Redox-responsive, oberflächenverstärkte Raman-Streu-Mikronadeln zur Überwachung der Akupunkturreaktionen bei Ratten mit verminderter Glukosetoleranz

Zusammenfassung

Diese explorative Rattenmodellstudie präsentiert eine redoxsensitive, oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS)-aktive Mikronadel für gleichzeitige Akupunkturintervention und ratiometrische Verfolgung von SERS-Indizes im Zusammenhang mit der lokalen oxidativen Kapazität und dem Redoxpotenzial bei Ratten mit beeinträchtigter Glukosetoleranz.

Zusammenfassung

Eine beeinträchtigte Glukosetoleranz (IGT) ist mit einer gestörten Redoxhomöostase und erhöhtem oxidativem Stress verbunden, aber die dynamische Verfolgung redoxassoziierter Veränderungen während der Akupunkturintervention in vivo bleibt technisch herausfordernd. Diese Studie entwickelte ein redox-sensitives, oberflächenverstärktes Raman-Streuungssystem (SERS)-aktives Mikronadelsystem für gleichzeitige Akupunkturinterventionen und relative ratiometrische Verfolgung der oxidativen Kapazität (OC)- und Redoxpotenzial-(RP)-bezogenen Sers-Indizes bei Ratten mit IGT. Oxidativ- und Redox-sensitive SERS-Sonden wurden hergestellt, indem Gold-Nanoschalen (GNS) mit p-Phenylendiamin (p-PDA) für die OC-Reaktion bzw. Anthraquinon für RP-Reaktion funktionalisiert wurden. Die Sonden wurden in zwei geätzte Rillen auf Akupunkturnadeln geladen, um SERS-aktive Mikronadeln herzustellen. In dieser explorativen Studie wurden männliche Sprague–Dawley-Ratten ohne spezifische Krankheitserreger verwendet. Drei Ratten dienten als normale Kontrollpersonen, und 20 Ratten erhielten eine fettreiche Diät und erhielten Streptozotocin (STZ), um IGT auszulösen. Nach dem Screening wurden 18 geeignete IGT-Ratten in fettreiche und normale Diätgruppen eingeteilt, jeweils 9 Ratten pro Diätgruppe. Jede Diätgruppe wurde weiter unterteilt in Akupunktpunkt-Twisting-, Nicht-Akupunktur-Set-Twisting und Akupunkturpunkt-Direktinsertions-Subgruppen mit jeweils 3 Ratten pro Untergruppe. Needling wurde zweimal täglich für 7 aufeinanderfolgende Tage durchgeführt, und es wurden Nüchternblutzucker (FPG), 2-stündige postprandialer Blutzucker (2hPG) sowie OC- und RP-bezogene Sers-Indizes erfasst. Die Ergebnisse zeigten, dass Nadeln an Akupunkturpunkten mit Verdrehung mit niedrigeren FPG- und 2hPG-Werten sowie veränderten OC- und RP-bezogenen SERS-Indizes in diesem IGT-Rattenmodell assoziiert waren. Da externe Kalibrierungskurven, unabhängige biochemische oxidative Stresstests, Probe-Leaching-Tests und Biokompatibilitätstests nicht enthalten waren, sollten die SERS-Verhältnisse als relative, redoxassoziierte optische Indizes und nicht als absolute biochemische Konzentrationen oder absolute Redoxpotentialwerte interpretiert werden. Diese Erkenntnisse unterstützen die Machbarkeit von SERS-aktiven Mikronadeln als explorative präklinische Plattform zur Kombination von Akupunkturintervention mit lokaler ratiometrischer SERS-Verfolgung bei IGT-Ratten.

Einleitung

Eine beeinträchtigte Glukosetoleranz (IGT), eine Abnahme der Glukosetoleranz des Körpers, stellt eine Übergangsstufe zwischen normalem Blutzucker und diabetischem Blutzucker¹ dar. IGT ist somit ein wichtiges Frühwarnsignal und ein reversibles Stadium in der Entwicklung von Typ-2-Diabetes². Klinische Daten zeigen, dass etwa 30 % der Bevölkerung mit IGT innerhalb von 5–10 Jahren zu Typ-2-Diabetes überschreiten³; Mit rechtzeitiger Intervention kann dieser Prozentsatz jedoch auf weniger als 10 ^{% reduziert} werden.

IGT ist ein dynamischer und komplexer Prozess, und eine anhaltend hohe Glukoseumgebung ist ein wichtiger Auslöser für oxidative Stoffwechselstörungen⁵. Wenn der Körper sich in einem langanhaltenden Zustand der Hyperglykämie befindet, funktioniert die mitochondriale Atemkette abnormal, und die Rate der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies steigt um 30–50 %, was die oxidative Kraft im Körper direkt erhöht⁶; Gleichzeitig hemmen hohe Zuckerwerte die Aktivität wichtiger Enzyme wie Glutathionreduktase, verhindern das Antioxidanssystem, überschüssige reaktive Sauerstoffspezies rechtzeitig zu entfernen, und stören das Oxidations-Reduktions-Gleichgewicht zusätzlich. Darüber hinaus geht IGT mit pathologischen Veränderungen einher, darunter Insulinresistenz und eine leichte Beeinträchtigung der β-Zellfunktion, was zu einer Reihe biologischer und biochemischer Reaktionen^führt. Zusammen mit der Entwicklung des Redox-Zustands verschärfen diese Veränderungen die Störung des Glukosestoffwechsels weiter und erhöhen das potenzielle Risiko für Diabeteskomplikationen, darunter Retinopathie, Nephropathie und Herz-Kreislauf-Erkrankungen ^9,10. Daher sollte die Überwachung der oxidativen Kapazität (OC) und des Redoxpotenzials (RP) bei Individuen oder Tiermodellen mit IGT unser Verständnis der Mechanismen der IGT-Entwicklung verbessern und die Entwicklung gezielter therapeutischer Strategien leiten.

Akupunktur hat eine Geschichte von mehr als 3.000 Jahren und hat eine gute klinische Wirksamkeit bei der Behandlung vieler Krankheiten^{gezeigt 11}. Darüber hinaus haben zahlreiche experimentelle Studien an Tieren gezeigt, dass Akupunktur positive Effekte bei der Regulierung oxidativer Stresszustände in Tiermodellen hat, indem sie das antioxidative Enzymsystem verbessert und die Lipidperoxidation¹² reduziert. Als traditionelle chinesische medizinische Praxis hat Akupunktur auch bedeutende Vorteile bei der Behandlung von Diabetes und IGT gezeigt. Guanyuan (CV4) und Sanyinjiao Akupunkturpunkte (SP6) sollen den SIRT1/PGC-1α-Weg in der Skelettmuskulatur aktivieren und so die Insulinresistenz von fettleibig-diabetischen Mäusen¹³ lindern. Darüber hinaus modulieren Tianshu-Akupunkturpunkte (ST25) die Aktivität der glukosehemmenden Neuronen im lateralen hypothalamischen Bereich und tragen zur Regulation des Glykolipidstoffwechsels¹⁴ bei. Die meisten Studien zu den Mechanismen der intravaskulären Akupunktur konzentrieren sich jedoch hauptsächlich auf das neuromodulatorische, immunmodulatorische und gastrointestinale System, bei denen Akupunktur den Glukosestoffwechsel durch Modulation der autonomen Funktion beeinflussen oder indirekt den Blutzuckerspiegel regulieren kann, indem sie das Gleichgewicht der Darmflora verbessert^15,16. Der spezifische Mechanismus der Wirkung der Akupunktur bei der IGT-Behandlung und ihre Auswirkungen auf oxidativen Stress haben keine eingehenden Untersuchungen und experimentelle Daten erhalten.

Oberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) bietet eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität, was die Detektion einer Vielzahl von Analyten ermöglicht. SERS-Nanosonden auf Basis von Nanofaseroptik¹⁷, Chitosanmembranen¹⁸ und früheren Studien haben gezeigt, dass Akupunkturnadeln¹⁹ für den Nachweis von Biomarkern, Neurotransmittern und anderen Aspekten der zellulären Biochemie in vivo verwendet werden können. Akupunkturnadeln sind insbesondere vielversprechende Werkzeuge für Tiefengewebstests, die eine minimalinvasive In-situ-Überwachung gefolgt von ex-vivo-Analysen ermöglichen. Akupunktur als gut etablierte therapeutische Methode hat ein äußerst breites klinisches Anwendungsspektrum. Neuere Studien haben gezeigt, dass SERS-fähige optische Fasern, Wundverbände und Mikronadelgeräte eine in situ oder minimal invasive Verfolgung redoxassoziierter Signale in biologisch relevanten Umgebungen unterstützen können^20,21. Parallel dazu haben sich SERS-aktive Akupunktur-Nadeln und verwandte Mikronadelsysteme als vielversprechende Träger für die Integration der Sensorfähigkeit mit der Gewebeintervention^{etabliert 19}, was zu SERS-aktiven Mikronadeln mit in-vivo-Reaktion und in vitro SERS-Nachweismöglichkeiten führt.

Die vorliegende Studie baut auf der zuvor berichteten SERS-aktiven Mikronadelstrategie zur Erkennung von oxidativen Kapazitäts- und Redoxpotenzial-bezogenen Signalen in glukoseinduzierten Stressmodellen auf. Die vorliegende Arbeit unterscheidet sich jedoch sowohl im biologischen Kontext als auch im experimentellen Zweck von der vorherigen Studie. Konkret wendet diese Studie die SERS-aktive Mikronadelplattform auf ein Rattenmodell mit beeinträchtigter Glukosetoleranz an und integriert lokale ratiometrische SERS-Verfolgung mit Akupunkturintervention. Die aktuelle Studie vergleicht außerdem Akupunkturpunkte mit benachbarten Nicht-Akupunkturstellen, bewertet verschiedene Nadelmanipulationen und überwacht Redox-assoziierte SERS-Indizes während einer 7-tägigen Interventionsphase. Im Vergleich zu zuvor berichteten SERS-basierten optischen Fasern, Wundverbänden und SERS-aktiven Mikronadeln, die hauptsächlich für die biochemische Detektion an einer Stelle oder mit einer Funktion entwickelt wurden, bietet die vorliegende Plattform zwei Fortschritte. Zunächst sind OC- und RP-responsive Sonden in zwei unabhängige geätzte Rillen auf einer einzigen Akupunkturnadel integriert, was eine gleichzeitige Überwachung komplementärer Redoxparameter ermöglicht. Zweitens fungiert die Akupunkturnadel nicht nur als Träger der SERS-Sonde, sondern auch als therapeutisches Gerät, das eine Redoxüberwachung während der Akupunkturintervention statt nach der Behandlung ermöglicht. Wie in Abbildung 1 gezeigt, entstehen nach dem Einführen der Mikronadeln in das Gewebe winzige Wunden, und die Sonden in den beiden Rillen reagieren mit dem Gewebe, sodass sie in vivo Spiegel von OC und RP nachweisen können. Ziel der Studie war es, diese SERS-aktiven Mikronadeln zu nutzen, um Veränderungen im OC und RP bei Ratten mit IGT zu untersuchen und die Effekte von Akupunktur im Zusammenhang mit Akupunkturpunkten bei diesen Tieren zu bestimmen, wodurch wertvolle Einblicke in den Wirkmechanismus der Akupunktur bei der Behandlung von IGT sowie die Beziehung zwischen Redox und abnormen hyperglykämischen Zuständen gewonnen wird.

Protokoll

Tiere und Modelle von IGT

Alle Tierverfahren wurden vom Tierethikkomitee des Southeast University Suzhou Research Institute genehmigt (Genehmigungsnummer SEU-IACUC-20250318007) und wurden gemäß institutionellen Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Labortieren durchgeführt. Die Ratten wurden entnommen und unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen bei 25 °C mit einem 12-Stunden-Licht/12-Stunden-Dunkelzyklus untergebracht. Bei Verfahren, die eine Anästhesie erfordern, wurden die Ratten mit Isofluran, das durch eine Induktionskammer in Sauerstoff abgegeben, betäubt und mit einem Nasenkegel gehalten. Isofluran wurde mit 3 % für die Induktion und 1 % für die Erhaltung verwendet, wobei die Konzentration entsprechend der Atemfrequenz und der prozeduralen Reaktion angepasst wurde.

Eine ausreichende Anästhesietiefe wurde vor der Nadel oder Injektion durch den Verlust des Aufrichtreflexes und das Ausbleiben einer Reaktion auf Zehenkneifen bestätigt. Während der Anästhesie wurden das Atemmuster, die Körperhaltung und die Erholung überwacht, und die Tiere wurden auf ein Wärmepad gelegt, um die Körpertemperatur zu halten. Die Tiere wurden pro Korb zwei Tiere untergebracht, mit freiem Zugang zu Futter und Wasser, es sei denn, für die Glukosetests war Fasten erforderlich. Nach der Ankunft wurden die Ratten eine Woche lang akklimatisiert, bevor das Modell ingeleitet wurde. Das Tierwohl wurde täglich überwacht, einschließlich allgemeiner Aktivität, Pflege, Nahrungsaufnahme, Körpergewicht, Zustand der Injektionsstelle und der Erholung nach der Anästhesie. Am Ende der Studie wurden die Ratten gemäß dem genehmigten Tierprotokoll eingeschläfert. Die Euthanasie erfolgte durch schrittweise Füllung von CO₂-Inhalation, gefolgt von der Bestätigung des Todes mittels der zervikalen Dislokationsmethode. Tiere, die die humanen Endpunktkriterien erfüllten, darunter starker Gewichtsverlust, anhaltende Beweglichkeit, abnormale Atmung, Unfähigkeit zu essen oder zu trinken oder starke Belastungen, wurden sofort eingeschläfert, anstatt bis zum geplanten Endpunkt gehalten zu werden. Männliche Sprague–Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 200 ± 20 g wurden in dieser Studie verwendet. Nach einer Woche der Akklimatisierung wurden die Ratten zufällig in zwei Gruppen eingeteilt: Die drei Ratten der normalen Gruppe erhielten normales Futter, während die 20 Ratten der Modellgruppe mit fettreichem Chow (50 % Basalfutter + 10 % Schmalz + 25 % Saccharose + 15 % Eigelbpulver) für 3 Wochen gefüttert wurden. Die Tiere der Modellgruppe erhielten eine intraperitoneale Injektion von 20 mg/kg 2%ige STZ-Lösung (gelöst in 0,1 mol/L, pH-Puffer 4,4 Citrat) für 12 Stunden, nach 12 Stunden Fasten ohne Wasserrestriktion. Die Normalgruppen erhielten nach der Verpflegung mit normalem Futter eine intraperitoneale Injektion der entsprechenden Dosis Citratpufferlösung. Eine Woche später wurde ein intraperitonealer Glukosetoleranztest (IPGTT) durchgeführt. Die in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräte sind in der Materialtabelle aufgeführt.

Der Nüchternblutzucker (FPG) wurde durch Blutentnahme an der Schwanzspitze jeder Rattengruppe nach 12 Stunden Fasten ohne Wasserrestriktion gemessen, und 2 Stunden postprandialer Blutzucker (2hPG) wurde nach einer intraperitonealen Injektion von 20 % Dextrose 2 g/kg gemessen. In der Normalgruppe lag der FPG-Bereich bei 5,1–6,6 mmol/L und der 2hPG-Glukosebereich bei 7,3–9,4 mmol/L, verglichen mit einem FPG von ≤7,0 mmol/L und einem 2hPG-Bereich von 10–16 mmol/L in der Modellgruppe. Von den 20 Ratten, die der Einleitung des IGT-Modells zugewiesen wurden, erfüllten 18 die vordefinierten IGT-Kriterien nach IPGTT und wurden in das anschließende Interventionsexperiment einbezogen. Zwei Ratten wurden ausgeschlossen, da ihre FPG- oder 2hPG-Werte außerhalb des vordefinierten IGT-Bereichs lagen. Die 18 geeigneten Ratten wurden dann zufällig einer fettreichen und einer normalen Diätgruppe zugeteilt, jeweils 9 Ratten pro Gruppe. Jede Diätgruppe wurde weiter in drei Untergruppen unterteilt: Akupunktpunktverdrehung, Nicht-Akupunkturstellenverdrehung und Akupunkturpunkt-direkter Einsatz, mit jeweils drei Ratten pro Untergruppe. Dies war eine explorative Methodenentwicklungsstudie, die darauf abzielte, die Machbarkeit der Kombination von Akupunkturintervention mit SERS-basierter ratiometrischer Verfolgung in einem präklinischen IGT-Rattenmodell zu bewerten. Es wurde keine formale statistische Leistungsberechnung durchgeführt. Die Untergruppengröße von drei Ratten wurde anhand von Machbarkeit, vorläufigen SERS-Mikronadelstudien und dem Prinzip der Tierreduktion ausgewählt. Die Ratten wurden vom Versuchsleiter zufällig zugeteilt; formelle Zuteilung, Tarnung und Blendung wurden nicht durchgeführt.

Die Akupunkturbehandlungsprotokolle wurden unter Berücksichtigung evidenzbasierter klinischer Praxisrichtlinien für die traditionelle chinesische Medizin und der Machbarkeit von Tierversuchen^{geprüft 22}. Die ausgewählten Akupunktpunkte waren Zhongwan (RN12/CV12), Shuifen (RN9/CV9), Yinjiao (RN7/CV7), bilaterale Tianshu (ST25), bilaterale Shuidao (ST28) und bilaterale Zusanli (ST36). RN12, RN9 und RN7 lagen auf der vorderen Mittellinie und wurden als einzelne Mittellinienpunkte behandelt, während ST25, ST28 und ST36 beidseitig behandelt wurden. Die Akupunkturpunkt-Paarungen basierten auf denen, die für die klinische Behandlung von IGT²³ verwendet wurden. Die Anpassung basierte auf der Literatur^24,25 unter Verwendung der dichotomen Methode. Bei Ratten wurden Akupunkturpunkte anhand anatomischer Orientierungspunkte und proportionaler Umwandlung von Standardpunkten des Menschen lokalisiert. Die abdominalen RN/CV-Punkte wurden entlang der vorderen Mittellinie anhand des Xiphoideus, des Umbilicus und der Schamsymphyse als anatomische Orientierungspunkte identifiziert. ST25 war beidseitig auf der Nabelschnur markiert, und ST28 beidseitig im unteren Bauchbereich im gleichen lateralen Abstand zur vorderen Mittellinie. ST36 wurde am anterolateralen Hintergliedmaß im vorderen Bereich des Tibialis, lateraal zum Tibia-Tuberkel, identifiziert. Benachbarte Vergleichsstellen ohne Akupunktur wurden 5 mm lateral zu den entsprechenden Akupunktpunkten und außerhalb der anerkannten Meridianlinie markiert, wobei sichtbare Gefäße, Narben und frühere Einstichstellen vermieden wurden. Vor dem Nadeln wurden die Ratten gemäß dem genehmigten Tierprotokoll mit Isofluran betäubt und in Rückenposition auf eine Wärmeplatte gelegt. Die Bauch- und Hintenkörperhaut an jeder Zielstelle wurde rasiert und mit 75 % Ethanol desinfiziert. SERS-aktive Mikronadeln wurden ungefähr senkrecht zur Haut in eine Tiefe von etwa 10 mm eingeführt. Für die Akupunkturpunktverdrehungsgruppen wurden SERS-aktive Mikronadeln in die ausgewählten Akupunktpunkte eingeführt und während der 20-minütigen Retentionszeit sanft bidirektional gedreht. Für die Gruppen ohne Akupunkturstellen wurde dasselbe Verfahren an den 5 mm benachbarten Vergleichsstellen durchgeführt. Für die Direkteinführungsgruppen wurden SERS-aktive Mikronadeln in die Akupunkturen eingeführt und 20 Minuten lang ohne Verdrehung gehalten. Alle Needling-Verfahren wurden vom selben geschulten Bediener durchgeführt, um die Unterschiede zwischen den Bedienern zu minimieren.

Needling wurde zweimal täglich, um 10:00 und 15:00 Uhr, an 7 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt. Vor jedem Tagesablauf wurde die FPG nach 8 Stunden Fasten ohne Wassereinschränkung gemessen. Nach dem täglichen Needling-Verfahren wurden OC- und RP-Antworten aufgezeichnet. Am 7. Tag wurde nach der Akupunkturbehandlung eine IPGTT durchgeführt und 2hPG-Werte erfasst.

Warnhinweise

Streptozotocin ist gefährlich und sollte als giftige Chemikalie behandelt werden. Bereiten Sie die Streptozotocin-Lösung in einer chemischen Dampfhaube oder einem zertifizierten Biosicherheitsschrank vor, während Sie einen Laborkittel, Nitrilhandschuhe, Schutzbrillen und eine Maske tragen. Streptozotocin-kontaminierte Spritzen, Nadeln, Feuchttücher, Bettzeug, Käfige und tierbezogene Abfälle sollten gemäß institutionellen Verfahren für gefährliche biologische und chemische Abfälle behandelt werden. Gebrauchte Nadeln und Spritzen sollten sofort in stichresistente Behälter ohne Deckdeckel entsorgt werden.

Herstellung von SERS-aktiven Mikronadeln zur Detektion von OC und RP

Akupunkturnadeln wurden vorbereitet, wie zuvor berichtet²⁶. SERS-aktive Mikronadeln wurden während der gesamten Studie mit demselben Typ kommerzieller Edelstahl-Akupunkturnadeln (0,25 mm × 26 mm) hergestellt. Die Nadeln wurden ungefähr senkrecht zur Haut bis zu einer Tiefe von 10 mm eingeführt. Für Verdrehungsgruppen wurde die manuelle bidirektionale Rotation sanft und gleichmäßig für 20 Minuten während der Retentionszeit vom gleichen geschulten Bediener angewendet. Die Manipulation wurde nicht instrumentell gesteuert; daher wurden die exakte Rotationsfrequenz und -amplitude nicht quantifiziert. Diese Einschränkung wurde in der Diskussion anerkannt.

Anfangs wurden die Nadeln in einer 20%igen (mit /v) PMMA-Lösung in MMA eingeweicht und anschließend einen Tag lang bei Raumtemperatur (25 °C) getrocknet. Anschließend wurden zwei parallele Einkerbungen gleichmäßiger Größe und ähnlicher Form und Tiefe in der PMMA-Schutzschicht (5 mm auseinander) mit einer kleinen Handwerksmesserklinge angefertigt, die mit Ethanol gereinigt worden war; anschließend wurden die Nadeln in 0,5 M Schwefelsäure eingetaucht und diente als Elektrolyt für 10 Sekunden, um eine elektrochemische Gravierung bei einer Spannung von 12 V zu durchlaufen, wodurch an den Scoringstellen zwei nahezu kreisförmige Rillen entstanden. Drittens wurden die Nadeln nach dreimaliger Spülung 24 Stunden bei Raumtemperatur in eine Ethanollösung mit 0,1 mol L⁻¹ MPTES und 0,3 mol L⁻¹ APTES eingetaucht, wodurch die gerillten Oberflächen eine Sulfhydrylfunktion erhielten. Viertens wurde die Beschichtung durch das Eintauchen der Nadel in MMA entfernt. Redox-potentiell-responsive SERS-aktive Mikronadeln wurden auf Basis einer zuvor berichteten Methode²⁷ hergestellt. Das SERS-Substrat wurde auf eine der geätzten Rillen jeder Akupunkturnadel adsorbiert, danach wurden die resultierenden SERS-aktiven Mikronadeln in eine wässrige p-PDA-Lösung mit einer Konzentration von 1 × 10^–4 mol/L für 60 Minuten bei 37 °C eingetaucht, was zu oxidationsempfindlichen, SERS-aktiven Mikronadeln führte. SERS-Substrate, die auf Gold-Nanoschalen basieren, wurden wie zuvor beschrieben^{synthetisiert 28}. Bei der vorliegenden Arbeit wurden diese Mikronadeln in die andere Rille jeder Akupunkturnadel getropft und dann natürlich trocknen lassen. Dies führte zu SERS-aktiven Mikronadeln mit OC- und RP-Antwort.

Ex-vivo-Bewertung der OC- und RP-Reaktion auf SERS-aktive Mikronadeln

Die Reaktionen der OC- und RP-Sonden wurden durch das Einführen der SERS-aktiven Mikronadeln in ex vivo Gewebe bewertet. Um die Reaktionsfähigkeit der OC-Sonde auf oxidative Veränderungen zu überprüfen, wurden SERS-Spektren von p-PDA vor und nach der Oxidation aufgezeichnet. Spektren der Redox-SERS-Sonden wurden ebenfalls in einer stark reduzierenden NaBH-4-Lösung und einer stark oxidierenden HAuCl-4-Lösung aufgenommen. Die Selektivität der OC-Sonde wurde mit Reduktionsmitteln bewertet, darunter 1 × ^10-4 M FeSO₄, 1 × ^10-4 M Na₂SO₄ und 1 × ^10-4 M Ascorbinsäure sowie Oxidationsmittel, darunter 1 × ^10-4 M CuSO₄, 1 × ^10-4 M H₂O₂, 1 × ^10-4 M FeCl₃, und 1 × ^10-4 m HAuCl₄. Alle Lösungen wurden in 20 mM PBS (pH 7,4) vorbereitet, und die Sonden wurden mit jeder Lösung 20 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Robustheit der SERS-aktiven Mikronadeln wurde bewertet, indem OC-Reaktionen vor und nach der Reaktion mit 1 × 10^–4 mol/L FeCl₃ bei Raumtemperatur erfasst wurden. Diese ex-vivo- und lösungsbasierten Tests wurden verwendet, um die Reaktionsfähigkeit der Sonde unter kontrollierten Bedingungen zu bestätigen. Sie reproduzieren jedoch nicht vollständig die Komplexität der in vivo Gewebe-Mikroumgebung, in der lokale pH-Variationen, Proteinadsorption, extrazelluläre Matrixkomponenten und andere biologische Substanzen die SERS-Signale beeinflussen können. Daher wurden die in vivo OC- und RP-Messungen als relative, redoxassoziierte SERS-Indizes und nicht als matrixunabhängige biochemische Messungen interpretiert.

OC- und RP-Detektion an Akupunktur- und Nicht-Akupunkturstellen

Um die Leistung der OC- und RP-Sonden an Akupunkturpunkten und Nicht-Akupunkturpunkten zu bewerten, wurden die SERS-aktiven Mikronadeln in gesunde Ratten an den ST36- und RN12-Akupunkturpunkten und 5 mm angrenzend an jedem dieser Punkte, in einer Tiefe von etwa 10 mm, für denselben Zeitraum eingeführt.

Auswirkungen des Nadeldrehens auf OC- und RP-Erkennung

Um die Reaktionsfähigkeit der OC- und RP-Sonden unter verschiedenen Nadeltechniken zu beurteilen, wurden SERS-aktive Mikronadeln in die ST36- und RN12-Akupunkturpunkte und 5 mm angrenzend an diesen Punkten bei gesunden Ratten in einer Tiefe von etwa 10 mm eingesetzt. An jedem Akupunkturpunkt wurde eine Nadel verdreht, während die entsprechende Nadel an diesem Punkt nicht verdreht war, und umgekehrt (eine Nadel am Akupunkturpunkt war verdreht, während ihr Gegenstück am Akupunkturpunkt nicht verdreht war). SERS-Signale von den Sonden wurden zur gleichen Einführungszeit für jede Nadel gesammelt.

Veränderungen von OC und RP bei Ratten mit IGT in Bezug auf Akupunkturpunkte, Nadeldrehen und Ernährungsbedingungen

Um die Auswirkungen von Akupunkturpunkten, Nadeldrehen und Ernährungsbedingungen auf OC und RP bei Ratten mit IGT zu bewerten, wurden Ratten der fettreichen Diätgruppe zufällig drei Gruppen zugeteilt (A1, A2 und A3; jeweils drei Ratten), ebenso wie die in der normalen Diätgruppe (Gruppen B1, B2 und B3; drei Ratten in jeder Gruppe). Bei Ratten in den Gruppen A1 und B1 wurden nach der Sedierung SERS-aktive Mikronadeln in Akupunkturpunkte eingeführt und 20 Minuten lang verdreht; dasselbe Verfahren wurde bei Ratten in den Gruppen A2 und B2 durchgeführt, wobei die Mikronadeln 5 mm neben den Akupunkturpunkten eingeführt wurden. Bei Ratten in A3 und B3 wurden die SERS-aktiven Mikronadeln ohne Verdrehung in die Akupunkturpunkte der Ratten eingeführt; Die Nadeln blieben 20 Minuten an Ort und Stelle. Needling wurde zweimal täglich durchgeführt, um 10:00 und 15:00 Uhr, über 7 Tage hinweg. Vor den täglichen Eingriffen wurde ein Blutzuckermessgerät verwendet, um FPG-Werte für jede Gruppe von Ratten zu erfassen (nach dem Fasten, aber ohne Wasserrestriktion für 8 Stunden). Nach jedem Tag des Nadelns wurden OC- und RP-Reaktionen gemessen und aufgezeichnet. Am siebten Tag, nach der Akupunktur, wurde bei jeder Gruppe von Ratten IPGTT durchgeführt und 2hPG-Werte erfasst.

Charakterisierung und Messung

Die Morphologie der SERS-aktiven Mikronadeln wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) untersucht. Die SERS-Spektren wurden bei 25 °C mit einem Raman-Spektrometer aufgenommen, das mit einem 50× langen Arbeitsdistanzobjektiv (NA: 0,5) und einem 785 nm Laser ausgestattet war. Für alle Messungen betrug die Erfassungszeit 10 Sekunden, und das Raman-System wurde mit einer nominalen Laserleistung von 600 μW unter derselben optischen Konfiguration betrieben. Die tatsächliche an der Gewebeoberfläche abgegebene Laserleistung wurde in dieser Studie nicht direkt gemessen. Daher wurden die SERS-Spektren für relative Vergleiche zwischen Gruppen unter identischen Erwerbsbedingungen verwendet, und es wurden keine Schlussfolgerungen hinsichtlich absoluter photothermischer Sicherheit des Gewebes gezogen. Die Intensitätsverhältnisse zweier SERS-Sonden wurden mit folgendem Ansatz berechnet: Das Verhältnis der Intensitätswerte bei 1450 cm⁻¹ zu dem bei 1500 cm⁻¹ wurde als Indikator für OC (I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹⁾ bestimmt, nachdem die Intensität bei 1700 cm⁻¹ (als Hintergrund) von jedem der beiden Gipfel abgezogen wurde, jeweils, wie in früheren Berichten ¹⁷; und unter Verwendung von I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ cm⁻¹ als RP-Indikator wurde die Intensität bei 1700 cm⁻¹ (als Hintergrund) jeweils von den beiden Gipfeln subtrahiert. Die berechneten Werte I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ und I₁₆₀₆ cm⁻¹/I₁₆₆₆ cm⁻¹ wurden als relative SERS-abgeleitete Indizes der OC- bzw. RP-assoziierten Antworten analysiert. Diese Verhältnisse wurden verwendet, um Veränderungen zwischen Gruppen und Zeitpunkten unter identischen Erwerbseinstellungen zu vergleichen.

In der vorliegenden Studie wurde keine externe Kalibrierungskurve festgelegt, um diese Verhältnisse in absolute Konzentrationen oxidativer Spezies oder absolute elektrochemische Redoxpotentialwerte umzuwandeln. Jedes Spektrum wurde zweimal an fünf verschiedenen Punkten der SERS-Sonde in drei replizierten Proben aufgezeichnet. Origin wurde verwendet, um Daten zu verarbeiten und Diagramme zu erstellen. Um die akquisitionsbezogene Variabilität zu minimieren, wurden auf alle Gruppen dieselbe Laserwellenlänge, das Objektiv, die Aufnahmezeit, die Laserleistungseinstellung und der Spektralverarbeitungsworkflow angewendet. Potenzielle photothermische oder photochemische Effekte, die durch Laserbestrahlung verursacht werden, wurden nicht unabhängig quantifiziert und gelten als Einschränkung. Statistische Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Stichprobengröße und der statistische Test, der für jedes Experiment oder Figurenpanel verwendet wird, sind in den entsprechenden Figurenlegenden angegeben. Für Ex-vivo-Probe-Validierungsexperimente wurde die SERS-Sonde oder eine unabhängig präparierte Mikronadel als Analyseeinheit verwendet. Für Blutzucker- und SERS-Indexanalysen in vivo wurde die Ratte als biologische Analyseeinheit verwendet. Spektren, die von mehreren Punkten auf derselben Sonde gesammelt wurden, wurden als technische Messungen behandelt und vor der Analyse auf Gruppenebene gemittelt. Statistische Analysen wurden mit SPSS-Software durchgeführt. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden mit den statistischen Tests durchgeführt, die in den entsprechenden Abbildungslegenden angegeben sind. Serielle Nüchternblutzucker- und SERS-Indexmessungen während des 7-tägigen Interventionszeitraums wurden aufgrund der kleinen Untergruppengröße als explorative longitudinale Trends interpretiert, und es wurde kein formales Wiederholungs- oder Mixed-Effects-Modell angewendet. Die statistische Signifikanz wurde als p < 0,05 definiert. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Ergebnisse

Herstellung von SERS-aktiven Mikronadeln zur Detektion von OC und RP

Um Veränderungen in OC und RP zu identifizieren, wurden SERS-aktive Mikronadeln mit den entsprechenden Sonden hergestellt. Repräsentative SEM-Bilder bestätigten die Zwei-Rillen-Struktur der SERS-aktiven Mikronadeln. Abbildung 2A zeigt den Akupunkturnadelkörper mit zwei geratzten Rillen, Abbildung 2B eine mit GNS belastete Nut, und Abbildung 2C eine vergrößerte Ansicht des GNS, das innerhalb der Nut verteilt ist. Diese Bilder bestätigten, dass die geätzten Rillen als lokale Ladestellen für die OC- und RP-responsiven SERS-Sonden dienen konnten. Das Verhältnis der Spitzenintensitäten I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ wurde verwendet, um den Grad der oxidierten p-PDA darzustellen. Abbildung 3A zeigt SERS-Spektren von p-PDA vor und nach der Wechselwirkung mit 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃, während Abbildung 3B Spektren für die Redoxsonde in 1 × 10⁻³ M NaBH4 und 1 × 10-4 M HAuCl₄ wässrigen Lösungen zeigt. Die RP-Sondenantwort wurde als Spitzenintensitätsverhältnis (I₁₆₀₆ ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1) ausgedrückt, das mit zunehmender RP abnahm.

Um die Selektivität der oxidativ-kapazitäts-responsiven Sonde zu bewerten, wurde das Verhältnis I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ nach der Exposition gegenüber verschiedenen Reduktions- und Oxidationsmitteln gemessen. Unabhängige Sondenmessungen wurden mit n = 3 pro Gruppe durchgeführt, wobei die SERS-Sonde oder die unabhängig vorbereitete Mikronadel als Analyseeinheit verwendet wurde (Abbildung 3C). Im Vergleich zur CK-Gruppe (Kruskal–Wallis-Test, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest) veränderten die Reduktionsmittel FeSO₄ und Na₂SO₄ das_I-1450 cm⁻¹/_I-1500 cm^{−1-Verhältnis} (p > 0,05) nicht signifikant. Ascorbinsäure (AA, p < 0,001) erzeugte unter der aktuellen Untersuchungsbedingung ebenfalls ein erhöhtes Verhältnis, obwohl sie als Reduktionsmittel enthalten war. Daher wurde die AA-Antwort in diesem lösungsbasierten Test vorsichtig als sondenspezifische spektrale Antwort interpretiert und nicht als Beleg für oxidierendes Verhalten. Im Gegensatz dazu erhöhten oxidierende oder oxidationsassoziierte Reagenzien das Verhältnis in unterschiedlichem Maße. Das Verhältnis wurde nach der Exposition gegenüber CuSO₄ (p < 0,0001), H₂O₂ (p < 0,0001), FeCl₃ (p < 0,0001) und HAuCl₄ (p < 0,0001) erhöht. Zur Beurteilung der Stabilität der OC-Sonde bei Raumtemperatur wurden SERS-Spektren stündlich über einen Zeitraum von 6 Stunden vor der Reaktion der Sonde mit 1 × 10⁻⁴ M FeCl₃ (Abbildung 3D) aufgenommen. und die entsprechenden_I-1450 cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm^{−1-Verhältnisse} wurden berechnet. Nach der Sondenadsorption blieb der Anfangswert bei etwa 0,20 ± 0,02 stabil, ebenso wie der Wert der Reaktion mit FeCl₃ bei etwa 0,9 ± 0,10 über den 6-Stunden-Zeitraum. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass p-PDA auf GNS in der Luft stabil ist.

OC- und RP-Antworten an Akupunktur- und Nicht-Akupunkturpunkten

Frühere Studien²⁹ haben gezeigt, dass die OC-Sonde ihre maximale Reaktion 10 Minuten nach dem Einsetzen erreicht. Die Abbildungen 4A und B zeigen die Reaktion von SERS-aktiven Mikronadeln bei gesunden Ratten, die in den ST36- und RN12-Akupunkturpunkten platziert wurden, sowie bei denen, die 5 mm an die Punkte angrenzen, für 10 Minuten. Für diese Experimente wurden n = 3 Ratten pro Gruppe, und Spektren, die von mehreren Punkten auf derselben Sonde gesammelt wurden, wurden als technische Replika behandelt und vor der Analyse auf Gruppenebene gemittelt. Die SERS-aktiven Mikronadeln reagierten effektiv auf Veränderungen in OC und RP in vivo, ohne signifikanten Unterschied zwischen OC und RP in der Akupunkturpunktegruppe im Vergleich zur Gruppe ohne Akupunkturpunkte (unabhängige Proben t-Test, S. > 0,05).

Um die Auswirkungen des Nadeldrehens auf lokale OC und RP in vivo weiter zu bestimmen, wurden SERS-aktive Mikronadeln in gesunde Ratten an den Akupunkturpunkten ST36 und RN12 sowie 5 mm darüber hinaus bis zu einer Tiefe von 10 mm eingesetzt. Während des Verdrehungsmanövers an jedem Akupunkturpunkt wurde die am Punkt angrenzende Nadel entdreht, und umgekehrt, und Änderungen der OC- und RP-Werte an der Punktionsstelle wurden aufgezeichnet (Abbildungen 4C–F). Es gab keine signifikanten Veränderungen im OC und RP, je nachdem, ob das Drehen entweder an Akupunkturpunkten oder an Nicht-Akupunkturpunkten bei gesunden Ratten durchgeführt wurde, noch gab es einen Effekt der Verdrehung an einem benachbarten Punkt (S. > 0,05).

Veränderungen von OC und RP bei Ratten mit IGT, die mit Akupunktur, Nadeldrehen und Ernährungsbedingungen verbunden sind.

Um die erfolgreiche Etablierung eines Rattenmodells mit IGT zu bestätigen, wurden FPG- und 2hPG-Werte mittels eines IPGTT-Tests in Modell- bzw. Kontrollratten aufgezeichnet. Die Kontrollgruppe umfasste n = 3 Ratten, und die Modellgruppe umfasste n = 18 Ratten, die die vordefinierten Kriterien für eine beeinträchtigte Glukosetoleranz erfüllten. Die Modellratten zeigten einen höheren Nüchternblutzucker als die Kontrollratten (6,92 mmol/L gegenüber 5,54 mmol/L; Mann–Whitney U-Test, p < 0,01) und einen 2-Stunden-Blutzucker nach der Mahlzeit höher als bei Kontrollratten (11,52 mmol/L gegenüber 7,92 mmol/L; Mann–Whitney-U-Test, S. < 0,001) (Abbildung 5), was auf eine erfolgreiche Induktion von IGT bei den Modelltieren hinweist.

Um die Auswirkungen der Kombination aus Akupunkturpunkten, Nadeldrehungen und Ernährungsbedingungen bei IGT-Ratten zu überprüfen, wurde ein typischer Satz von Akupunkturpunktpaaren ausgewählt. Die 18 geeigneten Modellratten wurden dann in fettreiche und normale Diätgruppen eingeteilt, wobei n = 9 Ratten pro Diätgruppe berücksichtigt wurden. Jede Diätgruppe wurde weiter in drei Interventionsuntergruppen unterteilt: Akupunkturpunkt-Twisting, Nicht-Akupunktur-Set-Twisting und Akupunktur-Punkt-Direktinsertion, wobei n = 3 Ratten pro Untergruppe vorhanden waren. FPG-Werte wurden vor jedem Tag der Nadelung erfasst (Abbildungen 6A–C), und 2hPG (Abbildung 6D) wurden nach 7 Tagen Nadelung per IPGTT-Test in jeder Gruppe gemessen. In diesem explorativen Datensatz wurde kein klarer Unterschied in FPG oder 2hPG zwischen den fettreichen und normalen Diät-Modellgruppen nach dem Nadeln an Akupunkturpunkten beobachtet. Vergleiche zwischen Akupunkturpunkt- und Nicht-Akupunktur-Punkt-Nadelung deuteten darauf hin, dass Akupunkturpunktverdrehung unter den aktuellen experimentellen Bedingungen mit niedrigeren Blutzuckerwerten assoziiert ist (unabhängige Proben t-Tests, S. < 0,05). Da die Untergruppengröße klein war und Ernährung, Akupunkturposition und Verdrehungsmanipulation nicht vollständig statistisch getrennt werden konnten, wurden diese Ergebnisse als vorläufige Beobachtungen von Tiermodellen interpretiert.

Veränderungen der oxidativ-kapazitätsbezogenen und redox-potentiell-bezogenen SERS-Indizes wurden während einer Woche der Akupunkturintervention bei IGT-Ratten überwacht. Für diese Analysen wurden n = 3 Ratten pro Untergruppe einbezogen, und jede Ratte wurde als biologische Analyseeinheit behandelt. Bei fettreichen Ratten sank der oxidativ-kapazitätsbezogene SERS-Index im Laufe der Zeit in den Akupunkturpunkt-Twisting- und Akupunkturpunkt-Direktinsertionsgruppen, während er in der Gruppe mit Nicht-Akupunktur-Stellen-Twisting relativ höher blieb (Abbildung 7A). Der Redox-Potenzial-bezogene SERS-Index stieg im Laufe der Zeit in den Akupunkturpunkt-Twisting- und Akupunkturpunkt-Direktinsertions-Gruppen, während die Gruppe ohne Akupunktur-Set-Twisting einen vergleichsweise schwächeren Anstieg zeigte (Abbildung 7B). Ähnliche Trends wurden bei IGT-Ratten mit normaler Ernährung beobachtet. Der oxidativ-kapazitätsbezogene SERS-Index nahm im Laufe der Zeit in den Akupunkturpunkt-Twisting- und Akupunkturpunkt-Direktinsertionsgruppen ab, mit einer geringeren Veränderung der nicht-akupunkturstellenden Verdrehungsgruppe (Abbildung 7C). Der Redox-Potenzial-bezogene SERS-Index stieg im Laufe der Zeit in den Akupunkturpunkt-Twisting- und Akupunkturpunkt-Direktinsertionsgruppen, während die Gruppe ohne Akupunktur-Set-Twisting vergleichsweise niedriger blieb (Abbildung 7D).

Um die Ernährungsbedingungen unter derselben Akupunkturmanipulation weiter zu vergleichen, wurden die Akupunktpunkt-Twisting-Untergruppen der fettreichen und normalen Diätgruppen verglichen. In diesem Vergleich nahm der oxidative-kapazitätsbezogene SERS-Index in beiden Diätbedingungen im Laufe der Zeit ab, wobei in der normalen Diät-Akupunkturpunkt-Twisting-Subgruppe bis Tag 7 ein größerer Rückgang beobachtet wurde (Abbildung 7E). Der Redox-Potenzial-bezogene SERS-Index stieg im Laufe der Zeit bei beiden Diätbedingungen, mit einem höheren Wert am 7. Tag in der normalen Diät-Akupunkturpunkt-Twisting-Subgruppe (Abbildung 7F). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Akupunkturpunktverdrehung und Ernährungsnormalisierung mit Veränderungen der lokalen, redoxassoziierten SERS-Indizes bei IGT-Ratten in Verbindung standen. Da jede Untergruppe nur drei Ratten enthielt und keine unabhängigen biochemischen oxidativen Stresstests durchgeführt wurden, sollten diese Ergebnisse als explorative Tiermodellbeobachtungen und nicht als endgültige biochemische Belege für die Verbesserung des oxidativen Stresses interpretiert werden.

DATENVERFÜGBARKEIT:

Alle numerischen Rohdaten, die für die Abbildung und statistische Analyse verwendet werden, einschließlich Blutzuckermessungen, von SERS abgeleiteten Verhältniswerten und Quelldaten für quantitative Figurenpanels, wurden organisiert und als ergänzende Tabelle 1 hochgeladen. Für kontinuierliche Sondenüberwachungsexperimente, die direkt vom Analyseinstrument generiert werden, sind die exportierten Werte und repräsentativen instrumentgenerierten Ausgaben, die zur Bewertung der Sondenleistung verwendet werden, in der Supplementary File 1 enthalten.

Abbildung 1: Methodischer Arbeitsablauf für Akupunkturinterventionen und lokale ratiometrische SERS-Verfolgung mit einer Doppelrille SERS-aktiven Mikronadel. Das Schema zeigt das Einsetzen der zweirilligen SERS-aktiven Mikronadel in einen Akupunkturpunkt oder eine benachbarte Nicht-Akupunkturstelle, gefolgt von der Raman-Spektralaufnahme. Die Autoren erstellten diese Figur mit der WPS-Software, und es ist keine Urheberrechtslizenz erforderlich. Abkürzungen: SERS = oberflächenverstärkte Raman-Streuung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 2: Repräsentative SEM-Bilder von SERS-aktiven Mikronadeln. (A) Akupunkturnadelkörper mit zwei Rillen; Skala = 200 μm; Vergrößerung = 77×. (B) Eine Nut, die mit GNS integriert ist; Skala = 20 μm; Vergrößerung = 1.000×. (C) Ein vergrößertes Bild der Rille in B; Skala = 2 μm; Vergrößerung = 30.000×. Abkürzungen: SEM = Rasterelektronenmikroskopie; GNS = goldene Nanoschalen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 3: Charakterisierung von OC-responsiven und RP-responsiven SERS-Sonden. (A) Normalisierte Spektren von p-PDA vor und nach der Interaktion mit FeCl₃. (B) Normalisierte SERS-Spektren von RP-Sonden in Lösungen von NaBH₄ bzw. HAuCl₄. (C) I₁₄₅₀ cm⁻¹/I₁₅₀₀ cm⁻¹ Verhältnisse für OC-Sonden in verschiedenen oxidierenden und reduzierenden Lösungen. n=3 unabhängige Sondenmessungen pro Gruppe. Kruskal–Wallis-Test, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest gegen die CK-Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. (D) Sechsstündige Stabilitätsbewertung der OC-responsiven Sonde vor und nach der Reaktion mit FeCl₃. Abkürzungen: SERS = oberflächenverstärkte Raman-Streuung; CK = Kontrollkontrolle; p-PDA = p-Phenylendiamin; AA = Ascorbinsäure. p < 0,001, ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 4: OC- und RP-bezogene SERS-Indizes, gemessen mit verschiedenen Nadelmethoden an Akupunktur- und Nicht-Akupunkturstellen bei gesunden Ratten. (A) OC-bezogener Sers-Index nach direktem Einsetzen an Akupunkturpunkten und angrenzenden nicht-akupunkturen Stellen. (B) RP-bezogener SERS-Index nach direktem Einsetzen an Akupunkturpunkten und benachbarten Nicht-Akupunkturstellen. (C) OC-bezogener Sers-Index nach direktem Einsetzen an nicht-akupunkturischen Stellen und Nadeldrehung an Akupunkturpunkten. (D) RP-bezogener SERS-Index nach direktem Einsetzen an nicht-akupunkturischen Stellen und Nadeldrehung an Akupunkturpunkten. (E) OC-bezogener Sers-Index nach direktem Einsetzen an Akupunkturpunkten und Nadeldrehung an benachbarten Nicht-Akupunkturstellen. (F) RP-bezogener Sers-Index nach direktem Einsetzen an Akupunkturpunkten und Nadeldrehung an benachbarten Nicht-Akupunkturstellen. OC wurde als I₁₄₅₀ ^cm-1/I₁₅₀₀ ^cm-1 berechnet, und RP als I₁₆₀₆ ^cm-1/I₁₆₆₆ ^cm-1. n=3 jede Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Zwischen den gepaarten Vergleichen wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet. Abkürzungen: OC = oxidative Kapazität; RP = Redoxpotenzial. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 5: FPG- und 2hPG-Werte gemäß dem IPGTT-Test bei Modell- und Kontrollratten (CK). FPG und 2hPG wurden gemessen, um die Etablierung des Rattenmodells für beeinträchtigte Glukosetoleranz zu überprüfen. n = 3 Ratten in der Kontrollgruppe und n = 18 Ratten in der Modellgruppe. Die statistische Analyse wurde mit dem Mann–Whitney U-Test durchgeführt, und die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. **p < 0,01, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 6: FPG- und 2hPG-Werte für IGT-Ratten während Akupunkturverfahren. (A) FPG-Werte für die Gruppe mit Nadeldrehung an Akupunkturpunkten und direktem Nadeleinsetzen an Akupunkturpunkten (n = 3 pro Gruppe). (B) FPG-Werte für Gruppen, die Needling mit Verdrehung an Akupunkturpunkten und Nicht-Akupunkturpunkten empfangen (n = 3 pro Gruppe). (C) FPG-Werte für die fettreiche und normale Diätgruppen (n = 3 pro Gruppe). (D) Tag 7: 2hPG-Werte bei fettreichen und normalen Ratten unter den Bedingungen des Akupunkturpunkt-Twisting-, Nicht-Akupunktur-Set-Twisting und Akupunkturpunkt-Direkteinsatz. (n = 3 pro Gruppe). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM präsentiert. Geplante paarweise Endpunktvergleiche im Panel D wurden mit einem ungepaarten, zweiseitigen Student's t-Test analysiert. *p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Abbildung 7: Veränderungen in OC und RP der Ratten in jeder Gruppe während einer Woche Akupunktur. (A) Veränderungen der OC bei fettreichen IGT-Ratten. (B) Veränderungen im RP bei fettreichen IGT-Ratten. (C) Veränderungen der OC bei normalen IGT-Ratten. (D) Veränderungen der RP bei normalernährter IGT-Ratten. (E) Vergleich des OC-bezogenen SERS-Index zwischen den fettreichen und normalen Diätbedingungen innerhalb der Akupunkturpunkt-Twisting-Untergruppe; (F) RP-bezogener SERS-Index-Vergleich zwischen den fettreichen und normalen Diätbedingungen innerhalb der Akupunkturpunkt-Twisting-Subgruppe. n = 3 Ratten pro Untergruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM präsentiert. Serielle Messungen wurden als explorative longitudinale Trends interpretiert. Abkürzungen: OC = oxidative Kapazität; RP = Redoxpotenzial. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzusehen.

Ergänzende Datei 1: Repräsentative, instrumentgenerierte Ausgaben für die Bewertung der Probe-Response. Diese Datei enthält repräsentative kontinuierliche Überwachungsausgaben, die direkt vom Analyseinstrument generiert und zur Bewertung der Probe-Response-Leistung verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Tabelle 1: Rohdatentabelle für quantitative Analysen. Diese Datei enthält die numerischen Quelldaten, die für die Figurengenerierung und statistische Analyse verwendet werden, einschließlich Blutzuckermessungen, von SERS abgeleiteten Verhältniswerten und quantitativen Paneldaten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Diskussion

Eine beeinträchtigte Glukosetoleranz stellt eine reversible Übergangsstufe vor Typ-2-Diabetes dar und steht in engem Zusammenhang mit metabolischem Ungleichgewicht, Insulinresistenz und oxidativ-stressbedingter Dysregulation. Lebensstilinterventionen und andere frühe therapeutische Strategien können das Risiko einer Progression von einer beeinträchtigten Glukosetoleranz zu Diabetes verringern, aber Werkzeuge zur dynamischen Überwachung lokaler biochemischer Reaktionen während der Intervention sind^{weiterhin begrenzt.} In experimentellen und klinischen Studien wurde berichtet, dass Akupunktur den Glukosestoffwechsel und die mit oxidativem Stress verbundenen Signalwege beeinflusst. Die meisten mechanistischen Studien zur Akupunktur basieren jedoch auf Blut- oder Gewebemessungen am Endpunkt, und relativ wenige Methoden ermöglichen eine minimalinvasive Verfolgung lokaler, redoxassoziierter Reaktionen während der Akupunkturintervention. Frühere klinische Studien zu IGT-Behandlungen haben bestätigt, dass das Diabetesrisiko durch Lebensstilinterventionen, einschließlich Ernährungsumstellungen, Körpermassenreduktion und erhöhter körperlicher Aktivität stark reduziert werden kann³¹. Akupunktur hat sich als wirksam erwiesen, um die Glukose-Stoffwechsel-Index zu verbessern und Fasten- und 2hPG-Werte zu senken. Daher kann die Aufklärung der Beziehung zwischen Akupunktur, Redox und IGT Ansätze bieten, um IGT umzukehren oder in dessen Fortschreitung einzugreifen, wodurch die Häufigkeit von Diabetes mellitus reduziert und Einblicke in die Pathologie von IGT und die zugrunde liegenden Mechanismen vermitteln.

Die vorliegende Studie schlägt eine dual-rillen-redox-sensitive, oberflächenverstärkte, Raman-streuungsaktive Mikronadelplattform vor, die Akupunkturintervention mit lokaler ratiometrischer SERS-Verfolgung in einem Rattenmodell mit beeinträchtigter Glukosetoleranz kombiniert. In diesem System wurden zwei geätzte Rillen auf einer einzelnen Akupunkturnadel verwendet, um oxidativ-kapazitäts-responsive und redox-potenzial-responsive Sonden zu führen. Dieses Design ermöglichte es der Akupunkturnadel, nicht nur als Interventionswerkzeug zu dienen, sondern auch als Sensorträger für relativ lokale, redoxassoziierte optische Messungen. Die Ergebnisse zeigten, dass Needling an Akupunkturpunkten mit Twisting mit niedrigeren Nüchternblutzucker- und 2hPG-Werten sowie mit Veränderungen der oxidativ-kapazitätsbezogenen und redox-potentiell-bezogenen SERS-Indizes bei Ratten mit beeinträchtigter Glukosetoleranz assoziiert war. Diese Ergebnisse unterstützen die Machbarkeit, SERS-aktive Mikronadeln zur Untersuchung lokaler, redoxassoziierter Reaktionen während der Akupunkturintervention zu erforschen. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass das Nadeln an Akupunkturpunkten mit Twisting mit niedrigeren FPG- und 2hPG-Werten sowie mit Veränderungen der OC- und RP-bezogenen Sers-Indizes bei IGT-Ratten assoziiert war. Diese Ergebnisse stützen die Machbarkeit, SERS-aktive Mikronadeln zu verwenden, um lokale redoxassoziierte optische Reaktionen während der Akupunkturintervention zu verfolgen. Da jedoch keine standardmäßigen biochemischen oxidativen Stresstests, Probe-Leaching-Analysen und Gewebe-Biokompatibilitätstests durchgeführt wurden, sollten die beobachteten SERS-Index-Änderungen nicht als endgültiger biochemischer Beweis für die Verbesserung des oxidativen Stresses interpretiert werden.

Mehrere alternative Ansätze könnten verwendet werden, um dieselbe Hypothese weiter zu untersuchen. Standard-biochemische oxidative-Stress-Tests, einschließlich Messungen von reaktiven Sauerstoffspezies, Malondialdehyd, Superoxiddismutase, Katalase, Glutathionperoxidase und Glutathion/Glutathion-Disulfid-Verhältnissen, könnten verwendet werden, um zu validieren, ob Änderungen der von SERS abgeleiteten Indizes den konventionellen oxidativen Stress-Biomarkern entsprechen^32,33. Elektrochemische Redoxsonden, fluoreszenzbasierte Redoxsensoren, chemilumineszenzteste, Mikrodialyse gefolgt von biochemischer Analyse sowie gewebebasierte immunhistochemische oder histologische Validierung können ebenfalls ergänzende Informationen liefern. Die Kombination von SERS-aktiver Mikronadel-Sensing mit diesen unabhängigen Ansätzen würde helfen, festzustellen, ob die beobachteten optischen Veränderungen spezifische biochemische Redox-Veränderungen oder breitere lokale Gewebereaktionen auf Needling und metabolischen Status³⁴ widerspiegeln.

Die potenziellen Anwendungen dieser Methode gehen über das derzeitige Modell der beeinträchtigten Glukosetoleranz hinaus. Da ein Redoxungleichgewicht an Stoffwechselerkrankungen, Gewebeschädigungen, Entzündungen und Wundreparatur beteiligt ist, könnten SERS-aktive Mikronadeln ein nützliches präklinisches Werkzeug zur Überwachung lokaler Redox-assoziierter Reaktionen in diabetesbezogenen Modellen, Wundheilungsstudien, entzündlichen Krankheitsmodellen und anderen minimalinvasiven Interventionsumgebungen^{sein 35}. In der Akupunkturforschung kann die Plattform nützlich sein, um Akupunkturpunkte, Nicht-Akupunkturstellen, verschiedene Needling-Manipulationen und unterschiedliche Interventionspläne zu vergleichen. Diese Anwendungen bleiben jedoch explorativ und erfordern weitere technische und biologische Validierung.

Es sollten mehrere Einschränkungen beachtet werden. Erstens wurden die OC- und RP-Anzeigen als von SERS abgeleitete Ratiometrie-Indizes berechnet und nicht anhand der Standardkonzentrationen oxidativer Spezies oder absoluter elektrochemischer Redox-Potentialwerte kalibriert. Daher sollten die vorliegenden Ergebnisse als relative, redoxassoziierte optische Reaktionen unter identischen Erfassungsbedingungen und nicht als absolute biochemische Messungen interpretiert werden. Zweitens kann die biologische Gewebemikroumgebung zusätzliche Quellen von Signalvariationen einführen, darunter lokale pH-Veränderungen, Proteinadsorption, extrazelluläre Matrixkomponenten und andere Matrixeffekte. Diese Faktoren wurden in serumhaltigen oder gewebenachahmenden Medien nicht vollständig untersucht. Drittens wurden die tatsächliche Laserleistung, die an die Gewebeoberfläche geliefert wurde, und die lokale Temperaturänderung während der Raman-Aufnahme nicht direkt gemessen; daher können potenzielle photothermische oder photochemische Effekte nicht vollständig ausgeschlossen werden. Viertens wurde die Reproduzierbarkeit der Nutgeometrie und der Sondenbelastung auf Chargenebene weder quantitativ durch Mehrnadel-SEM-Bildgebung noch durch Lasteffizienzanalyse bewertet. Schließlich wurden keine unabhängige biochemische Validierung, Probe-Leaching-Analyse und lokale Biokompatibilitätstests durchgeführt. Zukünftige Studien sollten Kalibrierungskurven in biologisch relevanten Matrizen etablieren, SERS-Indizes mit Standard-oxidativen Stress- und Redox-Assays korrelieren, die Probe-Laugung quantifizieren, lokale Gewebekompatibilität nach wiederholtem Einsetzen bewerten und das Gerät in größeren Tierkohorten validieren. SERS-aktive Mikronadeln können eine nützliche Plattform bieten, um Akupunkturintervention mit relativer ratiometrischer SERS-Verfolgung lokaler Redox-assoziierter Indizes in einem präklinischen IGT-Rattenmodell zu kombinieren. Weitere Kalibrierungen, biochemische Validierung, Probe-Leaching-Bewertung und Biokompatibilitätsstudien sind erforderlich, bevor eine absolute quantitative Überwachung oder translationale Anwendung geltend gemacht werden kann.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES, 98%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A800524
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilan (MPTES, 95%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	M742544
Ascorbinsäure	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CFAD310554
Blutzuckermessgerät	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe A03
Blutzucker-Teststreifen	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe-A03-C
Kupfersulfat (CuSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	PHR1477
Ethylalkohol (≥99,7%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW00641752
Eisen(II)-sulfat (FeSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW01772078701
Glukose (Glu)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	D9434
Wasserstoffperoxid (H2O2)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	P-17-0500
Eisen(III)-chlorid (FeCl3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CP81015228
Methylmethacrylat (MMA)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	M109626
Mikro-Raman-Spektrometer	Renishaw	InVia Raman Mikroskop
p-Phenylendiamin (p-PDA)	Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd.	P128784
Polymethylmethacrylat (PMMA)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	P742581
Rasterelektronenmikroskop	Zeiss	ULTRA Plus
Natriumborhydrid (NaBH4)	Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd.	S432207
Natriumsulfit (Na2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	S572396
Nadeln für die Akupunktur aus rostfreiem Stahl	Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd.	X-20-03
Statistisches Analysesoftware	International Business Machines Corporation	Version 2021
Streptozotocin (STZ)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	S408311
Tetrachlorogoldsäure (HAuCl4)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A124024
SPSS-Software	International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA	Version 26.0
Ratten	Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd.	Spezifische-Pathogen-freier männlicher Sprague-Dawley
Basisfutter	Anuokang Biotech.	SY10001
Schweinefett	MCE	HY-W127601
Saccharose	MCE	HY-B1779
Eigelbpulver	MCE	HY-B2235B
Zitronensäuremonohydrat	Sigma-Aldrich	C1909
Trinatriumcitratdihydrat	Sigma-Aldrich	S4641
Citrate-Puffer	beyotime	P0086
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	beyotime	ST448-1L
Isofluran	Bioss	D54468
Isofluran-Anästhesiesystem für Kleintiere	RWD Life Science	R500
Induktionskammer und Nasenkonus	RWD Life Science	R500kompatible Zubehörteile
Wärmepad	Shanghai Yuyan Life Science	Y69020
75% Ethanol	Boyu Bio.	YB60401
CO2-Euthanasiekammer	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	Beijing Kingsoft Office Software	WPS365