Dieses Protokoll beschreibt einen standardisierten und reproduzierbaren Arbeitsablauf zur Beurteilung der proliferativen Kapazität sowie der osteogenen und odontogenen Differenzierung humaner dentaler Stammzellen, die auf Nanomaterial-Scaffolds kultiviert werden. Dabei werden standardisierte Nachweisverfahren (ALP-Aktivität, RANKL-Immunfluoreszenz [osteogen] und DMP-1-Immunfluoreszenz [odontogen]) und Normalisierungsstrategien angewendet, um die Vergleichbarkeit zwischen Studien zu gewährleisten.
Methodenartikel
Ein standardisiertes In-vitro-Protokoll zur Bewertung der Differenzierung und Proliferation menschlicher dentaler Pulpastammzellen auf Nanomaterial-Scaffolds
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die zuverlässige Beurteilung der osteogenen und odontogenen Differenzierung sowie der Stammzellproliferation ist grundlegend für die Bewertung der biologischen Wirksamkeit regenerativer Strategien auf Basis von Gerüsten. Allerdings beschränken Variabilität in experimentellen Protokollen, der Auswahl von Assays und der Dateninterpretation häufig die Reproduzierbarkeit und den Vergleich zwischen Studien. Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll stellt einen standardisierten, reproduzierbaren Arbeitsablauf für die in-vitro-Bewertung der osteogenen und odontogenen Differenzierung sowie der proliferativen Kapazität von auf biomaterialbasierten Gerüsten kultivierten Stammzellen vor. Die osteogene Differenzierung wird anhand der enzymatischen Aktivität der alkalischen Phosphatase (ALP) und der Immunfluoreszenz des Rezeptor-Aktivators des nukleären Faktors κB-Liganden (RANKL) bewertet, während die odontogene Differenzierung mittels Immunfluoreszenz von DMP-1 (Dentin-Matrix-Protein-1) analysiert wird; beide proteinkodierten Endpunkte werden mithilfe der standardisierten H-Score-Methode quantifiziert. Kritische experimentelle Parameter, einschließlich Zellansaatdichte, Induktionszeitpunkte, Bedingungen der Assays, Normalisierungsstrategien (einschließlich protein-normalisierter ALP-Aktivität, zellnormalisierter 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Lebensfähigkeit und Immunfluoreszenz-H-Score) sowie Ansätze zur Datenanalyse, werden detailliert beschrieben, zusammen mit Anleitungen zur Fehlerbehebung, um technische Variabilität zu minimieren. Die Methodik wurde als standardisierter Rahmen in mehreren experimentellen Studien mit Gerüstsystemen angewandt und hat Robustheit und Reproduzierbarkeit gezeigt. Durch die Bereitstellung eines umfassenden, validierten Rahmens zielt dieser Artikel darauf ab, die standardisierte Beurteilung von Wechselwirkungen zwischen Stammzellen und Gerüsten zu erleichtern und die Vergleichbarkeit zwischen präklinischen regenerativen Studien zu verbessern.
Einleitung
Die regenerative Endodontie stellt einen Paradigmenwechsel in der Zahnheilkunde dar und konzentriert sich auf die Wiederherstellung der Pulpa-Vitalität unter Verwendung von Stammzellen, Wachstumsfaktoren und Gerüsten1,2. Die Erhaltung der Pulpa-Vitalität ist entscheidend für die sensorische Funktion und die Immunantwort und besonders wichtig beim Management unreifer Zähne mit nekrotischer Pulpa, um eine weitere Wurzelentwicklung zu ermöglichen2.
Menschliche dentale Pulpastammzellen (DPSCs) und Stammzellen aus der apikalen Papille (SCAPs) sind aufgrund ihres hohen Proliferationspotenzials, ihrer Selbsterneuerungsfähigkeit, immunsupprimierenden Eigenschaften und ihrer Fähigkeit, sich unter geeigneten mikroumgebungsbedingten Bedingungen in odontoblastenähnliche Zellen zu differenzieren, primäre Kandidaten für diese Verfahren und stellen daher vielversprechende Kandidaten für zukünftige Anwendungen in der regenerativen Medizin und zellbasierten therapeutischen Interventionen dar3,4,5.
Während herkömmlich formulierte Materialien wie zementbasierte Kalziumsilikate untersucht wurden, legen neuere Befunde nahe, dass eine nanopartikuläre Modifizierung die Wechselwirkungen zwischen Biomaterialien und Zellen erheblich beeinflussen kann6. Nanostrukturierte Biomaterialien könnten eine biomimetischere Mikroumgebung schaffen, wodurch möglicherweise die Adhäsion von Stammzellen und deren linien-spezifische Differenzierung verbessert wird7. Das biologische Verhalten neuartiger Materialien wie NeoMTA2 in nanopartikulärer Form ist jedoch im Vergleich zu etablierten Materialien wie Nanohydroxylapatit bisher unzureichend erforscht8. Dieses Protokoll schafft einen standardisierten methodischen Rahmen, um diese Wechselwirkungen genau und reproduzierbar bewerten zu können.
Dieses standardisierte Rahmenkonzept eignet sich besonders für Studien, die neuartige Biomaterialien oder Nanomaterial-Scaffolds unter identischen biologischen Bedingungen evaluieren, bei denen der Vergleich zwischen Studien von größter Bedeutung ist. Es bietet Vorteile gegenüber Einzel-Assay-Ansätzen, da es die Überprüfung der Vitalität (MTT), den frühen osteogenen Commitment (ALP-Aktivität) und die differenzierte Proteinebene (Immunfluoreszenz H-Score) in einem einzigen Arbeitsablauf kombiniert. Forscher, die herkömmliche Alizarinrot-Färbungen oder Einzelzeitpunkt-Assays verwenden, könnten davon profitieren, dieses mehrparametrige Rahmenkonzept zu übernehmen, um Beobachterbias zu reduzieren und die quantitative Auflösung zu verbessern. Dieses Protokoll ist jedoch nicht für dreidimensionale Organoid-Kulturen, Ko-Kultursysteme oder tierische Stammzellmodelle gedacht, es sei denn, es erfolgt eine entsprechende Anpassung. Untersuchende, die eine Genexpressionsanalyse benötigen (z. B. RT-qPCR für RUNX2, OCN oder DSPP), sollten diesen Arbeitsablauf durch molekulare Assays ergänzen, da das vorliegende Protokoll ausschließlich auf proteino- und enzymatische Endpunkte fokussiert ist.
Um die bifunktionale Differenzierungskapazität von dentalen Stammzellen umfassend zu erfassen, verwendet dieses Protokoll zwei komplementäre Immunfluoreszenzmarker, die unterschiedliche biologische Endpunkte widerspiegeln. RANKL (Rezeptor-Aktivator des nukleären Faktors Kappa-B-Ligand) dient als Marker für die osteogene Linienzugehörigkeit: seine Expression auf osteoblastenähnlichen Zellen spiegelt kalziumionengetriebene Mineralisierungssignale und die Aktivierung knochenbildender Zellen wider, was mit seiner Verwendung in mehreren Studien zur Bewertung von SCAPs4,8,9 übereinstimmt. Parallel dazu wird DMP-1 (Dentin-Matrix-Protein-1) als spezifischer Marker der odontogenen/dentino genen Differenzierung eingesetzt: seine Hochregulierung in odontoblastenähnlichen Zellen zeigt die Induktion der Dentinmatrixbildung und der pulpenspezifischen Hartgewebsreparatur an und ist insbesondere relevant, wenn die Zielzellpopulation aus DPSCs besteht10. Durch die Quantifizierung sowohl von RANKL als auch von DMP-1 innerhalb desselben experimentellen Ansatzes mittels H-Score-Methode ermöglicht dieses Protokoll es den Forschenden, osteogene von odontogenen Differenzierungsrichtungen zu unterscheiden – zwei sich überlappende, aber mechanistisch unterschiedliche Ergebnisse der Wechselwirkung zwischen Stammzellen und Trägermaterial, ohne separate experimentelle Ansätze erforderlich zu machen.
Protokoll
Dieses Protokoll wurde von dem Ethikkomitee der Fakultät für Zahnmedizin der Ain Shams Universität mit der Genehmigungsnummer FDASU-Rec IM112105 genehmigt. Alle Verfahren an menschlichem Gewebe wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt. Von allen Teilnehmern wurden vor der Zahnextraktion und der Stammzellgewinnung schriftliche, informierte Einwilligungen eingeholt.
1. Herstellung und Charakterisierung von Nanomaterialien
- Synthetisieren Sie Nanomaterialien gemäß spezifischer Anforderungen10,11. Für Nano-NeoMTA2 pulverisieren Sie das Pulver mithilfe eines Planettarbmühle (siehe Tabelle der Materialien) 10 h bei 350 U/min mit 3-minütigen Ein- und Ausschaltintervallen. Verwenden Sie ein Kugel-zu-Pulver-Massenverhältnis von 10:1 mit Zirkonia-Mahlkugeln (5 mm Durchmesser) in einem Zirkonia-Mahlschale. Überprüfen Sie die endgültige Partikelgröße mittels Transmissionselektronenmikroskop (TEM) (Ziel: <200 nm), bevor Sie fortfahren.
ACHTUNG: NeoMTA2-Pulver kann bei Inhalation Atemwegsreizungen verursachen. Führen Sie alle Trockenmahlungsschritte in einer zertifizierten Abzugshaube unter Verwendung einer N95-Atemschutzmaske, Sicherheitsschutzbrille und Nitrilhandschuhen durch. - Stellen Sie Nanohydroxylapatit nach der Nassfällungsmethode her8,11,12: 10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O. Bereiten Sie 1 L einer 0,5 M Calciumnitrat-Lösung und 0,6 L einer 0,3 M Ammoniumphosphat-Lösung, jeweils in entionisiertem Wasser, vor. Geben Sie die Calciumnitrat-Lösung unter kontinuierlichem Rühren bei 400 U/min tropfenweise (ca. 2–3 mL/min) in die Ammoniumphosphat-Lösung, erwärmen Sie auf 70 °C und halten Sie den pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von Ammoniumhydroxid zwischen 10 und 128.
ACHTUNG: Ammoniumhydroxid ist ätzend und setzt toxische Ammoniakdämpfe frei. Handhaben Sie es ausschließlich in einer chemischen Abzugshaube. Tragen Sie säurebeständige Handschuhe, Spritzschutzbrille und einen Laborkittel. Bei Hautkontakt sofort mindestens 15 Minuten lang mit Wasser spülen. - Behandeln Sie das resultierende Apatit-Fällprodukt hydrothermal in einem Autoklaven bei 140 °C und 0,3 MPa für 2–3 h10. Gefriertrocknen Sie das gereinigte Fällprodukt bei -50 °C unter einem Vakuum von ≤0,05 mbar für 48 h8.
- Stellen Sie bioaktive Glaskugeln 45S5-Nanopartikel nach der Sol-Gel-Methode wie folgt her.
- Bereiten Sie die Vorläuferlösung vor, indem Sie 40 mL Tetraethylorthosilikat (TEOS) mit 10 mL 2 M Salpetersäure (HNO₃) als Säurekatalysator in einem Polypropylenbecher unter kontinuierlichem Rühren bei 300 U/min bei Raumtemperatur mischen.
- Geben Sie nach 30 min Calciumnitrat-Tetrahydrat (Ca(NO₃)₂·4H₂O) und Natriumnitrat (NaNO₃) hinzu, um die Ziel-Molverhältnisse zu erreichen: 45 mol% SiO₂, 24,5 mol% CaO, 24,5 mol% Na₂O und 6 mol% P₂O₅. Fügen Sie Triethylphosphat (TEP) als Phosphor-Vorläufer hinzu.
- Rühren Sie 24 h bei Raumtemperatur. Lagern Sie das Gel 24 h bei 60 °C in einem verschlossenen Behälter. Trocknen Sie es 24 h bei 120 °C. Zünden Sie es in einem Muffelofen 3 h bei 650 °C ein (Aufheizrate: 2 °C/min). Mahlen Sie das Produkt und bestätigen Sie die Phasenzusammensetzung mittels TEM und Röntgenbeugung (XRD)4,9.
ACHTUNG: TEOS und Ethanol sind entzündlich. HNO₃ ist ätzend. Führen Sie alle Arbeiten in einer Abzugshaube fern von Zündquellen durch.
- Charakterisieren Sie alle hergestellten Nanopartikel mittels hochauflösendem TEM und XRD, um Partikelgröße und Kristallinität zu bestätigen8. Erfassen Sie mittlere Partikelgröße, Polydispersitätsindex (PDI) und Zeta-Potential mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS), um die kolloidale Stabilität zu überprüfen. Akzeptieren Sie Chargen mit einer mittleren Partikelgröße von <200 nm und einem Zeta-Potential von <−15 mV oder >+15 mV.
2. Gewinnung und Kultivierung von Stammzellen
- Gewinnen Sie DPSCs oder SCAPs aus frisch extrahierten, retinierten Unterkiefermolaren dritten Grades nach schriftlicher, informierter Einwilligung10. Verarbeiten Sie die extrahierten Zähne innerhalb von 2 Stunden nach der Extraktion und transportieren Sie sie in sterilem, mit Phosphatpufferlösung (PBS) versetztem Kochsalzlösung bei 4 °C.
ANMERKUNG: Zu den Spender-Eignungskriterien gehören systemisch gesunde Erwachsene im Alter von 18–35 Jahren, Nichtraucher, ohne Antibiotikaeinnahme in den letzten 3 Monaten, ohne Parodontalerkrankung und ohne radiographische Hinweise auf periapikale Pathologie. - Isolieren Sie die Zellen mithilfe der Enzymspaltungsmethode9. Zerkleinern Sie das Zahngewebe in Stücke von 1–2 mm Größe und verdauen Sie es mit einer Lösung aus Kollagenase Typ I in einer Konzentration von 3 mg/mL in serumfreiem Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) für 1 Stunde bei 37 °C unter kontinuierlicher Schüttelung mit 60 U/min auf einem Schüttelboden8. Neutralisieren Sie mit komplettem Kulturmedium und filtrieren Sie durch einen 70 µm Zellfilter.
ACHTUNG: Kollagenase Typ I kann Endotoxine enthalten. Verwenden Sie ausschließlich endotoxintestete, zellkulturgeeignete Kollagenase. Tragen Sie Handschuhe und vermeiden Sie Inhalation. - Impfen Sie die Einzelzell-Suspension in 75 cm2-Kolben mit einer anfänglichen Dichte von 1 × 104 Zellen/cm2 in komplettem Kulturmedium, bestehend aus DMEM, 10 % fetalem Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Tabelle der Materialien)8.
- Brüten Sie die Kolben bei 37 °C in einer Atmosphäre mit 5 % CO₂8. Überwachen Sie täglich Wachstum und Kontamination mittels eines invertierten Phasenkontrastmikroskops10. Ersetzen Sie das Kulturmedium alle 48–72 Stunden. Entsorgen Sie jeden Kolben, der Anzeichen von Kontamination zeigt (Trübung, Farbwechsel, unregelmäßige Zellmorphologie).
- Gewinnen Sie die Zellen nach der dritten Passage, wenn sie eine Konfluenz von etwa 70–80 % erreicht haben8. Für das Passagieren saugen Sie das Medium ab, spülen mit PBS und lösen die Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA bei 37 °C für 3–5 Minuten ab. Neutralisieren Sie mit komplettem Kulturmedium, zentrifugieren Sie bei 300 x g für 5 Minuten und impfen Sie erneut mit 1 × 104 Zellen/cm2 aus. Verwenden Sie ausschließlich Zellen zwischen der dritten und sechsten Passage, um die phänotypische Stabilität zu gewährleisten.
3. Charakterisierung von Stammzellen
- Analysieren Sie das Immunphänotyp der isolierten Zellen mittels Durchflusszytometrie8,10. Charakterisieren Sie die Zellen in der dritten Passage. Verwenden Sie eine unbehandelte negative Kontrolle sowie Einfachgefärbte-Kompensationskontrollen für jeden verwendeten Fluorochrom.
- Stellen Sie die Zellkonzentration auf 106/mL in PBS ein. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 10 min und waschen Sie das Pellet zweimal mit PBS8,10.
- Färben Sie die Zellen mit anti-humanen Antikörpern gegen mesenchymale Marker (CD44, CD43) und hämatopoetische Marker (CD45) in den vom Hersteller empfohlenen Verdünnungen (typischerweise 1:100 in PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA)) (Tabelle der Materialien)8,10. Inkubieren Sie 45 min bei 4 °C im Dunkeln. Waschen Sie zweimal mit PBS und resuspendieren Sie in 300 µL PBS zur Messung.
- Analysieren Sie die Zellen mit Software zur Durchflusszytometrie (Tabelle der Materialien), um das Immunphänotyp zu bestimmen (Expression von CD44 und CD73, mit CD45 als hämatopoetischem Ausschlussmarker). Wenden Sie eine schrittweise Gating-Strategie an: (a) Streulicht-Gating (FSC-A vs. SSC-A); (b) Ausschluss von Doppelzellen (FSC-H vs. FSC-A); (c) fluorspezifische Gates, die anhand der unbehandelten Kontrollen festgelegt werden. Geben Sie den Prozentsatz positiver Zellen für jeden Marker zusammen mit der Gating-Strategie an.
4. Bestimmung der sicheren Materialkonzentration (halbmaksimale wirksame Konzentration, EC₅₀)
- Bestimmen Sie den EC₅₀ mithilfe einer statistischen Analyse-Software (GraphPad Prism 9). Passen Sie die Dosis-Wirkungs-Daten einer nichtlinearen regressiven sigmoiden Kurve an (vierparametriges logistisches Modell: Y = Unten + (Oben − Unten) / (1 + 10^((LogEC₅₀ − X) × Hill-Steigung))). Geben Sie den EC₅₀-Wert in µg/mL mit 95 % Konfidenzintervall8 an.
- Bereiten Sie serielle Verdünnungen der Nanomaterialien (50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 und 1,56 µg/mL) in 1 mL PBS vor. Vortexen Sie die Stammlösung 30 s lang und führen Sie anschließend eine Beschallung durch (Sondenbeschallung, 40 W, 30 s an/10 s aus für 3 Zyklen bei 4 °C), um eine homogene Suspension sicherzustellen. Sterilisieren Sie die Probe unter UV-Licht in einem Sicherheitswerkbank 30 min lang.
- Kultivieren Sie Stammzellen mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen/Vertiefung in 96-Loch-Platten für 72 h mit den verschiedenen Konzentrationen und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mittels Trypanblau, um den EC₅₀ anhand des in Schritt 4.1 beschriebenen vierparametrigen logistischen Modells zu berechnen.
- Führen Sie die Experimente im Dreifachansatz (n = 3 unabhängige Vertiefungen pro Konzentration) mit mindestens drei biologischen Wiederholungen durch. Geben Sie die EC₅₀-Werte als Mittelwert ± SD an und berechnen Sie den Variationskoeffizienten (CV %) über die Wiederholungen (akzeptables CV <15 %).
5. Beurteilung der osteogenen und odontogenen Differenzierung
HINWEIS: Dieser Abschnitt bewertet zwei komplementäre Differenzierungswegwege mittels paralleler Immunfluoreszenz-Assays aus der gleichen Zellpräparation. RANKL (Schritt 5.5) dient als osteogener Marker; DMP-1 (Schritt 5.6) dient als odontogener Marker. Beide werden mit derselben H-Score-Methode quantifiziert (Schritt 5.8). Führen Sie beide Assays an getrennten Deckgläsern durch, die gleichzeitig vorbereitet wurden.
- Säen Sie Stammzellen in 6-Loch-Platten mit einer Dichte von 4,5 × 105 Zellen/Loch. Lassen Sie die Zellen 24 h in vollständigem Kulturmedium anhaften, bevor die Differenzierung eingeleitet wird.
- Teilen Sie die Proben in vier Gruppen ein: Negativkontrolle (DMEM allein), Positivkontrolle (osteogene/odontogene Differenzierungsmedium) und experimentelle Gruppen (Nanomaterialien in sicherer Konzentration auf Basis des EC₅₀).
- Stellen Sie das osteogene Differenzierungsmedium her, indem Sie DMEM mit 10 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 µg/mL Ascorbinsäure (L-Ascorbat-2-Phosphat) und 100 nM Dexamethason ergänzen. Ersetzen Sie das Medium alle 48 h. Inkubieren Sie 72 h bei 37 °C und 5 % CO₂.
- Bestimmung der ALP-Aktivität
- Säen Sie Zellen in 24-Loch-Kulturplatten mit 1 × 104 Zellen/Loch und inkubieren Sie 72 h bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO₂.
- Entfernen Sie das Kulturmedium, spülen Sie die Löcher mit PBS aus und lysieren Sie die Zellen durch Zugabe von 200 µL Lysepuffer pro Loch (0,1 % Triton X-100 in PBS) und Inkubation bei 4 °C für 10 min unter vorsichtigem Schütteln.
- Sammeln Sie das Lysat und zentrifugieren Sie es 5 min bei 4 °C mit 500 x g; verwenden Sie den Überstand für alle nachfolgenden ALP-Messungen. Übertragen Sie 50 µL jeder Testprobe und 100 µL p-Nitrophenol-Standards in eine 96-Loch-Mikrotiterplatte. Geben Sie AMP-Substratpuffer (Table of Materials) hinzu, um die katalytische Reaktion zu starten.
- Nach einer zweiten Inkubation von 30 min bei 37 °C beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von 50 µL 0,5 M NaOH pro Loch. Messen Sie die Extinktion unverzüglich bei 405 nm mit einem Absorptions-Mikroplattenreader (Table of Materials).
- Erstellen Sie eine Standardkurve der Extinktion in Abhängigkeit von der p-Nitrophenol-Konzentration und berechnen Sie die ALP-Aktivität in U/L.
- Bestimmen Sie den Gesamtproteingehalt desselben Zelllysats mittels eines Bradford- oder BCA-Proteinassays. Normalisieren Sie die ALP-Aktivität auf den Gesamtproteingehalt und geben Sie die Endergebnisse als U/mg Protein an.
- Osteogener Marker (RANKL)
- Untersuchen Sie die RANKL-Proteinexpression mittels Immunfluoreszenz. Bereiten Sie zunächst Isotyp- und Sekundärantikörper-Kontrollen vor: (a) ersetzen Sie den primären Antikörper durch ein isotypisch passendes Kaninchen-IgG in gleicher Konzentration und (b) verzichten Sie in separaten Löchern vollständig auf den primären Antikörper.
- Fixieren Sie die Zellen 15 min bei Raumtemperatur mit frisch zubereiteter 4 % Formaldehyd-Lösung in PBS. Waschen Sie dreimal mit PBS (jeweils 5 min).
- Permeabilisieren Sie mit 0,1 % Triton X-100 in PBS für 10 min, dann blockieren Sie mit 5 % normalem Ziegenserum in PBS für 1 h bei Raumtemperatur, um unspezifische Bindungen zu reduzieren. Geben Sie ohne vorheriges Waschen den primären Kaninchen-Anti-RANKL-Antikörper in einer Verdünnung von 1:200 im Blockpuffer (Table of Materials) direkt hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C.
- Waschen Sie dreimal mit PBS, dann inkubieren Sie mit einem fluoreszenzmarkierten sekundären Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper in einer Verdünnung von 1:500 im Blockpuffer (Table of Materials) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln8. Nach der Inkubation mit dem sekundären Antikörper waschen Sie dreimal mit PBS (jeweils 5 min) und fahren Sie direkt mit Schritt 5.7 zum Aufbringen fort.
ACHTUNG: Formaldehyd (4 %ige Lösung) ist ein toxisches Fixativ und wahrscheinlich krebserregend. Bereiten Sie es nur in einer zertifizierten Abzugshaube zu und verwenden Sie es dort. Tragen Sie Nitrilhandschuhe, Spritzschutzbrille und Laborkittel. Entsorgen Sie Abfälle gemäß den institutionellen Vorgaben.
HINWEIS. Die Zellidentität wird vor der Bewertung mittels Immunfluoreszenz stattdessen durch Phasenkontrastmikroskopie und morphologische Kriterien bestätigt (siehe Schritt 5.10).
- Odontogener Marker (DMP-1)
HINWEIS: Untersuchen Sie die DMP-1 (Dentin-Matrix-Protein-1)-Proteinexpression mittels Immunfluoreszenz parallel zu Schritt 5.5, um die odontogene Differenzierung zu bewerten.- Verwenden Sie eine separate Reihe Deckgläser aus derselben Zellpräparation und wiederholen Sie alle Fixierungs-, Permeabilisierungs- und Blockierungsschritte wie in Schritt 5.5 beschrieben, einschließlich der Isotyp- und Sekundärantikörper-Kontrollen.
- Ohne vorheriges Waschen nach der Blockierung geben Sie direkt den primären Anti-DMP-1-Antikörper (siehe Table of Materials) in einer Verdünnung von 1:200 im Blockpuffer hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie dreimal mit PBS, dann inkubieren Sie mit dem geeigneten fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper (verwenden Sie einen spektral unterschiedlichen Farbstoff als für RANKL; siehe Table of Materials) in einer Verdünnung von 1:500 im Blockpuffer für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln.
- Nehmen Sie Fluoreszenzbilder bei 10facher Vergrößerung auf, um die DMP-1-Expression als Indikator für eine odontoblastenähnliche Differenzierung zu bewerten10. Nach der Inkubation mit dem sekundären Antikörper waschen Sie dreimal mit PBS (jeweils 5 min) und fahren Sie direkt mit Schritt 5.7 zum Aufbringen fort.
- Bringen Sie die Präparate mit einem antibleichenden Einbettmedium (siehe Table of Materials) auf und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur aushärten. Bringen Sie die mit RANKL und DMP-1 gefärbten Präparate getrennt auf und beschriften Sie sie deutlich (z. B. „RANKL Gruppe 1“ und „DMP-1 Gruppe 1“), bevor Sie die Bilder aufnehmen.
- Untersuchen Sie die Präparate unmittelbar mittels Fluoreszenzmikroskopie oder lagern Sie sie bei 4 °C lichtgeschützt. Quantifizieren Sie die Proteinexpression durch Bewertung der Färbungsintensität mittels eines standardisierten Vierpunkt-Bewertungssystems: 0 (keine Färbung), 1+ (schwach), 2+ (mäßig) und 3+ (stark).
- Nehmen Sie Bilder mit identischen Mikroskopeinstellungen (Belichtungszeit, Laserleistung und Verstärkung) für alle experimentellen Gruppen auf. Wenden Sie die Einstellungen unabhängig für jeden Marker (RANKL und DMP-1) an, um die Konsistenz innerhalb jedes Markers über alle Gruppen hinweg sicherzustellen.
- Bewerten Sie mindestens fünf zufällig ausgewählte hochvergrößerte Felder (20x-Objektiv) pro Loch. Lassen Sie die Bewertung von zwei unabhängigen, verblindeten Beobachtern durchführen und geben Sie den Cohen’schen Kappa-Koeffizienten an (akzeptabler Kappa ≥ 0,7).
- Berechnen Sie den H-Score nach der Formel: H-Score = Σ(i × Pi), wobei i = Färbungsintensität (1, 2 oder 3) und Pi = Prozentsatz der Zellen (0–100 %) auf jeder Intensitätsstufe ist.
HINWEIS: Der H-Score liegt zwischen 0 und 30010. - Normalisieren Sie die H-Score-Daten auf die Gesamtanzahl der Zellen pro Feld, ermittelt durch manuelle Zählung aller sichtbaren Zellen in jedem Feld unter Phasenkontrastmikroskopie vor der Immunfluoreszenz-Aufnahme, um Dichteunterschiede zwischen den Löchern auszugleichen.
- Berechnen und berichten Sie die H-Scores getrennt für RANKL (osteogenes Endpunktmerkmal) und DMP-1 (odontogenes Endpunktmerkmal), um einen direkten Vergleich zwischen den beiden Differenzierungswegen zu ermöglichen.
6. Bewertung der Proliferation und Vitalität
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblau-Färbung, um lebensfähige von nicht lebensfähigen Zellen zu unterscheiden. Berechnen Sie die Gesamtanzahl der lebensfähigen Zellen pro mL Kultur. Zählen Sie mindestens 100 Zellen pro Probe, um statistische Zuverlässigkeit zu gewährleisten.
- Führen Sie den MTT-Assay durch, um die mitochondriale Stoffwechselaktivität zu messen8,10.
- Fügen Sie die MTT-Lösung in einer Endkonzentration von 0,5 mg/mL (Table of Materials) zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie 4 h bei 37 °C. Entfernen Sie die Lösung, geben Sie ein Lösungsmittel (z. B. SDS-HCl; siehe Table of Materials) hinzu und messen Sie die optische Dichte bei 570 nm mit einem Spektrophotometer (Referenzwellenlänge: 630–650 nm).
- Berechnen Sie die Zellviabilität wie folgt: Viabilität (%) = (Absorption der behandelten Zellen / Absorption der unbehandelten Kontrollzellen) × 100. Werte >100 % weisen auf eine proliferative Stimulierung im Vergleich zur Negativkontrolle hin. Führen Sie eine Leerprobe zur Hintergrundkorrektur mit.
- Normalisieren Sie die Ergebnisse anhand der Zellzahl unter Verwendung eines parallelen Trypanblau-Zählansatzes. Führen Sie alle Assays im Dreifachen durch (n = 3 Wells/Gruppe, ≥3 biologische Wiederholungen).
ACHTUNG: Das SDS-HCl-Lösungspuffer ist ätzend. Handhabung mit geeigneter PSA. Entsorgen Sie formazanhaltige Abfälle gemäß den institutionellen Vorschriften.
Ergebnisse
Alle hier präsentierten Ergebnisse wurden aus begleitenden Studien4,8,9,10 übernommen, die von derselben Forschungsgruppe unter einer einheitlichen institutionellen Ethikgenehmigung (FDASU-Rec IM112105) durchgeführt wurden.
Charakterisierung von Nanomaterialien und Isolierung von Stammzellen
Der standardisierte Workflow liefert zunächst quantifizierbare Bestätigungen der Gerüst-Eigenschaften und der Stammzell-Phänotypen. Nach der Synthese werden die hergestellten Nanomaterialien mittels hochauflösender TEM und Röntgenbeugung (XRD) validiert, um Partikelgröße und Kristallinität zu bestätigen (Abbildung 1A,B). Gleichzeitig zeigen über Enzymverdau isolierte DPSCs oder SCAPs eine stabile Anheftung und Proliferation im kompletten Kulturmedium. Die Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt das Immunphänotyp der geernteten Zellen im dritten Durchgang und zeigt eine hohe Expression mesenchymaler Marker (CD44, CD43) sowie die Abwesenheit von CD45, was ihre nicht-hämatopoetische Herkunft belegt (Abbildung 1C).
Herstellung einer sicheren Materialkonzentration und Proliferation
Durch die Kultivierung von Stammzellen über serielle Verdünnungen der Nanomaterialien (50–1,56 µg/mL) über 72 h liefert die vierparametrige logistische Regression der lebensfähigen Zellzahlen einen zuverlässigen EC₅₀-Wert (nichtlineares sigmoidales Dosis-Wirkungs-Modell, wie in Schritt 4.1 beschrieben). MTT-Vitalitätswerte über 100 % weisen auf eine proliferative Stimulierung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle hin, da die Werte auf die negative Kontrollgruppe bezogen werden (unbehandelte Zellen als 100 % festgelegt). Ein Wert von etwa 196 % für Nano-NeoMTA2 spiegelt beispielsweise eine bioaktive Stimulierung der mitochondrialen Aktivität wider und nicht ein absolutes Zellüberleben von >100 %9.
In mehreren Studien, in denen dieses standardisierte Protokoll angewandt wurde, wurden mittels des vierparametrigen logistischen Modells (Schritt 4.1) EC₅₀-Werte von 7,9 µg/mL (Nano-NeoMTA2, SCAPs)8 und 9,92 µg/mL (Nano-NeoMTA2, DPSCs)10 ermittelt, wodurch sichere Arbeitskonzentrationen für die in diesem Protokoll beschriebenen Differenzierungsassays bestätigt wurden. Diese Werte sind in Tabelle 1 als repräsentative Validierungsmetriken enthalten.
Quantifizierung der osteogenen und odontogenen Differenzierung (Dual-Marker-Bewertung)
Der dualen Immunfluoreszenzansatz liefert zwei unterschiedliche, sich ergänzende Ergebnismessungen aus derselben Zellpräparation. Zur Bewertung der osteogenen Differenzierung unterschieden die RANKL-H-Scores alle vier Gruppen mit statistischer Signifikanz: Zellen, die mit Nano-NeoMTA2 kultiviert wurden, wiesen einen deutlich höheren RANKL-Ausdruck als die Negativkontrolle auf, was mit einer hochregulierten osteoblastenähnlichen Aktivierung übereinstimmt (Abbildung 2A, Tabelle 1)8,9. Zur odontogenen Bewertung zeigten die DMP-1-H-Scores eine starke odontoblastenähnliche Differenzierung in mit Nano-NeoMTA2 kultivierten DPSCs, wobei die H-Scores signifikant über denen der Nanohydroxylapatit- und der Negativkontrollgruppen lagen, was eine bevorzugte dentinogene Differenzierung bestätigt (Abbildung 3A, Tabelle 1)10. Die Zellidentität wurde vor der Bewertung mittels Phasenkontrastmikroskopie und charakteristischer morphologischer Kriterien (spindelförmige oder polygonale Morphologie) bestätigt.
Die ALP-Aktivität wurde bei allen Gruppen spektrophotometrisch bei 405 nm nachgewiesen und dient als früher enzymatischer Marker für die osteogene und odontogene Differenzierung (Tabelle 1). Die spektrophotometrische MTT-Analyse bestätigte, dass alle Nanomaterialien bei aus EC₅₀ abgeleiteten sicheren Konzentrationen eine hohe Zellviabilität im Vergleich zur negativen Kontrolle aufwiesen, was mit den dargestellten repräsentativen Werten übereinstimmt (Tabelle 1).
Suboptimale und erfolglose experimentelle Ergebnisse
Suboptimale Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Eine geringe Zellviabilität im MTT-Assay deutet typischerweise darauf hin, dass die Nanomaterialkonzentration die EC₅₀-Schwelle überschreitet oder dass die UV-Sterilisation unzureichend war. Inkonsistente ALP-Absorption (CV > 20 %) weist in der Regel auf eine ungleichmäßige Ansiedlungsdichte oder eine unvollständige Homogenisierung des Lysepuffers hin. Ein schwaches oder fehlendes Immunfluoreszenzsignal für RANKL oder DMP-1 resultiert meist aus einer Antikörperinaktivierung, unzureichender Permeabilisierung oder Überfixierung; frisches 4 %iges Formaldehyd und Einmalportionen von Antikörpern beheben dies. Kreuzreaktivitäten zwischen den Kanälen für RANKL und DMP-1 sollten ausgeschlossen werden, indem Bilder der sekundär-allein-Kontrollen vor der Auswertung überprüft werden.
Abbildung 1: Standardisierte Charakterisierung von Nanomaterialien und Validierung des Stammzellphänotyps. (A) XRD-Spektren zur Bestätigung der kristallinen Phase und strukturellen Integrität der Nanopartikel. (B) Repräsentative TEM-Aufnahmen zur Demonstration der nanoskaligen Partikelgröße, Morphologie und homogenen Dispersion der synthetisierten Biomaterialien; Vergleich zwischen NeoMTA2 und Hydroxylapatit. Niedrige Vergrößerungen sind dargestellt für (a) NeoMTA2 und (b) Hydroxylapatit, während hochauflösende Aufnahmen in (c) NeoMTA2 und (d) Hydroxylapatit gezeigt werden. Maßstabsbalken befinden sich in der unteren linken Ecke. (C) Durchflusszytometrisches Gating-Protokoll zur Charakterisierung von Stammzellen. Repräsentative mehrparametrige Punktdiagramme zeigen Zellen, die für CD44, CD73 (im Original als CD43 PE gekennzeichnet) und CD45 gefärbt wurden. Die CD44+ und CD73+ Teilpopulationen wurden entsprechend der CD45-Expression ausgewählt. Panel A und C sind überarbeitet nach Zaki et al.8 (CC BY-NC-SA), und Panel B ist überarbeitet nach Habib et al.10 (CC BY-NC). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2: Quantitative und semiquantitative Beurteilung der osteogenen Differenzierung mittels RANKL-Immunfluoreszenz. (A) Vertretende hochauflösende Immunfluoreszenzmikrografien, die die Expression der wichtigen osteogenen Proteinmarker RANKL innerhalb des 2D-Scaffold-Mikroumfelds zeigen: (a) Negative Kontrollzellen bilden kleine Kolonien mit schwacher, membranöser RANKL-Expression, während (b) positive Kontrollzellen eine erhöhte Anzahl osteoblastenähnlicher Kolonien mit dichter, homogener Expression aufweisen. Stammzellen, die mit (c) NHAP, (d) NHAP/Chitosan und (e) bioaktiven Glaskompositnanopartikeln behandelt wurden, zeigen eine fortgeschrittene Differenzierung, gekennzeichnet durch große, verschmolzene osteoblastenähnliche Kolonien mit intensiver, homogener RANKL-Lokalisation sowohl in der Membran als auch im Kern; modifiziert nach: Elshahat et al.4. (B) Balkendiagramme zur Darstellung der H-Score-Quantifizierung der RANKL-Expression in den verschiedenen Studien. Anwendung der H-Score-Methode zur Normalisierung von Immunfluoreszenzdaten. Durch die mathematische Kombination der visuellen Färbungsintensität (eingestuft von 0–3) mit dem Prozentsatz der positiv gefärbten Zellen wandelt der H-Score die qualitative Mikroskopie in eine robuste, semiquantitative Metrik um und reduziert damit signifikant subjektive Beobachterverzerrungen. (a) Vergleich von Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) und bioaktiven Glaskompositnanopartikeln (NBG; 500 µg/mL) gegenüber dem positiven osteogenen Medium-Kontrollansatz (OM-PC) und dem DMEM-Negativkontrollansatz (DMEM-NC). NBG zeigte das höchste Expressionsprofil (p < 0,001). Modifiziert nach Abdelaziz et al. 9 (CC BY-NC-ND 4.0). (b) Bewertung von nanohydroxyapatit (NHAP; 10 µg/mL), NHAP/Chitosan-Komposit (10 µg/mL) und NBG (500 µg/mL) im Vergleich zu den Kontrollen, wobei NHAP/Chitosan die höchsten H-Scores aufwies. Modifiziert nach Elshahat et al.4 (CC BY 4.0). (c) Untersuchung von Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) im Vergleich zu NHAP (10 µg/mL) und den Kontrollen, wobei eine signifikant erhöhte RANKL-Expression im Nano-NeoMTA nachgewiesen wurde; modifiziert nach: Zaki et al.8. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3: Repräsentative Immunfluoreszenzbilder und H-Score-Analyse. (A) Immunfluoreszenzmikroskopische Bewertung der Expression von Dentin-Matrix-Protein (DMP-1) in den experimentellen Gruppen; grüne Fluoreszenz zeigt eine positive Färbung mit polyklonalen anti-DMP-1-Antikörpern an. (a) Negativer Kontrollversuch: Menschliche dentalen Pulpastammzellen (hDPSCs) in undifferenziertem Medium (UM) zeigen geringe Zellaggregate mit schwacher, homogener DMP-1-Expression (+). (b) Positiver Kontrollversuch: hDPSCs in odontogenem Medium (OM) weisen eine Ausdehnung der Kolonien auf, die durch dichte, homogene DMP-1-Signale gekennzeichnet sind (++). (c) Nanohydroxylapatit (10 μg/mL) und (d) Nano-NeoMTA2 (9,92 μg/mL): Differenzierte hDPSCs bilden große, verschmolzene Kolonien odontoblastenähnlicher Zellen aus, die eine starke, homogene DMP-1-Expression zeigen, die an Membranen und Kernen lokalisiert ist. Vergrößerung: ×10. Gelbe Kreise markieren odontoblastenähnliche Kolonien; gelbe Pfeile zeigen intensive DMP-1-Expression an. (B) Balkendiagramm zur quantitativen Darstellung der H-Scores für die Expression des Dentin-Matrix-Proteins in den Untersuchungsgruppen. Zwischen den Gruppen ergab sich ein hochsignifikanter Unterschied, wobei der höchste H-Score in der Nano-NeoMTA2-Gruppe (169,33 ± 4,04) beobachtet wurde, gefolgt von Nanohydroxylapatit (140,33 ± 2,52) und der negativen Kontrolle (15,33 ± 1,53). Die Panels A und B wurden angepasst aus Habib et al.10 (CC BY-NC). Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
| Test / Parameter | Nanomaterial / Zelltyp | Vertretender Wert (Mittelwert ± SD) | Normalisierung | Quelle |
| Zellviabilität (MTT-Assay) | ||||
| MTT-Viabilität | Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) / SCAPs | ~196 % (OD = 1,56 ± 0,24) | Bezogen auf unbehandelte Kontrolle (DMEM-NC = 100 %) | Abdelaziz et al.⁹ |
| MTT-Viabilität | Chitosan-nHA (10 µg/mL) / SCAPs | ~99,97 % | Bezogen auf unbehandelte Kontrolle (DMEM-NC = 100 %) | Elshahat et al.⁴ |
| MTT-Viabilität — Positive Kontrolle | OM-PC / SCAPs | 113,46 % (OD = 0,93 ± 0,03) | Bezogen auf unbehandelte Kontrolle (DMEM-NC = 100 %) | Abdelaziz et al.⁹ |
| MTT-Viabilität — Negative Kontrolle | DMEM-NC / SCAPs | 100 % (OD = 0,82 ± 0,02) — Referenzbasiswert | DMEM-NC definiert als 100 % Referenz für alle Gruppen | Abdelaziz et al.⁹ |
| Alkalische Phosphatase (ALP)-Aktivität | ||||
| ALP-Aktivität | Biokompatible Glasnano-Partikel (500 µg/mL) / SCAPs | 69,86 ± 0,98 U/L | Bezogen auf Gesamtproteininhalt (U/mg Protein, Bradford/BCA-Assay) | Abdelaziz et al.⁹ |
| ALP-Aktivität — Positive Kontrolle | OM-PC / SCAPs | 77,68 ± 1,28 U/L | Bezogen auf Gesamtproteininhalt (U/mg Protein, Bradford/BCA-Assay) | Abdelaziz et al.⁹ |
| ALP-Aktivität — Negative Kontrolle | DMEM-NC / SCAPs | 55,81 ± 1,6 U/L | Bezogen auf Gesamtproteininhalt (U/mg Protein, Bradford/BCA-Assay) | Abdelaziz et al.⁹ |
| Sichere Materialkonzentration (EC₅₀) | ||||
| EC₅₀ (SCAPs) | Nano-NeoMTA2 / SCAPs | 7,9 µg/mL | Vierparameter-logistisches Modell (nichtlineare, sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurve, GraphPad Prism 9) | Zaki et al.⁸ |
| EC₅₀ (DPSCs) | Nano-NeoMTA2 / DPSCs | 9,92 µg/mL | Vierparameter-logistisches Modell (nichtlineare, sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurve, GraphPad Prism 9) | Habib et al.10 |
| H-Score — RANKL-Proteinausprägung (osteogener Marker) | ||||
| H-Score (RANKL) Osteogener Marker | Nano-NeoMTA2 (7,9 µg/mL) / SCAPs | 164 ± 4 (Skala 0–300) | Gesamtanzahl sichtbarer Zellen pro Feld (Phasenkontrastmikroskopie) | Zaki et al.⁸ |
| H-Score (RANKL) Osteogener Marker | nHA (10 µg/mL) / SCAPs | 68 ± 3 (Skala 0–300) | Gesamtanzahl sichtbarer Zellen pro Feld (Phasenkontrastmikroskopie) | Zaki et al.⁸ |
| H-Score (RANKL) Positive Kontrolle | OM-PC / SCAPs | 84 ± 1 (Skala 0–300) | Gesamtanzahl sichtbarer Zellen pro Feld (Phasenkontrastmikroskopie) | Zaki et al.⁸ |
| H-Score (RANKL) Negative Kontrolle | DMEM-NC / SCAPs | 18 ± 1 (Skala 0–300) | Gesamtanzahl sichtbarer Zellen pro Feld (Phasenkontrastmikroskopie) | Zaki et al.⁸ |
| H-Score — DMP-1-Proteinausprägung (odontogener Marker) | ||||
| H-Score (DMP-1) Odontogener Marker | Nano-NeoMTA2 (9,92 µg/mL) / DPSCs | 169,33 ± 4,04 (Skala 0–300) | Gesamtanzahl sichtbarer Zellen pro Feld (Phasenkontrastmikroskopie) | Habib et al.10 |
| H-Score (DMP-1) Odontogener Marker | nHA (10 µg/mL) / DPSCs | 140,33 ± 2,52 (Skala 0–300) | Gesamtanzahl sichtbarer Zellen pro Feld (Phasenkontrastmikroskopie) | Habib et al.10 |
| H-Score (DMP-1) Negative Kontrolle | DMEM-NC / DPSCs | 15,33 ± 1,53 (Skala 0–300) | Gesamtanzahl sichtbarer Zellen pro Feld (Phasenkontrastmikroskopie) | Habib et al.10 |
| H-Score (DMP-1) Odontogener Marker [Positive Kontrolle -OM-PC] | OM-PC / DPSCs | ~103 H-Score (Skala 0–300) | Gesamtanzahl der Zellen pro Feld (Phasenkontrastmikroskopie) | Habib et al. Eur Endod J, 202610 |
| H-Score = Σ(i × Pi): i = Färbungsintensität (1, 2 oder 3); Pi = Anteil der Zellen mit jeweiliger Intensität (0–100 %); Bereich 0–300. MTT-Viabilität ausgedrückt relativ zu DMEM-NC, definiert als 100 % Referenz. ALP-Aktivität ausgedrückt als U/L aus enzymatischer Dephosphorylierung von p-Nitrophenylphosphat; weiter normalisiert auf Gesamtproteininhalt (U/mg Protein). OM-PC = osteogenes/odontogenes Induktionsmedium (positive Kontrolle). DMEM-NC = Dulbecco’s modifiziertes Eagles Medium (negative Kontrolle). | ||||
Tabelle 1: Vertretende Ergebnisse aus dem standardisierten In-vitro-Evaluierungsworkflow. Vertretende quantitative Ergebnisse aus früher veröffentlichten Studien, die Zellproliferation, alkalische Phosphatase-Aktivität sowie Immunfluoreszenzanalysen zeigen, die mithilfe des standardisierten Protokolls durchgeführt wurden.
| Beobachtetes Problem | Mögliche Ursache | Empfohlene Lösung |
| Geringe Zellviabilität im MTT-Assay (OD < unbehandelte Kontrolle) | Nanomaterialkonzentration übersteigt EC₅₀, unzureichende UV-Sterilisation oder ungenügende Dispergierung der Nanopartikel. | EC₅₀-Bestimmung erneut durchführen (Abschnitt 4). UV-Sterilisation auf 30 min verlängern. Homogene Nanopartikelsuspension unmittelbar vor Gebrauch durch Ultraschallsonde (40 W, 30 s an/aus, 3 Zyklen bei 4 °C) überprüfen. |
| CV der MTT-Viabilität >15 % zwischen den Wiederholungen | Pipettierfehler, ungleichmäßige Zellansaat oder variable Inkubationszeit/-temperatur des MTT. | Kalibrierte Mehrkanalpipette für alle Zugaben verwenden. Ansatzdichte vor dem Ansäen mittels Hämozytometer bestätigen. Genaue 4-stündige Inkubation bei 37 °C in einem befeuchteten CO₂-Inkubator sicherstellen. Eine Leerprobe zur Hintergrundkorrektur einbeziehen. |
| Inkonsistente ALP-Absorptionswerte (CV >20 % zwischen den Wells) | Ungleichmäßige Zelldichte, unvollständige Zelllyse oder inkonsistente Pipettierung beim Substratzugabe. | Genau 1 × 10⁴ Zellen pro Well in 24-Well-Platten ansäen. Lysepuffer vor Gebrauch gründlich vortexen. Gleichmäßige Lyse-Inkubation sicherstellen (10 min, 4 °C, sanftes Schütteln). Hintergrundabsorption mit einer Probe ohne Zellen überprüfen. |
| Schwaches oder fehlendes RANKL-Immunfluoreszenzsignal (Schritt 5.4a) | Ausfall des Antikörpers durch unsachgemäße Lagerung, Überfixierung mit eingeschränkter Epitopzugänglichkeit oder unzureichende Permeabilisierung. | Frische 4 % Formaldehydlösung unmittelbar vor Gebrauch herstellen. Vor dem Blockieren 0,1 % Triton X-100 zur Permeabilisierung hinzufügen (10 min, RT). Primärantikörperlösung titrieren (Beginn bei 1:200). Eine Positivkontrolle aus Gewebeschnitt einbeziehen. Antikörperbestand aliquotieren, um wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden. |
| Schwaches oder fehlendes DMP-1-Immunfluoreszenzsignal (Schritt 5.4b) | Ausfall des Antikörpers durch Gefrier-Tau-Zyklen, suboptimale Verdünnung des Primärantikörpers oder inkompatible Wirtsart des Sekundärantikörpers. | Anti-DMP-1-Antikörper aliquotieren, um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden. Verdünnung titrieren, beginnend bei 1:200. Kompatibilität der Wirtsarten zwischen Primärantikörper (DMP-1) und Sekundärantikörper bestätigen. Einen Dentinschnitt als Positivkontrolle für DMP-1 einbeziehen. |
| Kreuzreaktivität zwischen RANKL- und DMP-1- Fluoreszenzkanälen | Spektrale Überlappung der Emissionsspektren, wenn derselbe Fluorochrom für beide Sekundärantikörper verwendet wird, oder unzureichende Kanaltrennung am Fluoreszenzmikroskop. | Für RANKL und DMP-1 spektral getrennte Fluorochrome in den Sekundärantikörpern verwenden (z. B. Alexa Fluor 488 für einen Marker, Alexa Fluor 594 für den anderen). Sekundärkontrollbilder für jeden Kanal unabhängig überprüfen, bevor die Auswertung erfolgt. RANKL- und DMP-1-Bilder getrennt mittels sequenzieller Aufnahmetechnik erfassen. |
| Hoher unspezifischer Hintergrund in der Immunfluoreszenzfärbung | Unzureichende Blockierung der Proteine, zu hohe Konzentration des Sekundärantikörpers oder ungenügende Waschschritte zwischen den Inkubationen. | Blockierinkubation auf 2 h bei RT verlängern. Verdünnung des Sekundärantikörpers auf 1:1000 erhöhen. Spezifität mit einer Kontrolle ohne Primärantikörper überprüfen. Alle PBS-Waschschritte vollständig durchführen (jeweils 3 × 5 min). |
| H-Score-Variabilität zwischen Beobachtern (Cohens Kappa <0,7, Schritt 5.6) | Inkonsistente Anwendung der vierstufigen Färbungsintensitätsskala (0, 1+, 2+, 3+) zwischen den Beobachtern oder unzureichende Kalibrierung vor der Auswertung. | Vor der formalen Auswertung eine gemeinsame Kalibriersitzung mit repräsentativen Trainingsbildern durchführen. Identische Bildanzeigeeinstellungen (Helligkeit, Kontrast) für alle Beobachter verwenden. Mindestens fünf Hochleistungs-Felder pro Well auswerten und Kappa nach jeweils 10 Feldern berechnen, um Drift zu überwachen. |
| EC₅₀-Kurve konvergiert nicht oder schlechte Anpassung (Schritt 4.1) | Unzureichende Datenpunkte, zu enger Konzentrationsbereich oder nicht erreichte homogene Suspension vor dem Ansäen. | Bereich der seriellen Verdünnung erweitern, sodass mindestens 6 Konzentrationen im Bereich von 50–1,56 µg/mL abgedeckt werden. Ultraschallsondierung unmittelbar vor jedem Verdünnungsschritt durchführen. Mit mindestens 3 unabhängigen biologischen Wiederholungen wiederholen. CV <15 % zwischen den Wiederholungen bestätigen. |
Tabelle 2: Kritische Parameter und Fehlerbehebung. Häufige technische Probleme, die während des Protokolls auftreten können, ihre möglichen Ursachen sowie empfohlene Lösungen zur Verbesserung der experimentellen Reproduzierbarkeit und Datenqualität. Abkürzungen: CV = Variationskoeffizient; RT = Raumtemperatur.
Diskussion
Zu den kritischen Schritten dieses Protokolls gehören die genaue Bestimmung der EC₅₀, die homogene Suspension von Nanomaterialien und die Normalisierung der Ergebnisse biologischer Assays. Die Berechnung der EC₅₀ mittels nichtlinearer Regression (vierparametriges logistisches Modell) liefert eine genauere Abschätzung der Dosis-Wirkungs-Beziehung als die lineare Interpolation und sollte bevorzugt werden, wenn ausreichend Datenpunkte verfügbar sind13,14. Es ist entscheidend, unmittelbar vor der Zellbehandlung durch Ultraschallsondierung eine homogene Nanopartikelsuspension sicherzustellen; schlecht dispergierte Suspensionen führen zu unzuverlässigen Dosis-Wirkungs-Kurven und verfälschen die EC₅₀-Bestimmung. Bei neuen Materialien wie NeoMTA2 ist das Mahlen auf die Nanoskala ein unverzichtbarer erster Schritt, da die Partikelgröße im Makrobereich die Oberflächenreaktivität und damit die anschließende biologische Aktivität erheblich verändert13,14. Wenn bei Konzentrationen, die als sicher erwartet werden, eine geringe Zellviabilität beobachtet wird, sollten die Forschenden das UV-Sterilisationsprotokoll überprüfen und die Mahl- und Dispersionsverfahren erneut bewerten, bevor der EC₅₀-Assay wiederholt wird10.
Eine zentrale Komponente dieses Protokolls ist die Verwendung zweier komplementärer Immunfluoreszenzmarker, die unterschiedliche, jedoch teilweise überlappende Differenzierungsweg beschreiben. Die Hochregulierung von RANKL auf osteoblastenähnlichen Zellen spiegelt calciumionengetriebene osteogene Signalwege wider und korreliert mit der Anzahl osteogener Zellen8,9, während die Expression von DMP-1 als spezifischer Indikator für die odontoblastenähnliche Differenzierung und dentinogene Aktivität dient und daher besonders relevant ist, wenn die Zielzellpopulation aus DPSCs besteht10. Durch die Quantifizierung beider Marker mittels der H-Score-Methode ermöglicht dieses Protokoll es Forschenden, die Zugehörigkeit zu osteogenen und dentogenen Linien innerhalb eines einzigen standardisierten Assaysystems voneinander abzugrenzen – ein Fortschritt gegenüber Ansätzen mit nur einem Marker, die nicht zwischen knochenbildender und zahnbildender Differenzierung unterscheiden können. Sowohl der RANKL- als auch der DMP-1-H-Score sollten in allen Veröffentlichungen angegeben werden, die dieses Protokoll verwenden, um die Vergleichbarkeit zwischen Studien zu gewährleisten. Forschende sollten spektral unterschiedliche Fluorochrome für die beiden sekundären Antikörper verwenden, um Kanalüberschneidungen zu vermeiden, und stets die Kontrollbilder mit nur sekundärem Antikörper überprüfen, bevor sie die Werte bestimmen.
Beim Anpassen dieses Protokolls an alternative Biomaterialien oder Zellmodelle sind möglicherweise mehrere methodische Modifikationen erforderlich. Bei stark lichtundurchlässigen oder gefärbten Gerüsten kann eine Interferenz mit der MTT-Absorption bei 570 nm eine alternative Vitalitätsbestimmung notwendig machen, beispielsweise mittels CellTiter-Glo (Lumineszenz) oder PrestoBlue (Resazurin-Reduktion), da diese weniger anfällig für optische Störungen durch Gerüstmaterialien sind. Forscher, die SCAPs anstelle von DPSCs verwenden, sollten beachten, dass SCAPs tendenziell eine stärkere RANKL-Expression aufweisen, was ihrer stärkeren osteogenen Differenzierung entspricht, während DPSCs eine ausgeprägtere DMP-1-Expression zeigen, was ihrer stärkeren odontogenen/dentinogenen Linienausrichtung entspricht. Die Passagezahl ist eine entscheidende Variable: Zellen nach Passage 6 sollten vermieden werden, da sie eine verminderte Differenzierungsfähigkeit und veränderte Expression von Oberflächenmarkern aufweisen können.
Zu den Einschränkungen dieses methodischen Ansatzes zählt ein kurzer Beobachtungszeitraum (72 h), der möglicherweise späte Mineralisierungsphasen nicht erfasst, die typischerweise 14–21 Tage erfordern. Die fehlende Validierung in vivo stellt eine bedeutende translationsmedizinische Lücke dar. Die Verwendung des H-Scores birgt potenzielle Beobachtervariabilität; die in Abschnitt 5.10 angegebene Inter-Observer-Reliabilität (Cohens Kappa) sollte in allen publizierten Ergebnissen angeführt werden.
Dieses Verfahren bietet mehrere Vorteile gegenüber bestehenden Einzelendpunkt-Ansätzen. Herkömmliche osteogene Assays stützen sich häufig ausschließlich auf Alizarinrot-Färbung oder ALP-Aktivität zu einem einzigen Zeitpunkt. Die Integration der MTT-Vitalitätsscreening, der Quantifizierung der ALP-Aktivität und der dualen Immunfluoreszenz-H-Score-Bewertung von RANKL und DMP-1 in einem einzigen Arbeitsablauf liefert ein mehrparametriges Ergebnis, das einen direkten statistischen Vergleich zwischen verschiedenen Gerüsttypen unter identischen experimentellen Bedingungen ermöglicht. Die beschriebenen Normalisierungsstrategien – ALP-Aktivität bezogen auf mg Protein, MTT-Ergebnisse als Prozentsatz der unbehandelten Kontrolle und H-Score normalisiert auf die Gesamtanzahl der Zellen pro Feld – eliminieren Störeinflüsse durch Variabilität zwischen den Wells4,8.
Zukünftige Studien könnten diese Methodik anwenden, um die Wirkungen von Biomaterialien auf entzündliche Marker, angiogene Reaktionen oder alternative Stammzellmodelle zu bewerten. Die Abfolge des Assays lässt sich ebenfalls auf 3D-Scaffold-Formate übertragen. Letztendlich wird die Übernahme dieses standardisierten Rahmenwerks durch unabhängige Labore aussagekräftige, meta-analytische Vergleiche der Scaffold-Leistung in der präklinischen regenerativen Zahnmedizin-Forschung ermöglichen15.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 24-Loch-Kulturplatten | Corning | 3527 | Wird für ALP-Assays verwendet |
| 96-Well-Platten | Corning | 3596 | Wird für ALP-Absorptionsmessungen und MTT-Assays verwendet |
| ALP-Assay-Kit | Abcam | ab83369 (oder gleichwertig) | Wird zur Messung der alkalischen Phosphatase-Aktivität verwendet |
| Puffer für ALP-Substrat (2-Amino-2-methyl-1-propanol) | Sigma-Aldrich | N/V | Wird verwendet, um die ALP-katalytische Reaktion einzuleiten |
| Ammoniumhydroxid (NH4OH) | N/V | N/V | Zur pH-Einstellung während der Synthese von nanoskaligem Hydroxylapatit verwendet. KORROSIV |
| Primärantikörper gegen Anti-DMP-1 | N/V | N/V | odontogener Marker; Verdünnung 1:200 im Blockpuffer; über Nacht bei 4 °C |
| Anti-human CD44-Antikörper (CD44-FITC) | Beckman Coulter | N/V | Wird für die Durchflusszytometrie verwendet; positiver Marker für mesenchymale Stammzellen |
| Anti-human CD45-Antikörper (CD45-PC5) | Beckman Coulter | N/V | Wird für die Durchflusszytometrie verwendet; hämatopoetisches Linien-Marker-negativ |
| Anti-human CD73-Antikörper (CD73-PE) | Beckman Coulter | N/V | Wird für die Durchflusszytometrie verwendet; positiver Marker für mesenchymale Stammzellen |
| Autoklav (hydrothermischer Reaktor) | Tuttnauer | N/V | Zur hydrothermalen Behandlung von nano-Hydroxylapatit verwendet bei 140 °C, 0,3 MPa |
| BCA-Protein-Assay-Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 (oder gleichwertig) | Wird zur Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration zur Normalisierung der ALP-Aktivität verwendet |
| CO2 Inkubator | Thermo Fisher Scientific | N/V | Einstellen auf 37 °C und 5 % CO2 für alle Zellkulturschritte |
| Kollagenase Typ I | Sigma-Aldrich | C0130 | Zur enzymatischen Verdauung von Zahngeweben während der Stammzellisolation verwendet |
| DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | Basis-Kulturmedium; wird auch als negative Kontrollgruppe verwendet |
| Fötales Kälberserum (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10270-106 | Zusatz für das komplette Kulturmedium; MSC-qualifiziertes FBS, verwendet für Differenzierungsmedium |
| Durchflusszytometer (Navios) | Beckman Coulter | Navios | Zur Immunphänotypisierung von Stammzellen verwendet |
| Software zur Durchflusszytometrie-Analyse (Navios) | Beckman Coulter | N/V | Zur Gating- und Datenanalyse von Durchflusszytometrie-Panels verwendet |
| Fluoreszenzmikroskop | Labomed / NY Microscope Company | 9126000 | Zur Immunfluoreszenz-Bildgebung und H-Score-Bewertung verwendet |
| Gefriertrockner (Lyophilisator) | Labconco | N/V | Zur Trocknung von Nanomaterialpräzipitaten verwendet −50 °C |
| Sekundärantikörper Ziege anti-Kaninchen IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | A-11034 | Fluoreszierender sekundärer Antikörper; Verdünnung 1:500; 1 h bei Raumtemperatur |
| Sekundärantikörper Ziege anti-Kaninchen IgG (Alexa Fluor 594) | Invitrogen (oder gleichwertig) | A-11012 (oder äquivalent) | Spektral unterschiedlicher sekundärer Antikörper für die DMP-1-Immunfluoreszenz bei Mehrfachfärbung |
| GraphPad Prism Software | GraphPad Software | Version 9 | Wird für die EC verwendet50 Berechnung und statistische Analyse |
| Hämozytometer | Neubauer | N/V | Wird für die manuelle Zellzählung und die Gesamtzellzahl zur H-Score-Normalisierung verwendet |
| Invertiertes Phasenkontrastmikroskop | Olympus | N/V | Zur täglichen Überwachung des Zellwachstums und der Zellmorphologie |
| Einbettmedium, Antifade (ProLong Gold) | Invitrogen | P36930 | Zur Deckglas-Aufbringung nach Immunfluoreszenz-Färbung verwendet |
| MTT-Reagenz | Invitrogen | M6494 | Wird zur Beurteilung der zellulären Stoffwechselaktivität verwendet; 0,5 mg/mL, 4 h bei 37 °C |
| Nanohydroxylapatit (NHAP) | Nanogate, Kairo, Ägypten | N/V | Durch Nassfällung synthetisiert oder kommerziell bezogen; verwendet bei 10 µg/mL |
| NeoMTA2-Pulver | NuSmile Ltd. / Avalon Biomed | N/V | Ausgangsmaterial für die Herstellung von Nano-NeoMTA2 durch Planettarballmühle |
| Normales Ziegenserum | N/V | N/V | Zur Blockierung (5 % in PBS) vor der Applikation des primären Antikörpers verwendet |
| Osteogenes/odontogenes Differenzierungsmedium | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | N/V | Positivkontrollmedium; enthält DMEM, FBS, Ascorbat, Beta-Glycerophosphat und Dexamethason |
| Paraformaldehyd (4 %) | Sigma-Aldrich | P6148 | Wird zur Zellfixierung vor der Immunfluoreszenz verwendet. GIFTIG — Verwendung im Abzug |
| PBS (phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,4) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10010-023 | Wird zum Waschen von Zellen, zur Verdünnung von Antikörpern und zur Suspension von Nanomaterialien verwendet |
| Penicillin-Streptomycin-Lösung | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | Antibiotikazusatz; wird im kompletten Kulturmedium zu 1 % verwendet |
| Planetenmühle | Retsch (oder gleichwertig) | PM 400 | Zur Nanozerkleinerung von NeoMTA2-Pulver; 350 U/min, 10 h |
| p-Nitrophenol-Standards | Sigma-Aldrich | N/V | Wird zur Erstellung der Standardkurve für die ALP-Aktivität verwendet |
| primärer Kaninchen-Antikörper gegen RANKL | Abcam | ab9957 | Osteogener Marker; 1:200 Verdünnung; über Nacht bei 4 °C |
| Rabbit-IgG-IgG-Isotypkontrollantikörper | N/V | Negativkontrolle für die Immunfluoreszenz; passende Konzentration des primären Antikörpers | |
| SDS-HCl-Lösung zur Solubilisierung | Sigma-Aldrich | N/V | Wird zum Lösen von MTT-Formazankristallen verwendet. KORROSIV |
| Sechswell-Gewebekulturplatten | Corning | 3516 | Zur Durchführung von Differenzierungsassays verwendet |
| Natriumhydroxid (NaOH), 0,5 M | Sigma-Aldrich (oder gleichwertig) | N/V | Wird verwendet, um die ALP-Reaktion vor der Absorbanzmessung zu stoppen; ÄTZEND |
| Sonicator (Stabsonde / Ultraschallbad) | Branson Ultrasonics | N/V | Wird zur Dispergierung von Nanopartikeln vor biologischen Assays verwendet |
| T-75-Kulturflaschen | Corning | 430641 | Zur Vermehrung von Stammzellen verwendet |
| TEOS (Tetraethylorthosilikat) | N/V | N/V | Silica-Vorläufer für die Sol-Gel-Synthese von 45S5 bioaktivem Glas. ENTFLAMMBAHR |
| Transmissionselektronenmikroskop | JEOL Ltd. | JEM-2100 | Zur Charakterisierung der Größe und Morphologie von Nanomaterialien |
| Triton X-100 (0,1 % in PBS) | N/V | N/V | Wird zur Zellpermeabilisierung vor der Immunfluoreszenz verwendet |
| Trypanblau-Lösung (0,4 %) | Sigma-Aldrich | T8154 | Wird zur Bestimmung der Zellviabilität verwendet |
| Röntgendiffraktometer (X'PERT-PRO) | PANalytical | X'PERT-PRO | Zur kristallographischen Analyse von Nanopartikeln verwendet |
Referenzen
- Sui B et al. Dental pulp stem cells: from discovery to clinical application. J Endod. 2020;46(9 Suppl):S46-S55. doi:10.1016/j.joen.2020.06.027.
- Zhang W, Yelick PC. Vital pulp therapy: current progress of dental pulp regeneration and revascularization. Int J Dent. 2010;2010:856087. doi:10.1155/2010/856087.
- Zhang W et al. The performance of human dental pulp stem cells on different three-dimensional scaffold materials. Biomaterials. 2006;27(33):5658-68. doi:10.1016/j.biomaterials.2006.07.013.
- Elshahat S, Elgendy AA, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using chitosan-coated nanohydroxyapatite and bioactive glass nanoparticles. Eur J Dent. 2024;18(2):665-71. doi:10.1055/s-0043-1777044.
- Huang M, Dissanayaka WL, Yiu CKY. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges and opportunities. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):626. doi:10.1186/S13287-025-04705-8.
- Tran N, Webster TJ. Nanotechnology for bone materials. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2009;1(3):336-51. doi:10.1002/wnan.23.
- Ding F, Guo S, Pan G. Emerging biomimetic materials with micro/nanostructure-dependent biological effects. Rev Mater Res. 2025;1(2):100040. doi:10.1016/j.revmat.2025.100040.
- Zaki NT, El-Helbawy M, Mahran AH, Elsewefy T. Effect of Neo-MTA and hydroxyapatite nanoparticles on proliferation and osteogenic differentiation of apical papilla stem cells (SCAPs) (in vitro study). J Pharm Negat Results. 2023;14. doi:10.47750/pnr.2023.14.02.344.
- Abdelaziz H, Mahran AH, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using nanoparticles of Neo MTA and bioactive glass. Saudi Dent J. 2024;36(1):134-39. doi:10.1016/j.sdentj.2023.10.018.
- Habib N, Elgendy A, Elsewify T, Yehia T. The effect of Nano-NeoMTA2 and nanohydroxyapatite on the human dental pulp stem cells odontogenic differentiation and proliferation. Eur Endod J. 2026;11(4):158-65. doi:10.65717/eej.2026.25165.
- Ferraz MP, Monteiro FJ, Manuel CM. Hydroxyapatite nanoparticles: a review of preparation methodologies. J Appl Biomater Biomech. 2004;2(2):74-80.
- Xu F, Li Y, Wang X, Wang J, Yang A. Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite/poly(vinyl alcohol) hydrogel biocomposite. J Mater Sci. 2004;39:5669-72. doi:10.1023/B:JMSC.0000040074.64787.b3.
- Tanomaru-Filho M et al. Biocompatibility and mineralized nodule formation of Neo MTA Plus and an experimental tricalcium silicate cement containing tantalum oxide. Int Endod J. 2017;50(Suppl 2):e31-e39. doi:10.1111/iej.12780.
- Rodríguez-Lozano FJ et al. Biomineralization potential and biological properties of a new tantalum oxide (Ta2O5)-containing calcium silicate cement. Clin Oral Investig. 2022;26(2):1427-41. doi:10.1007/s00784-021-04117-x.
- Okajcekova T et al. A comparative in vitro analysis of the osteogenic potential of human dental pulp stem cells using various differentiation conditions. Int J Mol Sci. 2020;21(7). doi:10.3390/ijms21072280.