 3BDO beladenen auflösbaren Mikronadel-Pflastern auf Basis von Hyaluronsäure/Chitosan (HA/CS) in einem Haar-Regenerationsmodell an C57BL/6-Mäusen. Die Methode verwendet einen zweistufigen Gießprozess in einer Polydimethylsiloxan-(PDMS-)Form, um 3BDO in den Nadelspitzen anzureichern, während gleichzeitig eine arzneimittelfreie HA/CS-Trägerschicht gebildet wird. Das Pflaster wird mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM), mechanischen Prüfungen, Hautpenetrations- und Auflösetests, in vitro-Freisetzungsstudien, antibakteriellen Assays, Zytotoxizitätsprüfungen und in vivo-Haar-Regenerationsbewertungen charakterisiert. Nach der Insertion lösen sich die Mikronadel-Spitzen auf und setzen 3BDO lokal frei. Die in vivo-Untersuchung zeigte, dass die Gruppe mit 3BDO-beladenen Mikronadeln im Vergleich zu den untersuchten subkutanen Injektions- und Kontrollgruppen eine gleichmäßigere Haarregeneration aufwies. Dieses Protokoll ermöglicht zudem die Beurteilung der Pflaster-Morphologie, der Insertionsleistung und der lokalen Biokompatibilität. Die Methode stellt einen präklinischen Arbeitsablauf zur Bewertung der mikronadelvermittelten Abgabe von 3BDO für Haar-Regenerationsanwendungen bereit.

Einleitung

Die androgenetische Alopezie (AGA) ist eine der häufigsten klinischen Alopezieerkrankungen und zeichnet sich hauptsächlich durch fortschreitende Haarverdünnung und -verlust auf der Kopfhaut aus. Ihre Lebenszeitprävalenz bleibt bei Männern nach wie vor hoch, wodurch sie zu einem wichtigen Gesundheitsproblem wird, das eine dringende Lösung erfordert1,2. Derzeit lassen sich klinische Behandlungen der AGA hauptsächlich in pharmakologische Interventionen und chirurgische Transplantation einteilen, wobei beide Verfahren erhebliche Nachteile aufweisen. Erstlinientherapeutika wie Finasterid und Minoxidil zeigen gewisse therapeutische Wirkungen, sind jedoch mit definierten Nebenwirkungen wie sexueller Dysfunktion, Kopfhautjuckreiz und Kopfhauttrockenheit verbunden1,3. Obwohl die Haartransplantation eine lokale Haarregeneration ermöglichen kann, wird sie durch hohe Behandlungskosten, unzureichende Haarmenge in den Spenderarealen und schwankende Überlebensraten der Transplantate begrenzt, wodurch ihre breite klinische Anwendung erschwert wird1. Angesichts dieser Einschränkungen besteht Bedarf an neuen therapeutischen Strategien, die Wirksamkeit, Sicherheit und Patientencompliance vereinen.

3BDO ist ein kleines Molekül, das mTOR aktiviert und mit Rapamycin konkurriert4. Es wurde umfassend als Autophagie-Inhibitor in verschiedenen Systemen eingesetzt5,6,7. Beispielsweise könnte eine Langzeitbehandlung mit 3BDO die Gedächtnisfunktion verbessern, indem die Anzahl der Autophagosomen verringert wird8. Darüber hinaus deuten zunehmende Hinweise darauf hin, dass 3BDO unabhängig als mTOR-Aktivator wirken könnte. Zum Beispiel hemmte 3BDO den endothelialen Zelltod und die Entwicklung der Atherosklerose bei Mäusen unabhängig von der mTOR-Aktivität9. Seine mögliche Rolle beim Haarfollikelwachstum wurde jedoch bisher nicht beschrieben. Bemerkenswerterweise zeigte 3BDO in unseren vorläufigen Studien eine Förderung des Haarwachstums. Traditionelle topische Arzneimittelabgabemethoden weisen jedoch offensichtliche Einschränkungen auf. Die Hornschicht der Haut begrenzt die transdermale Effizienz und erschwert die Abgabe von Wirkstoffen an den Zielort im Haarfollikel in der Dermis. Obwohl transdermale Gele die Verweildauer des Wirkstoffs verlängern können, können sie unerwünschte Rückstände hinterlassen. Die klinische Wirksamkeit beider oben genannten Behandlungsstrategien bleibt suboptimal10,11.

Mikronadeln (MNs) sind eine neuartige, schmerzfreie Technologie zur Arzneimittelabgabe, deren entscheidender Vorteil darin besteht, dass sie leicht in den Stratum corneum eindringen und Wirkstoffe präzise in die perifollikuläre Mikroumgebung an der Grenzschicht zwischen Epidermis und Dermis abgeben können. Außerdem zeichnen sich MNs durch eine bequeme Anwendung, minimale Invasivität und angemessene Kosten aus12,13,14. Um die Engstelle der transdermalen Abgabe von topischem 3BDO zu überwinden, wurde ein MN-Pflaster unter Verwendung von Hyaluronsäure (HA) als Matrix und Chitosan (CS) als funktioneller Komponente entwickelt. Die Zugabe von CS soll eine funktionelle Komponente mit antibakterieller Wirkung bereitstellen. Darüber hinaus konnte die Anwendung von HA auf der Haut von alopekischen Mäusen die Entwicklung der Haarfollikel signifikant stimulieren15. Daher beschreibt dieses Protokoll die Herstellung und Charakterisierung eines 3BDO-beladenen, auflösbaren MN-Systems sowie dessen Anwendung in einem enthaarten C57BL/6-Maus-Modell zur Haarregeneration. Dieses Modell eignet sich zur Beurteilung der Haarwachstumsreaktionen nach Enthaarung, erlaubt aber nicht von sich aus eine Aussage über die klinische Wirksamkeit bei AGA.

Protokoll

Die Studie wurde von dem Tierversuchsausschuss der Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences (W202112030345) genehmigt. Alle Methoden wurden gemäß den einschlägigen Leitlinien und Vorschriften durchgeführt.

1. Herstellung von 3BDO@MN-Pflastern

  1. Herstellung der CS/HA-Formulierung
    1. 1 g CS-Pulver (Grad der Deazetylierung ≥ 95 %) abwiegen und zu 20 mL destilliertem Wasser geben, anschließend 10 min bei Raumtemperatur (RT) unter Rühren mischen.
    2. Weiterhin 0,4 mL einer 2 %igen (v/v) Essigsäurelösung (Molekulargewicht 60,05) zugeben und 2 h weiterrühren.
      ACHTUNG: Konzentrierte Essigsäure ist ätzend. Die Verdünnung und Handhabung im Abzug durchführen und Einweghandschuhe sowie Schutzbrille tragen, um Haut- und Schleimhautkontakt zu vermeiden.
    3. Anschließend 2 g HA-Pulver zugeben und die gemischte Formulierung bei 1.207 × g (ca. 3.000 U/min) 5 min zentrifugieren, um eine vollständige Auflösung sicherzustellen.
      ​HINWEIS: Die CS/HA-Formulierung sollte frisch hergestellt werden und kann höchstens 24 h im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahrt werden.
  2. Herstellung der mit 3BDO beladenen CS/HA-Formulierung
    1. Die vorab gelöste 3BDO-Lösung (2 mg/mL) in Dimethylsulfoxid (DMSO) geben
      ACHTUNG: DMSO ist hautdurchlässig. Während der Handhabung Handschuhe tragen, um direkten Hautkontakt zu vermeiden, und die Lösung zur CS/HA-Formulierung hinzufügen. Gut mischen, um eine vollständige Auflösung sicherzustellen.
    2. Die gemischte Formulierung 5 min bei 1.207 × g zentrifugieren, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
      ​HINWEIS: Bestehen nach der Zentrifugation noch Blasen, die Formulierung 5 min stehen lassen und erneut zentrifugieren.
  3. Herstellung der 3BDO@MN-Pflaster
    1. Eine polydimethylsiloxanbasierte (PDMS) Mikronadel-Form (MN-Form) verwenden, die ein 20 × 20-Array konischer Spitzen mit einer Höhe von 600 µm, einem Basisdurchmesser von 250 µm und einem Abstand (Pitch) von 550 µm aufweist.
    2. Die Oberfläche der PDMS-Form mit einem Plasma-Reiniger behandeln, um sie vollständig hydrophil zu machen.
    3. 1 mL der 3BDO@CS/HA-Formulierung zur PDMS-MN-Form hinzufügen. Die Form in eine Vakuumkammer stellen und 10 min evakuieren, um das Eindringen der viskosen Formulierung in die Mikrohohlräume zu erleichtern.
    4. Die Form 5 min bei 134 × g und RT zentrifugieren, um eine vollständige Füllung aller Hohlräume sicherzustellen. Mit einem sterilen Metallspatel vorsichtig überschüssige Formulierung von der Oberfläche der Form entfernen, sodass eine vollständig ebene Fläche entsteht.
    5. Die CS/HA-Matrixmischung ohne 3BDO auf die Oberfläche der Form auftragen. 5 min bei 134 × g und RT zentrifugieren, um eine gleichmäßige Trägerschicht zu bilden.
    6. Die Form über Nacht (ca. 12–16 h) bei 36 °C und 37 % Luftfeuchtigkeit im Ofen trocknen.
    7. Das vollständig getrocknete MN-Pflaster nach dem Abkühlen der Form auf RT vorsichtig ablösen.
      HINWEIS: Die hergestellten 3BDO@MN-Pflaster bis zur Verwendung im Kühlschrank bei 4 °C aufbewahren.

2. Charakterisierung von 3BDO@MN-Pflastern

  1. Befestigen Sie das vorbereitete 3BDO@MN-Pflaster mit doppelseitigem leitfähigem Kohlenstoffklebeband auf einem Probenträger.
    1. Bedampfen Sie die befestigte Probe mit einer dünnen Schicht Gold (oder Platin), um die elektrische Leitfähigkeit zu verbessern.
    2. Platzieren Sie den Probenträger in der Vakuumkammer eines Feldemissions-Rasterelektronenmikroskops (FE-SEM).
    3. Passen Sie die Beschleunigungsspannung und die Arbeitsdistanz an, um hochauflösende Aufnahmen zu erhalten. Untersuchen Sie die Gesamtmorphologie des Arrays sowie die feine Oberflächentopographie einzelner Mikronadeln.
    4. Nehmen Sie repräsentative REM-Aufnahmen auf. Messen Sie die Nadellänge und den Nadelspitzen-Durchmesser.
  2. Prüfung der mechanischen Festigkeit
    1. Legen Sie das MN-Pflaster flach auf die Probenaufnahmeplattform eines Texturanalysators. Stellen Sie sicher, dass der Träger vollständig eben ist und die Nadelspitzen direkt nach oben zeigen.
    2. Befestigen Sie eine flache zylindrische Sonde (25 mm Durchmesser) sicher am Lastaufnehmer des Geräts.
    3. Senken Sie die Sonde vertikal ab, bis sie sich unmittelbar über den Nadelspitzen befindet. Vermeiden Sie vor dem Test jeglichen physischen Kontakt zwischen Sonde und Spitzen.
    4. Stellen Sie im Softwareprogramm die spezifischen Testparameter ein: Geschwindigkeit der Abwärtsbewegung auf 0,05 mm/s und Ziel-Wegstrecke auf 0,7 mm.
  3. Lösetest
    1. Spannen Sie die dorsale Haut einer Ratte auf einem Präparationsbrett und tupfen Sie die Oberfläche trocken. Halten Sie die Haut flach und faltenfrei.
    2. Platzieren Sie trockene MN-Pflaster mit nach unten gerichteten Nadelspitzen auf der Hautoberfläche und üben Sie gleichmäßigen vertikalen Druck aus, um die Einführung der MNs in die Haut sicherzustellen.
    3. Entfernen Sie die Pflaster nach vorbestimmten Zeitintervallen (5, 10, 30 und 60 s) von der Haut und trocknen Sie sie 5 min lang.
    4. Untersuchen Sie die verbleibende Morphologie mittels REM unter identischen Bildgebungsbedingungen.
  4. In-vitro-Wirkstofffreisetzungsanalysen
    1. Geben Sie 500 µL gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in jedes Loch einer 6-Loch-Platte. Legen Sie die mit 3BDO beladenen MNs in jedes Loch, sodass sie mit dem PBS in Kontakt stehen.
    2. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur (RT). Entnehmen Sie zu jedem Zeitpunkt 500 µL PBS zur Quantifizierung der 3BDO-Konzentration.
    3. Füllen Sie jedes Loch unverzüglich mit 500 µL frischem PBS auf, um Sinkbedingungen aufrechtzuerhalten.
    4. Berechnen Sie den kumulativen Prozentsatz des freigesetzten 3BDO basierend auf der anfänglichen Gesamtwirkstoffmenge in den MNs.
  5. Antibakterielle Tests
    1. Entnehmen Sie Bakterienkulturen (E. coli und Staphylococcus aureus) aus der Lagerung bei -80 °C und geben Sie jeweils 10 µL Bakterienstammkultur in 5 mL LB-Medium.
    2. Inkubieren Sie das beimpfte Medium in einem Schüttelinkubator bei 37 °C und 250 U/min für etwa 16 h (über Nacht).
    3. Stellen Sie die Bakterienkultur mit LB-Medium auf eine initiale OD620 von 0,01 ein.
    4. Verdünnen Sie die CS-Stammlösung mit sterilisiertem Wasser, um CS-Lösungen in sechs Konzentrationen (1, 5, 10, 50, 100 und 500 mg/mL) herzustellen, jeweils mit drei Wiederholungen pro Konzentration.
    5. Teilen Sie die Proben in drei Gruppen ein: Leergruppe, Kontrollgruppe und CS-Gruppe. Für die Leergruppe geben Sie 200 µL LB-Medium hinzu. Für die Kontrollgruppe geben Sie 180 µL Bakterienlösung und 20 µL sterilisiertes Wasser hinzu. Für die CS-Gruppe geben Sie 180 µL Bakterienlösung und 20 µL der entsprechenden CS-Konzentration hinzu.
    6. Inkubieren Sie bei 37 °C für 20 h.
    7. Messen und dokumentieren Sie die OD620 jedes Wells einer 96-Loch-Platte mit einem Absorptionsplattenreader zu den Zeitpunkten 0 h und 20 h.
  6. Toxizitätsbewertungen
    1. Säen Sie 100 µL epidermale oder dermale Zellsuspension in eine 96-Loch-Platte (2 × 103 Zellen pro Loch).
    2. Geben Sie 10 µL der jeweiligen Behandlungen in die vorgesehenen Löcher, um vier Gruppen zu bilden: eine Kontrollgruppe (Kulturmedium), eine 3BDO-Gruppe (Endkonzentration 1 µM), eine MN-Extraktgruppe und eine 3BDO+MN-Extraktgruppe, jeweils mit drei Wiederholungen pro Gruppe.
    3. Inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO₂ für 24 h.
    4. Geben Sie 10 µL der Arbeitslösung des Cell Counting Kit-8 (CCK-8) in jedes Loch.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Blasen in den Löchern, da diese die Absorptionsmessung beeinflussen können.
    5. Inkubieren Sie bei 37 °C, 5 % CO₂ für 2 h.
    6. Lesen Sie die Absorption bei 450 nm für alle Löcher mit einem Mikroplatten-Spektrophotometer ab.
    7. Analysieren Sie die Daten und berechnen Sie die Zellüberlebensrate.

3. Tierversuche

  1. Vorbereitung und Behandlung der Versuchstiere
    1. Äthylisofluran-Narkose bei 7 Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäusen durchführen und während der Narkose eine Thermoregulation sicherstellen.
      ACHTUNG: Isofluran ist ein flüchtiges Anästhetikum. In einem gut belüfteten Bereich arbeiten, um eine übermäßige Inhalation zu vermeiden.
    2. Ophthalmologisches Gleitmittel auf die Augen der Mäuse auftragen, um sie vor Austrocknung zu schützen.
    3. Das Rückenfell der Mäuse mit einem elektrischen Rasierer abrasieren, wobei ein Bereich von etwa 2 × 2 cm2 rasiert wird.
    4. Die Enthaarungscreme auftragen, 5–10 s warten und anschließend abwischen. Die Haut mit einem mit physiologischer Kochsalzlösung befeuchteten Tupfer abwischen, um Reste der Enthaarungscreme und Haare zu entfernen.
    5. Die MN-Pflaster zuschneiden und beiseitelegen.
    6. Die rasierten Mäuse zufällig in fünf Gruppen einteilen (n = 5 pro Gruppe) und wie folgt behandeln:
      1. Unbehandelte Kontrollgruppe: lediglich Rasur der Haare, keine weitere Behandlung.
      2. Leere MN-Pflaster-Gruppe: die rasierte Haut mit MN-Pflastern ohne 3BDO entsprechend demselben Zeitplan wie der 3BDO@MN-Gruppe behandeln.
      3. 3BDO@MN-Pflaster-Gruppe: die rasierte Haut am Tag 1, 3, 5, 7, 9, 11 und 13 mit 3BDO@MN-Pflastern behandeln.
      4. PBS-Subkutanspritze-Gruppe: täglich eine subkutane Injektion von PBS-Lösung in den rasierten dorsalen Bereich der Mäuse verabreichen.
      5. 3BDO-Subkutanspritze-Gruppe: täglich eine subkutane Injektion von 3BDO-Lösung in den rasierten dorsalen Bereich der Mäuse verabreichen.
    7. Die 3BDO@MN-Pflaster auf die rasierte Haut auflegen und gleichmäßigen vertikalen Druck ausüben, um die Einführung der MNs in die Haut sicherzustellen. Die 3BDO@MN-Pflaster mit einer elastischen Binde fixieren und eine gerade Klemme verwenden, um die Binde an Ort und Stelle zu halten.
      ​HINWEIS: Die unterschiedlichen Applikationsschemata wurden entsprechend den verschiedenen Freisetzungsprofilen der jeweiligen Strategien gewählt: Das 3BDO@MN-Pflaster ermöglicht eine lokal begrenzte, langsame Freisetzung, während die subkutane Injektion 3BDO als Bolusgabe verabreicht.
    8. Die Mäuse während des gesamten Experiments beobachten, um sicherzustellen, dass sie sich vollständig von der Narkose erholen.
  2. Probenentnahme und Bewertung des Haarwachstums
    1. Täglich Fotografien der dorsalen Haut der Mäuse aufnehmen, um das Haarwachstum zu dokumentieren.
    2. Das Nachwachsen der Haare am Tag 15 durch Messung des Haarschaftdurchmessers, der Haarbedeckung und der Haardichte bewerten. Den Prozentsatz der Haarbedeckung im behandelten Bereich mithilfe der ImageJ-Software quantifizieren.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Charakterisierung des 3BDO@MN-Pflasters. Abbildung 1 zeigt das Schema des Herstellungsprozesses für das 3BDO@MN-Pflaster. 3BDO wurde in die CS/HA-Formulierung eingemischt, und die Matrixmischung wurde anschließend in die PDMS-MN-Form gegeben und zentrifugiert, um die Nadelspitzen zu füllen. Die CS/HA-Matrixmischung ohne 3BDO wurde auf die Oberfläche der Form aufgebracht und zentrifugiert, um die Trägerschicht zu füllen. Nach vollständiger Trocknung wurden die Pflaster abgezogen, um die 3BDO@MN-Pflaster zu erhalten. Die Morphologie der Mikronadeln wurde mittels REM charakterisiert, wie in Abbildung 2A dargestellt.

Die konischen Mikronadeln wurden gleichmäßig in einem 20 × 20-Array auf einem 15 × 15 mm großen Pflaster gebildet, jeweils mit einer Basisbreite von 250 µm und einer Höhe von 600 µm. Die Mikronadelspitzen hielten einer Kraft von 1,2 N stand, was ausreicht, um die Haut zu durchdringen, wie durch deutlich sichtbare Einstichlöcher in der Hämatoxylin- und Eosin-(H&E)-Färbung belegt wurde (Abbildung 2B,C). Anschließend wurde die Anwendung von 3BDO@MN-Pflastern an der dorsalen Haut von Mäusen getestet. Die Pflaster wurden auf die Maushaut gedrückt, um die Auflösezeit zu messen, wobei sich die Mikronadelspitzen innerhalb von 60 s vollständig auflösten (Abbildung 2D). Im in vitro-Assay zeigte das Freisetzungsprofil von 3BDO aus den Mikronadeln, dass etwa 90 % des Wirkstoffs freigesetzt wurden (Abbildung 2E). Der Mikronadel-Extrakt zeigte keine Zytotoxizität gegenüber epidermalen und dermalen Zellen, während 1 µM 3BDO das Zellwachstum signifikant förderte (Abbildung 2F). Die Chitosanhaltige Formulierung zeigte eine konzentrationsabhängige antibakterielle Wirkung gegen E. coli und S. aureus, wobei der Effekt bei Konzentrationen über 10 mg/mL stärker ausgeprägt war (Abbildung 2G,H). Diese Ergebnisse untermauern die Verwendung von Chitosan als funktionellen Bestandteil der Mikronadel-Formulierung, obwohl weitere Tests der endgültig hergestellten Pflaster erforderlich wären, um die antibakterielle Wirksamkeit unter Anwendungsbedingungen zu bestätigen.

Tierversuchsergebnisse zeigten, dass die Gruppe mit 3BDO@MN am Tag 5 eine signifikante Hautpigmentierung aufwies. Bis zum Tag 15 erreichte die Gruppe, die 3BDO-Injektionen erhielt, etwa 45 % Haarbedeckung im Vergleich zu etwa 39 % in der Kontrollgruppe, während die 3BDO@MN-Gruppe eine Bedeckung von rund 90 % erreichte (Abbildung 3). Das Nachwachsen der Haare in der 3BDO@MN-Gruppe war gleichmäßiger und dichter, was auf eine bessere Arzneimittelpenetration und -retention im Vergleich zur direkten Injektion hinweist.

Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die MN-vermittelte Applikation von 3BDO das Haarwachstum im enthaarten C57BL/6-Mausmodell, das in dieser Studie verwendet wurde, förderte. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um zu bestimmen, ob dieser Ansatz in krankheitsspezifischen Modellen der androgenetischen Alopezie und unter klinisch relevanten Dosierungsbedingungen wirksam ist.

Diagramm des 3D-Bioprinting-Prozesses: 3BDOQCS/HA-Beschichtung, Zentrifugation, Vakuumtrocknung, CS/HA-Matrix.
Abbildung 1Schematische Darstellung des Herstellungsprozesses von 3BDO@MNs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diagramme des Mikronadel-Arrays und Zellviabilitätsgrafiken; Studie zu den antibakteriellen Eigenschaften von Chitosanlaktat.
Abbildung 2. Herstellung und Charakterisierung des 3BDO@MN-Systems. (A) REM-Bild, das die Morphologie der 3BDO@MN zeigt. Maßstabsbalken = 500 µm. (B) Kraft-Weg-Kurve der 3BDO@MN. (C) H&E-gefärbter Querschnitt von Mäusehaut nach Einführung der 3BDO@MN und Entfernung des Sockels, der eine erfolgreiche Gewebedurchdringung bestätigt. Maßstabsbalken = 100 µm. (D) REM-Bilder, die die Auflösung der MN nach 5 s, 10 s, 30 s und 60 s nach der Einführung in die Haut zeigen. (E) Kumulatives in vitro-Freisetzungsmuster von 3BDO aus den MN. (F) Zellviabilität von epidermalen und dermalen Zellen, die mit 3BDO, MN-Extrakt und MN-Extrakt mit 3BDO über 24 h behandelt wurden. (G,H) Absorption bei 620 nm von (G) Staphylococcus aureus und (H) Escherichia coli, die in einem Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen an Chitosan kultiviert wurden. Die Daten sind als Mittelwert ± SD (n = 3) dargestellt, und die statistische Signifikanz wurde mittels einfaktorieller ANOVA analysiert (**p < 0,01). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Haarwachstumsexperiment mit Mikronadel-(MN-)Pflastern; Pigmentierung, Ergebnisse zur Haarbedeckung bei Mäusen.
Abbildung 3. Haarregenerationswirkung von 3BDO@MNs in vivo. (A) Schematische Darstellung der Tierversuche. (B) Vertretende Aufnahmen der dorsalen Haut von Mäusen am Tag 0 (Rasur), Tag 5, Tag 10 und Tag 15 nach der Behandlung. (C) Quantitative Analyse der Pigmentierungsscores (willkürliche Einheiten) in (B). (D) Quantitative Analyse der Haarbedeckungsfläche (%) im behandelten Bereich in (B). (E) Relativer Faltungsgrad der Haarbedeckungsfläche im behandelten Bereich im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Daten sind als Mittelwert ± SD (n = 5) dargestellt; die statistische Signifikanz wurde mittels einfaktorieller ANOVA analysiert (**p < 0,01). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Derzeit werden klinische Behandlungen für androgenetische Alopezie (AGA) hauptsächlich in pharmakologische Interventionen und chirurgische Transplantationen unterteilt. In dieser Studie förderten mit 3BDO beladene Mikronadeln (MNs) das Haarwachstum in einem C57BL/6-Mausmodell. Herkömmliche Arzneimittelabgabemethoden weisen jedoch Einschränkungen auf, wie beispielsweise eine ungleichmäßige Verteilung des Wirkstoffs. Das zentrale Verfahren dieser Studie ist eine zweistufige Methode zur Herstellung von mit 3BDO beladenen MNs. HA und CS sind die Hauptbestandteile der MNs. Mehrere kritische Schritte erfordern besondere Aufmerksamkeit, um die Qualität der MNs sicherzustellen.

Zunächst wurde zur Vermeidung von Luftporen in der Polymerslösung eine vorab gekühlte Form verwendet, um die Lösungsmittelverdunstung während der Zentrifugation zu verlangsamen. Zweitens beeinflussen die Trocknungsbedingungen direkt die Sprödigkeit der Spitzen und die Integrität der Trägerschicht. Das Trocknen über 16 h bei 36 °C mit kontrollierter Luftfeuchtigkeit half dabei, Spitzen mit ausreichender mechanischer Festigkeit zu gewährleisten, während die Flexibilität der Trägerschicht erhalten blieb und ein Übertrocknen vermieden wurde. Drittens eine Geschwindigkeit von 134 × g 5 min konzentriert 3BDO effektiv im Spitzenbereich, jedoch können höhere Geschwindigkeiten oder längere Zeiten eine Arzneimittelpräzipitation an der Formbasis verursachen und somit die Abgabeeffizienz verringern. Für das in vivo Assay, C57BL/6-Mäuse wurden als Modell für die Haarregeneration verwendet. Die Haarfollikel von C57BL/6-Mäusen weisen einen sichtbaren, stark synchronisierten Haarwachstumszyklus auf, was experimentelle Vorteile bietet und sie zu einem der gebräuchlichsten Modelle für die Untersuchung von Hauterkrankungen macht¹⁶. In einem Alter von etwa sieben Wochen treten die Haarfollikel von C57BL/6-Mäusen natürlicherweise in die Telogenphase ein. Nach künstlicher Enthaarung der Mäuse treten die Haarfollikel unmittelbar wieder in die Anagenphase ein.17. Der in vivo Der Assay zeigte, dass das MN-System in diesem Modell eine gleichmäßigere Haarneubildung förderte als die subkutane Injektion.

Das 3BDO@MN-System könnte eine vielversprechende präklinische Strategie zur Behandlung von Haarausfall darstellen, indem es ein haargenerierendes kleines Molekül mit einer minimalinvasiven transdermalen Abgabeanwendung kombiniert. Langwirksame Mikronadel-Formulierungen wurden bereits beschrieben und können eine kontrollierte oder verzögerte Wirkstofffreisetzung ermöglichen, die Applikationshäufigkeit verringern und die Patientencompliance verbessern, wodurch einige Nachteile herkömmlicher topischer oder systemischer Therapien adressiert werden18,19. Darüber hinaus stützen neuere, auf Mikronadeln basierende Strategien zur Haarregeneration – beispielsweise der Einsatz von Stammzellen – die breitere Anwendbarkeit solcher Mikronadel-Plattformen in diesem Bereich20. Dennoch sind vor der klinischen Anwendung weitere Studien erforderlich, um die Langzeit-Biosicherheit, pharmakokinetische/pharmakodynamische Profile, Dosisoptimierung, Lagerstabilität sowie die Herstellung im größeren Maßstab zu evaluieren.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Nationale Natürliche Wissenschaftsstiftung Chinas (82273554), das Projekt zur Entwicklung von Wissenschaft und Technologie im Bereich Medizin und Gesundheit der Provinz Shandong (Nr. 202304030716), das Nationale Ausbildungsprogramm für Innovation und Unternehmertum von Hochschulstudenten Chinas (Nr. 202410439001) sowie das Projekt zur wissenschaftlichen und technologischen Innovation und Entwicklung in Tai’an (Nr. 2023NS232).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
3BDOYuanye Bio-Technology Co., Shanghai, China890405-51-3Herstellung der 3BDO-beladenen CS/HA-Formulierung
6-Loch-PlatteCorning Incorporated, USAREF 3516antibakterieller Test und In-vitro-Arzneimittelfreisetzungs-Test
75 % EthanolShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.1202050004Desinfektion
96-Loch-PlatteCorning Incorporated, USAREF3599Zelltoxizitätsbewertungen und antibakterieller Test
C57BL/6-MäuseCharles River Laboratories7 WochenTierversuche
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)Dojindo, JapanCK04Toxizitätsbewertungen
ZentrifugeThermo Fisher Scientific75007204Zentrifugation der Formulierung
Chitosan (CS) Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd9012-76-4Herstellung der CS/HA-Formulierung
EnthaarungscremeVeet3059944023307Enthaarung
Dimethylsulfoxid (DMSO)Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd67-68-5Herstellung der 3BDO-beladenen CS/HA-Formulierung
Elektronische WaageRadwagAS 220.R2Wiegen von Pulvern
Escherichia coli (E. coli)ATCC/antibakterieller Test
Hyaluronsäure (HA)-PulverBloomage Biotechnology Co. China9067-32-7Herstellung der CS/HA-Formulierung
ImageJ-SoftwareNational Institutes of Health/Statistische Analyse
InkubationsschüttlerThermo Scientific  50163013Bakterieninkubation
Isofluran-VaporisatorGene&IAMSTieranästhesie
LB-MediumSigma Life ScienceL3022antibakterieller Test
Magnetischer RührerHangzhou MiuLab Instrument Co., Ltd.SP-16Rühren der Formulierung
Multiskan SkyHigh Mikroplatten-SpektrophotometerThermo Fisher Scientific/OD-Messung
OfenShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,LtdDHG-9260ATrocknung der Mikronadeln
Parafilm MAmcor PM-996Versiegelung der Mikronadeln
Phosphatpufferlösung (PBS)BiosharpBL302AIn-vitro-Arzneimittelfreisetzungs-Test
Staphylococcus aureus (S. aureus)ATCC/antibakterieller Test
Universal TA TexturanalysatorShanghai Tengba Instrument Technology Co., Ltd/Prüfung der mechanischen Festigkeit
VakuumkammerShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co.,LtdDZF-6050Vakuumtrocknung

Referenzen

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