Diese Studie untersucht die Expression von miR-21-5p, ihre Assoziation mit dem Zelladhäsionsmolekül 1 sowie ihre Beziehungen zur Migration, Proliferation, Expression entzündlicher Marker und Überlebensfähigkeit in Gewebeproben und Zelllinien von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs.
Forschungsartikel
Die miR-21-5p-Cell Adhesion Molecule 1-Achse bei der Progression und Prognose des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms
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11. September 2026
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es gibt Hinweise darauf, dass miR-21-5p ein wichtiger molekularer Regulator beim nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC) ist. Das Zelladhäsionsmolekül 1 (CADM1) ist ein potenzieller Tumorsuppressor, doch die regulatorische Beziehung zwischen miR-21-5p und CADM1 im Fortschreiten des NSCLC ist weiterhin unklar. Mit der quantitativen reversen Transkription-PCR (qRT-PCR) wurde die Expression von miR-21-5p und CADM1 in NSCLC-Geweben und -Zellen untersucht; die gezielte Bindung von miR-21-5p an CADM1 wurde mittels Doppelluciferase-Reportergen-Assay verifiziert; die Zellwanderungsfähigkeit wurde mit dem Transwell-Assay bestimmt; unter Einbeziehung der klinisch-pathologischen Daten und der Überlebensanalyse wurde die klinische Bedeutung von miR-21-5p untersucht; die Funktionsanreicherung der Zielgene von miR-21-5p wurde mittels Bioinformatik analysiert. Die Expression von miR-21-5p in NSCLC-Geweben war signifikant höher als in angrenzendem normalem Gewebe, und Patienten mit hoher miR-21-5p-Expression wiesen ein kürzeres Gesamtüberleben auf. Eine hohe Expression von miR-21-5p stellt einen unabhängigen Risikofaktor für das Überleben von NSCLC-Patienten dar; die Überexpression von miR-21-5p förderte die Zellmigration in NSCLC-Zellen und führte zu einer Hochregulation entzündlicher Faktoren; der Doppelluciferase-Reportergen-Assay bestätigte, dass miR-21-5p direkt CADM1 ansteuert; die Überexpression von CADM1 hemmte die Zellmigration in NSCLC-Zellen und bewirkte eine Herunterregulation entzündlicher Faktoren; bioinformatische Analysen zeigten, dass die Zielgene von miR-21-5p in mehreren Signalwegen angereichert sind, die mit Tumorentstehung und -entwicklung assoziiert sind. miR-21-5p fördert das Fortschreiten des NSCLC, indem es CADM1 gezielt ansteuert und hemmt, und könnte somit als prognostischer Biomarker und therapeutisches Ziel dienen.
Einleitung
Weltweit zählt Lungenkrebs zu den führenden Ursachen für krebsbedingte Todesfälle, wobei die Inzidenz stetig ansteigt1,2. Bei den Bevölkerungsgruppen Ostasiens liegen die Inzidenz und Mortalität von Lungenkrebs bei 222,1 bzw. 155,5 pro 100.000 Männer und bei 158,1 bzw. 87,3 pro 100.000 Frauen. Das nicht-kleinzellige Lungenkarzinom (NSCLC) macht etwa 80 % aller Lungenmalignome aus und umfasst drei wesentliche histologische Subtypen3. Im Vergleich zum hochaggressiven kleinzelligen Lungenkarzinom (SCLC) verläuft das NSCLC langsamer in Bezug auf Progression und Metastasierung; aufgrund unspezifischer früher klinischer Symptome erhalten jedoch über 75 % der Patienten die Diagnose erst im mittleren oder fortgeschrittenen Stadium, was zu einer nach wie vor schlechten Gesamtüberlebensrate über fünf Jahre beiträgt4. Die Entstehung von Lungenkrebs wird durch die onkogene Aktivierung und die Stilllegung von Tumorsuppressorgenen vorangetrieben5, was die dringende Notwendigkeit unterstreicht, die molekularen Grundlagen des NSCLC aufzuklären, um neuartige therapeutische Ansätze voranzutreiben6.
Mikro-RNAs (miRNAs, 18–25 Nukleotide lang) vermitteln die posttranskriptionelle Genrepression durch Bindung an die 3′-unübersetzte Region (3′-UTR) von Ziel-mRNAs, wodurch eine translationelle Unterdrückung oder mRNA-Abbau ausgelöst wird7. Die Biogenese von miRNAs beginnt mit der Transkription durch RNA-Polymerase II, die primäre miRNA-Transkripte erzeugt, die anschließend von RNase-III-Enzymen gespalten werden, um haarnadelartige prä-miRNAs (pre-miRNAs) zu bilden8. Während die meisten miRNAs die Genexpression über eine teilweise oder vollständige Sequenzkomplementarität zu mRNA-3′-UTRs hemmen, können bestimmte miRNAs unter spezifischen Zellzyklusbedingungen die mRNA-Translation fördern9. Bisher wurden Hunderte menschlicher miRNAs identifiziert, die zentrale biologische Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose steuern10. Früher war der Nachweis fehlerhaft exprimierter miRNAs technisch anspruchsvoll; das Aufkommen der Hochdurchsatzsequenzierung ermöglichte ein schnelles, unvoreingenommenes Profiling dysregulierter miRNAs in erkranktem Gewebe11. Hier konzentrieren wir uns auf miR-21-5p, eine der zuerst charakterisierten, von der RNA-Polymerase II transkribierten miRNAs, deren onkogene regulatorische Funktionen intensiv erforscht werden12.
miR-21-5p ist innerhalb eines Introns des TMEM49-Gens kodiert und wird konsequent bei mehreren menschlichen Malignitäten überexprimiert, einschließlich Speiseröhren-, kolorektalen und Lungenkrebs13. Vorhandene präklinische NSCLC-Daten bestätigen seine onkogene Aktivität: erhöhtes miR-21-5p beschleunigt Tumorzellproliferation, epithelial-mesenchymale Transition (EMT) und fernmetastatische Ausbreitung, indem es anti-onkogene Zielstrukturen wie PTEN und PDCD4 stilllegt14. Dennoch konzentriert sich die bisherige Forschung weitgehend auf die von miR-21 vermittelte apoptotische und proliferative Signalübertragung, und nur wenige Berichte untersuchen systematisch die regulatorische Achse miR-21-5p/CADM1 beim NSCLC15. Das Zelladhäsionsmolekül 1 (CADM1) ist ein gut etablierter Tumorsuppressor bei epithelialen Krebserkrankungen16; es erhält die interzelluläre Adhäsion aufrecht, um die Ablösung von Tumorzellen und deren metastatische Streuung zu verhindern, und seine Herunterregulation korreliert mit fortgeschrittenem Tumorstadium und schlechterer Überlebensrate in NSCLC-Patientenkohorten. Mechanistisch hemmt CADM1 außerdem die pro-tumorale nukleäre Faktor-kappa-B-(NF-κB)-entzündliche Signalübertragung, die durch die Induktion der Sekretion proinflammatorischer Zytokine und die Umgestaltung der Tumormikroumgebung die Metastasierung fördert17. Obwohl die onkogene Wirkung von miR-21-5p und die tumorsuppressiven Effekte von CADM1 jeweils separat dokumentiert sind, bestehen drei wesentliche Wissenslücken bezüglich der miR-21-5p/CADM1-Achse beim NSCLC: Erstens fehlt eine experimentelle Validierung der direkten Bindung und Repression von CADM1 durch miR-21-5p in Lungenkrebszellen; zweitens ist unklar, ob diese Achse maligne Phänotypen über nachgeschaltete entzündliche Signalwege antreibt; drittens wurde die prognostische Vorhersagekraft kombinierter Expressionsprofile von miR-21-5p/CADM1 in klinischen NSCLC-Proben bisher nicht untersucht.
Basierend auf diesen ungeklärten Fragen schlagen wir eine zentrale mechanistische Hypothese vor: Hochreguliertes miR-21-5p im NSCLC bindet direkt an die 3′-UTR von CADM1, um die Expression von CADM1 zu unterdrücken, wodurch die von CADM1 gehemmte metastatische inflammatorische Signalübertragung enthemmt wird, was die Migration des NSCLC beschleunigt und mit einer ungünstigeren klinischen Prognose einhergeht. Diese Studie verfolgt drei vorab definierte Forschungsziele: (1) Direkte molekulare Targeting von CADM1 durch miR-21-5p bestätigen und die Migration in A549- und H1299-NSCLC-Zelllinien bewerten; (2) Aufklären, ob die miR-21-5p/CADM1-Kaskade das metastatische Potenzial über die inflammatorische Signaltransduktion moduliert; (3) Den klinischen prognostischen Wert der Expressions-Signatur aus miR-21-5p/CADM1 bewerten, um neue diagnostische Biomarker und therapeutische Kandidaten für metastatischen NSCLC zu identifizieren.
Protokoll
Diese retrospektive Studie wurde vom Ethikkomitee des Krankenhauses für Traditionelle Chinesische Medizin in Quzhou geprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer 202402208). Von jedem eingeschlossenen Patienten oder einem gesetzlichen Vertreter wurde vor der Probensammlung schriftlich informierte Einwilligung eingeholt.
Probensammlung
Primäre NSCLC-Tumorgewebe wurden operativ von eingeschriebenen Patienten gewonnen, während die jeweils passenden angrenzenden gesunden Lungenproben retrospektiv aus dem National Engineering Research Center for Clinical Biopsy (Quzhou City, Zhejiang Province, China) bezogen wurden. In diese Kohortenstudie wurden insgesamt 157 konsekutiv eingeschriebene NSCLC-Patientenproben eingeschlossen, die zwischen Januar 2019 und Dezember 2024 gesammelt wurden. Die Stichprobengröße von 157 gepaarten Proben war statistisch begründet, basierend auf zuvor veröffentlichter Forschung zu miRNA-basierten Prognosefaktoren beim NSCLC: Unter Annahme einer moderaten Effektgröße von 0,5, α = 0,05 und einer statistischen Teststärke von 80 % ergab sich eine minimal erforderliche Stichprobengröße von 122 Fällen. Unter Berücksichtigung möglicher Probenverluste, schwerer Gewebenekrosen und Patienten, die dem Follow-up nicht mehr zur Verfügung standen, wurden konsekutiv 157 geeignete Patienten von Januar 2019 bis Dezember 2024 eingeschlossen, um eine ausreichende statistische Power sicherzustellen. Sowohl die Tumorproben als auch die jeweils passenden angrenzenden gesunden Lungenproben stammten vom selben Patienten und wurden während der chirurgischen Resektion gewonnen, wodurch gepaarte Proben für nachfolgende vergleichende Analysen entstanden.
Die Einschlusskriterien waren: (1) Patienten, bei denen mittels postoperativer Biopsie eine primäre NSCLC histologisch bestätigt wurde; (2) vollständige klinische Basisdaten, histopathologische Stadieneinteilung und Langzeit-Follow-up-Daten zur Überlebensrate; (3) keine vorherige Strahlentherapie, Chemotherapie oder zielgerichtete Therapie vor der Gewebeprobeentnahme; (4) vollständige gepaarte Tumor- und parakarzinomatöse Gewebeproben vorhanden.
Ausschlusskriterien waren: (1) Kombinierte sekundäre maligne Tumoren anderer Organe; (2) Patienten, die innerhalb von 3 Monaten nach der Operation für die Nachuntersuchung verloren gingen; (3) Proben mit schwerer Nekrose oder unzureichendem Gewebevolumen für die anschließende molekulare Detektion.
Alle frischen Gewebeproben wurden innerhalb von 15 Minuten nach der chirurgischen Resektion in flüssigem Stickstoff eingefroren, in einen Ultratiefkühler überführt und bei −80 °C zur RNA- und Proteinisolierung gelagert. Die klinische Nachbeobachtung erfolgte regelmäßig, und die Gesamtüberlebenszeit wurde in Monaten ab dem Zeitpunkt der pathologischen Diagnose bis zum Tod oder bis zum letzten Nachbeobachtungszeitpunkt erfasst.
Stratifizierung der miR-21-5p-Expressionshöhe
Die relativen Expressionswerte von miR-21-5p aller 157 Patienten wurden in aufsteigender Reihenfolge sortiert, und die Kohorte wurde anhand der medianen Expressionsschwelle unterteilt. Aufgrund mehrfacher gebundener Werte um den Median herum wurden Patienten mit einer Expression unterhalb des Medians der Gruppe mit niedriger Expression zugewiesen (n = 61); Patienten mit einer Expression gleich oder größer als der Median, einschließlich aller gebundenen Beobachtungen am Median, wurden der Gruppe mit hoher Expression zugeordnet (n = 96). Diese Regel zur Zuweisung gebundener Werte wurde vor der Gruppierung festgelegt, um doppelte Medianwerte eindeutig zuzuordnen, und das Gruppierungsergebnis wurde anhand der rohen qRT-PCR-Quantifizierungsdaten überprüft.
Zellkultur
Die humanen NSCLC-Zelllinien A549 und H1299 wurden von einem kommerziellen Anbieter bezogen (siehe Tabelle der Materialien). A549-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium kultiviert, H1299-Zellen in DMEM. Beide Zellkulturmedien wurden mit 10 % hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (FBS), Penicillin (100 U/mL) und Streptomycin (100 µg/mL) angereichert. Die Zellen wurden unter Standardbedingungen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ kultiviert.
Die Authentifizierung der Identität der A549- und H1299-Zelllinien erfolgte mittels Kurzsequenzrepetitions-(STR-)Profilanalyse vor allen funktionellen Experimenten. Die Testung auf Mykoplasmenkontamination wurde monatlich mit einem kommerziellen, PCR-basierten Nachweiskit für Mykoplasmen durchgeführt, und nur mykoplasmenfreie Zellen wurden für nachfolgende Assays verwendet.
Zellen in der logischen Wachstumsphase mit intakter Morphologie wurden zur transienten Transfektion gewonnen. Ein lipidbasiertes Transfektionsreagenz (siehe Tabelle der Materialien) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Nachfolgende zelluläre Assays wurden 50 h nach der Transfektion durchgeführt.
Transfektion von Zellen
Zur Transfektion wurden Zellen in der logischen Wachstumsphase mit intakter Morphologie 24 h im Voraus in Kulturschalen ausgesät, um eine Konfluenz von 60 %–70 % zu erreichen. Die Transfektion wurde mit einem lipidbasierten Transfektionsreagenz (siehe Tabelle der Materialien) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Vier experimentelle Gruppen wurden verwendet: Mimic-Negativkontrolle (mimic-NC), miR-21-5p-Mimic, Inhibitor-Negativkontrolle (inhibitor-NC) und miR-21-5p-Inhibitor. Die Nukleotidsequenzen sind in Zusatzdatei 1 angegeben.
Die Gesamt-RNA wurde 50 h nach der Transfektion extrahiert, und eine quantitative Reverse-Transkriptase-PCR (qRT-PCR) wurde durchgeführt, um die relative Expression von miR-21-5p zu messen und die Transfektionseffizienz zu überprüfen. Zellwanderungsassays wurden 50 h nach der Transfektion durchgeführt. Bei der transienten Transfektion wurden die Zellen mit dem miR-21-5p-Mimetikum oder einem Mimetikum-Negativkontrolle (mimic-NC) bei einer Endkonzentration von 50 nM behandelt, während der miR-21-5p-Inhibitor und der Inhibitor-Negativkontrolle (inhibitor-NC) bei 100 nM zugegeben wurden. Um störende Effekte aufgrund von Unterschieden in der Nukleinsäurezugabe auszuschließen, wurde die Gesamtmenge an transfizierter Nukleinsäure in allen vier Behandlungsgruppen identisch gehalten.
Die Zellproliferation wurde mithilfe des Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-Assays bewertet. Stabil transfizierte Zellen wurden in 96-Well-Platten mit 3 × 103 Zellen/Well ausgesät, wobei für jede Gruppe sechs technische Wiederholungen angelegt wurden. Nach 24, 48 und 72 Stunden wurden 10 µL CCK-8-Reagenz zu jedem Well hinzugefügt und anschließend 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Zellproliferation wurde durch Messung der Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenreader quantifiziert.
Alle Transienttransfektionen, CCK-8- und Migrationsversuche wurden mit nicht weniger als drei unabhängigen biologischen Wiederholungen durchgeführt, wobei jede biologische Wiederholung 3–6 technische Wiederholungen enthielt, wie oben beschrieben.
Quantitative Reverse-Transkriptions-PCR
Gesamt-RNA aus NSCLC-Zellen sowie gepaarten klinischen Tumor- und angrenzenden Normalgeweben wurde mit einem auf Phenol/Guanidin basierenden RNA-Extraktionsreagenz isoliert (siehe Tabelle der Materialien). Reinheit und Konzentration der RNA wurden mittels UV-Spektrophotometrie bestimmt; nur Proben mit einem Absorptionsverhältnis (OD) 260/280 und OD 260/230 im Bereich von 1,8–2,1 wurden der Reverse Transkription unterzogen. Die Primersequenzen sind in Zusatzdatei 1 angegeben. Das Reverse-Transkriptions-System enthielt 500 ng Gesamt-RNA, 2 µL Reverse-Transkriptionspuffer, 1 µL dNTP-Gemisch, 0,5 µL Reverse Transkriptase, 1 µL spezifischen Stamm-Schleife-Primer für miRNA oder Oligo(dT)-Primer für mRNA sowie RNase-freies Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 20 µL. Das qRT-PCR-Amplifikationssystem (Gesamtvolumen 20 µL) bestand aus 10 µL SYBR-Green-qPCR-Mastermix, 0,4 µL Vorwärtsprimer (10 µM), 0,4 µL Rückwärtsprimer (10 µM), 2 µL verdünnter cDNA-Vorlage und 7,2 µL RNase-freiem Wasser.
mRNA für CADM1 und GAPDH wurde mit einem Reverse-Transkriptionskit revers transkribiert, während miR-21-5p mit Stem-Loop-Primern und dem exogenen cel-miR-39 als Spike-in-Kontrolle revers transkribiert wurde. Der exogene cel-miR-39-Spike-in wurde unmittelbar nach der Gesamt-RNA-Isolierung und vor der Reverse Transkription zu jeder RNA-Probe hinzugefügt. Als synthetisches C. elegans-Mikro-RNA-Molekül ohne homologe Sequenz in menschlichen Transkripten kann cel-miR-39 die Abweichungen korrigieren, die durch unterschiedliche RNA-Extraktions-Effizienz, RNA-Abbauloss und Variationen der Effizienz der Reverse Transkription in verschiedenen klinischen Gewebeproben entstehen, und dient somit als exogene universelle Normalisierungskontrolle für die miRNA-Quantifizierung. Die qRT-PCR wurde mit einer Master-Mix-Lösung auf Basis eines fluoreszierenden DNA-Bindungs-Farbstoffs in einem Echtzeit-PCR-System durchgeführt (siehe Tabelle der Materialien): 95 °C für 3 min, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 10 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 20 s, jeweils mit Schmelzkurvenanalyse zur Bestätigung spezifischer Amplifikation. Jede Probe umfasste drei biologische Replikate mit jeweils drei technischen Replikaten, und die relative Expression wurde nach der 2⁻ΔΔCt-Methode berechnet. Die vollständigen Primersequenzen für die Amplifikation von CRP-, TNF-α- und IL-6-mRNA sind in Zusatzdatei 1 zusammen mit den Primersequenzen für CADM1, GAPDH und miR-21-5p enthalten.
Herstellung einer lentiviral vermittelten stabilen Expression von miR-21-5p
Kommerzielle lentivirale Vektoren LV-miR-21-5p und leeren Kontrollvektor LV-NC wurden in 293T-Zellen verpackt. Die Vorläufersequenz von miR-21-5p wurde in ein lentivirales Grundgerüst eingefügt, das eine Puromycin-Resistenz und Reporter-Gene für GFP trägt. Lentivirale Überstände wurden 48 h und 72 h nach der Transfektion gesammelt, angereichert und zur Zellinfektion gereinigt.
A549- und H1299-Zellen wurden 24 h vor der Infektion ausgesät, um eine Konfluenz von 50–60 % zu erreichen. Die Zellen wurden mit einem Multiplikationsfaktor (MOI) von 10 (A549) bzw. 15 (H1299) und 5 µg/mL Polybrene infiziert, um die Transfektionseffizienz zu verbessern. Das Medium wurde 24 h nach der Infektion erneuert, und die Zellen wurden weitere 48 h kultiviert, bevor die Puromycin-Selektion durchgeführt wurde.
Die stabile Zellselektion wurde mit 5 µg/mL Puromycin über 10 aufeinanderfolgende Tage durchgeführt; nicht infizierte Leerkontrollzellen wurden verwendet, um die vollständige Eliminierung nicht transduzierter Zellen innerhalb von 7 Tagen zu überprüfen. Einzelne GFP-positive Klone wurden isoliert und expandiert, um stabile monoklonale Zelllinien LV-21 und LV-NC zu erzeugen.
Für CADM1-Rettungsassays wurden kommerzielle LV-CADM1-Überexpression und sh-CADM1-Knockdown-Lentiviren hergestellt. Es wurden vier experimentelle Gruppen eingerichtet: LV-NC, LV-miR-21-5p, LV-CADM1 und die LV-miR-21-5p + LV-CADM1-Rettungsgruppe. CADM1-Lentiviren wurden mit derselben MOI und unter denselben Puromycin-Selektionsbedingungen infiziert wie die miR-21-5p-Vektoren. Alle Proliferations- und Migrations-Rettungsexperimente wurden mit drei unabhängigen biologischen Wiederholungen durchgeführt.
Überprüfung der stabilen Überexpression von miR-21-5p
Gesamt-RNA wurde aus geernteten LV-21- und LV-NC-stabilen Zellklonen extrahiert. Eine qRT-PCR wurde durchgeführt, um die relative Expressionsmenge von hsa-miR-21-5p unter Verwendung von cel-miR-39 als exogenem Referenzgen zu bestimmen. Zellklone mit einer mehr als 8-fachen Hochregulation von miR-21-5p im Vergleich zur LV-NC-Gruppe wurden für alle nachfolgenden Funktionsanalysen verwendet, wodurch die erfolgreiche Erzeugung von stabil miR-21-5p-überexprimierenden Zelllinien bestätigt wurde.
Dual-Luciferase-Reporter-Assay
Es wurden ein Wildtyp-CADM1-3'-UTR-Reporterplasmid (WT-CADM1) mit der vorhergesagten miR-21-5p-Bindungssequenz sowie ein mutiertes CADM1-3'-UTR-Reporterplasmid (MUT-CADM1) mit einer mutierten Bindungs-Seed-Region konstruiert. A549-Zellen wurden 24 h vor der Transfektion in 24-Well-Platten ausgesät, um eine Konfluenz von 60–70 % zu erreichen. Jedes Well wurde gemeinsam mit 500 ng WT/MUT-Reporterplasmid, 50 nM miR-21-5p-Mimetikum oder Mimetikum-NC und einem Renilla-Luciferase-Innenstandardplasmid in einem festen Massenverhältnis transfiziert. Nach einer 48-stündigen Inkubation post Transfektion wurden die Zellen vollständig lysiert, und die Lumineszenzsignale von Firefly- und Renilla-Luciferase wurden nacheinander mit einem Dual-Luciferase-Nachweiskit detektiert. Die relative Luciferase-Aktivität wurde als Verhältnis des Firefly-Lumineszenzwerts zum Renilla-Lumineszenzwert berechnet. Jede experimentelle Gruppe umfasste drei unabhängige biologische Wiederholungen, jeweils mit drei technischen Wiederholungen pro biologischer Wiederholung; zum statistischen Vergleich der relativen Luciferase-Aktivität zwischen der Mimetikum-NC- und der miR-21-5p-Mimetikum-Gruppe wurde ein zweigruppiger unabhängiger Stichproben-t-Test verwendet.
Transwell-Migrationsassay
Für den Transwell-Migrationsassay wurden stabil transfizierte Zellen in serumfreiem Medium suspendiert und in die oberen Einsätze mit 4 × 104 Zellen pro Bohrung gegeben. Die unteren Kammern wurden mit vollständigem Kulturmedium, das mit 10 % FBS ergänzt war, gefüllt, um einen chemotaktischen Gradienten zu erzeugen. Nach einer Inkubation für 48 h bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ wurden die auf der oberen Membranfläche verbliebenen Zellen vorsichtig entfernt. Die Zellen, die auf die Unterseite der Membran migriert waren, wurden mit Methanol fixiert und mit Kristallviolett angefärbt. Die Migration wurde durch Zählen der Zellen in fünf zufällig ausgewählten mikroskopischen Feldern pro Einsatz quantifiziert. Jedes Experiment wurde mit drei unabhängigen biologischen Wiederholungen durchgeführt, wobei für jede biologische Wiederholung drei technische Wiederholungen eingeschlossen wurden.
Statistische Analysen
Alle in vitro-Experimente wurden mit mindestens drei unabhängigen biologischen Wiederholungen durchgeführt, wobei jeweils entsprechende technische Wiederholungen durchgeführt wurden. Die Datenverteilung wurde zunächst mit dem Shapiro-Wilk-Normalitätstest überprüft, um die Wahl der statistischen Analysemethoden zu leiten. Für paarige Vergleiche zwischen Tumor- und angrenzendem Normalgewebe wurde entweder der gepaarte t-Test oder der gepaarte Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test angewandt, abhängig von der Datenverteilung. Vergleiche zwischen zwei unabhängigen Gruppen wurden entweder mit dem unabhängigen t-Test oder dem Mann-Whitney-U-Test analysiert. Unterschiede zwischen mehreren Gruppen, einschließlich Rescue-Experimenten, wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließender Bonferroni-Korrektur für post-hoc-Vergleiche bewertet, während wiederholte Messungen (repeated-measures ANOVA) zur Analyse longitudinaler Datensätze wie der CCK-8-Proliferations- und Wundheilungs-Assays verwendet wurden. Zusammenhänge zwischen kategorialen klinischen Variablen wurden mit dem χ2-Test untersucht, und die Beziehung zwischen der Expression von miR-21-5p und CADM1 wurde mittels Pearsons Korrelationsanalyse bewertet. Die Überlebenszeit der Patienten wurde anhand von Kaplan-Meier-Kurven analysiert, wobei die Vergleiche mit dem Log-Rank-Test durchgeführt wurden. Unabhängige prognostische Faktoren wurden mittels univariater und multivariater Cox-Regression mit proportionalen Hazards ermittelt. Statistische Signifikanz wurde als P < 0,05 definiert. Die multivariate Cox-Regression wurde für Alter, Geschlecht, histologischen Typ, miR-21-5p-Spiegel und Lymphknotenstatus adjustiert (Referenz: Alter ≤ 60, weiblich, Plattenepithelkarzinom, niedriger miR-21-5p-Spiegel, lymphknotennegativ); die proportionalen Hazards-Annahme wurde anhand der Schoenfeld-Residuen überprüft, und Variablen mit einem univariaten P-Wert < 0,10 wurden mittels Enter-Verfahren in das Modell aufgenommen.
Ergebnisse
Korrelation zwischen der Expression von miR-21-5p und den klinisch-pathologischen Merkmalen von NSCLC-Patienten
Insgesamt 157 NSCLC-Tumorproben wurden basierend auf dem medianen miR-21-5p-Spiegel in eine Gruppe mit niedriger miR-21-5p-Expression (n = 61) und eine Gruppe mit hoher Expression (n = 96) eingeteilt. Chi-Quadrat-Analysen ergaben keine signifikanten Zusammenhänge zwischen der miR-21-5p-Expression und dem Alter der Patienten (χ2 = 1,36, P = 0,2435), dem Geschlecht (χ2 = 1,06, P = 0,3032), dem histologischen Typ (χ2 = 1,09, P = 0,2965) oder der Tumorgröße (χ2 = 5,623, P = 0,0601). Dagegen war eine hohe miR-21-5p-Expression signifikant mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium (χ2 = 16,25, P = 0,00006), positiver lymphatischer Metastasierung (χ2 = 12,17, P = 0,00049) und einem höheren T-Stadium (χ2 = 4,30, P = 0,117) assoziiert, was darauf hindeutet, dass miR-21-5p onkogene Effekte entfaltet, die die Progression des NSCLC fördern (Tabelle 1).
Multivariable Cox-Regression-Analyse der proportionalen Hazardraten für unabhängige prognostische Faktoren von NSCLC
Die multivariable Cox-Regression-Analyse unter Einbeziehung von Alter, Geschlecht, histologischem Typ, miR-21-5p-Expression und lymphatischer Metastasierung zeigte, dass eine hohe miR-21-5p-Expression (Hazard-Ratio [HR] = 3,066; 95 %-Konfidenzintervall [KI]: 1,412–6,659; P = 0,005) und eine positive lymphatische Metastasierung (HR = 22,295; 95 %-KI: 3,039–163,588; P = 0,002) unabhängige ungünstige prognostische Risikofaktoren für ein schlechtes Gesamtüberleben von NSCLC-Patienten darstellen, während Alter, Geschlecht und histologischer Subtyp keine signifikanten unabhängigen prognostischen Auswirkungen hatten (alle P > 0,05) (Tabelle 2).
Klinische Expressionsmerkmale von miR-21-5p und ihre Korrelation mit CADM1 und entzündungsfördernden Faktoren
Die mittels qRT-PCR durchgeführte Analyse gepaarter NSCLC-Tumorgewebe und angrenzender normaler Gewebe zeigte signifikant erhöhte relative miR-21-5p-Spiegel in Tumorgeweben im Vergleich zu normalen Kontrollen (Abbildung 1A, P < 0,001). Kaplan-Meier-Überlebenskurven zeigten, dass Patienten mit hoher miR-21-5p-Expression ein signifikant schlechteres Gesamtüberleben aufwiesen als Patienten mit niedriger miR-21-5p-Expression (Abbildung 1B, P = 0,0027). Die mRNA-Mengen der entzündungsfördernden Mediatoren C-reaktives Protein (CRP), Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und Interleukin-6 (IL-6) waren in NSCLC-Proben alle deutlich erhöht (Abbildung 1C, P < 0,01, P < 0,001). Die Pearson-Korrelationsanalyse ergab eine stark signifikante negative Korrelation zwischen der Expression von miR-21-5p und CADM1-mRNA in klinischen Proben (r = -0,7773, 95 % KI: -0,8325 bis -0,7076, P < 0,0001, Abbildung 1D).
Zelluläre funktionelle Validierung von miR-21-5p in NSCLC-Zellen
Die qRT-PCR bestätigte die erfolgreiche Transfektionseffizienz des miR-21-5p-Mimikons in A549- und H1299-Zellen (Abbildung 2A). Transwell-Assays zeigten, dass die Überexpression von miR-21-5p die relative Migrationskapazität und die Anzahl migrierender Zellen in beiden Zelllinien signifikant erhöhte (Abbildung 2B,C). Die qRT-PCR-Analyse entzündungsfördernder Zytokine ergab deutlich erhöhte mRNA-Spiegel von CRP, TNF-α und IL-6 nach Transfektion mit dem miR-21-5p-Mimikon, während die Behandlung mit dem miR-21-5p-Inhibitor diese Hochregulation umkehrte (Abbildung 2D). Wiederherstellungs-Experimente bestätigten, dass das miR-21-5p-Mimikon die Transkription von CADM1 stark hemmte und die gleichzeitige Transfektion mit LV-CADM1 die mRNA-Expression von CADM1 in A549- und H1299-Zellen vollständig wiederherstellte (Abbildung 2E,F). Insgesamt zeigten diese zellulären Daten, dass miR-21-5p die Migration von NSCLC-Zellen und die entzündliche Antwort durch die Unterdrückung von CADM1 fördert.
Wirkung von miR-21-5p auf die Proliferation von NSCLC-Zellen
Die CCK-8-Proliferationskurven nach 24 h, 48 h und 72 h zeigten, dass die Transfektion mit dem miR-21-5p-Mimetikum die Extinktion bei 450 nm in beiden Zelllinien A549 und H1299 deutlich erhöhte, während der miR-21-5p-Inhibitor die Zellviabilität signifikant unterdrückte, wobei statistisch signifikante Unterschiede nach 72 h beobachtet wurden (Abbildung 3A,B; P < 0,001). Diese Ergebnisse zeigten, dass miR-21-5p eine proliferationsfördernde Wirkung auf NSCLC-Zellen ausübt.
Validierung von CADM1 als direktem Zielgen von miR-21-5p mittels bioinformatischer Vorhersage und Dual-Luciferase-Reporter-Assay
Drei Online-Datenbanken zur Vorhersage von miRNA-Zielgenen (miRWalk, StarBase, TargetScan) wurden kombiniert, um potenzielle downstream Gene von miR-21-5p zu identifizieren, wobei 95 überlappende Zielgene ermittelt wurden (Abbildung 4A). Die Gene Ontology (GO)-Anreicherungsanalyse zeigte, dass diese Kandidatengene hauptsächlich in biologischen Prozessen, zellulären Komponenten und molekularen Funktionen angereichert waren, die mit Zellstoffwechsel, Stressantwort und Transkriptionsregulation assoziiert sind (Abbildung 4B). Die Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-Pfadwege-Anreicherungsanalyse ergab darüber hinaus eine deutliche Anreicherung in tumorassoziierten Signalwegen, darunter die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPK)- und Ras-Signalwege (Abbildung 4C). Der Dual-Luciferase-Reporter-Assay zeigte, dass ein miR-21-5p-Mimetikum die relative Luciferase-Aktivität des Wildtyp-CADM1-3'-UTR-Reporters signifikant supprimierte, während in der Gruppe mit mutiertem CADM1-3'-UTR keine inhibitorische Wirkung beobachtet wurde (Abbildung 4D, P < 0,01, ns: nicht signifikant), was die direkte Bindung zwischen miR-21-5p und CADM1 bestätigt.
Förderung maligner Phänotypen des NSCLC durch Unterdrückung von CADM1 in Rettungsexperimenten
Die qRT-PCR bestätigte die Transfektionseffizienz des miR-21-5p-Mimikons und Inhibitors in A549- und H1299-Zellen (Abbildung 5A). Die Überexpression von CADM1 (LV-CADM1) verringerte die mRNA-Spiegel der proinflammatorischen Faktoren CRP, TNF-α und IL-6, während die Knockdown-Behandlung von CADM1 mittels small interfering RNA (si-CADM1) deren Expression deutlich erhöhte (Abbildung 5B). Transwell-Migrationsassays zeigten, dass die Transfektion mit LV-CADM1 die Migrationskapazität beider NSCLC-Zelllinien signifikant hemmte (Abbildung 5C,D). Die CCK-8-Proliferationsanalyse zeigte zudem, dass der durch LV-21 vermittelte proliferationsfördernde Effekt durch eine gleichzeitige Transfektion mit LV-CADM1 vollständig kompensiert wurde, während die durch si-CADM1 induzierte Beschleunigung des Zellwachstums durch den miR-21-5p-Inhibitor wiederhergestellt werden konnte (Abbildung 5E,F). Insgesamt bestätigten diese Rettungsdaten, dass CADM1 als funktioneller downstream-Mediator verantwortlich ist für die von miR-21-5p ausgelöste Proliferation, Migration und inflammatorische Aktivierung im NSCLC.
VERFÜGBARKEIT VON DATEN:
Die Quelldaten, die die Ergebnisse dieser Studie unterstützen, sind in Zusatzdatei 2 enthalten und stehen zusammen mit dem veröffentlichten Artikel zur Verfügung.
Abbildung 1: Expressionsprofile von miR-21-5p, entzündlichen Faktoren und deren Korrelation mit CADM1 in klinischen NSCLC-Proben. (A) Relative Expression von miR-21-5p in normalem Lungengewebe und NSCLC-Tumorgewebe. (B) Kaplan-Meier-Gesamtüberlebenskurven von NSCLC-Patienten, stratifiziert nach dem Expressionsniveau von miR-21-5p. (C) Relative mRNA-Expression der entzündlichen Faktoren CRP, TNF-α und IL-6 in normalem und NSCLC-Gewebe. (D) Streudiagramm nach Pearson mit negativer linearer Korrelation zwischen der Expression von miR-21-5p und CADM1-mRNA. **P < 0,01, ***P < 0,001. Für Panel C: Statistische Vergleiche wurden jeweils zwischen gepaarten Tumorgeweben und angrenzendem Normalgewebe für CRP, TNF-α und IL-6 durchgeführt; **P < 0,01, ***P < 0,001 kennzeichnen signifikante Unterschiede gegenüber dem jeweils zugehörigen normalen Lungengewebe. Alle Panels enthalten ≥3 unabhängige biologische Wiederholungen; qRT-PCR-Daten zeigen Mittelwert ± Standardabweichung; für den intergruppellen Vergleich wurde der gepaarte t-Test verwendet; für die Korrelationsanalyse im Streudiagramm wurde der Pearson-Test angewendet. Abkürzungen: CADM1 = Zelladhäsionsmolekül 1; CI = Konfidenzintervall; CRP = C-reaktives Protein; IL-6 = Interleukin-6; NSCLC = nicht-kleinzelliger Lungenkrebs; TNF-α = Tumornekrosefaktor alpha. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 2: Zelluläre Phänotypen und CADM1-Expression, die durch miR-21-5p in A549- und H1299-NSCLC-Zellen reguliert werden. (A) qRT-PCR-Nachweis der miR-21-5p-Expression nach Transfektion mit dem Mimetikum. (B) Statistische Quantifizierung der relativen Zellmigration aus Transwell-Assays. (C) Quantifizierung der Anzahl migrierter Zellen pro mikroskopischem Feld. (D) Relative mRNA-Expression von CRP, TNF-α und IL-6 bei Überexpression oder Hemmung von miR-21-5p. (E) Relative CADM1-mRNA-Expression in den A549-Rettungsgruppen (NC, miR-21-5p-Mimetikum, LV-CADM1, Mimetikum+LV-CADM1). (F) Relative CADM1-mRNA-Expression in den H1299-Rettungsgruppen. **P < 0,01, ***P < 0,001. Alle zellulären Assays wurden dreimal mit jeweils drei technischen Wiederholungen in drei unabhängigen biologischen Wiederholungen durchgeführt; die Fehlerbalken repräsentieren Mittelwert ± SD; für den Vergleich zwischen Gruppen wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Korrektur verwendet; die Gruppenbezeichnungen entsprechen genau den in der Methodik beschriebenen Transfektionsgruppen. Abkürzungen: CADM1 = Zelladhäsionsmolekül 1; CRP = C-reaktives Protein; IL-6 = Interleukin-6; LV = lentiviraler Vektor; NC = negativer Kontroll; NSCLC = nicht-kleinzelliger Lungenkrebs; qRT-PCR = quantitative reverse Transkriptions-PCR; TNF-α = Tumornekrosefaktor alpha. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 3: CCK-8-Proliferationskurven, die die Zellviabilität nach Überexpression oder Herunterregulation von miR-21-5p widerspiegeln. (A) Zeitabhängige OD₄₅₀-Absorptionskurven von A549-Zellen, die mit mimic-NC, miR-21-5p-Mimetikum, inhibitor-NC oder miR-21-5p-Inhibitor transfiziert wurden. (B) Zeitabhängige OD₄₅₀-Absorptionskurven von H1299-Zellen in den vier Transfektionsgruppen. ***P < 0,001. Die CCK-8-Assays enthielten sechs technische Wiederholungen pro Gruppe über 3 biologische Wiederholungen hinweg; die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt; für den Vergleich der Zeitpunkte wurde eine ANOVA mit wiederholten Messungen verwendet. Abkürzungen: CCK-8 = Cell Counting Kit-8; NC = negativer Kontroll; OD = optische Dichte. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
Abbildung 4Bioinformatische Screening- und Dual-Luciferase-Assay zur Identifizierung von Zielgenen für miR-21-5p CADM1. (AVenn-Diagramm, das die gemeinsamen Zielgene von miR-21-5p zeigt, die von den Vorhersagedatenbanken miRWalk, StarBase und TargetScan identifiziert wurden.B) Blasendiagramm der GO-Funktionsanreicherungsanalyse für die überschneidenden Zielgene. (CBalkendiagramm der am stärksten angereicherten KEGG-Signalwege.DDuales-Luciferase-Reporteraktivität von Wildtyp und Mutante CADM1 3'-UTR nach Überexpression von miR-21-5p. **P < 0,01; ns, keine Signifikanz. Panel D nimmt nur WT- anCADM1 3'-UTR und MUT-CADM1 3'-UTR ko-transfiziert mit miR-21-5p-Mimetikum/Mimetikum-NC zur Dual-Luciferase-Detektion; die in den Rohdatenplots als Control/Überexpression/Interferenz gekennzeichneten Beschriftungen wurden in den endgültigen Abbildungen auf die standardmäßige WT/MUT-Einteilung angepasst. Die Zielvorhersageanalyse verwendete drei Online-Datenbanken; die Anreicherungs-P-Werte wurden mittels Benjamini-Hochberg-FDR-Korrektur adjustiert; die Dual-Luciferase-Experimente umfassten drei biologische Wiederholungen (jeweils mit drei technischen Wiederholungen); die Fehlerbalken repräsentieren Mittelwert ± SD; zwei-Gruppen t-Test zur statistischen Vergleichung. Abkürzungen: CADM1 = Zelladhärenzmolekül 1; GO = Genontologie; KEGG = Kyoto Enzyklopädie der Gene und Genome; MUT = Mutante; NC = negativer Kontrolle; ns = nicht signifikant; UTR = nicht übersetzte Region; WT = Wildtyp Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Funktionsrestitutionsexperimente zur Bestätigung der regulatorischen Achse miR-21-5p/CADM1 in A549- und H1299-Zellen. (A) Relative Expression von miR-21-5p nach Transfektion mit Mimetikum oder Inhibitor. (B) Relative mRNA-Expression von CRP, TNF-α und IL-6 in den Gruppen LV-CADM1 und si-CADM1. (C) Statistische Quantifizierung der relativen Migrationsfähigkeit unter CADM1-Überexpression. (D) Quantifizierung der Anzahl migrierter Zellen pro mikroskopischem Feld in den LV-CADM1-Gruppen. (E) CCK-8-OD₄₅₀-Werte der A549-Rettungsgruppen (LV-NC, LV-21, LV-CADM1, LV-21+LV-CADM1, si-NC, si-CADM1, si-CADM1+miR-21-Inhibitor). (F) CCK-8-OD₄₅₀-Werte der H1299-Rettungsgruppen mit identischen Transfektionsbedingungen. **P < 0,01, ***P < 0,001. Alle Rettungsassays enthielten drei unabhängige biologische Wiederholungen; Fehlerbalken zeigen Mittelwert ± SD, einfaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Post-hoc-Test für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen. Abkürzungen: CADM1 = Zelladhäsionsmolekül 1; CRP = C-reaktives Protein; IL-6 = Interleukin-6; LV = lentiviraler Vektor; NC = negativer Kontroll; OD = optische Dichte; qRT-PCR = quantitative revers-transkriptive PCR; si = small interfering RNA; TNF-α = Tumornekrosefaktor alpha. Bitte klicken Sie hier, um eine vergrößerte Version dieser Abbildung anzusehen.
| miR-21-5p-Expression | Gesamt | x2 | P-Wert | |||
| Niedrig | Hoch | |||||
| Alter (Jahre) | ≤60 | 24 | 29 | 53 | 1,357 | 0,244 |
| ˃60 | 37 | 67 | 104 | |||
| Gesamt | 61 | 96 | 157 | |||
| Geschlecht | Männlich | 42 | 73 | 115 | 1,06 | 0,3032 |
| Weiblich | 19 | 23 | 42 | |||
| Gesamt | 61 | 96 | 157 | |||
| Histologischer Typ | Plattenepithelkarzinom | 31 | 41 | 72 | 1,09 | 0,2965 |
| Adenokarzinom | 30 | 55 | 85 | |||
| Gesamt | 61 | 96 | 157 | |||
| Tumorglättung | Ⅰ-Ⅱ | 55 | 58 | 113 | 16,25 | 0,00006 |
| Ⅲ | 6 | 38 | 44 | |||
| Gesamt | 61 | 96 | 157 | |||
| Lymphknotenmetastase | Negativ | 41 | 37 | 78 | 12,17 | 0,00049 |
| Positiv | 20 | 59 | 79 | |||
| Gesamt | 61 | 96 | 157 | |||
| Tumorgröße (cm) | ≤3 | 20 | 23 | 43 | 5,623 | 0,0601 |
| 3–7 | 40 | 62 | 102 | |||
| ˃7 | 1 | 11 | 12 | |||
| Gesamt | 61 | 96 | 157 | |||
| T-Stadium | T1 | 15 | 17 | 32 | 4,295 | 0,117 |
| T2 | 36 | 52 | 88 | |||
| T3 | 10 | 27 | 37 | |||
| Gesamt | 61 | 96 | 157 | |||
Tabelle 1: Zusammenhang zwischen der Expression von miR-21-5p und den klinisch-pathologischen Merkmalen bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom. Die Werte geben die Anzahl der Patienten an. Die Zusammenhänge wurden mittels des χ2-Tests bewertet. Abkürzung: NSCLC = nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom. Jeder χ2-Test wurde für kategoriale klinisch-pathologische Variablen durchgeführt; alle Analysen umfassten die vollständige Stichprobe von 157 Patienten.
| n | P-Wert | Relatives Risiko | 95 % Konfidenzintervall | |||
| Untere Grenze | Obere Grenze | |||||
| Alter (Jahre) | ≤60 | 53 | 0.503 | 1.282 | 0.62 | 2.652 |
| ˃60 | 104 | |||||
| Geschlecht | Männlich | 115 | 0.339 | 1.418 | 0.693 | 2.901 |
| Weiblich | 42 | |||||
| Histologischer Typ | Plattenepithelkarzinom | 72 | 0.515 | 1.261 | 0.627 | 2.537 |
| Adenokarzinom | 85 | |||||
| miR-21-5p-Expression | Hoch | 96 | 0.005 | 3.066 | 1.412 | 6.659 |
| Niedrig | 61 | |||||
| Lymphknotenmetastase | Negativ | 78 | 0.002 | 22.295 | 3.039 | 163.588 |
| Positiv | 79 | |||||
Tabelle 2: Multivariable Cox-Regression mit proportionalen Hazards zur Gesamtüberlebensanalyse bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom. Die Werte entsprechen Hazard-Ratios mit 95 % Konfidenzintervallen. Abkürzungen: CI = Konfidenzintervall; NSCLC = nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom. Die multivariable Cox-Regression wurde anhand vollständiger klinischer Kohortendaten durchgeführt, HR und 95 % CI wurden für die unabhängige prognostische Screening-Analyse berechnet.
Zusatzdatei 1: Oligonukleotid- und Primersequenzen, die für die Transfektion und die quantitative reversen Transkriptions-PCR verwendet wurden. Die Datei enthält den miR-21-5p-Mimetikum und -Inhibitor, ihre jeweiligen negativen Kontrollen sowie Primer für CADM1, GAPDH, hsa-miR-21-5p und cel-miR-39. Alle Sequenzen sind in 5′–3′-Richtung angegeben. Abkürzungen: CADM1 = Zelladhäsionsmolekül 1; cel = Caenorhabditis elegans; GAPDH = Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase; hsa = Homo sapiens; miR = microRNA; PCR = Polymerase-Kettenreaktion. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Zusatzdatei 2. Quelldaten zur Unterstützung der Abbildungen. Diese Datei enthält die zugrundeliegenden Datensätze und statistischen Analysen, die zur Erstellung der in der Arbeit dargestellten Abbildungen verwendet wurden, einschließlich der klinischen Merkmale, Expressionsanalysen, Überlebensdaten und zugehörigen statistischen Ergebnisse. Diese Quelldaten stützen die in dem Haupttext berichteten Ergebnisse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Diskussion
Diese Studie bestätigte systematisch eine erhöhte Expression von miR-21-5p in klinischen NSCLC-Geweben, die mit einer verstärkten Transkription inflammatorischer Faktoren sowie einer stärkeren Zellmigration und Proliferationskapazität korrelierte; Dual-Luciferase-, qRT-PCR- und Rescue-Experimente identifizierten CADM1 als direktes funktionelles Target, und bioinformatische Vorhersagen zeigten zudem, dass die downstream-Ziele von miR-21-5p in den onkogenen Kaskaden MAPK und Ras angereichert sind, was erste Hinweise darauf liefert, dass die miR-21-5p/CADM1-Achse an tumorassoziierten Signalwegen der malignen Progression beteiligt sein könnte.
Die Analyse der klinischen Kohorte zeigte, dass ein hoher miR-21-5p-Expression eng mit einem fortgeschrittenen Tumorstadium, einer Lymphknotenmetastasierung und einer kürzeren Gesamtüberlebenszeit assoziiert war. Die multivariate Cox-Regression bestätigte miR-21-5p als unabhängigen ungünstigen prognostischen Faktor, was darauf hindeutet, dass miR-21-5p als potenzieller Biomarker zur Beurteilung des Progressionsrisikos und des Überlebensausfalls bei NSCLC-Patienten dienen könnte.
In-vitro-Funktionsassays zeigten, dass die Überexpression von miR-21-5p die Proliferation, Migration und entzündliche Reaktion von NSCLC-Zellen förderte, während die Hochregulation von CADM1 alle diese onkogenen Phänotypen umkehrte; eine negative Expressionskorrelation zwischen miR-21-5p und CADM1 in Patientenproben sowie Rescue-Zelldaten erläuterten vollständig den regulatorischen Mechanismus, durch den miR-21-5p das maligne Verhalten von NSCLC über die direkte Hemmung von CADM1 antreibt.
In Übereinstimmung mit früheren Studien, die die onkogene Rolle von miR-21-5p beim Lungenkarzinom beschreiben, ergänzt diese Arbeit die intakten klinischen Korrelationsdaten und vollständige Rescue-Validierungen, um die tumorfördernde Funktion zu untermauern; im Gegensatz zu bestehenden Untersuchungen, die sich nur auf ein einzelnes Metastasenphänotyp konzentrieren, verknüpft die vorliegende Studie miR-21-5p gleichzeitig mit der Zellproliferation und der tumorassoziierten entzündlichen Mikroumgebung über das Zielgen CADM1 und erweitert damit das regulatorische Netzwerk von miR-21-5p beim NSCLC.
Basierend auf den oben genannten vorläufigen Ergebnissen besitzt der Nachweis der Gewebeexpression von miR-21-5p ein potenzielles unterstützendes Wert für die Risikostratifizierung und die prognostische Beurteilung von NSCLC, und die miR-21-5p/CADM1-Achse könnte neuartige molekulare Zielstrukturen für die Entwicklung von Anti-Progressions-Interventionsstrategien bei NSCLC liefern, obwohl ihre klinische therapeutische Wirksamkeit noch zu überprüfen bleibt.
Diese Studie weist mehrere Einschränkungen auf. Sie verwendete in vitro-Zelltests und eine einzelne retrospektive klinische Kohorte, ohne in vivo-Xenotransplantate oder eine unabhängige externe Kohortenvalidierung. Zusätzliche Proliferationsassays (z. B. EdU- und Koloniebildungsassays), sowie Untersuchungen zur Invasion, Apoptose und zum Zellzyklus wurden nicht durchgeführt. Auch eine Testung von peripherem Blut auf nichtinvasives diagnostisches Potenzial, die Validierung auf CADM1-Proteinebene, die vollständige Liste überlappender Zielgene und eine systematische Analyse des Protein-Protein-Interaktions-(PPI-)Netzwerks standen nicht zur Verfügung. Künftige Arbeiten sollten diese Einschränkungen berücksichtigen und weitere Untersuchungen zu den upstream regulierenden Faktoren von miR-21-5p sowie zur downstream CADM1-Signalübertragung durchführen.
Insgesamt liefert diese Arbeit erste Hinweise darauf, dass miR-21-5p als onkogenes Mikro-RNA wirkt, das das Wachstum, die Migration und die Entzündungsreaktion von NSCLC beschleunigt, indem es direkt CADM1 targetiert, und dessen hohe Expression ein ungünstiges Überleben der Patienten vorhersagt.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine relevanten finanziellen oder nichtfinanziellen Interessen offenzulegen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10 % neutral gepuffertes Formalin | Fisher Scientific (Fisherbrand)™) | SF100-4 (typisch) | Gewebefixierungsmittel; Gewebe geschnitten auf &<5 mm Dicke, bei Raumtemperatur 14–26 Stunden fixiert |
| 24-Loch-Zellkulturplatte | Corning | 3526 | Platte zum Aussäen transfizierter Zellen und Durchführen des Wundheilungs-(Scratch-)Assays |
| A549-Zelllinie | ATCC (oder Shanghai Resource Center) | CCL-185 | Menschliche nicht-kleinzellige Lungenkarzinom-Zelllinie (Adenokarzinom) |
| CCK-8-Assay-Kit | Dojindo | CK04 | Nachweis der Proliferation |
| Zellkulturmedium (nicht spezifiziert) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | Verschiedene (z. B. RPMI-1640: 11875093, F-12K: 21127022) | Basales Medium für NSCLC-Zelllinien; die genaue Zusammensetzung hängt von der verwendeten Zelllinie ab |
| cel-miR-39 (exogene Spike-in-Kontrolle) | GenePharma (Shanghai, China) | Benutzerdefiniert (z. B. B010302) | Externe Referenz zur Normalisierung der miRNA-Expression, hinzugefügt während der RNA-Isolierung |
| CO2 Brutschrank (befeuchtet) | Thermo Fisher Scientific (Heracell) | Heracell 150i (50116047) | Bietet 37°C, 5 % CO₂2und gesättigte Luftfeuchtigkeit für die Zellkultur |
| CRP/TNF-α/IL-6-Primerpaare | Sangon Biotech | kundenspezifische Synthese | Vollständige Sequenzen in der Zusatzdatei 1 |
| Kristallviolett-Färbungslösung | Solarbio | G1062 | Färbung migrierter Zellen |
| DMEM-Medium | Gibco | 11965092 | Für die Kultur von H1299/293T |
| Dual-Luciferase-Reporter-Assay-Kit | Promega | E1910 | WT/MUT CADM1 3'UTR-Nachweis |
| Exogenes cel-miR-39 | Qiagen | benutzerdefinierter Spike-in | Nach der RNA-Isolierung zur Normalisierung hinzugefügt |
| Fötales Kälberserum (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10437028 | Zusatz, der dem Kulturmedium in einer Endkonzentration von 10 % zugesetzt wird, um das Zellwachstum zu unterstützen |
| Feine Pipettenspitze (z. B., 10 µL Spitze | Axygen (Corning) | T-300 | Wird verwendet, um manuell eine Zellschicht abzukratzen, um eine "Wunde" Spalt |
| GAPDH (endogene Kontrolle) | Mehrere Anbieter (z. B. Sangon Biotech, RiboBio; kundenspezifische Primer) | Benutzerdefiniert | Referenzgen für die mRNA-Normalisierung, verwendet in der qRT-PCR |
| GO/KEGG (clusterProfiler-Anmerkung) | Bioconductor | 2026-Aufbau | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v9.5.1 | Darstellung & in vitro-Statistik |
| H1299-Zelllinie | ATCC (oder Shanghai Resource Center) | CRL-5803 | Humanes nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (NSCLC), Zelllinie aus Lymphknotenmetastase |
| durch Hitzedinaktivierung behandeltes FBS | Gibco | 10099141 | 10 % Arbeitskonzentration |
| HEK-293T-Zelllinie | ATCC | CRL-3216 | RRID:CVCL_0063; STR monatlich getestet, Mykoplasmanachweis negativ |
| Lentivirus-Verpackungsmix | Genecopoeia (oder Takara Bio) | HPK-LvT-100 (Genecopoeia) | Stellt Verpackungsplasmide (gag/pol, rev, vsv-g) für die Lentivirus-Produktion bereit |
| Lentivirus-21-Vektor (LV-21) | GeneChem (Shanghai, China) oder Genecopoeia | Benutzerdefiniert | Lentiviraler Vektor mit miR-21-5p zur Herstellung stabiler exprimierender Zelllinien |
| Lentivirus-NC-Vektor (LV-NC) | GeneChem (Shanghai, China) oder Genecopoeia | Benutzerdefiniert | Negativer Kontroll-Lentiviralvektor ohne miR-21-5p-Insert |
| Lipid-Transfektionsreagenz | Thermo Fisher | L3000015 | Für die transiente Transfektion |
| Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | L3000015 oder L3000008 | Lipidbasiertes Transfektionsreagenz; 50 Stunden nach der Transfektion für nachfolgende Experimente |
| Methanol | Sinopharm | 67-56-1 | Fixierung von Zellen |
| Methanol (Fixierungslösung/Färbelösungsverdünnung) | Sigma-Aldrich | 34860 | Als Fixiermittel oder Verdünnungsmittel für die Kristallviolett-Färbung verwendet |
| miR-21-5p-Inhibitor/Inhibitor-NC | GenePharma | kundenspezifische Synthese | Sequenzen in der Zusatzdatei 1 |
| miR-21-5p-Mimetikum/Mimetikum-NC | GenePharma | kundenspezifische Synthese | Sequenzen in der Zusatzdatei 1 |
| miRDB | Washington University | v6.0 | |
| miRWalk | Universität Heidelberg | v3.0 | |
| Nationales Biopsie-Engineering-Zentrum | Nationales Biopsie-Engineering-Zentrum (China) | N/V | Institutionelle Bereitstellung von Lungenkrebs-Gewebeproben mit dokumentierten klinischen Daten und histopathologischer Diagnose |
| NSCLC-Gewebe (für Primärkultur) | Shanghai Rui Bao He Biotechnology Co. | Individuelle Bestellung | Gewebesorte; kultiviert in Medium mit 10 % FBS 37°C; Zellen mit guter Morphologie in der logarithmischen Wachstumsphase zur Transfektion ausgewählt |
| PCR-Instrument | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | 7500 Fast (4406984) | Amplifikationsprodukte für die qRT-PCR erhalten |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin |
| Pipetten (Einzel-) & Mehrkanal | Eppendorf | Reihe Research Plus | Für eine präzise Flüssigkeitshandhabung in allen Experimenten |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Endgültig 5 μg/mL für die Lentivirus-Infektion |
| Puromycin | InvivoGen | Ameise-pr-1 | 5 μg/mL für die stabile Zellselektion |
| Puromycin-Dihydrochlorid | Thermo Fisher Scientific (InvivoGen) | ant-pr-1 (InvivoGen); P7255 (Sigma-Aldrich) | Selektionsantibiotikum, verwendet bei 5 μg/mL zur Herstellung stabil transfizierter Zelllinien |
| R | R Foundation | v4.2.1 | Paket: clusterProfiler, ggplot2 |
| Reverse-Transkriptionskit | Takara | RR047 | Stamm-Schleife-RT für miRNA, Oligo(dT) für mRNA |
| RNase-freie EP-Röhrchen | Axygen (Corning) | MCT-150-C | 1,5-mL-RNase-freie Röhrchen zur RNA-Lagerung und -Aufarbeitung |
| RPMI-1640-Medium | Gibco | 11875093 | Für die Kultur von A549-Zellen |
| si-CADM1 | GenePharma | kundenspezifische Synthese | Sequenzen in der Zusatzdatei 1 |
| si-NC | GenePharma | kundenspezifische Synthese | Sequenzen in der Zusatzdatei 1 |
| SPSS | IBM | v26.0 | Klinische Cox-Regressionanalyse |
| SYBR Green qPCR-Mastermix | Roche | 4913914001 | qRT-PCR-Amplifikation |
| TargetScan | MIT | v8.2 | |
| Reagenz zur Gesamt-RNA-Extraktion | Takara | 9109 | Phenol/Guanidin-basierte Lyse |
| Transwell-Kammer | Corning (Costar) | 3422 (24-Loch, 8.0 µm) | Für die Zelltransfektion im Medium bei Raumtemperatur; chemische Primer werden hinzugefügt und 48 h inkubiert |
| Transwell-Migrationskammern | Corning | 3422 | 8 μm Porengröße |
| TRIzol-Reagenz | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 15596026 | Extraktion von Gesamt-RNA aus Gewebeproben; Bewertung der RNA-Qualität anhand der OD260/280- und OD260/230-Verhältnisse |
| Trypsin-EDTA (0,25 %) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 25200072 | Zum Lösen der Zellen aus Kulturgefäßen vor der Aussaat in 24-Well-Platten |
Referenzen
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