Methodenartikel

Eine neuartige Biopsiemethode im Maßstab zur Sammlung bösartiger und nicht-bösartiger Lymphozyten von Zebrafischen

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DOI:

10.3791/72153

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7. August 2026

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1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Division of Pediatric Hematology-Oncology, Department of Pediatrics, Stephenson Cancer Center, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine neuartige Biopsiemethode ermöglicht die Sammlung akuter lymphoblastischer Leukämiezellen aus lebenden Zebrafischen. Die Ergebnisse zeigen reichlich Lymphozyten in Wildtyp-(WT) Fischschuppen und einen dramatisch erhöhten Lymphozytenanteil in Schuppen von Fischen mit ALL (akute lymphoblastische Leukämie). Diese Technik ermöglicht eine minimalinvasive Untersuchung von epidermalen, normalen und bösartigen Lymphozyten.

Zusammenfassung

Zebrafische (Danio rerio) sind ein leistungsstarkes Modell zur Untersuchung von Lymphopoese und lymphoiden Krebs, da Zebrafische und Menschen ähnliche adaptive Immunsysteme teilen, einschließlich B- und T-Zellen. Mehrere D. rerio T-Zell-Modelle der akuten lymphoblastischen Leukämie (T-ALL) sind beschrieben, darunter Fische, die lymphoblast-spezifisches humanes MYC (hMYC) exprimieren. Wir berichteten, dass rag2:hMYC-Fische auch eine B-zellige akute lymphoblastische Leukämie (B-ALL) entwickeln, was sie nützlich macht, um beide ALLE Typen zu untersuchen. Eine Einschränkung der Zebrafisch-ALL-Modelle ist, dass es keine nicht-tödlichen Methoden für die serielle Beprobung von ALL gibt. Um dem entgegenzuwirken, haben wir eine neuartige "Skalenbiopsie"-Methode entwickelt, um ALLE Zellen von lebenden Zebrafischen zu entnehmen. Allerdings ist das Wissen darüber, welche Lymphozyten in normalen Zebrafischschuppen vorkommen, begrenzt. Um normale epidermale Lymphozytenidentitäten zu definieren, führten wir Skalenbiopsien an lymphozyteng-markierten transgenen Linien ohne rag2:hMYC durch. Wir verwendeten konventionelle und konfokale Mikroskopie, um die Skalen zu analysieren und zeigten reichlich epidermale Lymphozyten. Wir analysierten außerdem Schuppen von Fischen mit T- und B-ALL, die in vielen Schuppen eine deutlich erhöhte Lymphozytenzahl in zusammenführenden Schichten von ALL-Zellen zeigten. Anschließend verwendeten wir fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), um nicht bösartige und ALLE Lymphozyten von Skalen für ex-vivo-Studien zu reinigen. Flowzytometrische und expressionsbezogene Analysen ALLER Zellen aus Schuppen oder anderen Geweben desselben Fisches zeigten, dass die Skalen-ALLE Zellen-Genexpressionen der von ALLEN Zellen anderswo ähnelten. Wir quantifizierten außerdem die Anzahl der normalen T-, B-, T-ALL- und B-ALL-Zellen, die pro Skala gereinigt werden konnten. Insgesamt bietet die Schuppenbiopsie eine nicht-tödliche, minimalinvasive Technik zur Untersuchung von zebrafischen epidermalen Lymphozyten und ermöglicht Ex-vivo-Studien , einschließlich Analysen bösartiger Proben.

Einleitung

Die Barrierefunktion und die Rolle der Haut von Säugetieren im Immunsystem sind nachgewiesen 1,2,3. Säugetierlymphozyten tragen zur kutanen Immunität bei, wobei zytotoxische T-Zellen in der Epidermis und B-, T- sowie natürliche Killerzellen (NK) in der Dermis 1,3,4,5 vorhanden sind. Zebrafische besitzen diese Lymphozyten mit Oberflächenimmunglobulinen, T-Zell-Rezeptoren, Major Histocompatibility Complex (MHC)-Rezeptoren, Zytokinen und deren Rezeptoren sowie anderen Immunmolekülen, und teilen somit die meisten immunologischen Merkmaleder Säugetiere 6,7,8,9. Jüngste Studien an Zebrafisch-Haut und Schuppen zeigten verschiedene kutane Lymphozytenpopulationen, darunter epitheliale T- und B-Zellen10,11 sowie ein lymphoides Netzwerk, das den T-Zell-Transport unddie Antigenüberwachung ermöglicht. Ähnlichkeiten zwischen Lymphozyten von Teleostfischen und Säugetieren machen D. rerio zu einem leistungsstarken in-vivo-Modell zur Untersuchung der Lymphopoiese, der Funktion der Lymphozyten und lymphoider Erkrankungen, einschließlich akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL)8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.

Unsere früheren Arbeiten zeigten, dass T- und B-Linien ALL (T-ALL, B-ALL) beide bei transgenen rag2:hMYC-Zebrafischen vorkommen, was diese Linie nützlich macht, um beide ALL-Typen13, 15, 21, 22 zu untersuchen. Eine wesentliche Einschränkung der D. rerio ALL-Modelle, insbesondere in Studien zur Längsexpression oder bei Medikamententests, ist das Fehlen von Methoden zur Entnahme serieller ALL-Proben von einzelnen Tieren. Frühere Methoden, wie die retro-orbitale Blutentnahme, sind technisch anspruchsvoll aufgrund der geringen Größe von D. rerio, was die serielle Blutentnahmeerschwert. Daher euthanadieren die meisten Forscher Zebrafische, um ALLE Zellen zu erhalten. Dies ist im Labor und in den meisten Bereichen gängige Praxis, schließt jedoch die Durchführung von Längsversuchen an lebenden Tieren aus. Um dies zu überwinden, beschrieben wir kürzlich epitheliale T- und B-Lymphozyten in Zebrafischschuppen, die mit einer nicht-lethalen SchuppenbiopsieStrategie 10 gesammelt wurden. Eine weitere aktuelle Studie zeigte ein T-Zell-Reservoir auf/nahe der Zebrafischoberfläche, zwischen benachbarten Schuppen12. D. rerio beherbergt Hunderte von Schuppen, die sich nur wenige Tage nach derEntfernung von 24 schnell regenerieren. Zusammen deuten diese Funde und Merkmale darauf hin, dass Zebrafischschuppen eine Quelle von Lymphozyten sind, die keine Euthanasie benötigen, was Längsstudien an lebenden Fischen ermöglicht.

Hier beschreiben wir eine Skalenbiopsie zur Entnahme von epidermalen Lymphozyten von Zebrafischen von Fischen mit lymphozytenspezifischen Fluorophormarkern, mit oder ohne ALL. Um T-Linienzellen zu untersuchen, verwendeten wir gut etablierte lck:GFP-Fisch und eine ähnliche lck:mCherry-Linie; beide beschriften T- und T-ALL-Zelle10, 13, 15, 20. Zur Untersuchung von B-Linienzellen verwendeten wir cd79a:GFP- und cd79b:GFP-transgene Fische mit fluoreszierend markierten B- und B-ALL-Zellen 10,13,17. Jede dieser Linien ermöglicht eine Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie und Reinigung der durchflusszytometrischen Zellsortierung13. Wir untersuchten Schuppen nach der Biopsie, erzeugten hochauflösende Bilder von Lymphozyten in Schuppen, identifizierten die Genexpression epidermaler Lymphozyten mittels qRT-PCR, verglichen sie mit denen von Lymphozyten anderer lymphoider Gewebe desselben Fisches und quantifizierten Lymphozyten pro Skala mittels Durchflusszytometrie/fluoreszenzaktivierter Zellsortierung. Zusammenfassend beschreibt das Protokoll eine einfache und praktische Methode zur Gewinnung von Lymphozyten aus lebenden Zebrafischen, einschließlich der Probennahme einzelner Tiere längs über mehrere Zeitpunkte in einer experimentellen Sequenz. Diese Methode soll die Biologie der Lymphozyten von Zebrafischen, den Verlauf von Leukämie, die Medikamentenreaktionen oder andere longitudinale Versuchsdesigns untersuchen, die wiederholte Probenentnahmen einzelner Zebrafische erfordern. Wir entwickelten das Protokoll mit adulten transgenen Zebrafischen mit fluoreszenzmarkierten Lymphozytenpopulationen und validierten es für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich Fluoreszenzmikroskopie, Flowzytometrie/fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, RNA-Expressionsanalysen und andere ex-vivo-Studien, die lebensfähige Lymphozyten erfordert.

Protokoll

Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des University of Oklahoma Health Sciences Center genehmigt (Protokolle 24-028-EAH und 25-068-EACHIR). Dieses Protokoll bietet einen Ansatz zur Isolierung und Analyse normaler und/oder bösartiger Lymphozyten aus den Schuppen lebender Zebrafische, mit Details zum Zweck, zur Durchführung und zu den Prinzipien dieser Verfahren.

VORSICHT: MS-222 ist ein gefährliches chemisches Anästhetikum und muss mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) wie Laborhandschuhen, Augenschutz und einem Laborkittel behandelt werden. Entsorgen Sie MS-222-Lösungen gemäß den institutionellen Richtlinien für chemische Abfälle. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Nadeln und Pinzetten, um scharfe Verletzungen zu vermeiden. Betrachten Sie alle biologischen Proben als potenziell biologisch gefährlich und entsorgen Sie Abfälle gemäß institutionellen Biosicherheitsverfahren.

1. Vorbereitung der Sortiermedien

  1. Ergänzen Sie 1× RPMI 1640 media-Lösung mit 1 % fetalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin.
    HINWEIS: RPMI 1640 Media erhält die Lymphozytenlebensfähigkeit ex vivo. RPMI 1640 kann durch 0,9× PBS ersetzt werden. Das fetale Rinderserum (FBS) liefert Wachstumsfaktoren, die die zelluläre Lebensfähigkeit fördern. Penicillin und Streptomycin begrenzen bakterielle Kontaminationen.
  2. Aliquot-Medien in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhren in 500 μL-Volumen, wobei jedes Rohr für 10–20 Skalen vorgesehen ist. Halten Sie die Sortier-Medienröhren auf Eis.

2. Zebrafischanästhesie, Fluoreszenzmikroskopie, Screening und Bildgebung

  1. Anästhesieren Sie D. rerio mit einem gepufferten 0,02%igen Tricain-Methanesulfonat (MS-222), das gemäß den institutionellen Tierpflegerichtlinien mit Wasser aus dem Fischsystem hergestellt wird.
  2. Nach dem Sedieren setzen Sie den Fisch vorsichtig in eine Zellkulturschale mit ausreichendem Systemwasser (plus 0,02 % MS-222), um die Feuchtigkeit bei der anschließenden Handhabung zu erhalten.
  3. Untersuchen und fotografieren Sie anästhesierte Fische mit einem Epifluoreszenzmikroskop, um Fluoreszenz von den Transgen(en) zu erkennen. Dieser Schritt identifiziert fluoreszierende Schuppen für die Biopsie.
    HINWEIS: Linien ohne fluoreszierende Transgene können mittels Standardlichtmikroskopie betrachtet werden.
  4. Verwenden Sie Fluoreszenz, um T-Zellen (lck:GFP oder lck:mKirschfisch) oder T-ALL (rag2:hMYC + lck:GFP oder lck:mKirschfisch) zu identifizieren. T-Linienzellen sind in diesen Linien hell fluoreszierend; B-ALLE Zellen sind schwach fluoreszierend in den Hintergründen lck:GFP und lck:mCherry 13,15,21.
  5. Screening B-Linie mit CD79a:GFP oder cd79b:GFP-Fischen (mit oder ohne rag2:hMYC) für epidermale B-Zellen und/oder B-ALL, wobei GFP zur Auswahl von Schuppen für die Biopsie verwendet wird.
  6. Üben Sie die Positionierung von Zebrafischen und das Anpassen der Mikroskopeinstellungen vor der Biopsie, falls eine Bildgebung gewünscht ist
    HINWEIS: Bildgebende und Biopsie erfordern 5–7 Minuten Sedierung mit 0,02 % MS-222. Überwachen Sie die operkuläre Bewegung kontinuierlich. Wenn sich die operuläre Bewegung deutlich verlangsamt oder aufhört, wird der Fisch sofort in ein anästhethefreies System überführt und die Biopsie abgebrochen. Geben Sie während der Bildaufnahme und Biopsie alle 1–2 Minuten ~50–100 μL anästhetischhaltiges Fischwasser auf Haut, Operculum und Kiemen auf, um die Oberflächenfeuchtigkeit zu erhalten.

3. Scale Collection und Vorbereitung

  1. Um den Fisch für die Biopsie zu positionieren, legt man den sedierten Fisch auf die Seite in eine Zellkulturschale.
  2. Um zu verhindern, dass der Fisch während der Biopsie rutscht, verwenden Sie einen feuchten Schwamm mit einem linearen oder V-förmigen Ausschnitt und legen Sie ihn in die Zellkulturschale, um den Fisch zu wiegen.
  3. Alternativ sollten Sie darauf achten, dass der Wasserstand des Systems den Boden der Zellkulturschale kaum bedeckt (genug, um die Oberfläche feucht zu halten), damit die Oberflächenspannung den Fisch stabilisiert.
  4. Periodisch werden ~50–100 μL von 0,02 % MS-222, das im Systemwasser zubereitet wird, auf das Operculum und die Kiemen aufgetragen, um die Feuchtigkeit zu erhalten und die Anästhesie während der Bildgebung und Biopsie aufrechtzuerhalten.
  5. Führen Sie eine Biopsie mittels Epifluoreszenzmikroskopie durch, um hochfluoreszierende Schuppen auszuwählen, die mit Lymphozyten oder ALLEN Zellen angereichert sind.
  6. Sammeln Sie 10–20 benachbarte Schuppen aus einem einzelnen hochfluoreszierenden Bereich, vorzugsweise innerhalb des ersten oder zweiten horizontalen pigmentierten Streifens.
    HINWEIS: Eine Skala reicht in der Regel für die Bildgebung aus. Eine Sammlung von 10–20 Schuppen ergibt typischerweise >1.000 Lymphozyten von WT-Fischen und wird für nachgelagerte Analysen wie Flowzytometrie und qRT-PCR empfohlen.
  7. Dominante Hand (Nadel): Verwenden Sie eine Spritzennadel mit 31 Gauge, legen Sie die Nadelspitze vorsichtig unter den hinteren Rand einer Waage und drehen Sie sie nach vorne (also Cephalad). Verwenden Sie für jeden Fisch eine andere sterile Nadel. Saubere Pinzetten zwischen den Fischen; Sterilisieren Sie, falls es institutionelle Verfahren vorschreiben.
    HINWEIS: Das Anheben der Schuppe mit einer Nadel ist vorzuziehen als nur eine Pinzette, da sie die Schuppe anhebt, um Oberflächenabwürfe zu minimieren. Dies stellt sicher, dass die zarte Epidermalschicht unter der Schuppe an der Schuppenoberfläche haftet, was entscheidend ist, um die Zellausbeute zu maximieren.
  8. Nicht-dominante Hand (Pinzette): Halten Sie die Waage in der nach vorne geklappten Position mit der Nadel und greifen Sie mit der Pinzette die starre Außenfläche der Waage. In einer sanften Bewegung zieht man die Waage aus der Tasche.
    HINWEIS: Leichte Blutungen können an Stellen der Suppenentnahme auftreten, was in der Regel selbstbegrenzt ist.
  9. Bei übermäßiger Blutung üben Sie sanften Druck mit der Pinzette aus und spülen Sie kurz mit 0,02 % MS-222 im Systemwasser.
    HINWEIS: Hämostase kann innerhalb von Sekunden erreicht werden, bevor zur nächsten Skala übergegangen wird.
  10. Um mehrere Schuppen zu biopsieren, entnehmen Sie 10–20 Schuppen pro Fisch, wobei benachbarte Schuppen aus einem zusammenhängenden Bereich in einem horizontalen pigmentierten Streifen entfernt werden, anstatt mehrere Körperregionen oder auf beiden Seiten des Tieres.
  11. Zupfen Sie einzelne Schuppen nacheinander und behalten Sie sie während der Sammlung an den Spitzen der Pinzette, wobei die mediale Schuppenfläche nach oben zeigt.
  12. Um eine Störung der angesammelten Schuppen durch die anschließende Schuppenentfernung zu vermeiden, drehen Sie jede Schuppe zuerst nach vorne und greifen Sie dann an ihrer hinteren Kante. Übertragen Sie die Wachen in ein Rohr mit Sortiermedien nach jeweils 5 Waagen oder wenn keine zusätzlichen Wachen sicher an den Spitzen der Pinzette gehalten werden können.
  13. Nach der Entnahme der Skala werden Proben so schnell wie möglich verarbeitet. Der unmittelbare Umzug skaliert von der Zange in 1,5 mL Röhren mit 500 μL kaltem Sortiermedium auf Eis, um die Zelllebensfähigkeit zu erhalten. Dekontaminieren Sie die Pinzetten zwischen Fischen mit 70 % Ethanol, bevor Sie weitere Proben entnehmen. Prozessieren Sie die Skalen jedes Fisches in separaten Röhren während der Entnahme, Dissoziation und für nachgeschaltete Analysen.
  14. Nach der Schuppensammlung werden die Fische sofort in ein Bergungsbecken mit Frischwasser ohne MS-222 überführt.
  15. Überwachen Sie die operkuläre Bewegung und das Schwimmverhalten, bis normale Atmung und Haltung wiederhergestellt sind. Beobachten Sie die Biopsiestelle auf anhaltende Blutungen oder Anzeichen von Belastung, bevor Sie den Fisch ins Kreislaufsystem zurückführen.
  16. Bringen Sie den Fisch nach normalem Gleichgewicht und dem Schwimmen wieder in sein Heimatbecken zurück.

4. Zelldissoziation und Filterung

  1. Überprüfe die Waage am Boden des Rohrs. Schuppen sind mit bloßem Auge vor der Dissoziation leicht sichtbar. Dissoziiere die Schuppen mit einem sterilen Kunststoff-Mikrorohr-Stößelhomogenisierer, indem du sanften, kontrollierten manuellen Druck für 30–60 Sekunden ausübst.
  2. Verwenden Sie langsame Rotations- und Auf-und-Ab-Bewegung, um Epidermiszellen freizusetzen und übermäßiges Schieren der Schuppen zu vermeiden.
  3. Dissoziation wird fortgesetzt, bis die Sortiermedien sichtbar trüb werden.
    HINWEIS: Der Erfolg des Eingriffs zeigt sich darin, dass das Medium trüb wird, was auf eine hohe Konzentration freigesetzter Zellen in Suspension hinweist.
  4. Homogenisierte Proben werden durch einen 35 μm großen Nylon-Gitterfilter geführt, um Schmutz zu entfernen und Einzelzellsuspensionen für die Flowzytometrie/fluoreszenzaktivierte Zellsortierung zu erzeugen.
  5. Wenn nach der Erstfiltration sichtbare Zellaggregate vorhanden sind, wird die Probe unmittelbar vor der Durchflusszytometrie erneut durch einen frischen 35-μm-Netzfilter geleitet. Wiederholen Sie die Filtration nicht mehr als das Doppelte insgesamt, um den Zellverlust zu minimieren.

5. Flusszytometrische Analyse

  1. Proben mit Durchflusszytometrie analysieren.
    HINWEIS: Die Flusszytometrie kann vor fluoreszenzaktivierter Zellsortierreinigung oder RNA-Extraktion durchgeführt werden, um die Probenzusammensetzung zu bewerten.
  2. Analysieren Sie Einzelzell-Suspensionen mit einem Durchflusszytometer, das mit einem 488-nm-Laser für GFP-Detektion und einem 561-nm-Laser für mCherry-Detektion ausgestattet ist.
  3. Schließen Sie Trümmer unter Verwendung von Vorwärtsstreu- (FSC) und Seitenstreuungsparametern (SSC) aus. Identifizieren Sie Lymphozyten mit dem zuvor beschriebenen Lymphozytentor 10,13,21.
  4. Zellaggregate werden durch Singlet-Gating-Parameter (d. h. SSC-Fläche [SSC-A] versus SSC-Höhe [SSC-H]) ausgeschlossen.
  5. Bewerten Sie die Lebensfähigkeit der Zellen mit Propidiumiodid (PI) oder einem äquivalenten lebenden/toten Farbstoff. PI-positive Zellen von nachfolgenden Analysen und Sortierverfahren ausschließen.
  6. Einrichtung von Fluoreszenzgattern mit nicht-transgenen Zebrafischkontrollen und einfarbigen fluoreszierenden transgenen Kontrollen. Definieren Sie GFP-positive und mCherry-positive Populationen im Vergleich zu negativen Kontrollgruppen.
  7. Exportieren Sie Durchflusszytometrie-Standarddateien (FCS) und analysieren Sie Daten mit Durchflusszytometrie-Analysesoftware.

6. Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung

  1. Zur Sortierung der Zellen verwenden Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit 488 nm und/oder 561 nm Lasern zur GFP- und mCherry-Detektion.
  2. Gate-Lymphozyten (FSC/SSC), Senkeln (SSC-A versus SSC-H) und lebensfähige Zellen (PI-negativ) vor der fluoreszenzbasierten Sortierung sequenziell.
  3. Definieren Sie GFPlo, GFPhi und mCherry-positive Populationen mit Fluoreszenzgattern, die aus negativen Kontrollproben hergestellt wurden.
  4. GFPlo, GFPhi und mCherry-positive Populationen werden in Sammelröhren mit gekühltem Sortiermedium sortiert.
    HINWEIS: In dieser Arbeit mit der lck:GFP-Linie sind hohe GFP (GFPhi) versus niedrige GFP (GFPlo) Zellen unterschiedliche lymphozytenge Linien, wie zuvor beschrieben 10,13,15,21.
  5. Sortierte Proben auf Eis aufbewahren und sofort mit nachgelagerten Anwendungen wie RNA-Isolierung übergehen.

Ergebnisse

Nach den oben genannten Schritten haben wir erwachsene Zebrafische mittels Mikroskopie betäubt und auf fluoreszierende Lymphozyten oder ALLE untersucht. Wildtyp-(WT) lck:GFP-Fische zeigten Fluoreszenz hauptsächlich im thymischen Bereich, während cd79b:GFP-Fische Fluoreszenz im Kopf-/Kiemenbereich zeigten, was mit früheren Beobachtungen10 übereinstimmt (Abbildung 1A, links). Im Gegensatz dazu zeigten doppel-transgene rag2:hMYC; lck:GFP/lck:mKirschfische mit T-ALL oder rag2:hMYC + cd79b:GFP-Fische mit B-ALL helle, verbreitete Fluoreszenz im ganzen Körper (Abbildung 1A, rechts), was viele hochfluoreszierende Schuppen für Biopsien ermöglicht.

Nach der Entfernung blieben die Schuppen intakt, wobei das epidermale Gewebe an deren Oberflächen haftete. Konventionelle und konfokale Bildgebung montierter Schuppen zeigte verstreute GFP+- Lymphozyten in der Epidermis der WT lck:GFP- und cd79b:GFP-Schuppen , während Fische mit Leukämie häufig dichte Cluster oder konfluente Schichten von GFP+/mCherry+- Zellen auf Schuppenoberflächen aufwiesen (Abbildung 1B). Um lymphoide Morphologien der von Schuppen geborgenen Zellen zu validieren, wurde eine Wright-Giemsa-Färbung an Zellen durchgeführt, die von verschiedenen anatomischen Stellen eines WT lck:GFP-Fisches stammten. Skalenabgeleitete Lymphozyten wiesen Morphologien auf, die Lymphozyten aus Thymus, Mark und Blut ähneln, einschließlich hoher Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnisse und dicht gefärbten Kerne (Abbildung 1C, oben). Die Wright-Giemsa-Färbung einer Schuppe eines Fisches mit T-ALL zeigte weitere viele lymphoblastenähnliche Zellen nahe der Oberfläche der Schuppe (Abbildung 1C, unten). Diese morphologischen Ergebnisse bestätigen die Daten der Fluoreszenzmikroskopie und bestätigen, dass dichte Ansammlungen von fluoreszierenden Zellen auf T-ALL-Skalen aus Lymphoblasten bestehen. Diese mikroskopischen Ergebnisse liefern eine qualitative Anzeige, mit morphologischer Bestätigung, dass Schuppen epidermale Lymphozyten (oder leukämische Lymphoblasten) enthalten, die für die Skalendissoziation verfügbar sind. WT-doppeltransgene lck:mCherry + cd79a:GFP-Fische ermöglichten die gleichzeitige Visualisierung von mCherry+ -T-Linien- und GFP+ B-Linienzellen (Abbildung 1D, 1E).

Für Flowzytometrie-Analysen und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung wurden Skalen dissoziiert und gefiltert, um Einzelzellsuspensionen zu erzeugen. Das lymphoide Gate wurde10,25 identifiziert und über Forward Scatter und Side Scatter auf Lymphozyten/Blasts gefiltert. Die Färbung von Propidiumiodid (PI) zeigte, dass die Mehrheit der Zellen innerhalb des lymphoiden Tores nach der Skalendissoziation und -verarbeitung lebensfähig blieb, mit einer durchschnittlichen Lebensfähigkeit von ~92 % (n = 16 Fische). Fluoreszenzgatter wurden mit fluorophor-negativen, nicht-transgenen Kontrollen sowie GFP+- und mCherry+-transgenen Linien hergestellt (Abbildung 2A). Bei WT lck:GFP-Skalen (d. h. Fische ohne rag2:hMYC) waren die meisten fluoreszierenden Zellen GFPlo (Abbildung 2B, oberes Panel), während Schuppen von rag2:hMYC + lck:GFP-Fischen mit T-ALL prominente GFP-hi-Populationen enthielten, was mit bösartigen Lymphoblasten übereinstimmt (Abbildung 2B, mittleres Panel). B-Linien-Skalen mit CD79b:GFP-Skalen lieferten sowohlGFP-lo- als auch GFP-hi-Populationen (Abbildung 2B, unteres Panel), was die Isolierung unterschiedlicher B-Linien-Untermengen ermöglichte.

Zur Validierung der Linienidentitäten von fluoreszierenden Zellen aus Skalen wurdenGFP-lo-Zellen aus WT lck:GFP-Skalen, GFP-hi-Zellen aus rag2:hMYC + lck:GFP T-ALL-Skalen und GFP+-Zellen aus cd79b:GFP-Skalen fluoreszenzaktivierte Zellsortierungen gereinigt, RNA extrahiert und anschließend mit qRT-PCR analysiert. Zellen aus cd79b:GFP-Skalen exprimierten B-Linien-Transkripte (pax5, cd79b, ighm und ighz; Abbildung 2C, oberes Panel), während lck:GFP-Zellen T-Linien-Gene exprimierten (cd4, cd8 und lck; Abbildung 2C, mittleres Panel), im Einklang mit unseren bisherigen Profilen von Zebrafisch-Epidermallymphozyten, die durch eine Skalenbiopsie erhalten wurden, wobei T-Zellen auf WT-Skala mehr CD4 als CD810 exprimierten. T-ALL-Skalen-Zellen exprimierten T-Linien-Transkripte mit höherer rag2-Expression als nicht-leukämische Zellen (Abbildung 2C, unteres Panel), was mit ihrer Lymphoblast-Identität übereinstimmt. T-ALL-Zellen zeigten außerdem nahezu gleiche Werte von cd4 und cd8, was mit ihrem doppelt positiven unreifen T-Lymphoblast-Status übereinstimmt.

Um festzustellen, ob skalierte ALLE Zellen repräsentativ für Krebszellen an anderer Stelle im Tier sind, verglichen wir die flowzytometrischen zellsortierenden Lymphozyten aus Schuppen oder Körpergewebe desselben Fisches und analysierten sie mit qRT-PCR. GFP+- Zellen aus Schuppen oder Körpergewebe von rag2:hMYC + LCK:GFP T-ALL-Fische zeigten nahezu identische Genexpressionsprofile, mit einer höheren Expression von T-Zell-Genen (cd4, lck), lymphoblast-angereicherten Genen (rag1, rag2) und dem hMYC-Onkogenen im Vergleich zu B-Zell-Genen (pax5, ighm, ighz) (Abbildung 2D). Insgesamt unterstützen diese Daten und unsere früheren Arbeiten10 die Verwendung von Skalenbiopsien zur Sammlung nicht-bösartiger und ALLER Zellen für nachgelagerte Studien. Um die Eignung von skalenabgeleiteten leukämischen Zellen für nachgelagerte molekulare Analysen zu bewerten, wurde RNA nach der Reinigung durch die Flowzytometrie-Zellsortierung aus gematchten Körper- und Skalenabgeleiteten T-ALL-Zellen isoliert. Nach der Sortierung von 50.000GFP-Hi-Zellen ergaben die von der Skala abgeleiteten T-ALL-Proben eine durchschnittliche RNA-Ausbeute von ~82 ng, verglichen mit ~106 ng bei körperabgeleiteten T-ALL-Zellen (n = 4 Fische). Trotz der etwas geringeren Ausbeute von skalenabgeleiteten Proben zeigte die erfolgreiche Amplifikation von linien- und leukämieassoziierten Transkripten durch qRT-PCR, dass skalenabgeleitete RNA für nachgelagerte Genexpressionsanalysen geeignet ist.

Biopsien von nicht-leukämischen Fischen ergaben typischerweise 50–65 fluoreszierende Lymphozyten pro Skala (Abbildung 3), was die Entnahme von >1.000 Lymphozyten aus 20 Skalen ermöglichte, was für eine durchflusszytometrische Analyse und gezielte Expressionstests ausreicht. Bei Fischen mit ALL waren die Erträge dramatisch höher, wobei T-ALL-Schuppen ~20.000GFP-Hi-Zellen pro Schild enthielten (WT lck:GFP-Fische hatten ~65 Zellen/Schuppen; Abbildung 3, oben). B-ALL aus rag2:hMYC + cd79b:GFP-Skalen enthielten ~4.000 GFP+- Zellen/Skala (WT cd79b:GFP-Fische hatten ~50 GFP+- Zellen/Skala; Abbildung 3, unten). Die große Anzahl an Zellen, die von Fischen mit ALL gewonnen werden können, bietet eine praktische Grundlage für die längsbeprobte Beprobung ALLER Zellen einzelner Fische über mehrere Zeitpunkte. Zur Unterstützung der Machbarkeit wiederholter Probenahmen überlebten alle 24 Zebrafische in einer früheren Längsschnittstudie serielle Biopsien, was selten ist, und die Biopsien konnten kontrolliert und auf derselben Seite über zwei Wochenund 10 Uhr durchgeführt werden. Darüber hinaus zeigten Longitudinalanalysen von acht Fischen eine Wiederherstellung von Schuppen, Schuppenlymphozyten und Fluoreszenz an der Biopsiestelle bereits 10 Tage nach der Probenahme. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein 10-tägiges Intervall für wiederholte Probenahmen derselben Biopsiestelle ausreichend ist. Zusammen unterstützen diese Ergebnisse die Regenerationskapazität biopsischer Schuppen und belegen die Schuppenbiopsie als praktischen Ansatz für Längsstudien lebender Zebrafische.

Suboptimale Ergebnisse zeichnen sich oft durch eine geringe Zellgewinnung und überschüssige Ablagerungen in Biopsieproben aus. Eine geringe Erholung kann auftreten, wenn Schuppen aus Körperbereichen mit niedriger Fluoreszenz gesammelt werden oder wenn die Epidermis während der Schuppenextraktion versehentlich abgetragen wird. Um dies zu vermeiden, drehen wir die Schuppen vor der Entfernung der Zange nach vorne (Cephalad). Das Entfernen von Schuppen aus stark fluoreszierenden zusammenhängenden Regionen scheint ebenfalls den Ertrag zu verbessern. Bezüglich überschüssiger Ablagerungen kann aggressive Homogenisierung die Zellscherung erhöhen und die Anzahl der Zellen für fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder Durchflusszytometrie verringern. Sanftes Dissoziieren, bis keine sichtbare Epidermis mehr an Schuppenfragmenten haftet, gefolgt von Filtration durch ein 35 μm großes Gitter, ergibt in der Regel eine geeignete Einzelzell-Suspension. Schlechte Lebensfähigkeit ist meist mit verlängerter Verarbeitung oder übermäßiger mechanischer Dissoziation verbunden; daher sollten die Schuppen sofort in eiskalten Sortiermedien überführt und umgehend verarbeitet werden. Zellklumpung kann die Flusszytometrie und -analyse beeinträchtigen, kann jedoch durch wiederholte Filtration durch ein 35-μm-Netz unmittelbar vor der Analyse minimiert werden. Anhaltende Blutungen an Biopsiestellen sind selten und können durch Druck mit der Pinzette und Spülen mit einer anästhetischhaltigen Lösung kontrolliert werden. Schwache Fluoreszenzsignale können durch Probenaufnahmen von Skalen außerhalb von Regionen entstehen, die mit fluoreszierenden Lymphozyten bzw. ALLEN Zellen angereichert sind; Daher wird eine fluoreszente Bildgebung des gesamten Fisches vor der Biopsie empfohlen, um optimale Probeaufnahmeregionen zu identifizieren.

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Abbildung 1: Fluoreszenzmikroskopie und konfokale Bilder der T-Linie (Wildtyp [WT] lck:GFP, T-Zell akute lymphoblastische Leukämie [T-ALL] lck:GFP + rag2:hMYC und T-ALL lck:mCherry + rag2:hMYC), B-Linie (WT cd79b:GFP und B-Zell akute lymphoblastische Leukämie [B-ALL] cd79b:GFP + rag2:hMYC) und Doppellinie (WT lck:mCherry; cd79a:GFP) als transgene Fische und Schuppen gekennzeichnet. (A) Brightfield (obere Reihe) und Fluoreszenzbilder (untere Reihe) von erwachsenen Zebrafischen aus WT T-Linie gekennzeichnet (lck:GFP) und WT B-Linie markiert (cd79b:GFP) Linien sowie Beispiele T-ALL (lck:GFP oder lck:mCherry + rag2:hMYC) und B-ALL (cd79b:GFP + rag2:hMYC) Fischen. Der gelbe Kreis bezeichnet die thymische Region. Schuppenbalken, 2 mm. (B) Repräsentative Schuppen für jeden Genotyp. Obere Reihe: Hellfeldbilder; Mittlere Reihe: Fluoreszenzmikroskopie-Bilder von GFP+/mCherry+- Zellen in der Schuppenepidermis. Untere Reihe: Konfokale Bilder von geboxten Regionen in der mittleren Reihe, die einzelne Lymphozyten in WT-Schuppen und Cluster/Schichten von Zellen in ALLEN Schuppen zeigen. Skalenbalken, 200 μm (Hellfeld- und Reihen mit niedriger Vergrößerung) und 20 μm (Reihe mit hoher Vergrößerung). (C) Wright-Giemsa-gefärbte Bilder von Zellen, die aus Thymus, Mark, Schuppen und Blut eines WT lck:GFP-Zebrafisches und Wright-Giemsa-gefärbten Schuppenbildern stammen, die von einem T-ALL (lck:GFP + rag2:hMYC) Zebrafisch stammen. Top vier Panels unter LCK:GFP: Hochvergrößerungsbilder von gefärbten Zellen lymphoider Organe desselben Zebrafischs. Oberes Panel unter T-ALL: Bild mit niedriger Vergrößerung einer gefärbten Schuppe, die klebende Zellen zeigt. Unteres Panel unter T-ALL: Bild mit höherer Vergrößerung des umrahmten Bereichs im oberen Panel, das lymphoblast-ähnliche Zellen mit hohen Kern-zu-Zytoplasma-Verhältnissen und dicht färbenden Kernen zeigt. Skalenbalken: 10 μm (oben, einzelne Lymphozytenbilder), 200 μm (mittler; niedrige Vergrößerung) und 20 μm (unten; hohe Vergrößerung). (D) Brightfield (BF), GFP, mCherry und zusammengefügte Bilder von adulten WT doppel-transgenen lck:mCherry; cd79a: GFP-Zebrafisch . (E) Brightfield, GFP, mCherry und zusammengeführte Bilder einer Schuppe desselben Fisches, die gleichzeitig T-Linien mCherry+- und B-Linien-GFP+- Zellen demonstrieren. Maßstab, 2 mm Zoll (D) und 200 μm Zoll (E). Fluoreszenzbilder wurden mit identischen Belichtungseinstellungen über alle Kanäle aufgenommen, außer im Panel E, wo sie angepasst wurden, um die gleichzeitige Visualisierung sowohl der GFP- als auch der mCherry-Signale zu ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 2: Durchflusszytometrie und qRT-PCR von Lymphozyten auf Skalenebene sowie Vergleich zwischen Körper- und Skalenzellen aller Zellen. (A) Beispiel für Flusszytometrie-Workflow, das lymphoide (Vorwärtsstreuung, FSC; Seitenstreuung, SSC) sowie GFP⁻, GFPlo und GFPHi-Tore von Zellen aus einer lck:GFP-Skala zeigt. (B) Beispiele für fluoreszierende Bilder (links) und GFP-Histogramme von Skalenzellen (rechts) von WT lck:GFP (oben), T-ALL lck:GFP + rag2:hMYC-Fisch (Mitte) und WT cd79b:GFP (unten) Fischen. Der gelbe Kreis bezeichnet die thymische Region. Schuppenbalken, 2 mm (C) qRT-PCR fluoreszenzaktivierter Zellsortierung gereinigte GFP+-Skalen-Zellen für linien- und stadienspezifische B-Linien (pax5, cd79b, ighm, ighz; oben), T-Linie (cd4, cd8, lck; mittler) und lymphoblast-angereicherte (igic1s1, rag2; unten) Transkripte. (D) qRT-PCR von abgestimmten, körper- und schuppenabgeleiteten Lymphozyten, die aus demselben T-ALL lck:GFP + rag2:hMYC Zebrafisch isoliert wurden (n = 2). Die Expression von B-Zellen (pax5, ighm, ighz), T-Zell (cd4, lck) und lymphoblast-angereicherten (igic1s1, rag1, rag2) Genen sowie hMYC wird für Körper- und Skalenproben gezeigt. Die 2-ΔCt-Methode (ΔCt = Ct_experimental − Ct_housekeeping) wurde verwendet, um die Expression relativ zu den beiden Housekeeping-Genen zu berechnen: eef1a1l1 (ef1a) und rpl13a. Ergebnisse als Mittelwerte ± SD dargestellt. Jede Gruppe repräsentiert Daten von zwei biologischen Replikaten. Die Daten in den Panels C und D sind beschreibende Illustrationen, die linienspezifische Genexpressionsmuster zeigen. Körper-zu-Skalen-Vergleiche wurden statistisch nicht getestet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

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Abbildung 3: Skalen von D. rerio mit ALL ergeben deutlich höhere Lymphozyten. Oben: Fluoreszierende Zellen pro Skala von Wildtyp-(WT) lck:GFP (GFPlo) und T-zell akuter lymphoblastischer Leukämie (T-ALL) lck:GFP; rag2:hMYC und cd79b:GFP; rag2:hMYC(GFP hi)Fisch. Unten: Fluoreszierende Zellen auf einer Skala von WT cd79b:GFP und B-Zell akute lymphoblastische Leukämie (B-ALL) cd79b:GFP; rag2:hMYC Fisch. Jeder Punkt repräsentiert eine Skala. Schuppen wurden von zwei Fischen pro Gruppe gesammelt (T-Liniengruppen: n = insgesamt 10 Schuppen, 5 Schuppen pro Fisch; B-Liniengruppen: n = 8 Schuppen insgesamt, 4 Schuppen pro Fisch). Symbole bezeichnen Schuppen, die von verschiedenen Fischen gesammelt wurden. Balken spiegeln Gruppenmittel mit SD (Standardabweichung) wider. Diese Daten stellen Beispiele für fluoreszierende Lymphozyten dar, die aus Schuppen nicht-leukämischer und leukämischer Fische gewonnen wurden. Viele Schuppen stammen vom selben Fisch ab und können als technische und nicht als biologische Replikationen betrachtet werden. Es wurden keine statistischen Vergleiche durchgeführt, da wir nicht zufällig die hellsten ALL-Skalen für die Biopsie ausgewählt haben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-tödliche Skalenbiopsiemethode zur Sammlung von zebrafischen epidermalen Lymphozyten, einschließlich sowohl nicht-maligner Lymphozyten als auch akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL). Zebrafische sind gut etablierte Modelle für Lymphopoese und lymphoide Malignitäten, aber die meisten Ansätze zur Gewinnung von Lymphozyten erfordern Euthanasie und Gewebedissektionen, was longitudinale Studien an einzelnen Tierenverhindert 8,10,13,15. Schuppen bieten ein experimentell zugängliches Epithelkompartiment mit zahlreichen Lymphozyten und können wiederholt entnommen werden, da erwachsene Zebrafische Hunderte von Schuppen besitzen, die sich nachder Entfernung schnell regenerieren. Daher sind Skalenbiopsien eine praktische Strategie zur seriellen Überwachung von Lymphozyten (wie der leukämischen Belastung) und zur Erstellung einzelner Suspensionen für nachgelagerte Tests, ohne Versuchstiere einzuschläfern.

Mehrere Schritte sind entscheidend, um reproduzierbar hohe Zellerholungen zu erreichen. Erstens reduzieren eine ausreichende Anästhesie und die Aufrechterhaltung der Oberflächenfeuchtigkeit während der Bildgebung und Biopsie (0,02 % MS-222 im Systemwasser) den Stress und begrenzen die Trocknung. Zweitens verbessert das Sammeln von 10–20 benachbarten Schuppen aus einem einzelnen pigmentierten Streifen die Reproduzierbarkeit und minimiert die regionale Variabilität. Drittens bewahrt das Vorwärtsumdrehen der Schuppen (Cephalad) vor der Extraktion und das sofortige Übertragen in eiskalte Sortiermedien das epidermise Gewebe und die Lebensfähigkeit der Lymphozyten. Obwohl Skalenlymphozyten eine hohe Lebensfähigkeit zeigten und für Endpunkt-Assays wie Mikroskopie, Durchflusszytometrie/fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und qRT-PCR validiert wurden, wurden die maximale Dauer, für die Schuppen auf Eis bleiben können, sowie ihre Eignung für eine langfristige Ex-vivo-Kultur nicht untersucht und rechtfertigen eine weitere Untersuchung. Schließlich muss die Dissoziation ausreichend kraftvoll sein, um die Epidermiszellen zu lösen, aber nicht so aggressiv, dass die Skalenmatrix zermalmt wird, wodurch die Ablagerungen vermehrt und die Flusszytometrie beeinträchtigt wird. Trotz dieser Vorsichtsmaßnahmen wird wahrscheinlich nur eine Teilmenge der in jeder Skala vorhandenen Lymphozyten wiederhergestellt, da die Skalenmikroskopie (Abbildung 1B) zeigt, dass jede Skala deutlich mehr enthält als die 50–65 fluoreszierenden Zellen pro Skala, die wir durch Durchflusszytometrie/fluoreszenzaktivierte Zellsortierung nachweisen können (Abbildung 3). Wir haben keine Trypsinisierung oder andere Verdauungsmethoden getestet, um Zellen von Schuppen zu befreien, und solche oder andere Protokollmodifikationen könnten die Zellausbeute noch weiter steigern. Dennoch bietet diese Methode eine einfache Methode, um >1.000 Lymphozyten von WT-Fischen und Zehntausende bis Hunderttausende bösartiger Zellen von Fischen mit disseminiertem ALL zu sammeln.

Unsere Methode lässt sich leicht an andere experimentelle Pläne und transgene Hintergründe anpassen. Fluoreszenzmarkierte Linien ermöglichen sowohl mikroskopisch basierte Auslesungen als auch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung und -reinigung unterschiedlicher Zelltypen, wie GFPlo vs. GFPhi Teilmengen. Falls eine Längsbeprobung erforderlich ist, können Schuppen von alternativen Flanken über Zeitpunkte hinweg gesammelt werden, um das Wiederwachsen der Schuppen zu ermöglichen und Entzündungen zu reduzieren, was wir zuvor für serielle Proben von mit Dexamethason10 behandelten Fischen implementiert haben. Obwohl sich die vorliegende Studie auf Lymphozyten konzentrierte, enthält das Skalenepithel zusätzliche Immunzellpopulationen, darunter Makrophagen und Neutrophile11, die ebenfalls mit diesem Ansatz untersucht werden könnten.

Biopsie-Einschränkungen sollten im experimentellen Design berücksichtigt werden. Bei WT-Fischen ist die Anzahl der Lymphozyten pro Schuppe moderat (<100 Zellen pro Schuppe), was für einige Tests möglicherweise nicht ausreicht, es sei denn, es werden viele Schuppen und/oder mehrere Fischeverwendet. Außerdem beeinträchtigt die Biopsie die Epidermis und kann Entzündungen oder Gewebeumbildungen verursachen; Daher sollten serielle Probenahmen simulierte Biopsiekontrollen und, wenn möglich, räumliche Trennung der Stellen einbeziehen. Bei Fischen mit ALL bieten Schuppen eine bequeme, angereicherte Quelle bösartiger Zellen. Forscher sollten jedoch berücksichtigen, dass die Krankheitsbelastung zwischen Körperregionen und im Laufe der Zeit variieren kann. Wir empfehlen eine Fluoreszenzbildgebung des gesamten Fisches vor der Biopsie, um repräsentative Probeaufnahmeregionen zu identifizieren und eine mögliche Probenahmeverzerrung zu minimieren. Eine Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass keine Vergleiche zwischen von Skalen und Körper abgeleiteten normalen und bösartigen B-Zellen durchgeführt wurden. Dieses Protokoll zeigt eine effiziente Rückgewinnung von B-Linienzellen aus Schuppen, aber eine umfassendere Bewertung der B-Linien-Zellpopulationen an mehreren anatomischen Standorten ist in einer speziellen zukünftigen Studie erforderlich. Die Anzahl der gesammelten Schuppen hängt wahrscheinlich ebenfalls von der Tiergröße und dem Entwicklungsstadium ab. Wir entwickelten das heutige Protokoll mit erwachsenen Fischen im Alter von 4–12 Monaten, die Hunderte von Schuppen haben und die Sammlung von 10–20 Schuppen aus einer einzigen Körperregion gut vertragen. Bei der Verwendung kleinerer oder junger Fische müssen die Ermittler möglicherweise die Anzahl der gesammelten Schuppen reduzieren. Nach unserer Erfahrung werden wiederholte Skalenbiopsien gut toleriert.10, aber zukünftige Studien sollten potenzielle verfahrensassoziierte Ereignisse systematischer bewerten. Relevante Endpunkte könnten Cortisolspiegel, Erholungsverhalten (z. B. abnormales Schwimmen oder veränderte Nahrungsaufnahme) und lokale Entzündungen (z. B. Infektion) an Biopsiestellen umfassen.

Trotz dieser Überlegungen erweitert die Skalenbiopsie-Methode die experimentellen Möglichkeiten in der Immunologie von Zebrafischen und der Leukämieforschung. Dieser Ansatz ermöglicht eine minimalinvasive Sammlung lebensfähiger Lymphozyten für Zytometrie, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, Expressionsanalysen, funktionelle Assays und andere Anwendungen. Biopsien können in Arzneimittel-Response-Studien undandere Längsschnittstudien integriert werden. Durch die Erlaubnis wiederholter Probenahmen desselben Tieres kann diese Methode die Nutzung von Tieren reduzieren, die statistische Leistungsfähigkeit für Vergleiche innerhalb der Probanden verbessern und zeitaufgelöste Studien sowohl zur normalen epidermalen Immunität als auch zur Biologie bösartiger Lymphozyten ermöglichen.

Offenlegungen

Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir danken Ameera Hasan, M.B.B.S., Ph.D., und Brashé Wood für ihre Beiträge zu diesem Projekt. Die Studien wurden vom OUHSC Stephenson Cancer Center Pilot Grant Program, dem Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research (OCASCR), den Wissenschafts- und Saatförderprogrammen der Presbyterian Health Foundation sowie der W.J. Jones Family Foundation unterstützt. FACS vom OUHSC Stephenson Cancer Center Molecular Biology and Cytometry Research Core wurde durch den NCI Cancer Center Support Grant Award P30 CA225520 finanziert. Diese Studie wurde teilweise durch Mittel der American Cancer Society (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC) unterstützt. Iman Owens ist ACS Post-Baccalaureate "STRONG"-Programmstipendiatin.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien & Verbrauchsmaterialien:
Tricain-methansulfonat (MS-222)Sigma-AldrichE10521Anästhetisches Mittel
RPMI 1640-MediumThermoFisher11875093Medium für die Lymphozyten-Lebensfähigkeit
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442Für die zelluläre Lebensfähigkeit
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15140122Beschränkung der bakteriellen Kontamination
70% EthanolThermoScientificT038181000Zur Sterilisation von Forceps
CellPro 1x PBSVWR104027-280Auf 0,9x mit sterilem Wasser verdünnen
PropidiumiodidInvitrogenP1304MMPUnterscheidung lebender/toter Zellen für Durchflusszytometrie/FACS
Cut Goods Misc-Pn; Größe: 12 x 12 Zoll. 35um Filterpapier
Lab Pak 03-35/16		SefarZur Zellsortierung
Referenz: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. Isolierer maligner und nicht-maligner B-Zellen aus lck:Egfp Zebrafische. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019).
Alternative für Filterpapier: EASYstrainer Cell Sieves, Greiner Bio-OneGreiner89508-342Zur Zellsortierung
Eppendorf® Flex-Tubes® Mikroröhrchen, 1,5 mlEppendorf®20901-551Mikrozentrifugenrohr für die Zellsortierung
UltiCare VetRx U-100 Insulinspritzen 3/10 ccm 31G x 5/16" Halbe EinheitsmarkierungUltiCare9436Für Skalenbiopsien
100 x 25 mm Tiefe PetrischaleUSA Scientific8609-0625Für Skalenbiopsien
Bel-Art® Einweg-StösselBel-Art® BAF199230001Zur Skalendissoziation
E-Z Pik 6-teiliges Pinzetten-SetAven18480EZFür Skalenbiopsien
Corning® Mikroskop-Objektträger, eine Seite gefrostet, ein EndeSigma-AldrichCLS294875X25Zum Abbilden
DeckgläserSigma-AldrichC8181Zum Abbilden
SlowFade™ Glass Soft-set Antifade Mountant, mit DAPIThermoFisherS36920Zum Montieren von Skalen auf Objektträgern
RNeasy Mini Kit Qiagen74104Zur RNA-Extraktion
Geräte:
Nikon AZ100 Mikroskop und DS-Qi1MC KameraNikonFluoreszenzmikroskop & Kamera
CFX96 Touch-PCR SystemBio-Rad3600037
CytoFLEXBeckman-CoulterDurchflusszytometrie-Analysen
Leica SP8LeicaKonfokalmikroskop
Software:
Kaluza Analysis Software Version 2.1Beckman-CoulterDurchflusszytometrie-Analysen
Referenz: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads
LAS-X Software Version 3.7.4.23463LeicaKonfokalmikroskop
Referenz: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/

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