Handgerät zur Speichelvorbehandlung zur Verbesserung der Cortisolerkennung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine schnelle Speichelvorbehandlungsmethode zur Verbesserung der Cortisolerkennung. Ein Handfiltergerät wird verwendet, um Mucine und andere störende Substanzen zu entfernen, während der Zielanalyt erhalten bleibt. Der vorbehandelte Speichel zeigt einen verbesserten Kapillarfluss, was eine gleichmäßigere und reproduzierbarere Testleistung ermöglicht.

Zusammenfassung

Speichelcortisolnachweis bietet eine nicht-invasive Alternative zur blutbasierten Analyse. Seine praktische Umsetzung bleibt jedoch durch die intrinsische Viskosität des Speichels und das Vorhandensein interferierender Komponenten begrenzt. Insbesondere behindern Mucine und Speichelproteine den kapillargesteuerten Fluss und beeinträchtigen die Zuverlässigkeit nachfolgender Lateralfluss-Assays (LFAs), weshalb wirksame und zugängliche Vorbehandlungsstrategien erforderlich sind. Hier präsentieren wir ein handgehaltenes Speichelvorbehandlungsgerät namens SaliFilter zur Point-of-Care-Erkennung von Cortisol. Das Gerät verwendet einen Filtermechanismus, der selektiv hochmolekulare störende Komponenten entfernt und gleichzeitig den Durchgang kleiner Moleküle, einschließlich Cortisol, ermöglicht. Betrieben durch einfachen manuellen Druck, ermöglicht es eine schnelle Probenverarbeitung (~2 Min) ohne externe Ausrüstung, was es für dezentrale Umgebungen geeignet macht. Die Leistung des Geräts wurde mittels Trübungsmessungen, Proteinquantifizierung und SDS-PAGE bewertet, was eine effiziente Entfernung von Muzin- und Speichelproteinen bestätigte. Behandelte Proben zeigten einen verbesserten Kapillarfluss, was zu einem stabilen und zuverlässigen LFA-Betrieb führte. Quantitative Analysen zeigten eine verbesserte Signalreproduzierbarkeit, und der Cortisolnachweis erreichte eine Nachweisgrenze von 1,47 ng mL⁻¹ über klinisch relevante Konzentrationsbereiche. Dieses Protokoll etabliert eine effektive Speichel-Vorbehandlungsstrategie, die die analytische Sensibilität und Zuverlässigkeit verbessert, ohne die Integrität der Analyten zu beeinträchtigen. Der vorgeschlagene Ansatz bietet eine praktische, tragbare Lösung für speichelbasierte Diagnostik mit potenzieller Anwendbarkeit für Point-of-Care-Tests und Selbstüberwachung.

Einleitung

Cortisol, ein vom Nebennierenrinde ausgeschiedenes Glukokortikoidhormon, ist ein wichtiger Biomarker zur Bewertung physiologischen Stresses ^1,2. Es kann in mehreren biologischen Flüssigkeiten gemessen werden, darunter Serum, Plasma, Urin, Zwischenflüssigkeit und Speichel, wobei Blut und Speichel am häufigsten in der klinischen^{Praxis verwendet} werden. Obwohl blutbasierte Messungen verlässliche quantitative Informationen liefern, erfordern sie eine invasive Venenpunktion und geschultes Personal, was ihre Eignung für häufige oder längsgående Überwachung ^{einschränkt 4,5,6}. Im Gegensatz dazu bietet die Messung des Speichelcortisols eine nicht-invasive und bequeme Alternative, die Point-of-Care- und Selbstüberwachungsanwendungen^ermöglicht. Bemerkenswert ist, dass die Speichelcortisolwerte stark mit den Blutkonzentrationen korrelieren und Speichel als zuverlässige Ersatzprobe⁹ unterstützen. Die intrinsische Viskosität des Speichels und das Vorhandensein von störenden Komponenten beeinträchtigen jedoch die analytische Leistung erheblich, weshalb eine effektive Vorbehandlung vor Analyse 10,11,12 erforderlich ist.

Verschiedene Vorbehandlungsstrategien wurden untersucht, um diese Herausforderungen zu bewältigen. Zentrifugation wird weit verbreitet eingesetzt, um große Komponenten wie Mucine, Proteine und Zellreste zu entfernen. Allerdings erfordert es sperrige Laborausrüstung und mehrere Verarbeitungsschritte, was seine Anwendbarkeit in dezentralen Umgebungen^{einschränkt 13,14}. Verdünnung mit Pufferlösungen kann die Viskosität reduzieren und den Probenfluss^verbessern. Dennoch senkt es gleichzeitig die Analytenkonzentration und beeinträchtigt damit die analytische Sensibilität. Daher bleiben bestehende Ansätze für Point-of-Care-Anwendungen unzureichend, bei denen eine schnelle, gerätefreie Verarbeitung und Erhaltung von Zielanalyten unerlässlich sind.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelten wir SaliFilter, ein Handgerät zur Speichelvorbehandlung, das auf die Point-of-Care-Cortisolerkennung zugeschnitten ist. Das Gerät verwendet einen Filtrationsmechanismus, der selektiv hochmolekulare störende Substanzen entfernt und gleichzeitig den Durchgang kleiner Moleküle, einschließlich Cortisol¹⁶, ermöglicht. Manuell betrieben, ermöglicht das Gerät eine schnelle, benutzerfreundliche Verarbeitung ohne externe Instrumentierung. Durch die Eliminierung störender Komponenten verbessert dieser Ansatz den Kapillarfluss in Lateralfluss-Assays und erhöht somit die analytische Zuverlässigkeit. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung des Geräts und seine Anwendung zur schnellen Speichelbehandlung vor der Cortisoldetektion mittels Lateralfluss-Tests.

Protokoll

In dieser Studie wurde kommerziell gewonnener, deidentifizierter menschlicher Speichel verwendet. Es wurden keine menschlichen Teilnehmer rekrutiert, und eine institutionelle ethische Genehmigung war nicht erforderlich.

1. Speichelprobenvorbereitung

1. Weisen Sie die Teilnehmer an, mindestens 30 Minuten vor der Probenentnahme auf Essen oder Trinken zu verzichten.
2. Bereiten Sie die Speichelprobe gemäß den Anweisungen des Lieferanten vor.
   HINWEIS: Diese Studie verwendete kommerziell verfügbaren, gesammelten menschlichen Speichel zur Validierung auf Protokollebene.
3. Mischen Sie die Speichelprobe vorsichtig vor der Verwendung, um die Homogenität sicherzustellen.
4. Lagern Sie die Speichelproben bei 4 °C und verwenden Sie sie innerhalb der vom Lieferanten empfohlenen Lagerzeit.

2. Vorbereitung der RBCM-beschichteten Membran (Abbildung 1A)

1. Isolieren Sie RBCM aus Vollblut gemäß einem zuvor berichteten Protokoll¹⁶.
   1. Verwenden Sie kommerziell gewonnenes humanes Vollblut, das mit K2EDTA antikoaguliert ist, als RBCM-Quelle.
   2. Zentrifugiere das Vollblut bei 800 × g für 5 Minuten und entnehme die Fraktion der roten Blutkörperchen, nachdem du das Plasma und die Buffy-Schicht entfernt hast.
   3. Waschen Sie das isolierte rote Blutkörperchen-Pellet dreimal mit eiskalten 1× phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) unter sanftem manuellem Mischen.
   4. Suspendiere das gewaschene rote Blutkörperchen-Pellet für 30 Minuten in eiskalten 0,25× PBS, um eine Hämolyse zu induzieren.
   5. Trennen Sie freies Hämoglobin, indem Sie die lysierte Suspension bei 20.000 × g für 30 Minuten zentrifugieren und das RBCM-Pellet sammeln.
   6. Waschen Sie das gesammelte RBCM-Pellet dreimal mit 0,25× PBS und lagern Sie das blassrosa RBCM-Pellet bei −80 °C bis zum weiteren Gebrauch.
2. Bereiten Sie eine Polyethersulfonmembran (PES) mit einer Porengröße von 30 nm und einem Durchmesser von 13 mm vor.
3. Auf eine Seite der PES-Membran werden 100 μL 2% (w/v) RBCM-Lösung aufgetragen. Verteilen oder dosieren Sie die Lösung vorsichtig, bis die gesamte Membranoberfläche vollständig benetzt ist.
4. Inkubieren Sie die Membran bei 50 °C für 30 Minuten, um eine gleichmäßige Beschichtung und Trocknung zu gewährleisten.
5. Lagere die beschichtete Membran bei Raumtemperatur und verwende sie innerhalb von 15 Tagen nach^{Vorbereitung 17}.
   HINWEIS: Eine detaillierte Charakterisierung der RBCM-beschichteten PES-Membran wurde in unserer vorherigen Studie¹⁶ beschrieben.

3. Herstellung des SaliFilter-Bauteils (Abbildung 1B)

1. Setzen Sie die RBCM-beschichtete Membran in den vorgesehenen Filterhalter.
2. Bauen Sie das Gerät zusammen, indem Sie die Ein- und Auslasskomponenten sicher verbinden.
3. Befestigen Sie eine 1-mL-Spritze am Einlass des Geräts.
   VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass alle Komponenten fest abgedichtet sind, um Undichtigkeiten während des Betriebs zu verhindern.

4. Speichelvorbehandlung

1. Füllen Sie 500 μL Speichel in die Spritze, die mit dem SaliFilter-Gerät verbunden ist.
2. Üben Sie sanften manuellen Druck aus, um die Speichelprobe durch die Membran zu führen (~ 2 Min).
3. Sammeln Sie den vorbehandelten Speichel aus dem Auslass.
4. Verwenden Sie die vorbehandelte Probe sofort oder lagern sie bis zur weiteren Analyse bei 4 °C.

5. SDS-PAGE-Analyse von Speichelproteinen

1. Mischen Sie 15 μL der Probe mit 5 μL Laemmli-Samplepuffer.
2. Füllen Sie die Mischung in separate Brunnen mit einem 8%igen SDS-PAGE-Gel.
3. Führe eine Elektrophorese bei 150 V für 40 Minuten durch.
4. Färbe das Gel 2 Stunden lang mit Coomassie Blue.
5. Das Gel über Nacht in destilliertem Wasser abfärben.
6. Nehmen Sie Bilder des Gels mit einem Smartphone oder Bildgebungssystem auf.

6. Cortisoldetektion mit Lateral Flow Assay (LFA)

1. Trage 150 μL vorbehandelten Speichel auf das Probepad des LFA-Streifens auf.
2. Lass die Probe 10 Minuten entlang des Streifens wandern.
3. Nehmen Sie Bilder der Testergebnisse mit einem Smartphone oder Bildgebungssystem auf.
4. Öffnen Sie das LFA-Bild in ImageJ und verwenden Sie Image > Color > Split Channels, um die RGB-Kanäle zu trennen.
5. Verwenden Sie das grüne Kanalbild für die Analyse der Testlinienintensität.
6. Wählen Sie eine rechteckige Interessenregion (ROI) von 100 × 10 Pixeln, die die Testlinie abdeckt, und wenden Sie die gleiche ROI-Größe auf alle Streifenbilder an.
7. Missen Sie den mittleren Intensitätswert der ROI der Testleitung. Wählen Sie eine benachbarte leere Membranregion mit derselben ROI-Größe aus und messen Sie die Hintergrundintensität.
8. Berechnen Sie die normalisierte Testlinienintensität wie folgt: Normalisierte Intensität = Testlinienintensität − Hintergrundintensität.

7. Statistische Analyse

1. Präsentieren Sie quantitative Daten als Mittelwert ± Standardabweichung (SD), sofern nicht anders angegeben. Definiere Fehlerbalken als SD.
   HINWEIS: In dieser Studie repräsentieren alle berichteten N-Werte technische Replikationen, die mit Aliquoten von kommerziell gewonnenem gesammeltem menschlichem Speichel durchgeführt wurden.
2. Führen Sie eine lineare Regressionsanalyse unter Verwendung der normalisierten Testlinienintensitätswerte durch, die aus Cortisolkonzentrationen von 0–8 ng mL⁻¹ gewonnen werden, und berechnen Sie den Bestimmungskoeffizienten (R²) aus der angepassten Kurve.
3. Berechnen Sie den Detektionsgrenzwert (LOD) mit folgender Gleichung: LOD = 3,3 × SE / |Steigung|, wobei SE der Standardfehler des y-Intercepts und |slope| ist der Absolutwert der Steigung, die aus der linearen Regressionsgleichung gewonnen wird. Verwenden Sie den Absolutwert der Steigung, da die wettbewerbsfähige LFA eine negative Steigung erzeugt.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden keine inferenziellen statistischen Tests durchgeführt und keine Signifikanzkriterien angewandt.

Ergebnisse

Eine wirksame Speichelvorbehandlung erfordert das Entfernen störender Bestandteile, darunter Mucine und Proteine, die die nachgelagerte analytische Leistung beeinträchtigen. Die Filtrationsfähigkeit von SaliFilter wurde zunächst durch den Vergleich von Trübungsänderungen mit solchen bewertet, die mit kommerziellen Speichelsammelkits erzielt wurden (Abbildung 2A). Unbehandelter Speichel zeigte eine hohe Trübheit, während SaliFilter-behandelte Proben sichtbar ...

Diskussion

Speichelbasierte Diagnostik bietet eine nicht-invasive Alternative zur Blutanalyse. Ihre breitere Akzeptanz wurde jedoch durch die intrinsische Viskosität des Speichels und das Vorhandensein interferierender Komponenten wie Mucine und Proteine eingeschränkt. Diese Faktoren stören den kapillargesteuerten Fluss und beeinträchtigen die Leistung einfacher analytischer Plattformen, einschließlich LFAs, weshalb eine effektive Probenvorbehandlung erforderlich ist.

In...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Künstlicher Speichel	Solarbio, China	A7990
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagenz	Bio-Rad, USA	5000006	Für Bradford-Assay
Coomassie-Blau	Abcam, UK	ab119211	Zur Proteinbanden-Visualisierung
Cortisol ELISA-Kit	Abcam, UK	ab154996
Cortisol LFA	Eigenherstellung
Heizplatte	Daihan Scientific, Republik Korea)
Hydrocortison (Cortisol)	Sigma-Aldrich, USA	PHR1014
Laemmli-Stichprobenpuffer	GenDEPOT, USA	L1200-001	Zur Proteindenaturierung vor SDS-PAGE
Membranhalter	GVS Filter Technology	1220950	13 mm Durchmesser-Halter
Mini-PROTEAN® Tetra Zelle für 0,75 mm Gele	Bio-Rad, USA	1658000	Für Gelelektrophorese
Mucin	Sigma-Aldrich, USA	M2378
NanoDrop 2000 Spektrophotometer	Thermo Fisher Scientific, USA		Für Protein-Assay
PES-Membranen	STERLITECH, USA	PES00313100	0,03 Mikron, 13 mm PES-Membran
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	DUKSAN, Republik Korea	LB004
Gemischter menschlicher Speichel	Innovative Research Inc., USA	IRHUSL5ML
RBCM	Eigenherstellung
Auflösungs-Gel-Puffer für PAGE	Bio-Rad, USA	1610798	Für die Herstellung des Auflösungs-Gels
Salivette Cortisol	SARSTEDT, Deutschland	51.1534.500	Speichel-Sammelset
Stapel-Gel-Puffer für PAGE	Bio-Rad, USA	1610799	Für die Herstellung des Stapel-Gels
Super•SAL™	Oasis Diagnostics, USA	SSAL-601	Speichel-Sammelset
Spritze	koreavaccine, Republik Korea)		1 mL Volumen
TEMED	Bio-Rad, USA	1610800	Für die Acrylamid-Polymerisation