Analyse der Bioinformatik von Pankrebs kombiniert mit experimenteller Validierung von Darmkrebs: Eine Studie zu TMED3 als diagnostischem und prognostischem Biomarker

Zusammenfassung

Dieses Protokoll kombiniert pan-krebs-bioinformatische Analyse mit immunhistochemischer Validierung bei Darmkrebs, um die Expression der transmembranen Emp24-Protein-Transportdomäne 3, die prognostische Bedeutung, Immunassoziationen und verwandte biologische Signalwege anhand öffentlicher Multiomik-Datenbanken und klinischer Gewebeproben zu bewerten.

Zusammenfassung

Transmembrane Emp24 Protein Transport Domain 3 (TMED3), ein Mitglied der p24-Proteinfamilie, wurde an der Tumorproliferation, Invasion und Migration in Verbindung gebracht. Diese Studie zielte darauf ab, die Expressionsmuster, die prognostische Bedeutung, Immunassoziationen und mögliche biologische Funktionen von TMED3 über mehrere Krebsarten hinweg mittels pancancer-bioinformatischer Analyse in Kombination mit immunhistochemischer (IHC)-Validierung bei Darmkrebs zu bewerten. Multiomics-Datensätze aus den Datenbanken The Cancer Genome Atlas, Genotype-Tissue Expression, UALCAN, Human Protein Atlas und cBioPortal wurden analysiert, um die TMED3-Expression und genetische Veränderungen beim Pankrebs zu untersuchen. Die Immunhistochemie wurde durchgeführt, um die TMED3-Proteinexpression im Darmkrebsgewebe zu evaluieren. Die Kaplan–Meier-Überlebensanalyse und die Cox-Regressionsanalyse wurden verwendet, um den prognostischen Wert von TMED3 zu bewerten. Die Spearman-Korrelationsanalyse wurde durchgeführt, um die Assoziationen von TMED3 mit tumoraler Mutationslast, Mikrosatelliteninstabilität (MSI), Immunzellinfiltration und Immunkontrollpunkten zu bewerten. Die Gen-Satz-Anreicherungsanalyse wurde durchgeführt, um potenzielle biologische Signalwege zu untersuchen, die mit TMED3 im Darmkrebs assoziiert sind. Die TMED3-Expression war bei den meisten Tumortypen erhöht und war mit einem ungünstigen Gesamtüberleben und krankheitsspezifischem Überleben bei Adrenokortikomkarzinom, Colonadenokarzinom und uvealem Melanom assoziiert. Die größte Häufigkeit von TMED3-genetischen Veränderungen wurde im Mesotheliom festgestellt, wobei die Amplifikation den vorherrschenden Veränderungstyp darstellt. Darüber hinaus zeigte die TMED3-Expression signifikante Korrelationen mit tumoraler Mutationslast und Mikrosatelliteninstabilität im Nieren-Nieren-Klarzellkarzinom, Magenadenokarzinom und Uterus-Endometriumkarzinom. Die TMED3-Expression war auch mit Immuninfiltration und Immuncheckpoint-Expression in mehreren Tumoren assoziiert. Die IHC-Analyse zeigte eine erhöhte TMED3-Expression im Darmkrebsgewebe im Vergleich zu normalen Darmgeweben und zeigte eine Assozion mit dem T-Stadium. Die funktionelle Anreicherungsanalyse identifizierte Wege im Zusammenhang mit Ribosomen, Antigenverarbeitung und -präsentation, oxidativer Phosphorylierung und Pentosphosphat. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMED3 ein vielversprechender Biomarker für die Diagnose und prognostische Bewertung von Darmkrebs sowie anderen Tumorarten darstellen könnte.

Einleitung

Die Transmembrane Emp24 Domain (TMED)-Proteinfamilie besteht aus vier Unterfamilien (α, β, γ und δ), die in eukaryotischen Zellen häufig als Monomere, Dimere oder oligomere Komplexe vorkommen. Mitglieder der TMED-Familie sind am intrazellulären Vesikeltransport beteiligt und wurden mit einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Krebs, immunbezogene Erkrankungen, Diabetes, neurodegenerative Erkrankungen, nichtalkoholische Fettleber, dilatierte Kardiomyopathie, Mucin-1-Nierenerkrankung (MKD) und Sjögren-Syndrom (SS)¹. Das transmembranäre emp24-domänenhaltige Protein 3 (TMED3), ein Mitglied der p24-Proteinfamilie, ist ein hochkonserviertes Single-Pass-Typ-I-Transmembranprotein, das auf Chromosom 15q25.1 beim Menschen ^2,3 codiert ist. Zunehmende Evidenz zeigt, dass TMED3 in mehreren Malignitäten abweichend exprimiert ist und an Tumorinitiation, Proliferation, Invasion, Metastasen und -progression beteiligt ist. Eine erhöhte TMED3-Expression wurde bei Osteosarkom⁴, Lungenplattenepithelkarzinom⁵, Brustkrebs⁶, Endometriumkarzinom⁷ und Darmkrebs⁸ berichtet. Experimentelle Studien haben gezeigt, dass die Unterdrückung der TMED3-Expression die Proliferation von Tumorzellen, die metastasierte Fähigkeit und die anti-apoptotische Aktivität hemmt und dadurch den Tumorfortschritt hemmt. Im Gliom wurde die Überexpression von TMED3 mit einem höheren Tumorgrad und einer schlechteren Prognose assoziiert, und es wurde berichtet, dass TMED3 die Progression des Glioblastoms durch Regulation von ZBTB7A⁹ fördert. Obwohl frühere Untersuchungen die biologische Rolle von TMED3 bei bestimmten Tumortypen untersucht haben, sind seine Expressionsmuster, die prognostische Bedeutung und die molekularen Funktionen im Pankrebs noch nicht systematisch charakterisiert worden.

Jüngste Fortschritte in Multiomics-Datenbanken und bioinformatischen Analysen haben eine systematische Bewertung der Genexpression, Prognose, Immunmerkmale und molekularen Veränderungen über verschiedene Tumortypen hinweg ermöglicht. Im Vergleich zu Einzelkohortenstudien bietet eine integrierte Pankrebsanalyse unter Verwendung öffentlich zugänglicher Datenbanken einen umfassenderen Ansatz zur Identifizierung potenzieller Biomarker und therapeutischer Ziele über Krebsarten hinweg. In der vorliegenden Studie wurden umfassende bioinformatische Analysen durchgeführt, um die Rolle von TMED3 über mehrere Krebsarten hinweg mithilfe öffentlich zugänglicher Multiomics-Datenbanken zu untersuchen, darunter The Cancer Genome Atlas (TCGA), Genotype-Tissue Expression (GTEx), UALCAN, Human Protein Atlas und cBioPortal. Die Studie bewertete systematisch TMED3-Expressionsmuster, klinisch-pathologische Merkmale, prognostische Bedeutung, immunbezogene Assoziationen und potenzielle biologische Funktionen bei Pankarzinom. Zusätzlich wurde eine immunhistochemische (IHC)-Analyse im Darmkrebsgewebe durchgeführt, um die TMED3-Proteinexpression und deren Zusammenhang mit klinisch-pathologischen Merkmalen zu validieren. Unsere Pankrebsanalyse dient als Screening-Strategie, um potenzielle Biomarker zu identifizieren. Anschließend führten wir eine experimentelle Validierung speziell bei Darmkrebs (CRC) durch. Die Ergebnisse zeigen, dass TMED3 ein vielversprechender prognostischer Biomarker bei CRC ist, obwohl seine Relevanz für andere Krebsarten weitere Untersuchungen erfordert.

Protokoll

Alle Verfahren mit menschlichem Gewebe wurden gemäß institutionellen Biosicherheits- und ethischen Richtlinien und in einem zertifizierten biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt. Das Studienprotokoll wurde vom Forschungsethikkomitee des Tangshan Central Hospital genehmigt (Nr. TZYL/K/2023-16), und vor der Probenentnahme wurde von allen Teilnehmern eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt.

Datenerhebung
TMED3-Expressionsprofildaten aus verschiedenen Tumor- und ungepaarten normalen Geweben wurden aus den TCGA- und GTEx-Datenbanken^10,11 gewonnen (TCGA: https://portal.gdc.cancer.gov/; GTEx: https://gtexportal.org/; abgerufen am 1. Juli 2025). Wilcoxon-Rank-Sum-Tests wurden durchgeführt, um die differenzielle TMED3-Expression zwischen Tumor und ungepaarten normalen Geweben zu analysieren. Transkript-per-Million (TPM)-normalisierte RNA-Sequenzierungs-Expressionsmatrizen, heruntergeladen von UCSC Xena, wurden für nachgelagerte Analysen verwendet. Die Ausdruckswerte wurden vor der statistischen Analyse mittels_log-2(TPM + 1)-Transformation harmonisiert. TMED3-Expressionsdaten für 33 Tumortypen und abgestimmte normale Gewebe wurden anschließend aus der TCGA-Datenbank heruntergeladen. Wilcoxon-Signed-Rank-Tests wurden eingesetzt, um die unterschiedliche TMED3-Expression zwischen Tumoren und abgestimmten normalen Geweben zu bewerten. Die differenzielle TMED3-Proteinexpression zwischen Tumor und normalem Gewebe wurde aus der UALCAN-Datenbank¹² (http://ualcan.path.uab.edu; abgerufen am 1. Juli 2025) gewonnen. Das Modul zur Proteomik-Analyse wurde aufgerufen, und die Option "Pan-cancer View" wurde für die Analyse ausgewählt. Die Proteinexpressionsanalysen wurden mit den CPTAC-Datensätzen durchgeführt, die über das UALCAN-Modul "Pan-cancer View" mit Standard-Plattformeinstellungen und ohne zusätzliche Probenfilterung verfügbar sind.

Analyse klinisch-pathologischer Merkmale
Klinisch-pathologische Informationen aus 33 Tumortypen in der TCGA-Datenbank wurden gesammelt, um die Beziehung zwischen TMED3-Expression und pathologischem Stadium zu untersuchen. Die Tumorstadien wurden in Frühstadien (Stadium I–II) und fortgeschrittene Phasen (Stadium III–IV) eingeteilt. Unterschiede in der TMED3-Expression zwischen Stadiengruppen wurden mittels Wilcoxon-Rangsummentests über mehrere Krebsarten hinweg untersucht.

Prognostische Analyse
Überlebenszeit- und Überlebensstatusdaten von 33 Tumortypen wurden für die prognostische Analyse gewonnen. Normale Fälle und Fälle ohne klinische Informationen wurden ausgeschlossen. Fehlende Werte wurden entsprechend der Fehlensfähigkeit jeder Variablen behandelt. Die TMED3-Expression wurde entsprechend dem Medianwert in Hoch- und Niedrigausdrucksgruppen unterteilt. Das Überlebenspaket (Version 3.2-7) in der R-Statistikanalyse-Software (Version 4.2.1) wurde zur Durchführung der Cox-Proportionalhazard-Regressionsanalyse verwendet. Die Ergebnisse wurden mit den Paketen survminer und ggplot2 visualisiert. Das Gesamtüberleben (OS) wurde als das Intervall von der Diagnose bis zum Tod aus jeder Ursache definiert, während das krankheitsspezifische Überleben (DSS) als das Intervall von der Diagnose bis zum Tod definiert wurde, das auf den spezifischen Krebs zurückzuführen ist, wobei Todesfälle, die nicht mit der Malignität zusammenhängen, als zensierte Ereignisse behandelt wurden. Kaplan–Meier-Überlebensanalysen wurden anschließend durchgeführt, um die Zusammenhänge zwischen TMED3-Expression und sowohl OS als auch DSS im Darmadenokarzinom (COAD) zu bewerten.

Mutationsanalyse
Die cBioPortal-Datenbank (www.cbioportal.org; abgerufen am 5. Juli 2025) wurde verwendet, um die Häufigkeit genetischer Veränderungen von TMED3 bei 33 Krebsarten¹³ zu analysieren. Die cBioPortal-Website wurde aufgerufen, und "TMED3" wurde in die Schnellsuchleiste eingegeben, um das Mutationsprofil von TMED3 über mehrere Krebsarten hinweg zu analysieren. Genetische Veränderungen von TMED3 umfassten hauptsächlich Mutationen, Amplifikationen, tiefe Deletion und multiple Veränderungen. Standard-Pankrebsstudien und Abfrageeinstellungen, die in cBioPortal verfügbar sind, wurden für die Mutationsanalyse ohne zusätzliche Filterung verwendet.

Korrelationsanalyse der DNA-Methylierung
Eine DNA-Methylierungsanalyse wurde durchgeführt, um den Promotormethylierungsstatus von TMED3 im Tumor und normalen Geweben mithilfe der UALCAN-Datenbank (https://ualcan.path.uab.edu/; abgerufen am 5. Juli 2025) zu bewerten. Der DNA-Methylierungsstatus der TMED3-Promotorregion wurde anhand von Level-3-Methylierungsdaten analysiert, die von der Illumina Infinium HumanMethylation450K-Plattform in TCGA erzeugt wurden. Die Methylierungswerte wurden als β Werte angegeben, berechnet als β = methylierte Sondenintensität / (methylierte Sondenintensität + unmethylierte Sondenintensität), mit Werten von 0 (unmethyliert) bis 1 (vollständig methyliert). CpG-Sonden, die sich innerhalb von 1500 bp oberhalb des Transkriptionsstartstandorts (TSS) befinden, einschließlich der von UALCAN definierten TSS200- und TSS1500 Regionen, wurden analysiert, um den Promotermethylierungsstatus zu bewerten. UALCAN extrahierte automatisch alle verfügbaren CpG-Sonden innerhalb der Promotorregion des Zielgens ohne zusätzliche Filterung. Methylierungswerte β Geweben wurden von Pankrebs- und normalen Geweben ermittelt, und ungepaarte Zweiproben-T-Tests wurden durchgeführt, um Unterschiede zwischen den Gruppen zu vergleichen. Eine Signifikanzschwelle von α = 0,05 wurde verwendet, und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Analyse der Wechselwirkung zwischen TMED3, Tumormutationslast und Mikrosatelliteninstabilität
Tumormutationslast (TMB) und Mikrosatelliteninstabilität (MSI) wurden analysiert, um ihre Assoziationen mit der TMED3-Expression über mehrere Krebsarten hinweg zu untersuchen. Einheitlich verarbeitete Pankrebsdatensätze wurden aus der UCSC Xena-Datenbank heruntergeladen (https://xenabrowser.net/; abgerufen am 5. Juli 2025), und TMED3-Expressionsprofile wurden für spätere Analysen extrahiert. Level-4-Daten zur einfachen Nukleotidvariation für TCGA-Proben, die mit MuTect2 erzeugt wurden, wurden aus der Genomic Data Commons (GDC)-Datenbank (https://portal.gdc.cancer.gov/)¹⁴ bezogen. TMED3-Ausdrucksdaten wurden mit TMB-Datensätzen integriert, und Ausdruckswerte wurden mittels log₂(x + 1)-Transformation vor der statistischen Analyse normalisiert. MSI-Scores für einzelne Tumortypen wurden aus zuvor veröffentlichten Studien¹⁵ erhoben und anschließend mit TMED3-Expressionsdaten nach demselben Normalisierungsverfahren zusammengeführt. Die Zusammenhänge zwischen TMED3-Expression und TMB/MSI wurden mittels Spearman-Korrelationsanalyse in Pan-Krebs-Datensätzen^16,17 bewertet.

Analyse der Immuneigenschaften von TMED3
Der ESTIMATE-Algorithmus wurde angewandt, um Stromal-, Immun- und ESTIMATE-Scores für mehrere Tumortypen zu berechnen. Stromal- und Immuninfiltrationswerte in Pankrebs-Datensätzen wurden mit dem Schätzungspaket (Version 1.0.13) in der statistischen Analysesoftware generiert. Unterschiede im stromalen Score, Immun-Score und ESTIMAT-Score zwischen Gruppen mit hoher und niedriger TMED3-Expression wurden mittels Wilcoxon-Rangsummentests bewertet. Darüber hinaus wurden immun-checkpointbezogene Analysen durchgeführt, um die Beziehungen zwischen TMED3-Expression und Immun-Checkpoint-Molekülen zu untersuchen, einschließlich des programmierten Zelltodesproteins 1 (PD-1), des programmierten Todesliganden-1 (PD-L1) und des zytotoxischen T-lymphozytenassoziierten Proteins 4 (CTLA4), über verschiedene Krebsarten hinweg. STAR-Count-Expressionsdaten und entsprechende klinische Informationen für COAD wurden aus der TCGA-Datenbank heruntergeladen. TPM-formatierte Ausdrucksmatrizen wurden extrahiert und mittels log₂(TPM + 1)-Transformation normalisiert. Expressionsprofile von acht immunkontrollpunktbezogenen Genen wurden anschließend aus COAD-Proben gewonnen, und Korrelationen zwischen TMED3-Expression und Immun-Checkpoint-Markern wurden mittels Spearman-Korrelationsanalyse analysiert.

Arzneimittelsensitivitätsanalyse
Die Analyse der Arzneimittelsensitivität wurde mit der GSCALite-Plattform durchgeführt, um den Zusammenhang zwischen TMED3-Expression und der Reaktion auf Krebsmedikamente bei verschiedenen Krebsarten¹⁸ zu untersuchen. Level-3-RNA-Sequenzierungsdaten und entsprechende klinische Informationen für COAD-Proben wurden aus dem TCGA-Datensatz gewonnen. Vorhergesagte Chemotherapie-Reaktionen für jede Probe wurden anhand von Daten aus der Datenbank Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) (https://www.cancerrxgene.org/) erzeugt. Die Vorhersage der Arzneimittelantwort wurde mit dem pRRophetic-Paket in der statistischen Analysesoftware durchgeführt. Die geschätzten Werte der halbmaximalen inhibitorischen Konzentration (IC₅₀) wurden mittels Ridge-Regression mit Standardeinstellungen berechnet, einschließlich Batch-Effektkorrektur durch den Kampfalgorithmus und gewebespezifischen Anpassungsanalysen. Replikierte Genexpressionsmessungen wurden vor der nachgelagerten Analyse gemittelt.

Expression und Prognose von TMED3 bei Darmkrebs
TMED3-Expressionsprofile und entsprechende klinisch-pathologische Daten für das Darmadenokarzinom wurden aus der TCGA-Datenbank gewonnen. Die differenzielle TMED3-Expression zwischen Darmkrebsgeweben und unpassenden normalen Geweben wurde mittels Wilcoxon-Rangsummentests untersucht, während die Zusammenhänge zwischen TMED3-Expression und klinisch-pathologischen Merkmalen mittels Chi-Quadrat-Tests analysiert wurden. Die Patienten wurden nach dem median TMED3-Expressionsniveau in Hoch- und Niedrig-Expressionsgruppen eingeteilt. Anschließend wurde eine Kaplan–Meier-Überlebensanalyse durchgeführt, um prognostische Unterschiede zwischen den beiden Gruppen zu vergleichen. Univariate und multivariate Cox-Proportionalhazard-Regressionsanalysen wurden durchgeführt, um die prognostische Bedeutung der TMED3-Expression bei Darmkrebs zu bewerten. Zusätzlich wurde eine Analyse der zeitabhängigen Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC)-Kurve durchgeführt, um die prädiktive Leistung des TMED3-Ausdrucks für 1-, 3- und 5-Jahres-Betriebssysteme zu bewerten. ROC-Analysen wurden mit dem timeROC-Paket in der statistischen Analysesoftware durchgeführt, und eine grafische Visualisierung wurde mit dem ggplot2-Paket erstellt.

Immunhistochemische Analyse
Insgesamt wurden 60 Gewebeproben aus Darmkrebs und 20 Nicht-Krebsgewebe zufällig aus dem Tangshan Central Hospital ausgewählt. Die Studie wurde vom örtlichen institutionellen Überprüfungsgremium genehmigt (Nr. TZYL/K/2023-16), und vor der Operation wurde von allen Patienten eine schriftliche informierte Zustimmung eingeholt. Alle Gewebeproben wurden von Patienten entnommen, die eine chirurgische Resektion ohne vorherige Chemotherapie oder Immuntherapie unterzogen hatten. Die Kohorte umfasste 39 männliche und 21 weibliche Patienten im Alter von 20–87 Jahren. Nach Dukes Stufenkriterien wurden 33 Patienten als Stadium I+II und 27 Patienten als Stadium III+IV klassifiziert. Die Phasenverteilung der Kohorte kann eine potenzielle Selektionsverzerrung zugunsten fortgeschrittener Krankheitsstadien verursachen; daher sollten überlebensbezogene Befunde mit Vorsicht interpretiert werden.

Paraffin-eingebettete Gewebeproben wurden in 4-μm-Scheiben zerschnitten, gefolgt von Deparaffinisierung und Rehydratisierung. Die endogene Peroxidase-Aktivität wurde mit 4 % H_2O2 abgeschreckt, und die unspezifische Bindung wurde anschließend mit Ziegenserum blockiert. Die Schnitte wurden dann über Nacht bei 4°C mit dem TMED3-Primärantikörper bei einer Verdünnung von 1:100 inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Schaf-Anti-Kaninchen-IgG-Polymer (PV-6000) für 30 Minuten bei Zimmertemperatur aufgetragen. Die Immunreaktivität wurde mittels Diaminobenzidin-Färbung visualisiert, und Abschnitte wurden mit neutralem Harz montiert. Die histologische Färbung wurde unter einem optischen Mikroskop mit hoher Vergrößerung untersucht. Die Intensität der Immunfärbung wurde mit 0 (negativ), 1 (schwach), 2 (moderat) und 3 (stark) bewertet, während der Anteil positiver Tumorzellen mit 1 (1 %–25 %), 2 (26 %–50 %), 3 (51 %–75 %) oder 4 (76 %–100 %) bewertet wurde. Die endgültigen immunhistochemischen Werte wurden berechnet, indem die Färbungsintensität mit dem prozentualen Wert positiver Tumorzellen multipliziert wurde. Die TMED3-Expressionswerte wurden als negative/niedrige Expression (Score ≤ 6) oder Überexpression (Score > 6)¹⁹ klassifiziert.

Genanreicherungsanalyse von TMED3 bei Darmkrebs
Eine Genanreicherungsanalyse wurde durchgeführt, um die potenziellen biologischen Funktionen und Signalwege zu bewerten, die mit der TMED3-Expression bei Darmkrebs verbunden sind. Differenziell exprimierte Gene zwischen Hoch- und Niedrig-TMED3-Expressionsgruppen wurden mit dem DESeq2-Paket in der statistischen Analysesoftware gescreent. Die von TCGA gewonnenen Rohzähldaten wurden mit der in DESeq2 implementierten Medianverhältnis-Normalisierungsmethode normalisiert. Gene mit niedriger Expression und Zählungen <10 in über 50 % der Proben wurden vor der Analyse ausgeschlossen. Differenziell exprimierte Gene wurden mit Schwellenwerten von |log₂ (FC)| identifiziert. ≥ 1 und ein adjustiertes P < 0,05 nach Benjamini–Hochberg (BH) Mehrfachtestkorrektur. Alle analytischen Parameter wurden festgelegt, um die Reproduzierbarkeit der Analyse zu gewährleisten.

Anschließend wurde die Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) mit dem clusterProfiler-Paket in R durchgeführt, basierend auf den Gensätzen der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (Version 7.5.1), die aus der Molecular Signatures Database (MSigDB) gewonnen wurden. Eine vorgerankte Genliste wurde basierend auf den log2-Fold-Change-Werten zwischen hoch- und niedrig-TMED3-Expressionsgruppen erstellt. Die Anreicherungsanalyse wurde mit 1000 Phänotyp-Permutationen durchgeführt, und Gensätze mit 15–500 Genen wurden in die Analyse einbezogen. Wege mit normalisierten Anreicherungswerten (NES) von >1, bereinigtem P < 0,05 und False Discovery Rate (FDR) < 0,25 wurden als signifikant angereichert angesehen. Die Anreicherung des Parkinson-Krankheitswegs wurde beibehalten, da dieser Pfad eng mit mitochondrialer Dysfunktion und oxidativen phosphorylierungsbezogenen biologischen Prozessen verbunden ist, die auch an der Tumorstoffwechsel-Reprogrammierung und dem Krebsfortschreiten beteiligt sind.

Statistische Analyse
Alle statistischen Analysen wurden mit der Software zur statistischen Analyse durchgeführt. Die differenzielle Expression zwischen den Gruppen wurde mittels zweiseitiger Wilcoxon-Rangsummentests für ungepaarte Proben und Wilcoxon-Zeichenrangtests für gepaarte Stichproben bewertet. Die Zusammenhänge zwischen TMED3-Expression und klinisch-pathologischen Variablen wurden mittels Chi-Quadrat-Tests untersucht. Überlebensanalysen wurden mit dem Überlebenspaket (Version 3.3-1) durchgeführt, und mit dem Survminer-Paket wurden Kaplan–Meier-Überlebenskurven erzeugt. Unterschiede in den Überlebensergebnissen zwischen den Gruppen wurden mit dem Log-Rank-Test verglichen. Cox-Proportional-Hazard-Regressionsmodelle wurden angewandt, um prognostische Faktoren zu identifizieren, die mit OS assoziiert sind. Die Patienten wurden nach dem median TMED3-Expressionsniveau in Hoch- und Niedrig-Expressionsgruppen eingeteilt. Zeitabhängige ROC-Analysen wurden mit dem timeROC-Paket durchgeführt, und Figuren wurden mit dem ggplot2-Paket generiert. Sofern nicht anders angegeben, wurde die statistische Signifikanz als ein zweiseitiger P-Wert von < 0,05 definiert.

Die Spearman-Korrelationsanalyse wurde durchgeführt, um die Korrelationen zwischen TMED3-Expression und Immunmerkmalen, TMB und MSI zu bewerten. Für alle Korrelationsanalysen wurden normalisierte quantitative Expressionsdaten aus den entsprechenden öffentlichen Datenbanken verwendet. Für TCGA-RNA-Sequenzierungsdaten wurden TPM-formatierte Expressionswerte vor der Analyse, wo anwendbar, mittels_log-2(TPM + 1)-Normalisierung transformiert. Proben mit fehlenden klinischen oder molekularen Daten wurden vor der statistischen Analyse ausgeschlossen. Spearman-Korrelationsanalysen wurden als zweiseitige, nicht-parametrische Tests durchgeführt. Roh-P-Werte wurden für Analysen mit begrenzten Vergleichen verwendet, darunter Wilcoxon-Tests, Spearman-Korrelationsanalysen und Überlebensanalysen. Für groß angelegte bioinformatische Analysen mit hohem Durchsatz, einschließlich Differentialgenexpressionsanalyse, KEGG-Anreicherungsanalyse und GSEA, wurde eine mehrfache Testkorrektur mit der BH-FDR-Methode durchgeführt. Bereinigte FDR-Werte von <0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Expressionsanalyse von TMED3 bei Pankrebs
Die Analyse von TCGA- und GTEx-Datensätzen zeigte, dass die TMED3-Messenger-Ribonukleinsäure (mRNA)-Expression in den meisten Tumorgeweben im Vergleich zu entsprechenden normalen Geweben, einschließlich Adrenokortikalkarzinom (ACC), Blasen-Urothelkarzinom (BLCA), Brustinvasivem Karzinom (BRCA), zervikalem Plattenepithelkarzinom und endozervikalem Adenokarzinom (CESC), Cholangiokarzinom (CHOL), Colonadenokarzinom (COAD), diffusem großzelligen B-Lymphom (DLBC), signifikant erhöht war. Speiseröhrenkarzinom (ESCA), Glioblastom multiforme (GBM), Nieren-Nieren-Klarzellkarzinom (KIRC), Nieren-Papillarzellkarzinom (KIRP), Hirn-Lider-Grad-Gliom (LGG), Leber-Hepatozellkarzinom (LIHC), Lungenadenokarzinom (LUAD), Lungenplattenepithelkarzinom (LUSC), ovariales seröses Cystadenokarzinom (OV), Pankreasadenokarzinom (PAAD), Phänochromozytom und Paragangliom (PCPG), Prostataadenokarzinom (PRAD), Rektumadenokarzinom (READ), Haut-Haut-Hautmelanom (SKCM), Magenadenokarzinom (STAD), Hodenkeimzelltumoren (TGCT), Schilddrüsenkarzinom (THCA), Thymom (THYM), Endometriakkarzinom (UCEC) und Gebärmutterkarzinom (UCS), während eine verminderte Expression bei Kopf- und Halsplattenepithelkarzinom (HNSC) und akuter myeloischer Leukämie (LAML) beobachtet wurde (Abbildung 1A). Abgestimmte benachbarte normale Gewebe dienten als Kontrollen für paarweise Expressionsanalysen. Die gepaarte TCGA-Analyse bestätigte zudem eine signifikant erhöhte TMED3-Expression in BLCA, BRCA, CHOL, COAD, Nierenchromophob (KICH), KIRP, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, STAD und UCEC im Vergleich zu gepaarten normalen Geweben (Abbildung 1B). Darüber hinaus zeigte die Proteinexpressionsanalyse mit der UALCAN/Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC)-Datenbank erhöhte TMED3-Proteinspiegel in BRCA-, COAD-, GBM-, KIRC-, LIHC-, LUAD-, LUSC-, OV- und UCEC-Tumorgeweben, während in PAAD im Vergleich zu normalen Geweben eine reduzierte Proteinexpression beobachtet wurde (Abbildung 1C). Die TMED3-Proteinexpression war jedoch in PAAD niedriger als in normalen Geweben. Diese Diskrepanz zwischen mRNA- und Proteinexpressionsmustern könnte posttranskriptionelle oder posttranslationale Regulationsmechanismen widerspiegeln. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMED3 bei mehreren Krebsarten abweichend hochreguliert ist und möglicherweise mit diagnostischen und prognostischen Eigenschaften bei mehreren Krebsarten assoziiert ist.

Abbildung 1. TMED3-Expressionsprofile bei menschlichen Krebsarten. (A) Differenzielle TMED3-mRNA-Expression zwischen Tumor und normalen Geweben über mehrere Krebsarten hinweg basierend auf TCGA- und GTEx-Datensätzen. Expressionsniveaus werden als log₂ (TPM + 1) dargestellt. (B) Gepaarte Analyse der TMED3-mRNA-Expression zwischen Tumorgeweben und abgeglichenen benachbarten normalen Geweben aus TCGA-Datensätzen. (C) Differenzielle TMED3-Proteinexpression zwischen normalen Geweben und primären Tumoren in CPTAC/UALCAN-Datensätzen, darunter brustinvasives Karzinom (BRCA), Colonadenokarzinom (COAD), Glioblastom multiforme (GBM), Nierenrenales Klarzellkarzinom (KIRC), Leberhepatozellkarzinom (LIHC), Lungenadenokarzinom (LUAD), Lungenplattenepithelkarzinom (LUSC), ovariales seröses Cystadenokarzinom (OV), Pankreasadenokarzinom (PAAD) und Uteruskorpusendometriumkarzinom (UCEC). Die Daten werden als Boxdiagramme präsentiert. Die statistische Signifikanz wurde je nach Bedarf mittels Wilcoxon-Rangsummen- oder Wilcoxon-Zeichenrangtests analysiert. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; NS, nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Analyse klinisch-pathologischer Merkmale
Die klinische Analyse zeigte, dass die TMED3-Expression bei fortgeschrittenen Tumoren (Stadium III–IV) signifikant höher war als bei Tumoren im frühen Stadium (Stadium I–II) in ACC, KIRC, KIRP und LUAD (Abbildung 2). Im Gegensatz dazu war die TMED3-Expression in fortgeschrittenen UCEC-Geweben signifikant reduziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine erhöhte TMED3-Expression bei mehreren Krebsarten mit dem Tumorfortschritt assoziiert sein könnte.

Abbildung 2. Zusammenhang zwischen TMED3-Expression und pathologischem Stadium über mehrere Krebsarten. Violin-Diagramme zeigen TMED3-mRNA-Expressionsniveaus in Tumoren im Frühstadium (Stadium I–II) und in fortgeschrittenen Tumoren (Stadium III–IV) bei Adrenokortikomkarzinom (ACC), Nieren-Nieren-Klarzellkarzinom (KIRC), Nierenpapillarzellkarzinom (KIRP), Lungenadenokarzinom (LUAD) und Endometriakarzinom (UCEC). Expressionsniveaus werden als log₂ (TPM + 1) dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mittels Wilcoxon-Rangsummentests bewertet. *P < 0,05, ***P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Prognostische Analyse
Cox-Regressions- und Überlebensanalysen zeigten, dass eine hohe TMED3-Expression mit schlechterem OS in ACC, COAD, LUAD und UVM assoziiert war (Abbildung 3A). Die DSS-Analyse zeigte außerdem, dass eine erhöhte TMED3-Expression signifikant mit ungünstigem DSS in ACC, COAD, GBM, KIRP und UVM assoziiert war (Abbildung 3B). Bemerkenswert ist, dass ACC, COAD und UVM bei Patienten mit hoher TMED3-Expression durchweg eine schlechte Prognose für sowohl OS als auch DSS zeigten. Prognostische Zusammenhänge auf Trendebene wurden auch bei ausgewählten Tumortypen beobachtet, darunter LUAD, KIRC und LGG. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die TMED3-Expression prognostische Relevanz bei mehreren Malignitäten haben könnte.

Abbildung 3. Prognostische Bedeutung der TMED3-Expression in der Pankrebsanalyse. (A) Forest-Plot, das den Zusammenhang zwischen TMED3-Expression und dem Gesamtüberleben (OS) über mehrere Krebsarten hinweg zeigt. (B) Forest Plot, das den Zusammenhang zwischen TMED3-Expression und krankheitsspezifischem Überleben (DSS) über mehrere Krebsarten hinweg zeigt. Hazard-Ratios (HRs) und 95%-Konfidenzintervalle (95%-KI) wurden mittels der Cox-Proportionalhazard-Regressionsanalyse berechnet. HR > 1 weist auf eine schlechte Prognose hin, die mit einer hohen TMED3-Expression assoziiert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Mutationsanalyse
Die Analyse der genetischen Veränderungen mit der cBioPortal-Datenbank zeigte, dass TMED3-Veränderungen bei Krebsarten hauptsächlich aus Mutationen, Amplifikationen, tiefen Deletionen und multiplen Veränderungen bestanden (Abbildung 4). Die höchste Häufigkeit von TMED3-Veränderungen wurde beim Mesotheliom (MESO) beobachtet, hauptsächlich durch Genamplifikation (2,3 %). ESCA zeigte gemischte Alterationstypen, darunter Mutation (0,55 %), Amplifikation (1,1 %) und tiefe Deletion (0,55 %). Im Gegensatz dazu wurden in LIHC, KICH, THCA, PCPG, CHOL, UVM, LAML, UCS, DLBC, KIRC, TGCT und GBM-Datensätzen keine nachweisbaren TMED3-Veränderungen festgestellt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass genomische Veränderungen von TMED3 tumorspezifisch auftreten und zur Krebsheterogenität beitragen können.

Abbildung 4. Genetische Alterslandschaft von TMED3 über Krebsarten hinweg. Häufigkeit und Art von TMED3-genetischen Veränderungen in Pan-Krebs-Datensätzen, die aus der cBioPortal-Datenbank gewonnen wurden. Alterationskategorien umfassten Mutation, Amplifikation, tiefe Deletion und multiple Alterationen. Die y-Achse zeigt die Veränderungshäufigkeit (%) zwischen verschiedenen Krebsarten an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

DNA-Methylierungsanalyse
Die Analyse der UALCAN-Datenbank zeigte, dass die TMED3-Promotormethylierung in BRCA-, COAD-, ESCA-, HNSC-, KIRC-, KIRP-, LIHC-, LUAD-, PAAD- und PRAD-Tumorgeweben im Vergleich zu entsprechenden normalen Geweben signifikant erhöht war (Abbildung 5). Im Gegensatz dazu wurden reduzierte TMED3-Promotormethylierungswerte in BLCA-, TGCT- und UCEC-Geweben im Vergleich zu normalen Kontrollen beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass abweichende Methylierung des TMED3-Promotors zur tumorspezifischen Regulation der TMED3-Expression beitragen kann.

Abbildung 5. Promotormethylierungswerte von TMED3 bei Krebsarten. Vergleich der TMED3-Promotormethylierungswerte zwischen Tumorgeweben und entsprechenden normalen Geweben beim Blasenurothelkarzinom (BLCA), Brustinvasivem Karzinom (BRCA), Kolonadenokarzinom (COAD), Speiseröhrenkarzinom (ESCA), Kopf- und Halsplattenepithelkarzinom (HNSC), Nieren-Nieren-Klarzellkarzinom (KIRC), Nierenpapillarzellkarzinom (KIRP), Leber-Hepatozellkarzinom (LIHC), Lungenadenokarzinom (LUAD), Pankreataskaladenokarzinom (PAAD), Prostataadenokarzinom (PRAD), Hodenkeimzelltumoren (TGCT) und Uterinalkorpusendometriumkarzinom (UCEC) Datensätze, die aus UALCAN gewonnen wurden. Die Daten werden als β Werte in Boxdiagrammen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Analyse der Korrelationen zwischen TMED3, TMB und MSI
Die Spearman-Korrelationsanalyse zeigte, dass die TMED3-Expression positiv mit TMB in ACC, ESCA, KIRC, LGG, PAAD, STAD, THYM und UCEC korreliert war, während negative Korrelationen bei CESC, LUAD und TGCT beobachtet wurden (Abbildung 6A). Darüber hinaus war die TMED3-Expression positiv mit MSI in DLBC, KIRC, SKCM, STAD und UCEC assoziiert (Abbildung 6B). Bemerkenswert ist, dass die TMED3-Expression positive Korrelationen mit sowohl TMB als auch MSI in KIRC, STAD und UCEC zeigte, was auf mögliche Assoziationen mit Tumorimmunogenität bei diesen Krebsarten hindeuten könnte.

Abbildung 6. Die Korrelation der TMED3-Expression mit der Tumormutationslast und Mikrosatelliteninstabilität in der Pankrebsanalyse. (A) Radarplot, das die Korrelation zwischen TMED3-Expression und tumoraler Mutationslast (TMB) über Krebsarten hinweg zeigt. (B) Radarplot, das die Korrelation zwischen TMED3-Expression und Mikrosatelliteninstabilität (MSI) über Krebsarten hinweg zeigt. Die Korrelationskoeffizienten wurden mittels Spearman-Korrelationsanalyse berechnet. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Analyse der Immuncharakteristik
Die ESTIMATE-Analyse zeigte, dass die TMED3-Expression negativ mit dem stromalen Score, dem Immunscore und dem ESTIMAT-Score in BCLA, ESCA, LAML, LUAD, LUSC, PAAD, PRAD, SKCM, STAD, THCA und UCEC korreliert war (Abbildung 7A). Im Gegensatz dazu wurden positive Korrelationen zwischen der TMED3-Expression und diesen immunbezogenen Scores in LGG, LIHC und PCPG beobachtet. In ACC, CHOL, DLBC, GBM, KICH, KIRC, KIRP, OV und UCS wurden keine signifikanten Korrelationen festgestellt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMED3 die Tumor-Mikroumgebung und die Infiltration von Immunzellen auf krebstypabhängige Weise beeinflussen könnte. Die Analyse der Immunkontrollpunktkorrelation zeigte außerdem, dass die TMED3-Expression negativ mit den immun-checkpoint-bezogenen Genen CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) und CTLA4 in BLCA, BRCA, CESC, ESCA, HNSC, LUAD, LUSC, PRAD, SKCM und THCA assoziiert war (Abbildung 7B). Positive Korrelationen zwischen TMED3-Expression und Immuncheckpoint-Genen wurden in LIHC und UVM festgestellt, während keine signifikanten Assoziationen bei GBM, KICH, LAML, MESO, OV, PCPG, READ und TGCT beobachtet wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMED3 mit der Immunregulation des Tumors und der Immunkontrollpunkt-Signalübertragung bei ausgewählten Krebsarten assoziiert sein könnte.

Abbildung 7. Zusammenhänge zwischen der TMED3-Expression und den Immunmerkmalen des Tumors. (A) Heatmap, die die Korrelationen zwischen TMED3-Expression und stromalem Score, Immunscore und ESTIMAT-Wert über Krebsarten hinweg zeigt, berechnet mit dem ESTIMATE-Algorithmus. (B) Heatmap, die Korrelationen zwischen TMED3-Expression und immunkontrollpunktbezogenen Genen zeigt, einschließlich CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) und CTLA4. Die Korrelationskoeffizienten wurden mittels Spearman-Korrelationsanalyse bestimmt. Die Farbskala gibt die Korrelationsstärke an. *P < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Arzneimittelsensitivitätsanalyse
Eine Arzneimittelsensitivitätsanalyse mit der GSCALite-Plattform auf Basis von GDSC-Datensätzen zeigte, dass die TMED3-Expression negativ mit den halbmaximalen Inhibitorkonzentrationswerten (IC₅₀) von 17-AAG, Lapatinib, PD-0325901, RDEA119 und Trametinib korreliert war (Abbildung 8). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Tumore mit erhöhter TMED3-Expression eine erhöhte Sensibilität gegenüber diesen Krebsmedikamenten zeigen könnten, was auf mögliche Zusammenhänge zwischen TMED3-Expression und therapeutischer Sensitivität hindeutet.

Abbildung 8. Korrelation zwischen TMED3-Expression und Sensitivität für Krebsmedikamente. Blasenplot, das Korrelationen zwischen TMED3-mRNA-Expression und der Sensitivität gegenüber Krebsmedikamenten zeigt, die aus Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC)-Datensätzen über die GSCALite-Plattform gewonnen wurden. Die Blasengröße repräsentiert die statistische Signifikanz basierend auf der False Discovery Rate (FDR), und die Farbe zeigt die Korrelationskoeffizienten an. Negative Korrelationen deuten auf eine erhöhte Arzneimittelsensitivität hin, die mit hoher TMED3-Expression einhergeht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Expression und Prognose von TMED3 bei Darmkrebs
Die TMED3-Expressionsanalyse zeigte signifikant erhöhte TMED3-mRNA-Spiegel im Darmkrebsgewebe im Vergleich zu normalen Darmgeweben in TCGA-Datensätzen (Abbildung 9A). Die gepaarte Analyse mit übereinanderstimmenden normalen Geweben als Kontrollen bestätigte eine erhöhte TMED3-Expression im Darmkrebsgewebe weiter (Abbildung 9B). Im Einklang mit den transkriptomischen Befunden zeigte die Proteinexpressionsanalyse mit UALCAN/CPTAC-Datensätzen und immunhistochemischer Färbung eine erhöhte TMED3-Proteinexpression im Darmkrebsgewebe im Vergleich zu normalen Darmgeweben (Abbildung 9C–9E). Die ROC-Kurvenanalyse zeigte eine Fläche unter dem Kurvenwert (AUC) von 0,869, was auf eine günstige diagnostische Leistung von TMED3 zur Unterscheidung von Darmkrebsgeweben und normalen Geweben hinweist (Abbildung 9F). Klinisch-pathologische Analysen zeigten außerdem, dass die TMED3-Expression signifikant mit der T-Stufe assoziiert war, während keine signifikanten Assoziationen mit Alter, Geschlecht, N-Stadium oder TNM-Phase beobachtet wurden (Tabelle 1). Diese Ergebnisse stützen die potenzielle diagnostische Bedeutung von TMED3 bei Darmkrebs.

Abbildung 9. Expression, diagnostischer Wert und immunhistochemische Validierung von TMED3 bei Darmkrebs. (A) Differenzielle TMED3-mRNA-Expression zwischen Darmkrebsgewebe und normalen Darmgeweben aus TCGA-Datensätzen. (B) Gepaarte Analyse der TMED3-mRNA-Expression in Darmkrebsgeweben und abgestimmten benachbarten normalen Geweben. (C) TMED3-Proteinexpression im Darmkrebs und normalen Geweben, die aus CPTAC/UALCAN-Datensätzen gewonnen wurden. (D) Repräsentative immunhistochemische Färbung von TMED3 im normalen Dickdarmgewebe. (E) Repräsentative immunhistochemische Färbung von TMED3 im Darmkrebsgewebe mit erhöhter TMED3-Expression. (F) Receiver operating characteristic (ROC)-Kurve, die den diagnostischen Wert von TMED3 bei Darmkrebs bewertet. Skalenbalken = 100 μm. Die Fläche unter der Kurve (AUC) betrug 0,869 mit einem 95%-Konfidenzintervall (KI) von 0,813–0,924. Die statistische Signifikanz wurde je nach Bedarf mittels Wilcoxon-Rangsummen- oder Wilcoxon-Zeichenrangtests analysiert. P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Typ		TMED3		P-Wert	χ2
		Niedriger Ausdruck	Hoher Ausdruck
Alter
≤ 55	25	15	10	0.13	2.34
> 55	35	14	21
Geschlecht
Weiblich	21	10	11	0.94	0.007
Männlich	39	19	20
T-Stufe
T1+T2	23	15	8	0.04	4.26
T3+T4	37	14	23
N Stage
N0	30	12	18	0.2	1.67
N1+N2	30	17	13
TNM-Bühne
I+II	33	13	20	0.13	2.35
III+IV	27	16	11

Tabelle 1: Zusammenhang zwischen TMED3-Expression und klinisch-pathologischen Merkmalen bei Darmkrebs. Klinisch-pathologische Merkmale von Patienten mit Darmkrebs wurden zwischen Gruppen mit niedriger und hoher TMED3-Expression verglichen. Zusammenhänge zwischen TMED3-Expression und kliniopathologischen Variablen, einschließlich Alter, Geschlecht, T-, N-Stadium und TNM-Stadium, wurden mittels Chi-Quadrat-(^χ-2)-Tests analysiert. Die Daten werden als Anzahl der Patienten in jeder Untergruppe dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde als P < 0,05 definiert.

Die KM-Überlebensanalyse zeigte, dass Patienten mit hoher TMED3-Expression signifikant schlechtere OS-Expression (P = 0,031) und DSS (P = 0,020) aufwiesen als Patienten mit niedriger TMED3-Expression (Abbildung 10A und 10B). Die zeitabhängige ROC-Analyse zeigte, dass die prädiktive Leistung der TMED3-Expression für OS AUC-Werte von 0,620, 0,564 und 0,575 nach 1, 3 und 5 Jahren ergab (Abbildung 10C). Darüber hinaus identifizierten univariate und multivariate Cox-Regressionsanalysen das T-Stadium, das M-Stadium, das pathologische Stadium und die TMED3-Expression als prognostische Faktoren, die mit dem Gesamtüberleben bei Darmkrebs verbunden sind (Tabelle 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine erhöhte TMED3-Expression mit einer schlechten Prognose bei Darmkrebs assoziiert ist, obwohl die zeitabhängige ROC-Analyse nur eine moderate prädiktive Leistung zeigte.

Abbildung 10. Prognostische Bedeutung der TMED3-Expression bei Darmkrebs. (A) Kaplan–Meier (KM) Gesamtüberlebenskurven (OS) vergleichen Patienten mit hoher und niedriger TMED3-Expression bei Darmkrebs. (B) Kaplan–Meier-spezifische Überlebenskurven (DSS), die Patienten mit hoher und niedriger TMED3-Expression vergleichen. (C) Zeitabhängige Empfänger-Betriebscharakteristik (ROC)-Kurven, die die prädiktive Leistung der TMED3-Expression für 1-, 3- und 5-Jahres-OS bewerten. Überlebensunterschiede wurden mit dem Log-Rank-Test analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Merkmale	Univariate Analyse		Multivariate Analyse
	Gefahrenverhältnis (95 % KI)	P-Wert	Gefahrenverhältnis (95 % KI)	P-Wert
Geschlecht	1.101(0.746–1.625)	0.627
T-Stufe	3.072(1.423–6.631)	0.004	3.817(1.174–12.407)	0.026
N-Stage	2.592(1.743–3.855)	<0,001	0.587(0.223–1.584)	0.28
M-Stufe	4.193(2.683–6.554)	<0,001	2.272(1.314–3.930)	0.003
Pathologische Phase	2.947(1.942–4.471)	<0,001	3.115(1.032–9.401)	0.044
TMED3	1.537(1.037–2.277)	0.032	1.599(1.039–2.462)	0.033

Tabelle 2: Univariate und multivariate Cox-Proportionalhazard-Regressionsanalysen prognostischer Faktoren, die mit dem Gesamtüberleben bei Darmkrebs assoziiert sind. Univariate und multivariate Cox-Proportional-Hazard-Regressionsanalysen wurden durchgeführt, um die prognostische Bedeutung klinisch-pathologischer Merkmale und TMED3-Expression bei Patienten mit Darmkrebs zu bewerten. Hazard Ratios (HRs) werden mit 95%-Konfidenzintervallen (95%-KI) präsentiert. Variablen umfassten Geschlecht, T-Stadium, N-Stadium, M-Stadium, pathologisches Stadium und TMED3-Expression. Die statistische Signifikanz wurde als P < 0,05 definiert.

Die Analyse der Arzneimittelsensitivität zeigte, dass Patienten in der Gruppe mit hoher TMED3-Expression niedrigere geschätzte_IC-50-Werte für 5-Fluorouracil, Lapatinib und Trametinib im Vergleich zur Gruppe mit niedriger TMED3-Expression aufwiesen (Abbildung 11). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Darmkrebspatienten mit erhöhter TMED3-Expression eine erhöhte Sensibilität gegenüber diesen chemotherapeutischen und zielgerichteten Therapeutika zeigen können, was auf mögliche Zusammenhänge zwischen TMED3-Expression und therapeutischer Antwort hindeutet.

Abbildung 11. Korrelation zwischen TMED3-Expression und chemotherapeutischer Medikamentensensitivität bei Darmkrebs. Box-Diagramme zeigen geschätzte halbmaximale inhibitorische Konzentrationswerte (IC₅₀) für 5-Fluorouracil, Lapatinib und Trametinib zwischen niedriger TMED3-Expression (G1) und hoher TMED3-Expression (G2)-Gruppen. Niedrigere_IC-50-Werte deuten auf eine höhere Arzneimittelsensitivität hin. Die statistische Signifikanz wurde mit Wilcoxon-Rangsummentests analysiert. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Genanreicherungsanalyse
GSEA zeigte anhand von KEGG-Datensätzen aus der MSigDB-Datenbank, dass TMED3-bezogene Gene bei Darmkrebs signifikant in Signalwegen angereichert waren, die mit Ribosomen, Antigenverarbeitung und -präsentation, oxidativer Phosphorylierung und dem Pentosephosphat-Pfad assoziiert sind (Abbildung 12). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMED3 an der Tumorprogression über die oben genannten Signalwege im Darmkrebs beteiligt sein könnte.

Abbildung 12. Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) von TMED3-bezogenen Genen bei Darmkrebs. GSEA-Diagramme zeigen die Anreicherung von TMED3-bezogenen Genen in Wegen, die mit Antigenverarbeitung und -präsentation, Ribosomen, oxidativer Phosphorylierung und dem Pentosephosphatweg im Darmkrebs assoziiert sind. In jedem Panel sind der normalisierte Anreicherungswert (NES), der nominale P-Wert und die False Discovery Rate (FDR)-Werte angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diese Studie zeigte, dass TMED3 bei mehreren Krebsarten abweichend exprimiert ist und mit Tumorprogression, Prognose, Immunmerkmalen, TMB, MSI und Arzneimittelsensitivität assoziiert ist. Bei Darmkrebs war die Überexpression von TMED3 mit ungünstigen Überlebensergebnissen und einem erhöhten diagnostischen Wert assoziiert. Die Analyse der funktionellen Anreicherung deutete zudem darauf hin, dass TMED3 an krebsbedingten Stoffwechsel- und Signalwege beteiligt sein könnte. Zusammen unterstützen diese Ergebnisse eine weitere Untersuchung von TMED3 als potenziellen diagnostischen und prognostischen Biomarker bei Pankrebs, insbesondere bei Darmkrebs.

Datenverfügbarkeit:
Die in dieser Studie analysierten Datensätze stammen aus öffentlich verfügbaren Datenbanken, darunter The Cancer Genome Atlas (TCGA; https://portal.gdc.cancer.gov/projects/; abgerufen am 1. Juli 2025), UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/; abgerufen am 1. Juli 2025), cBioPortal (https://www.cbioportal.org/; abgerufen am 5. Juli 2025) und die Plattform Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) über GSCA (https://guolab.wchscu.cn/GSCA/#/drug; abgerufen am 5. Juli 2025). Alle während dieser Studie generierten verarbeiteten Daten sind im Artikel enthalten.

Diskussion

TMED-Proteine sind hochkonservierte Proteine, die die emp24-Domäne enthalten und als Monomere oder Dimere in eukaryotischen Zellen²⁰ existieren. Mitglieder der TMED-Familie sind Typ-I-Transmembranproteine, die an vesikelvermitteltem Proteintransport und intrazellulärem Transport²⁰ beteiligt sind. Die p24-Proteinfamilie besteht aus 10 TMED-Mitgliedern, darunter TMED3. Zunehmende Belege zeigen, dass TMED3 in mehreren Malignitäten abnormal exprimiert wird, wie zum Beispiel Endometriumkarzinom, Osteosarkom, klarzelliges Karzinom, hepatozelluläres Karzinom, Prostatakrebs und Brustkrebs 4,6,21,22,23. Eine erhöhte TMED3-Expression wurde ebenfalls mit einer ungünstigen Prognose bei mehreren Tumortypen 3,5,17,18,19 in Verbindung gebracht. Im Lungenplattenepithelkarzinom wurde gezeigt, dass TMED3 das Tumorprogression durch Regulierung von Ezrin fördert, während TMED3 die Zellproliferation, Koloniebildung, Migration und apoptosebedingte^{Proteindysregulation} unterdrückte. Zusammen zeigen diese Studien, dass TMED3 eng an der Entwicklung und dem Fortschreiten von Krebs beteiligt ist; Seine biologischen Funktionen und molekularen Mechanismen beim Pankrebs sind jedoch noch vollständig geklärt.

In der vorliegenden Studie wurden mehrere öffentliche Datenbanken integriert, um die Expressionsmuster, die prognostische Bedeutung, die Immunmerkmale und die potenziellen biologischen Funktionen von TMED3 über Krebsarten hinweg umfassend zu bewerten. Die TMED3-Expression war bei 26 Tumortypen deutlich erhöht, und diese Befunde wurden durch gepaarte Tumor- und angrenzende normale Gewebeanalysen bei mehreren Krebsarten weiter bestätigt. Konsequent zeigten CPTAC-Daten eine erhöhte TMED3-Proteinexpression in BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OV und UCEC. Interessanterweise wurde zwar die TMED3-mRNA-Expression in PAAD-Geweben erhöht, aber in der UALCAN-Datenbank eine reduzierte Proteinexpression beobachtet, was darauf hindeutet, dass posttranskriptionelle Regulation, Proteinabbau oder posttranslationale Veränderungen zu dieser Diskrepanz beitragen können. Frühere Studien zeigten, dass die Überexpression von TMED3 in Brustkrebszellen die Ansammlung von β-Catenin und Axin-2 sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern von MCF-7-Zellen fördert und die Expression von Wnt/β-Catenin-nachgelagerten Zielen, einschließlich c-myc, MMP7 und TCF4, fördert, wodurch die Proliferation, Migration und Invasion von Tumorzellen gefördert^werden.. Ähnlich wurde berichtet, dass TMED3 im nicht-kleinzelligen Lungenkrebs hochreguliert ist, und das Schweigen von TMED3 unterdrückt die Proliferation von Tumorzellen und die invasive Fähigkeit²⁵. In der aktuellen Studie zeigten klinisch-pathologische Analysen, dass die TMED3-Expression im fortgeschrittenen Stadium von ACC, KIRC, KIRP und LUAD erhöht war, während eine niedrigere Expression im fortgeschrittenen Stadium von UCEC beobachtet wurde, was auf mögliche tumorspezifische biologische Rollen von TMED3 während des Krebsverlaufs hinweist. Überlebensanalysen zeigten zudem signifikante Zusammenhänge zwischen hoher TMED3-Expression und ungünstigem OS- und DSS-Wert in ACC, COAD und UVM, was den potenziellen prognostischen Wert von TMED3 bei mehreren Malignitäten unterstützt. Zusätzlich zeigte die Promotormethylierungsanalyse erhöhte TMED3-Methylierungswerte in BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD und PRAD, während in BLCA, TGCT und UCEC verringerte Methylierungswerte festgestellt wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass abweichende Promotormethylierung zur Dysregulation der TMED3-Expression auf tumorabhängige Weise beitragen und zur Krebsentwicklung beitragen kann.

MSI stellt eine eigenständige molekulare Untergruppe von Krebs dar, die häufig mit einer verbesserten Immuntherapie-Reaktion assoziiert wird, da diese Tumore häufig eine erhöhte Mutationslast und eine erhöhte PD-L1-Expression aufweisen^26,27. Tumore mit hohem TMB können zahlreiche Neoantigene erzeugen, die aus somatischen Mutationen abgeleitet sind, wodurch die T-Zell-vermittelte Antitumor-Immunaktivität verbessert und möglicherweise die Empfindlichkeit gegenüber der Immunkontrollpunkt-Blockade^28,29 erhöht wird. In der vorliegenden Studie zeigte die TMED3-Expression positive Korrelationen mit sowohl TMB als auch MSI in KIRC, STAD und UCEC, was darauf hindeutet, dass TMED3 mit der Tumorimmunogenität und immuntherapeutischer Responsivität bei diesen Krebsarten in Verbindung stehen könnte. Zunehmende Evidenz hat gezeigt, dass die Tumormikroumgebung, insbesondere die Immun- und Stromkomponenten, eine entscheidende Rolle beim Krebsverlauf, der therapeutischen Wirkung, dem Rückauftreten und der Patientenprognose spielt. Der ESTIMATE-Algorithmus berechnet stromale, immune und ESTIMATE-Werte anhand immunbezogener Genexpressionsmuster, und frühere Untersuchungen haben signifikante Zusammenhänge zwischen diesen Werten und klinischen Ergebnissen bei Prostatakrebs, Glioblastom und Darmkrebs 30,31,32 berichtet. Unsere Analysen zeigten, dass die TMED3-Expression variabel mit stromalem Score, Immunscore und ESTIMATE-Score über verschiedene Tumortypen hinweg assoziiert war, was darauf hindeutet, dass TMED3 durch Modulation des Tumormikroumfelds zum Tumorfortschritt beitragen kann. Darüber hinaus war die TMED3-Expression mit mehreren immun-checkpoint-bezogenen Genen korreliert, darunter CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) und CTLA4, wobei sich die Richtung und das Ausmaß dieser Assoziationen je nach Tumortyp unterschieden. Signifikante positive Korrelationen zwischen TMED3 und Immuncheckpoint-Markern wurden in ACC, KIRP, LGG, LIHC, THYM und UVM festgestellt, was darauf hindeutet, dass Tumore mit erhöhter TMED3-Expression in diesen Krebsarten eine erhöhte Immuntherapiesensitivität aufweisen könnten. Medikamentensensitivitätsanalysen zeigten zudem Zusammenhänge zwischen TMED3-Expression und Reaktion auf 17-AAG, Lapatinib, PD-0325901, RDEA119 und Trametinib, was auf eine mögliche Beziehung zwischen TMED3-Expression und therapeutischer Wirksamkeit hinweist.

Darmkrebs wurde für immunhistochemische Validierung ausgewählt, und die Ergebnisse bestätigten, dass die TMED3-Expression im Darmkrebsgewebe im Vergleich zu normalen Darmgeweben deutlich erhöht war, was mit früheren Befunden⁷ übereinstimmt. Kliniopathologische Analysen zeigten zudem einen signifikanten Zusammenhang zwischen TMED3-Expression und dem T-Stadium im Darmkrebs. Darüber hinaus zeigte TMED3 potenziellen diagnostischen Wert, während eine erhöhte TMED3-Expression mit einer schlechteren Patientenprognose assoziiert war. Zeitabhängige ROC-Analysen zeigten jedoch, dass die AUC-Werte zur Vorhersage von 1-, 3- und 5-Jahres-OS nur geringfügig über 0,5 lagen, was auf eine begrenzte prädiktive Genauigkeit trotz statistischer Signifikanz hinweist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMED3 derzeit als explorativer prognostischer Biomarker einen größeren Wert hat und nicht als robuster Prädiktor für routinemäßige klinische Anwendung. Univariate und multivariate Cox-Regressionsanalysen identifizierten zudem das T-Stadium, das M-Stadium, das pathologische Stadium und die TMED3-Expression als unabhängige prognostische Faktoren, die mit OS bei Darmkrebs assoziiert sind. Analysen zur Arzneimittelsensitivität zeigten, dass Patienten mit erhöhter TMED3-Expression eher auf häufig verwendete Therapeutika wie 5-Fluorouracil, Lapatinib und Trametinib ansprechen können. Darüber hinaus zeigten funktionelle Anreicherungsanalysen, dass TMED3-bezogene Gene im Darmkrebs hauptsächlich in Signalwegen angereichert sind, die mit Ribosomen, Antigenverarbeitung und -präsentation, oxidativer Phosphorylierung und dem Pentosephosphatweg assoziiert sind.

Diese Studie bewertete systematisch die Expressionsprofile, den prognostischen Wert und immunbezogene Eigenschaften von TMED3 über mehrere Krebsarten hinweg. Dennoch sollten mehrere Einschränkungen berücksichtigt werden. Die meisten Ergebnisse stammten aus bioinformatischen und multiomischen Analysen auf Basis öffentlicher Datensätze, und die experimentelle Validierung beschränkte sich auf immunhistochemische Analysen im Darmkrebsgewebe. Darüber hinaus wurden keine funktionellen Experimente durchgeführt, um die genauen molekularen Mechanismen der Rolle von TMED3 im Tumorverlauf zu untersuchen. Daher sind weitere in-vitro- und in-vivo-Studien erforderlich, um die biologischen Funktionen und die potenzielle therapeutische Bedeutung von TMED3 bei verschiedenen Malignitäten weiter zu klären.

Materialien

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Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,5% Ammonia-Lösung	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1336-21-6	N/A
1% Säurealkohol	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
10% neutral gepuffertes Formalin	Wuhan Huntz Biotechnology Co., Ltd	H-H8060	N/A
100% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
70% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
80% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
95% Ethanol	Shandong Lirun Medical Technology Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
Alcian-Blau-Färbung	Baso Diagnostics Inc., Zhuhai	BA4121	N/A
cBioPortal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center	N/A	SCR_014555
Citratbasierter Antigen-Retrieval-Puffer	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9640-CN	N/A
clusterProfiler-Paket	Bioconductor	N/A	SCR_016884
DESeq2-Paket	Bioconductor	N/A	SCR_015687
Diaminobenzidin-Tetrahydrochlorid-Hydrat	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
ESTIMATE-Paket	R-Paket	Version 1.0.13	N/A
GSCALite-Plattform	GSCALite	N/A	N/A
GTEx-Datenbank	GTEx Consortium	N/A	SCR_013042
Hämatoxylin	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
Wasserstoffperoxid	OriGene Technologies, Inc	PV-6000D	N/A
Kaplan–Meier-Überlebensanalyse	survival R-Paket	Version 3.2-7	SCR_021137
KEGG-Gensets	MSigDB	Version 7.5.1	SCR_016863
Lichtmikroskop	Zeiss Technology (Suzhou) Co., Ltd	N/A	N/A
Paraffin-Einbettmedium	PATHO-Reagent Department of YL Company	CAS:8002-74-2	N/A
Polymerbasiertes Nachweissystem	Leica Biosystems Newcastle Ltd	PV-6000	N/A
R statistische Analysesoftware	R Foundation for Statistical Computing	Version 4.2.1	SCR_001905
sekundäres Kaninchen-Anti-Maus-IgG	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
TCGA-Datenbank	National Cancer Institute	N/A	SCR_003193
TMED3-Primärantikörper	CUSABIO Technology, Houston, USA	CSB-PA897107LA01HU	N/A
Tris-gepuffertes Salz (TBS)	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9590-CN	N/A
UALCAN-Datenbank	UALCAN	N/A	SCR_015827
Wilcoxon-Statistische Analyse	stats R-Paket	N/A	SCR_003005
Xylol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1330-20-7	N/A

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