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Methodenartikel

Eine neuartige Biopsiemethode im Maßstab zur Sammlung bösartiger und nicht-bösartiger Lymphozyten von Zebrafischen

190 Aufrufe

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DOI:

10.3791/72153

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7. August 2026

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1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Division of Pediatric Hematology-Oncology, Department of Pediatrics, Stephenson Cancer Center, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine neuartige Biopsiemethode ermöglicht die Sammlung akuter lymphoblastischer Leukämiezellen aus lebenden Zebrafischen. Die Ergebnisse zeigen reichlich Lymphozyten in Wildtyp-(WT) Fischschuppen und einen dramatisch erhöhten Lymphozytenanteil in Schuppen von Fischen mit ALL (akute lymphoblastische Leukämie). Diese Technik ermöglicht eine minimalinvasive Untersuchung von epidermalen, normalen und bösartigen Lymphozyten.

Zusammenfassung

Zebrafische (Danio rerio) sind ein leistungsstarkes Modell zur Untersuchung von Lymphopoese und lymphoiden Krebs, da Zebrafische und Menschen ähnliche adaptive Immunsysteme teilen, einschließlich B- und T-Zellen. Mehrere D. rerio T-Zell-Modelle der akuten lymphoblastischen Leukämie (T-ALL) sind beschrieben, darunter Fische, die lymphoblast-spezifisches humanes MYC (hMYC) exprimieren. Wir berichteten, dass rag2:hMYC-Fische auch eine B-zellige akute lymphoblastische Leukämie (B-ALL) entwickeln, was sie nützlich macht, um beide ALLE Typen zu untersuchen. Eine Einschränkung der Zebrafisch-ALL-Modelle ist, dass es keine nicht-tödlichen Methoden für die serielle Beprobung von ALL gibt. Um dem entgegenzuwirken, haben wir eine neuartige "Skalenbiopsie"-Methode entwickelt, um ALLE Zellen von lebenden Zebrafischen zu entnehmen. Allerdings ist das Wissen darüber, welche Lymphozyten in normalen Zebrafischschuppen vorkommen, begrenzt. Um normale epidermale Lymphozytenidentitäten zu definieren, führten wir Skalenbiopsien an lymphozyteng-markierten transgenen Linien ohne rag2:hMYC durch. Wir verwendeten konventionelle und konfokale Mikroskopie, um die Skalen zu analysieren und zeigten reichlich epidermale Lymphozyten. Wir analysierten außerdem Schuppen von Fischen mit T- und B-ALL, die in vielen Schuppen eine deutlich erhöhte Lymphozytenzahl in zusammenführenden Schichten von ALL-Zellen zeigten. Anschließend verwendeten wir fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um nicht bösartige und ALLE Lymphozyten von Skalen für ex-vivo-Studien zu reinigen. Flowzytometrische und expressionsbezogene Analysen ALLER Zellen aus Schuppen oder anderen Geweben desselben Fisches zeigten, dass die Skalen-ALLE Zellen-Genexpressionen der von ALLEN Zellen anderswo ähnelten. Wir quantifizierten außerdem die Anzahl der normalen T-, B-, T-ALL- und B-ALL-Zellen, die pro Skala gereinigt werden konnten. Insgesamt bietet die Schuppenbiopsie eine nicht-tödliche, minimalinvasive Technik zur Untersuchung von zebrafischen epidermalen Lymphozyten und ermöglicht Ex-vivo-Studien , einschließlich Analysen bösartiger Proben.

Einleitung

Die Barrierefunktion und die Rolle der Haut von Säugetieren im Immunsystem sind nachgewiesen 1,2,3. Säugetierlymphozyten tragen zur kutanen Immunität bei, wobei zytotoxische T-Zellen in der Epidermis und B-, T- sowie natürliche Killerzellen (NK) in der Dermis 1,3,4,5 vorhanden sind. Zebrafische besitzen diese Lymphozyten mit Oberflächenimmunglobulinen, T-Zell-Rezeptoren, Major Histocompatibility Complex (MHC)-Rezeptoren, Zytokinen und deren Rezeptoren sowie anderen Immunmolekülen, und teilen somit die meisten immunologischen Merkmaleder Säugetiere 6,7,8,9. Jüngste Studien an Zebrafisch-Haut und Schuppen zeigten verschiedene kutane Lymphozytenpopulationen, darunter epitheliale T- und B-Zellen10,11 sowie ein lymphoides Netzwerk, das den T-Zell-Transport unddie Antigenüberwachung ermöglicht. Ähnlichkeiten zwischen Lymphozyten von Teleostfischen und Säugetieren machen D. rerio zu einem leistungsstarken in-vivo-Modell zur Untersuchung der Lymphopoiese, der Funktion der Lymphozyten und lymphoider Erkrankungen, einschließlich akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL)8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.

Unsere früheren Arbeiten zeigten, dass T- und B-Linien ALL (T-ALL, B-ALL) beide bei transgenen rag2:hMYC-Zebrafischen vorkommen, was diese Linie nützlich macht, um beide ALL-Typen13, 15, 21, 22 zu untersuchen. Eine wesentliche Einschränkung der D. rerio ALL-Modelle, insbesondere in Studien zur Längsexpression oder bei Medikamententests, ist das Fehlen von Methoden zur Entnahme serieller ALL-Proben von einzelnen Tieren. Frühere Methoden, wie die retro-orbitale Blutentnahme, sind technisch anspruchsvoll aufgrund der geringen Größe von D. rerio, was die serielle Blutentnahmeerschwert. Daher euthanadieren die meisten Forscher Zebrafische, um ALLE Zellen zu erhalten. Dies ist im Labor und in den meisten Bereichen gängige Praxis, schließt jedoch die Durchführung von Längsversuchen an lebenden Tieren aus. Um dies zu überwinden, beschrieben wir kürzlich epitheliale T- und B-Lymphozyten in Zebrafischschuppen, die mit einer nicht-lethalen SchuppenbiopsieStrategie 10 gesammelt wurden. Eine weitere aktuelle Studie zeigte ein T-Zell-Reservoir auf/nahe der Zebrafischoberfläche, zwischen benachbarten Schuppen12. D. rerio beherbergt Hunderte von Schuppen, die sich nur wenige Tage nach derEntfernung von 24 schnell regenerieren. Zusammen deuten diese Funde und Merkmale darauf hin, dass Zebrafischschuppen eine Quelle von Lymphozyten sind, die keine Euthanasie benötigen, was Längsstudien an lebenden Fischen ermöglicht.

Hier beschreiben wir eine Skalenbiopsie zur Entnahme von epidermalen Lymphozyten von Zebrafischen von Fischen mit lymphozytenspezifischen Fluorophormarkern, mit oder ohne ALL. Um T-Linienzellen zu untersuchen, verwendeten wir gut etablierte lck:GFP-Fisch und eine ähnliche lck:mCherry-Linie; beide beschriften T- und T-ALL-Zelle10, 13, 15, 20. Zur Untersuchung von B-Linienzellen verwendeten wir cd79a:GFP- und cd79b:GFP-transgene Fische mit fluoreszierend markierten B- und B-ALL-Zellen 10,13,17. Jede dieser Linien ermöglicht eine Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie und Reinigung der durchflusszytometrischen Zellsortierung13. Wir untersuchten Schuppen nach der Biopsie, erzeugten hochauflösende Bilder von Lymphozyten in Schuppen, identifizierten die Genexpression epidermaler Lymphozyten mittels qRT-PCR, verglichen sie mit denen von Lymphozyten anderer lymphoider Gewebe desselben Fisches und quantifizierten Lymphozyten pro Skala mittels Durchflusszytometrie/fluoreszenzaktivierter Zellsortierung. Zusammenfassend beschreibt das Protokoll eine einfache und praktische Methode zur Gewinnung von Lymphozyten aus lebenden Zebrafischen, einschließlich der Probennahme einzelner Tiere längs über mehrere Zeitpunkte in einer experimentellen Sequenz. Diese Methode soll die Biologie der Lymphozyten von Zebrafischen, den Verlauf von Leukämie, die Medikamentenreaktionen oder andere longitudinale Versuchsdesigns untersuchen, die wiederholte Probenentnahmen einzelner Zebrafische erfordern. Wir entwickelten das Protokoll mit adulten transgenen Zebrafischen mit fluoreszenzmarkierten Lymphozytenpopulationen und validierten es für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich Fluoreszenzmikroskopie, Flowzytometrie/fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, RNA-Expressionsanalysen und andere ex-vivo-Studien, die lebensfähige Lymphozyten erfordert.

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Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des University of Oklahoma Health Sciences Center genehmigt (Protokolle 24-028-EAH und 25-068-EACHIR). Dieses Protokoll bietet einen Ansatz zur Isolierung und Analyse normaler und/oder bösartiger Lymphozyten aus den Schuppen lebender Zebrafische, mit Details zum Zweck, zur Durchführung und zu den Prinzipien dieser Verfahren.

VORSICHT: MS-222 ist ein gefährliches chemisches Anästhetikum und muss mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) wie Laborhandschuhen, Augenschutz und einem Laborkittel behandelt werden. Entsorgen Sie MS-222-Lösungen gemäß den institutionellen Richtlinien für chemische Abfälle. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Nadeln und Pinzetten, um scharfe Verletzungen zu vermeiden. Betrachten Sie alle biologischen Proben als potenziell biologisch gefährlich und entsorgen Sie Abfälle gemäß institutionellen Biosicherheitsverfahren.

1. Vorbereitung der Sortiermedien

  1. Ergänzen Sie 1× RPMI 1640 media-Lösung mit 1 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin.
    HINWEIS: RPMI 1640 Media erhält die Lymphozytenlebensfähigkeit ex vivo. RPMI 1640 kann durch 0,9× PBS ersetzt werden. Das fetale Rinderserum (FBS) liefert Wachstumsfaktoren, die die zelluläre Lebensfähigkeit fördern. Penicillin und Streptomycin begrenzen bakterielle Kontaminationen.
  2. Aliquot-Medien in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren in 500 μL-Volumen, wobei jedes Rohr für 10–20 Skalen vorgesehen ist. Halten Sie die Sortier-Medienröhren auf Eis.

2. Zebrafischanästhesie, Fluoreszenzmikroskopie, Screening und Bildgebung

  1. Anästhesieren Sie D. rerio mit einem gepufferten 0,02%igen Tricain-Methanesulfonat (MS-222), das gemäß den institutionellen Tierpflegerichtlinien mit Wasser aus dem Fischsystem hergestellt wird.
  2. Nach dem Sedieren setzen Sie den Fisch vorsichtig in eine Zellkulturschale mit ausreichendem Systemwasser (plus 0,02 % MS-222), um die Feuchtigkeit bei der anschließenden Handhabung zu erhalten.
  3. Untersuchen und fotografieren Sie anästhesierte Fische mit einem Epifluoreszenzmikroskop, um Fluoreszenz von den Transgen(en) zu erkennen. Dieser Schritt identifiziert fluoreszierende Schuppen für die Biopsie.
    HINWEIS: Linien ohne fluoreszierende Transgene können mittels Standardlichtmikroskopie betrachtet werden.
  4. Verwenden Sie Fluoreszenz, um T-Zellen (lck:GFP oder lck:mKirschfisch) oder T-ALL (rag2:hMYC + lck:GFP oder lck:mKirschfisch) zu identifizieren. T-Linienzellen sind in diesen Linien hell fluoreszierend; B-ALLE Zellen sind schwach fluoreszierend in den Hintergründen lck:GFP und lck:mCherry 13,15,21.
  5. Screening B-Linie mit CD79a:GFP oder cd79b:GFP-Fischen (mit oder ohne rag2:hMYC) für epidermale B-Zellen und/oder B-ALL, wobei GFP zur Auswahl von Schuppen für die Biopsie verwendet wird.
  6. Üben Sie die Positionierung von Zebrafischen und das Anpassen der Mikroskopeinstellungen vor der Biopsie, falls eine Bildgebung gewünscht ist
    HINWEIS: Bildgebende und Biopsie erfordern 5–7 Minuten Sedierung mit 0,02 % MS-222. Überwachen Sie die operkuläre Bewegung kontinuierlich. Wenn sich die operuläre Bewegung deutlich verlangsamt oder aufhört, wird der Fisch sofort in ein anästhethefreies System überführt und die Biopsie abgebrochen. Geben Sie während der Bildaufnahme und Biopsie alle 1–2 Minuten ~50–100 μL anästhetischhaltiges Fischwasser auf Haut, Operculum und Kiemen auf, um die Oberflächenfeuchtigkeit zu erhalten.

3. Scale Collection und Vorbereitung

  1. Um den Fisch für die Biopsie zu positionieren, legt man den sedierten Fisch auf die Seite in eine Zellkulturschale.
  2. Um zu verhindern, dass der Fisch während der Biopsie rutscht, verwenden Sie einen feuchten Schwamm mit einem linearen oder V-förmigen Ausschnitt und legen Sie ihn in die Zellkulturschale, um den Fisch zu wiegen.
  3. Alternativ sollten Sie darauf achten, dass der Wasserstand des Systems den Boden der Zellkulturschale kaum bedeckt (genug, um die Oberfläche feucht zu halten), damit die Oberflächenspannung den Fisch stabilisiert.
  4. Periodisch werden ~50–100 μL von 0,02 % MS-222, das im Systemwasser zubereitet wird, auf das Operculum und die Kiemen aufgetragen, um die Feuchtigkeit zu erhalten und die Anästhesie während der Bildgebung und Biopsie aufrechtzuerhalten.
  5. Führen Sie eine Biopsie mittels Epifluoreszenzmikroskopie durch, um hochfluoreszierende Schuppen auszuwählen, die mit Lymphozyten oder ALLEN Zellen angereichert sind.
  6. Sammeln Sie 10–20 benachbarte Schuppen aus einem einzelnen hochfluoreszierenden Bereich, vorzugsweise innerhalb des ersten oder zweiten horizontalen pigmentierten Streifens.
    HINWEIS: Eine Skala reicht in der Regel für die Bildgebung aus. Eine Sammlung von 10–20 Schuppen ergibt typischerweise >1.000 Lymphozyten von WT-Fischen und wird für nachgelagerte Analysen wie Flowzytometrie und qRT-PCR empfohlen.
  7. Dominante Hand (Nadel): Verwenden Sie eine Spritzennadel mit 31 Gauge, legen Sie die Nadelspitze vorsichtig unter den hinteren Rand einer Waage und drehen Sie sie nach vorne (also Cephalad). Verwenden Sie für jeden Fisch eine andere sterile Nadel. Saubere Pinzetten zwischen den Fischen; Sterilisieren Sie, falls es institutionelle Verfahren vorschreiben.
    HINWEIS: Das Anheben der Schuppe mit einer Nadel ist vorzuziehen als nur eine Pinzette, da sie die Schuppe anhebt, um Oberflächenabwürfe zu minimieren. Dies stellt sicher, dass die zarte Epidermalschicht unter der Schuppe an der Schuppenoberfläche haftet, was entscheidend ist, um die Zellausbeute zu maximieren.
  8. Nicht-dominante Hand (Pinzette): Halten Sie die Waage in der nach vorne geklappten Position mit der Nadel und greifen Sie mit der Pinzette die starre Außenfläche der Waage. In einer sanften Bewegung zieht man die Waage aus der Tasche.
    HINWEIS: Leichte Blutungen können an Stellen der Suppenentnahme auftreten, was in der Regel selbstbegrenzt ist.
  9. Bei übermäßiger Blutung üben Sie sanften Druck mit der Pinzette aus und spülen Sie kurz mit 0,02 % MS-222 im Systemwasser.
    HINWEIS: Hämostase kann innerhalb von Sekunden erreicht werden, bevor zur nächsten Skala übergegangen wird.
  10. Um mehrere Schuppen zu biopsieren, entnehmen Sie 10–20 Schuppen pro Fisch, wobei benachbarte Schuppen aus einem zusammenhängenden Bereich in einem horizontalen pigmentierten Streifen entfernt werden, anstatt mehrere Körperregionen oder auf beiden Seiten des Tieres.
  11. Zupfen Sie einzelne Schuppen nacheinander und behalten Sie sie während der Sammlung an den Spitzen der Pinzette, wobei die mediale Schuppenfläche nach oben zeigt.
  12. Um eine Störung der angesammelten Schuppen durch die anschließende Schuppenentfernung zu vermeiden, drehen Sie jede Schuppe zuerst nach vorne und greifen Sie dann an ihrer hinteren Kante. Übertragen Sie die Wachen in ein Rohr mit Sortiermedien nach jeweils 5 Waagen oder wenn keine zusätzlichen Wachen sicher an den Spitzen der Pinzette gehalten werden können.
  13. Nach der Entnahme der Skala werden Proben so schnell wie möglich verarbeitet. Der unmittelbare Umzug skaliert von der Zange in 1,5 mL Röhren mit 500 μL kaltem Sortiermedium auf Eis, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten. Dekontaminieren Sie die Pinzetten zwischen Fischen mit 70 % Ethanol, bevor Sie weitere Proben entnehmen. Prozessieren Sie die Skalen jedes Fisches in separaten Röhren während der Entnahme, Dissoziation und für nachgeschaltete Analysen.
  14. Nach der Schuppensammlung werden die Fische sofort in ein Bergungsbecken mit Frischwasser ohne MS-222 überführt.
  15. Überwachen Sie die operkuläre Bewegung und das Schwimmverhalten, bis normale Atmung und Haltung wiederhergestellt sind. Beobachten Sie die Biopsiestelle auf anhaltende Blutungen oder Anzeichen von Belastung, bevor Sie den Fisch ins Kreislaufsystem zurückführen.
  16. Bringen Sie den Fisch nach normalem Gleichgewicht und dem Schwimmen wieder in sein Heimatbecken zurück.

4. Zelldissoziation und Filterung

  1. Überprüfe die Waage am Boden des Rohrs. Schuppen sind mit bloßem Auge vor der Dissoziation leicht sichtbar. Dissoziiere die Schuppen mit einem sterilen Kunststoff-Mikrorohr-Stößelhomogenisierer, indem du sanften, kontrollierten manuellen Druck für 30–60 Sekunden ausübst.
  2. Verwenden Sie langsame Rotations- und Auf-und-Ab-Bewegung, um Epidermiszellen freizusetzen und übermäßiges Schieren der Schuppen zu vermeiden.
  3. Dissoziation wird fortgesetzt, bis die Sortiermedien sichtbar trüb werden.
    HINWEIS: Der Erfolg des Eingriffs zeigt sich darin, dass das Medium trüb wird, was auf eine hohe Konzentration freigesetzter Zellen in Suspension hinweist.
  4. Homogenisierte Proben werden durch einen 35 μm großen Nylon-Gitterfilter geführt, um Schmutz zu entfernen und Einzelzellsuspensionen für die Flowzytometrie/fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zu erzeugen.
  5. Wenn nach der Erstfiltration sichtbare Zellaggregate vorhanden sind, wird die Probe unmittelbar vor der Durchflusszytometrie erneut durch einen frischen 35-μm-Netzfilter geleitet. Wiederholen Sie die Filtration nicht mehr als das Doppelte insgesamt, um den Zellverlust zu minimieren.

5. Flusszytometrische Analyse

  1. Proben mit Durchflusszytometrie analysieren.
    HINWEIS: Die Flusszytometrie kann vor fluoreszenzaktivierter Zellsortierreinigung oder RNA-Extraktion durchgeführt werden, um die Probenzusammensetzung zu bewerten.
  2. Analysieren Sie Einzelzell-Suspensionen mit einem Durchflusszytometer, das mit einem 488-nm-Laser für GFP-Detektion und einem 561-nm-Laser für mCherry-Detektion ausgestattet ist.
  3. Schließen Sie Trümmer unter Verwendung von Vorwärtsstreu- (FSC) und Seitenstreuungsparametern (SSC) aus. Identifizieren Sie Lymphozyten mit dem zuvor beschriebenen Lymphozytentor 10,13,21.
  4. Zellaggregate werden durch Singlet-Gating-Parameter (d. h. SSC-Fläche [SSC-A] versus SSC-Höhe [SSC-H]) ausgeschlossen.
  5. Bewerten Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit Propidiumiodid (PI) oder einem äquivalenten lebenden/toten Farbstoff. PI-positive Zellen von nachfolgenden Analysen und Sortierverfahren ausschließen.
  6. Einrichtung von Fluoreszenzgattern mit nicht-transgenen Zebrafischkontrollen und einfarbigen fluoreszierenden transgenen Kontrollen. Definieren Sie GFP-positive und mCherry-positive Populationen im Vergleich zu negativen Kontrollgruppen.
  7. Exportieren Sie Durchflusszytometrie-Standarddateien (FCS) und analysieren Sie Daten mit Durchflusszytometrie-Analysesoftware.

6. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung

  1. Zur Sortierung der Zellen verwenden Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit 488 nm und/oder 561 nm Lasern zur GFP- und mCherry-Detektion.
  2. Gate-Lymphozyten (FSC/SSC), Senkeln (SSC-A versus SSC-H) und lebensfähige Zellen (PI-negativ) vor der fluoreszenzbasierten Sortierung sequenziell.
  3. Definieren Sie GFPlo, GFPhi und mCherry-positive Populationen mit Fluoreszenzgattern, die aus negativen Kontrollproben hergestellt wurden.
  4. GFPlo, GFPhi und mCherry-positive Populationen werden in Sammelröhren mit gekühltem Sortiermedium sortiert.
    HINWEIS: In dieser Arbeit mit der lck:GFP-Linie sind hohe GFP (GFPhi) versus niedrige GFP (GFPlo) Zellen unterschiedliche lymphozytenge Linien, wie zuvor beschrieben 10,13,15,21.
  5. Sortierte Proben auf Eis aufbewahren und sofort mit nachgelagerten Anwendungen wie RNA-Isolierung übergehen.

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Ergebnisse

Nach den oben genannten Schritten haben wir erwachsene Zebrafische mittels Mikroskopie betäubt und auf fluoreszierende Lymphozyten oder ALLE untersucht. Wildtyp-(WT) lck:GFP-Fische zeigten Fluoreszenz hauptsächlich im thymischen Bereich, während cd79b:GFP-Fische Fluoreszenz im Kopf-/Kiemenbereich zeigten, was mit früheren Beobachtungen10 übereinstimmt (Abbildung 1A, links). Im Gegensatz dazu zeigten doppel-transgene ...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-tödliche Skalenbiopsiemethode zur Sammlung von zebrafischen epidermalen Lymphozyten, einschließlich sowohl nicht-maligner Lymphozyten als auch akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL). Zebrafische sind gut etablierte Modelle für Lymphopoese und lymphoide Malignitäten, aber die meisten Ansätze zur Gewinnung von Lymphozyten erfordern Euthanasie und Gewebedissektionen, was longitudinale Studien an einzelnen Tierenverhindert<...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Ameera Hasan, M.B.B.S., Ph.D., und Brashé Wood für ihre Beiträge zu diesem Projekt. Die Studien wurden vom OUHSC Stephenson Cancer Center Pilot Grant Program, dem Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research (OCASCR), den Wissenschafts- und Saatförderprogrammen der Presbyterian Health Foundation sowie der W.J. Jones Family Foundation unterstützt. FACS vom OUHSC Stephenson Cancer Center Molecular Biology and Cytometry Research Core wurde durch den NCI Cancer Center Support Grant Award P30 CA225520 finanziert. Diese Studie wurde teilweise durch Mittel der American Cancer Society (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC) unterstützt. Iman Owens ist ACS Post-Baccalaureate "STRONG"-Programmstipendiatin.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien & Verbrauchsmaterialien:
Tricain-methansulfonat (MS-222)Sigma-AldrichE10521Anästhetisches Mittel
RPMI 1640-MediumThermoFisher11875093Medium für die Lymphozyten-Lebensfähigkeit
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442Für die zelluläre Lebensfähigkeit
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15140122Beschränkung der bakteriellen Kontamination
70% EthanolThermoScientificT038181000Zur Sterilisation von Forceps
CellPro 1x PBSVWR104027-280Auf 0,9x mit sterilem Wasser verdünnen
PropidiumiodidInvitrogenP1304MMPUnterscheidung lebender/toter Zellen für Durchflusszytometrie/FACS
Cut Goods Misc-Pn; Größe: 12 x 12 Zoll. 35um Filterpapier
Lab Pak 03-35/16		SefarZur Zellsortierung
Referenz: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Isolierer maligner und nicht-maligner B-Zellen aus lck:Egfp Zebrafische. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019).
Alternative für Filterpapier: EASYstrainer Cell Sieves, Greiner Bio-OneGreiner89508-342Zur Zellsortierung
Eppendorf® Flex-Tubes® Mikroröhrchen, 1,5 mlEppendorf®20901-551Mikrozentrifugenrohr für die Zellsortierung
UltiCare VetRx U-100 Insulinspritzen 3/10 ccm 31G x 5/16" Halbe EinheitsmarkierungUltiCare9436Für Skalenbiopsien
100 x 25 mm Tiefe PetrischaleUSA Scientific8609-0625Für Skalenbiopsien
Bel-Art® Einweg-StösselBel-Art® BAF199230001Zur Skalendissoziation
E-Z Pik 6-teiliges Pinzetten-SetAven18480EZFür Skalenbiopsien
Corning® Mikroskop-Objektträger, eine Seite gefrostet, ein EndeSigma-AldrichCLS294875X25Zum Abbilden
DeckgläserSigma-AldrichC8181Zum Abbilden
SlowFade™ Glass Soft-set Antifade Mountant, mit DAPIThermoFisherS36920Zum Montieren von Skalen auf Objektträgern
RNeasy Mini Kit Qiagen74104Zur RNA-Extraktion
Geräte:
Nikon AZ100 Mikroskop und DS-Qi1MC KameraNikonFluoreszenzmikroskop & Kamera
CFX96 Touch-PCR SystemBio-Rad3600037
CytoFLEXBeckman-CoulterDurchflusszytometrie-Analysen
Leica SP8LeicaKonfokalmikroskop
Software:
Kaluza Analysis Software Version 2.1Beckman-CoulterDurchflusszytometrie-Analysen
Referenz: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads
LAS-X Software Version 3.7.4.23463LeicaKonfokalmikroskop
Referenz: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/

Referenzen

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