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Methodenartikel

Optisches System zur Beurteilung der atrialen und ventrikulären Mechanik in Langendorff-perfundierten Mäuseherzen

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DOI:

10.3791/72264

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14. August 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Entnahme und Kanülierung des Mausherzens sowie die Vorbereitung und Konfiguration des Langendorff-Rückwärts-Perfusionssystems. Der experimentelle Aufbau ist mit einem hochauflösenden optischen System gekoppelt, das darauf ausgelegt ist, die mechanischen Reaktionen der Vorhöfe und Ventrikel zu bewerten, während deren natürliche Dynamik erhalten bleibt.

Zusammenfassung

Das Mausherz dient in der kardiovaskulären Forschung als weit verbreitetes Modell, was durch Fortschritte in der Ingenieurtechnik erleichtert wird. Die Beurteilung der Vorhof- und Ventrikelkontraktilität bleibt jedoch aufgrund der geringen Größe des Mausherzens herausfordernd. Diese Studie stellt eine neuartige Methodik zur Bewertung der Kontraktilität und Herzfrequenz in einem intakten, isolierten Herzen vor. Die Kombination eines Langendorff-perfunden Mausherzens mit einem hochauflösenden optischen System ermöglicht die Beurteilung der Vorhof- und Ventrikelkontraktilität. Der experimentelle Aufbau begegnet den Herausforderungen, die mit der geringen Herzgröße und hohen Kontraktionsfrequenzen verbunden sind, und ermöglicht gleichzeitig die Erfassung hochauflösender Signale. Die Synchronisation zwischen Stimulationsfrequenz und Herzkontraktionsfrequenz im Bereich von 420 bis 660 Schlägen pro Minute (bpm) stimmte mit den Ergebnissen der auxotonen Methode überein. Zudem erlauben Messungen der ventrikulären Verkürzung und der dynamischen atrialen Signale die Bestimmung der atrioventrikulären Kontraktion. Diese Methode eignet sich zur Beurteilung der Kontraktilität und Herzfrequenz in einem intakten, isolierten Herzen ohne pharmakologische oder systemische Einflüsse. Diese Ergebnisse zeigen, dass das optische System die Messung der ventrikulären und atrialen Verkürzungsreaktionen ermöglicht.

Einleitung

In der Herzphysiologie gibt es noch viel zu entdecken; zentrale Vorgänge wie die Schrittmacheraktivität des Herzens und die Erregungs-Kontraktions-Kopplung sind grundlegende Prinzipien, die kontinuierlich erforscht werden1. Obwohl die Auswirkungen biologischen Rauschens auf die herzliche Kontraktilität2 und die Schrittmacheraktivität noch wenig verstanden sind1, haben neue optische Bildgebungsverfahren die Vorstellung neuer Paradigmen ermöglicht3,4.

Zwei experimentelle Methoden unter Verwendung des Langendorff-Systems haben wertvolle Beiträge zur Messung der Herzfunktion geleistet. Erstens die isovolumetrische Kontraktionsmethode, bei der ein Signal von einem kleinen Ballon abgeleitet wird, der in den linken Ventrikel eingeführt ist5,6,7. Zweitens die auxotonische Registrierungsmethode, bei der ein Signal gewonnen wird, indem ein Ende eines Fadens am Herzapex vernäht und das andere Ende mit einem mechanischen Aufzeichnungsgerät verbunden wird, um auxotonische Kontraktionen entlang der Herzachse zu messen2,8. Die Beurteilung der Kontraktilität von Vorhof und Ventrikel im Mausherzen ist jedoch aufgrund der geringen Größe des Organs herausfordernd. Außerdem erfordert die Präparation eine gewisse Sorgfalt, da das Herz verletzungsanfällig ist9,10,11,12,13.

Das optische System zur Beurteilung der mechanischen Dynamik von Mäuseherzen weist mehrere neuartige Merkmale und Vorteile auf. Erstens eignet sich diese Methode zur Bewertung der Kontraktilität und der Herzfrequenz in einem intakten, isolierten Herz ohne pharmakologische oder systemische Einflüsse. Das Protokoll könnte außerdem effektiv in Experimenten zur Untersuchung von Ischämie-Reperfusionsschäden eingesetzt werden, wenn pharmakologische, zellregenerative oder auf Sauerstofftherapie basierende Behandlungen untersucht werden.

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Aufzeichnung biophysikalischer Parameter der kontraktilen Funktion der Maus-Herzmuskulatur mittels eines hochauflösenden optischen Systems vor. Diese Methode ermöglicht die Beurteilung der Kontraktilität und der Herzfrequenz an einem intakten, isolierten Herzen. Darüber hinaus erlaubt sie die Bewertung der Vorhof- und Ventrikelkontraktilität. Die Langendorff-Präparation am Mauseherz stellt eine Weiterentwicklung dar, die eine geringfügige Modifikation einschließt, um den Verlust der Perfusattemperatur und Bewegungsartefakte zu minimieren, ohne die Muskelkontraktionen zu beeinträchtigen.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den bundesweiten Vorschriften für Tierversuche und Tierversuchstierhaltung durchgeführt und vom Ausschuss für Tierversuchstierhaltung des CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Mexiko) genehmigt. In dieser Studie wurden männliche C57BL/6J-Mäuse verwendet, die 28–34 g wogen und 8–14 Wochen alt waren. Alle im Protokoll verwendeten Materialien und Geräte sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt. Die Zusatzdateien 1–11 enthalten ergänzende Abbildungen, Software-Anleitungen, Analyseprogramme, Stimulationsdaten und Anwendungsdateien für das Protokoll.

1. Herstellung der Stammlösungen

  1. Bereiten Sie zwei Stammlösungen im Voraus vor und lagern Sie sie bei 4 °C im Kühlschrank: (1) Stamm I, 1 L (in entionisiertem Wasser; in g/L: 76,13 NaCl, 4,02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0,4 NaH2PO4) und (2) Stamm II, 0,1 L (in entionisiertem Wasser; in g/L: 73,5 CaCl2(2H2O)).
    HINWEIS: Die Lösungen können bis zu 30 Tage nach der Herstellung verwendet werden. Lagern Sie sie bei 4 °C.

2. Anschluss an das Langendorff-System und Reinigung

  1. Verbinden Sie das Reservoir (1), das Reservoir-Warmwasserbad (2), die Perfusionspumpe (3), die Serpentine (4), den Serpentinenumwälzer (5), das Überwachungssystem (6) und das Drainagesystem (8) wie in Abbildung 1A dargestellt.
    HINWEIS: Die Verbindung zwischen dem Überwachungssystem und dem Drainagesystem ist in Ergänzende Datei 1 detaillierter dargestellt.
  2. Füllen Sie das Langendorff-System mit 1 L entionisiertem Wasser bei 50 °C, starten Sie anschließend die Perfusions- und Drainagepumpen (Ergänzende Datei 1, Drainagesystem). Entfernen Sie nach etwa 20–30 Minuten die Flüssigkeit aus dem System und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
    HINWEIS: Überprüfen Sie, ob im System keine Lecks oder Druckabfälle auftreten. Falls dies der Fall ist, setzen Sie das Experiment nicht fort.
  3. Füllen Sie das System mit 1 L 1%iger Essigsäure (in entionisiertem Wasser gelöst), schalten Sie dann die Perfusions- und Drainagepumpen aus und warten Sie 60 Minuten. Schalten Sie danach die Pumpen wieder ein, um die Flüssigkeit zu entfernen.
  4. Wiederholen Sie Schritt 2.2 zweimal.
  5. Füllen Sie das System mit 70%igem Ethanol (in entionisiertem Wasser gelöst), um die Adhäsion von Lösungskomponenten zu verhindern.
    HINWEIS: Das Langendorff-Perfusionssystem muss alle zehn Experimente oder monatlich gereinigt werden. Das Reinigungsprotokoll vor dem Experiment wird in Abschnitt 4 erläutert. Das Reinigungsprotokoll nach dem Experiment ist in Abschnitt 8 beschrieben.

3. Herstellung der Tyrode-Lösung während des Experiments

  1. Bereiten Sie 1 L der Lösung in mM vor: 130,25 NaCl, 5,4 KCl, 0,53 MgCl2(6H2O), 0,33 NaH2PO4, 1,8 CaCl2(2H2O), 10 D-Glucose, 10 HEPES, eingestellt auf pH 7,35 ± 0,05 mit NaOH.
    1. Mischen Sie 100 mL der Stammlösung I mit 700 mL entionisiertem Wasser unter ständigem Rühren und erhöhen Sie anschließend die Temperatur der Lösung auf 37 °C; halten Sie die Sauerstoffversorgung der Lösung aufrecht, indem Sie den O2-Behälter mit dem Luftsauerstoffstein verbinden, wie in Abbildung 1A (1) gezeigt.
    2. Geben Sie 3,6 mL der Stammlösung II und 96,4 mL entionisiertes Wasser hinzu, um 1,8 mM CaCl2(2H2O) zu erhalten, und fügen Sie anschließend NaOH hinzu, um den pH-Wert auf 7,35 ± 0,05 einzustellen.
    3. Füllen Sie mit entionisiertem Wasser auf, um 1 L Tyrode-Lösung zu erhalten.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, 100 mL der Lösung im Kühlschrank bei 4 °C aufzubewahren; dieses Volumen wird später in Schritt 6 benötigt.

4. Vorbereitung des Langendorff-Systems

HINWEIS: Falls das Langendorff-System am Tag des Experiments nicht mit Ethanol gefüllt ist, wird davon abgeraten, mit dem Verfahren fortzufahren; stattdessen wiederholen Abschnitt 2.

  1. Schalten Sie die Perfusions- und Drainagepumpe ein. Stellen Sie die Flussrate der Perfusionspumpe auf 3 mL/min und die der Drainagepumpe auf 10 mL/min ein. Entleeren Sie das System.
  2. Füllen Sie das System mit 1 L deionisiertem Wasser 37 °C, dann das Wasser abgießen.
  3. Füllen Sie das System mit der in Tyrode-Lösung hergestellten Lösung Schritt 3 und die Lösung bei physiologischer Temperatur und konstanter Sauerstoffversorgung halten.
  4. Schalten Sie die Reservoir-Warmwasserbäder und den Spiral-Rezirkulator ein. Stellen Sie die Reservoirtemperatur (Abbildung 1A (2)) auf 38 °C um die Lösung unter physiologischen Bedingungen zu halten. Stellen Sie die Temperatur der Serpentine ein (Abbildung 1A (5)) bei 40 °CDies gleicht den Temperaturverlust in der Lösung des Langendorff-Systems aus.
    HINWEIS: Falls die Temperatur der Tyrode-Lösung am Systemausgang nicht physiologisch ist (37 ± 0.5 °C), stellen Sie die Temperatur des serpentinenförmigen Rezirkulators ein. Es wird nicht empfohlen, mit Schritt 6 fortzufahren, bis die Temperatur den entsprechenden Wert stabil erreicht hat.
  5. Schalten Sie den Druckmonitor ein (Zusatzdatei 1, Überwachungssystem) und kalibrieren Sie im Bereich von 0–200 mmHg. Zur Kalibrierung des Systems steht die Überwachungs- und Stimulations-Software zur Verfügung (Zusatzdatei 3 und Zusatzdatei 11).
    HINWEIS: Es ist unbedingt erforderlich, sicherzustellen, dass im System kein Druckverlust und keine Blasen vorhanden sind. Falls sich Blasen im System befinden, vorübergehend den unteren Auslass des Spiralrohres verschließen und das obere Ventil öffnen; dadurch füllt sich die Säule und die Blasen können nach außen entweichen. Es wird nicht empfohlen, das Experiment fortzusetzen, bis diese Bedingung überprüft wurde.

5. Optisches System14

  1. Bauen Sie die CMOS-Kamera (Abbildung 1A, 10), das verstellbare Kameraobjektiv (LC) und das Beleuchtungssystem zusammen.
    ANMERKUNG: Das Beleuchtungssystem besteht aus zwei LEDs (Abbildung 1A, 9), zwei plan-konvexen Beleuchtungslinsen (LI), einer Beleuchtungssteuerung (Abbildung 1A, 11), einer Aufnahmekarte (ergänzende Datei 1, Überwachungssystem) und 3D-gedruckten Halterungsteilen (ergänzende Datei 1).
  2. Platzieren Sie ein Referenzobjekt mit einem Volumen von etwa 1.000 mm3 in einem Abstand von 100–200 mm zur Objektivmitte der Kamera (Mitte von Abbildung 1A).
    ANMERKUNG: Das Objekt muss an der Position des Herzens im Langendorff-System platziert werden. Diese Position ist in Abbildung 1B erkennbar, insbesondere im Zentrum des Bildes, wo die Lichtstrahlen auftreffen.
  3. Starten Sie die Kamera-Aufnahmesoftware und stellen Sie die Kamera auf eine Untertastung von 4x ein (4 Pixel = 1 Unterpixel). Legen Sie einen interessierenden Bildbereich (ROI) von 200 × 200 Unterpixeln fest (ergänzende Datei 2).
    ANMERKUNG: Mit dieser Konfiguration ist eine zeitliche Auflösung von 750 Bildern pro Sekunde (fps) möglich.
  4. Schalten Sie das Beleuchtungssystem ein (ergänzende Datei 1), richten Sie die Lichtstrahlen auf das Referenzobjekt aus und erzielen Sie eine homogene Beleuchtung (Abbildung 1B).
  5. Stellen Sie die Lichtintensität am Referenzobjekt so ein, dass eine Überbelichtung des Bildes vermieden wird.
    ANMERKUNG: Das Bild sollte wie Abbildung 2A (oder Abbildung 1C, Steuer-PC) aussehen. Reflexionen auf der Oberfläche des Objekts (Herz) müssen so weit wie möglich reduziert werden, ohne die Konturdefinition zu verlieren. Dies kann durch Anpassung der Leistung der Beleuchtungssteuerung oder durch Verringerung der Belichtungszeit in den Kameraeinstellungen erreicht werden.
  6. Fokussieren Sie das Kameraobjektiv, um ein scharfes Bild des Referenzobjekts zu erhalten (Abbildung 1C, Steuer-PC). Stellen Sie sicher, dass das Referenzobjekt 80 % des Sichtfeldes einnimmt (Abbildung 2A), um eine Umrechnungsskala von etwa 61 µm pro Unterpixel zu erhalten.
    ANMERKUNG: Das optische System aktiviert das Beleuchtungssystem automatisch, sobald die Kamera in den Aufnahmemodus geschaltet wird (Abbildung 1A und ergänzende Datei 2). Es wird empfohlen, die Kamera im Standby-Modus zu belassen, sodass das Beleuchtungssystem ausgeschaltet bleibt und nur während der experimentellen Datenaufnahme aktiviert wird, um eine Überhitzung zu vermeiden.

6. Chirurgische und Kanülierungsverfahren

  1. Heparinisierung und Anästhesie
    1. Stellen Sie eine anästhetische Mischung her, die Tiletamin-Zolazepam (40 mg/kg Körpergewicht der Maus) und Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht der Maus) enthält, und verdünnen Sie diese mit physiologischer Kochsalzlösung auf 200 µL.
    2. Spritzen Sie die anästhetische Mischung intraperitoneal mit einer 27-G-Nadel ein. Lassen Sie die Maus in eine tiefe Anästhesie eintreten.
      HINWEIS: Überprüfen Sie das Fehlen eines Reflexes auf einen Reiz an den Gliedmaßen oder am Schwanz (üblicherweise sind 10 Minuten ausreichend).
    3. Injizieren Sie 200 IE unfraktioniertes Heparin intraperitoneal mit einer 27-G-Nadel und warten Sie etwa 5 Minuten, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren.
  2. Entnahme und Kanülierung
    1. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage, entfernen Sie das Fell und die Haut im Brustbereich mit einer chirurgischen Schere.
    2. Führen Sie einen Bauchschnitt unterhalb des Zwerchfells durch und achten Sie darauf, dessen Integrität zu bewahren.
    3. Fahren Sie mit einem quer verlaufenden Schnitt im Zwerchfell fort und führen Sie schnell eine beidseitige aufsteigende Thorakotomie durch die Rippen durch, anschließend entfernen Sie die Rippenwand.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, das Herz nicht zu beschädigen. Falls das Herz während des Eingriffs beeinträchtigt oder beschädigt wird, sollte das Experiment nicht fortgesetzt werden.
    4. Halten Sie die oberen Strukturen des Herzens vorsichtig mit feiner Pinzette, dem Aortenbogen und den angrenzenden Gefäßen. Heben Sie diese sanft an, um darunter und nach oben einen Schnitt zu setzen, und entfernen Sie Herz und Lunge gemeinsam.
    5. Überführen Sie das Herz schnell in eine Petrischale mit 50 mL Tyrode-Lösung bei 4 °C zur ersten Spülung.
      HINWEIS: Ab dem Zeitpunkt des Zwerchfell-Schnitts beginnt das Tier Atemnot zu erleiden; ab diesem Zeitpunkt verbleibt eine Zeitspanne von 60 Sekunden, um die Schritte 6.2.3–6.2.6 durchzuführen. Die Überschreitung dieses Zeitlimits kann ischämische Schäden verursachen.
    6. Entfernen Sie Lunge und überschüssiges Fettgewebe, um den Aortenbogen unter dem Stereomikroskop mit feiner Schere freizulegen.
      HINWEIS: Während der Gewebereinigung sicherstellen, dass der Aortenbogen nicht beschädigt wird. Falls die Aorta unterhalb der Arteria brachiocephalica durchtrennt wird, wird die Kanülierung erschwert und es können Drucklecks entstehen.
    7. Überführen Sie das Herz in die eigens angefertigte Kanülierungsunterlage mit 50 mL Tyrode-Puffer bei 4 °C und führen Sie das aortale Ende in die speziell angefertigte Kanüle aus einer 20-G-Nadel ein (Supplementary File 1).
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die Aortenklappe nicht zu beschädigen. Falls die Klappe beeinträchtigt ist, schwillt das Herz an und die koronare Durchspülung funktioniert nicht ordnungsgemäß.
    8. Binden Sie zwei Kanülierungsknoten mit 4/0-Seidennaht: den ersten in der Vertiefung distal zur Kanülenspitze und den zweiten vor dem Truncus brachiocephalicus (Supplementary File 1).
    9. Tragen Sie langsam Tyrode-Lösung mit einer 1-mL-Spritze, gefüllt mit Puffer bei Raumtemperatur, auf. Überprüfen Sie, ob das koronare Gewebe klar wird, um eine erfolgreiche Kanülierung zu bestätigen.
    10. Entfernen Sie Fettgewebe, um Zugang zu Ventrikeln und Vorhöfen zu erhalten.
      HINWEIS: Vermeiden Sie eine Kanülierungsdauer von mehr als 5 Minuten, um die Lebensfähigkeit des Herzens zu bewahren.
    11. Überführen Sie das Herz in ein Langendorff-System und lassen Sie es sich 30 Minuten lang stabilisieren.
      HINWEIS: Das Herz wird in der Mitte des Systems platziert (Abbildung 1A,B), vertikal aufgehängt. Beim Aufhängen des Herzens ist äußerste Vorsicht geboten, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Tritt dies auf, steigt der Druck über 140 mmHg, das Herz beginnt anzuschwellen und ist nicht mehr lebensfähig.
      HINWEIS: Die Langendorff-Montage ist abgeschlossen, wenn das Herz eine mechanisch stabile Reaktion zeigt, eine natürliche Oszillationsfrequenz von etwa 360 Schlägen pro Minute (BPM) aufweist und ein Perfusionsdruck zwischen 60 und 110 mmHg vorliegt.

7. Pulsprotokoll und Videobildaufnahme

  1. Herzvitalität
    1. Überprüfen Sie, ob der koronare Druck im Bereich von 60–110 mmHg bei einer Perfusionspumpe mit 3 mL/min liegt. Falls der koronare Perfusionsdruck unter 60 mmHg sinkt, erhöhen Sie leicht die Flussrate der Perfusionspumpe (niedriger Druck führt dazu, dass das Herz blass und schlaff wird). Umgekehrt verringern Sie bei einem Druck über 110 mmHg die Flussrate der Pumpe leicht (übermäßiger Druck verursacht Gewebeödeme und einen progressiven Druckanstieg bis zum Herzstillstand).
      HINWEIS: Eine längere Aufrechterhaltung des Perfusionsdrucks außerhalb des oben genannten optimalen Bereichs beeinträchtigt die Herzvitalität irreversibel.
    2. Platzieren Sie das Herz in einer frontalen Position, sodass eine vollständig frontale Ansicht in der Kamera sichtbar ist. Passen Sie die Position so an, dass beide Vorhöfe in der Kamera sichtbar sind (Abbildung 2A).
    3. Platzieren Sie die Platinelektroden vorsichtig oberflächlich auf dem rechten Vorhof am Sinusknoten. Nutzen Sie das Kamerabild als Orientierungshilfe, um die Elektroden in das Sichtfeld zu bringen. Positionieren Sie die Elektrode so, dass sie den rechten Vorhof nicht verdeckt. Bewegen Sie die Elektrode unter Beobachtung der Live-Ansicht langsam vorwärts, bis sie das Vorhofgewebe berührt, und achten Sie darauf, keinen übermäßigen Druck auszuüben (da dies den rechten Vorhof im Bild abflachen würde).
      HINWEIS: Bei korrekter Durchführung entspricht die Kameraansicht Abbildung 2A.
    4. Starten Sie die Überwachungs- und Stimulationsanwendung (Zusatzdatei 11) und schalten Sie die Erfassungskarte ein (Abbildung 1A (6)). Stellen Sie die Stimulationsparameter ein: Amplitude bei 2 V, Frequenz bei 420, 540 und 720 Impulsen pro Minute (IPM) mit einem rechteckförmigen Puls mit 7 ms Einschaltdauer (Einschub in Abbildung 2A).
    5. Wenden Sie die Vitalitätsstimulation beginnend mit der niedrigsten Frequenz an, wobei jede Stimulation 20 s dauert, gefolgt von einer 20 s langen Erholungsphase (Ruhezeit) zwischen den einzelnen Reizen.
      HINWEIS: Beurteilen Sie die Herzvitalität anhand der Kameraüberwachung. Ist das Organ physiologisch funktionsfähig, wird eine Synchronisation zwischen dem applizierten Reiz und der Herzantwort beobachtet, begleitet von einer ordnungsgemäßen Koordination zwischen den Herzkammern. Umgekehrt zeigt sich ein Mangel an Vitalität durch einen Verlust der Kammerkoordination oder durch das alleinige Auftreten isolierter Vorhofkontraktionen.
    6. Schließen Sie die Kammer, da das Experiment empfindlich gegenüber Raumlicht und thermischen Schwankungen ist (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Die Kammertür muss während der gesamten Versuchsdauer geschlossen bleiben. Überwachen Sie die Herzvitalität mittels Kamera und Perfusionsdruck.
  2. Datenaufzeichnung
    1. Wenden Sie den Stimulationsprotokoll an, das aus 30 s langen Rechteckpulszügen besteht, gefolgt von 30 s ohne Signal. Stellen Sie die Stimulationsparameter für jeden Stimulationszug ein: Amplitude bei 2 V, 7 ms Einschaltdauer und Frequenz im Bereich von 360 bis 720 IPM.
      HINWEIS: Das Stimulationsprotokoll beginnt bei 360 IPM und erhöht sich in jedem Zeitschritt um 60 IPM (Einschub von Abbildung 2A).
    2. Nehmen Sie kontinuierlich Videos der Dynamik der frontalen Herzansicht im .avi-Format mit der Kameraerfassungssoftware auf (Zusatzdatei 2). Erstellen Sie eine 20 s lange Videosequenz für jeden Stimulationszug. Beginnen Sie die 20 s lange Aufnahme 5 s nach Start der Stimulation. Eine repräsentative Rohaufnahme ist in Zusatzfilm 1 enthalten.
      HINWEIS: Ein Computer zeichnet gleichzeitig den applizierten Stimulationszug (.xls, Zusatzdatei 9) für jedes aufgezeichnete Video (.avi) auf, die jeweils von der Überwachungs- und Stimulationsanwendung sowie der Kameraerfassungssoftware generiert werden (Zusatzdatei 2 und Zusatzdatei 3).
    3. Überprüfen Sie die Herzvitalität, indem Sie das erste Video, das vor Beginn des Stimulationsprotokolls aufgenommen wurde, mit dem zweiten Video, das nach Anwendung des Protokolls aufgenommen wurde, vergleichen (Abbildung 2B).

8. Nachbereitung des Langendorff-Perfusionsystems nach dem Experiment

  1. Entfernen Sie den Stimulator und die EKG-Platinelektroden. Entnehmen Sie das Herz aus dem System und lassen Sie alle restlichen Tyrode-Lösungen ablaufen.
  2. Schalten Sie das optische System aus und schließen Sie das O2-Ventil.
  3. Spülen Sie das System mit 1 L entionisiertem Wasser bei 37 °C durch und lassen Sie es anschließend ablaufen.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5.
  5. Schalten Sie alle Systeme und Geräte aus.

9. Videobearbeitung

  1. Importieren Sie zunächst jedes Video in eine Software und wenden Sie eine Videonormalisierungsfunktion an15.
  2. Wählen Sie einen interessierenden Bereich (ROI), der den Herzbereich umfasst. Führen Sie eine Bildsegmentierung durch, um Hintergrundrauschen, Elektroden und die Kanüle zu entfernen (ergänzende Datei 4).
    HINWEIS: Um den korrekten Bildbereich für die Entfernung auszuwählen, ziehen Sie bitte ergänzende Datei 10 heran.
  3. Führen Sie eine globale Analyse der mechanischen Dynamik durch (ergänzende Datei 5). Beispiele zur Variabilität und zu Signalen sind in ergänzender Abbildung S1, ergänzender Abbildung S2 und ergänzender Abbildung S3 dargestellt.
    1. Wenden Sie morphologische Operatoren auf jeden Videorahmen an, um den Herzumriss zu erkennen, und anschließend einen Füllalgorithmus, um eine Maske zu erzeugen15.
    2. Zählen Sie die Pixel innerhalb des segmentierten Bereichs in jedem Frame und normalisieren Sie diesen Wert durch die Gesamtanzahl der Pixel im Bild, um ein dynamisches Signal zu erzeugen (Einlage in Abbildung 2B und ergänzende Abbildung S3).
    3. Wenden Sie einen bidirektionalen Butterworth-Filter 5. Ordnung zwischen 3 und 100 Hz auf das erhaltene Signal an, um hochfrequentes Rauschen und Artefakte durch Perfusionsauftropfen zu unterdrücken15.
    4. Normalisieren Sie die Signale über alle Videos hinweg unter Verwendung der aufgezeichneten Maximal- und Minimalwerte.
    5. Bestimmen Sie die Herzfrequenz, indem Sie das Intervall zwischen zwei Maximalamplitudenwerten (IAA (s)) für jedes dynamische und Reizsignal berechnen.
    6. Berechnen Sie die Frequenz in Schlägen pro Minute (BPM) mit der folgenden Formel:
      Gleichung zur Frequenzberechnung, die zeigt, dass die Herzfrequenz in BPM gleich 60 geteilt durch IAA ist.
    7. Erzeugen Sie Poincaré-Diagramme aus den IAA-Daten, um die Variabilität über kurze und langfristige Zeiträume zu veranschaulichen16,17,18 (ergänzende Abbildung S1 und ergänzende Abbildung S2).
      HINWEIS: Detailliertere Informationen finden Sie in ergänzender Datei 10.
  4. Führen Sie eine segmentale Analyse der ventrikulären mechanischen Dynamik durch (ergänzende Datei 6).
    1. Wenden Sie eine Bildbinarisierung an. Nutzen Sie morphologische Operatoren, um den ventrikulären Bereich abzugrenzen, und passen Sie ihn an eine elliptische Geometrie an, ohne den ROI zu beeinträchtigen15.
    2. Passen Sie eine minimale Ellipse an den ventrikulären Bereich in jedem Frame an. Extrahieren Sie die Koordinaten einer Reihe distaler Punkte in einem Frame. Verwenden Sie 10–20 Punkte an jedem Extrem entlang der Y-Achse (Abbildung 3A). Ein repräsentativer Ausgabewert der Ellipsenschätzung ist in ergänzendem Film 2 enthalten.
    3. Berechnen Sie die ventrikuläre Verkürzung als mittleren Abstand zwischen den Extrempunkten entlang der Y-Achse in jedem Video19.
    4. Wenden Sie einen bidirektionalen Butterworth-Filter 5. Ordnung zwischen 3 und 100 Hz auf das erhaltene Signal an, um hochfrequentes Rauschen und Artefakte durch Perfusionsauftropfen zu unterdrücken15.
    5. Normalisieren Sie das Signal der ventrikulären Verkürzung relativ zu allen für jede Stimulation aufgezeichneten Videos und berechnen Sie Herzfrequenz und Verzögerung wie in den Schritten 9.3.5–9.3.6.
      HINWEIS: Parameter wie ventrikuläre Zyklusdauer (DVE), Relaxationsdauer (DVW), interventrikuläres Intervall (IVV) und ventrikuläre Amplitude (VA) werden ermittelt (Abbildung 3A).
      HINWEIS: Detailliertere Informationen finden Sie in ergänzender Datei 10.
  5. Führen Sie eine segmentale Analyse der mechanischen Dynamik der Vorhöfe durch (ergänzende Datei 7).
    1. Verwenden Sie zwei ROIs, um die Vorhöfe abzugrenzen (Abbildung 3C).
    2. Analysieren Sie jeden Vorhof einzeln.
      1. Verwenden Sie morphologische Operatoren, um die Vorhöfe abzugrenzen, und passen Sie diese an, ohne den ROI zu beeinträchtigen15. Wenden Sie einen Kontrastverstärkungs-Algorithmus an, um jeden Vorhof zu definieren20,21.
      2. Wenden Sie eine Bildbinarisierung an und quantifizieren Sie die Anzahl der von Null verschiedenen Pixel pro Frame, um ein dynamisches Vorhofsignal zu erhalten.
      3. Wenden Sie einen bidirektionalen Butterworth-Filter 5. Ordnung zwischen 3 und 100 Hz auf die erhaltenen Signale an, um hochfrequentes Rauschen und Artefakte durch Perfusionsauftropfen zu unterdrücken15.
      4. Berechnen Sie den Mittelwert der beiden Vorhofsignale (Abbildung 3D).
    3. Normalisieren Sie das Signal der Vorhofverkürzung relativ zu allen für jede Stimulation aufgezeichneten Videos und berechnen Sie Herzfrequenz und Verzögerung wie in den Schritten 9.3.5–9.3.6.
      HINWEIS: Parameter wie Vorhofzyklusdauer (DAE), Vorhof-Vorhof-Intervall (IAT) und Vorhofamplitude (AA) werden ermittelt (Abbildung 3D). Detailliertere Informationen finden Sie in ergänzender Datei 10.
  6. Führen Sie eine elektromechanische Analyse durch13,22 (ergänzende Datei 8).
    1. Vergleichen Sie die Stimulationsdaten mit den Vorhof- und Ventrikelsignalen (Abbildung 3D).
    2. Berechnen Sie die Ausbreitungszeit im Herzensleitungssystem, indem Sie die Verzögerung zwischen Vorhof- und Ventrikelerignissen (AVD) unter Verwendung des applizierten Reizes als Referenz ermitteln.

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Ergebnisse

Die Experimente zur kardialen mechanischen Funktion werden mit der Langendorff-Apparatur durchgeführt, wie in Abbildung 1A (oben) dargestellt. Überwachungs- und optische Systeme ermöglichen die Videoaufzeichnung, sobald die Beleuchtungssteuerung ausgelöst wird, wie in Abbildung 1A (unten) gezeigt. Abbildung 1C zeigt die Außenansicht des thermostatisch geregelten Gehäuses, das entwickelt wurde, um da...

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Diskussion

Das Mausherz ist sehr empfindlich gegenüber Temperaturschwankungen2,9,10,11,22. In diesem Experiment wurde das perfundierte Herz vertikal positioniert. Wir führten eine geringfügige Modifikation durch, um den Temperaturverlust des Perfusats und Bewegungsartefakte bei der Langendorff-Perfusionsmethode zu minimieren. Eine Rezirkulationspumpe wurde dem Serpentins...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch eine Förderung der Sekretariat für Wissenschaft, Geisteswissenschaften, Technologie und Innovation (SECIHTI) mit der Nummer LN-2025-C-23 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1-mL-SpritzeBD Plastipak302485Chirurgisches Verfahren
20-G-NadelNIPROAH-2032Aortenkanüle
25-mm-Verstelllinse mit 8x- bis 100facher VergrößerungGenericN/VKameraobjektiv des optischen Systems; allgemein als verstellbares Kameraobjektiv zitiert
27-G-NadelBD PrecisionGlide302358Chirurgisches Verfahren
3D-gedruckte HalterungselementeCINVESTAVN/VIndividuell angefertigte 3D-gedruckte Halterungselemente
4-0-SeidennahtAMERICAN SUTURETGSN0901Aortenkanüle
40-A-NetzteilSTERENPRL-25LED-Netzteil
LufsteinN/VN/VSauerstoffanreicherung der Tyrode-Lösung
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306Tyrode-Lösung
D-GlukoseJ.T. Baker1916-01Tyrode-Lösung
AbflusspumpeCINVESTAVN/VIndividuell angefertigte Abflusspumpe; allgemein als Abflusspumpe zitiert
F = 25,4 mm, plan-konvexe LinseTHORLABSLA1951-ABeleuchtungslinse des optischen Systems; allgemein als plan-konvexe Beleuchtungslinse zitiert
EisessigsäureSigma-Aldrich695092Reinigung des Langendorff-Systems
HeparinPiSA060M91Antikoagulans
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode-Lösung
Leistungsstarke LEDsLuminiusCBT-90-G-L11-C12LED-Lichtquelle
BeleuchtungssystemCINVESTAVN/VIndividuelles Beleuchtungssystem; allgemein als Beleuchtungssystem zitiert
KClCTR SCIENTIFICCTR02196Tyrode-Lösung
LabVIEW-Software Version 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/VSoftware zur Ausführung der Überwachungs- und Stimulationsanwendung; allgemein als Überwachungs- und Stimulationsanwendung zitiert
MATLAB-SoftwareThe MathWorksN/VSoftware zur Berechnung, Normalisierung, Segmentierung und Analyse von Videos; allgemein als Berechnungssoftware zitiert
Sauerstoff medizinischer QualitätGRUPO INFRAN/VSauerstoffanreicherung der Tyrode-Lösung
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104Tyrode-Lösung
Mini-Pumpe mit variabler DurchflussrateCONTROL COMPANY3385Perfusionspumpe
Maus-Chirurgie-SetKent ScientificINSMOUSEKITChirurgisches Verfahren
NaClSigma-AldrichS5886Tyrode-Lösung
NaH2PO4DEQDEQF290400250Tyrode-Lösung
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108pH-Einstellung
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01Aufnahmekarte
Platinelektroden, Durchmesser 0,25 mmSigma-Aldrich349402Elektrische Stimulations-Elektroden
Netzteil (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30ANetzteil für Rezirkulator
DruckmessgerätCINVESTAVN/VIndividuelles Druckmessgerät; allgemein als Druckmessgerät zitiert
DruckaufnehmerLA BOUVETB17295Druckmessgerät des Langendorff-Systems
Reiner EthylalkoholSigma-Aldrich493511Äthanol zur Systemreinigung
Wiederholender Thermostatenbehälter (LXC)PolyScienceL113A0412Behälter-Rezirkulator
SalzlösungPiSA1118480,9-%ige Natriumchlorid-(NaCl)-Lösung
Schlangenförmiger ThermostatenbehälterCINVESTAVN/VIndividueller schlangenförmiger Rezirkulator/Thermostatenbehälter
StereomikroskopN/VN/VChirurgisches Verfahren
Beleuchtung für StereomikroskopN/VN/VChirurgisches Verfahren
uEye Cockpit-SoftwareIDS Imaging Development System GmBHN/VKamera-Aufnahmesoftware; allgemein als Kamera-Aufnahmesoftware zitiert
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kamera; allgemein als CMOS-Kamera zitiert
XylazinPiSA4001211Anästhetikum
Zoletil 100Virbac83048907Tiletamin-Zolazepam-Anästhetikum; allgemein als Anästhetikum-Mischung zitiert

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