Hier stellen wir ein Protokoll für die Konstruktion, Zusammenstellung und den Betrieb einer blasenfreien, geschlossenen Mikrofluidikvorrichtung zur Kultivierung endothelialer Zellen unter physiologischen Strömungsbedingungen in simulierter Mikrogravitation vor.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Eine Plattform für die kontinuierliche Kultivierung von Endothelzellen unter physiologischen Flussbedingungen in simulierter Mikrogravitation
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mikrophysiologische Systeme (MPS) sind wertvoll in vitro Modelle, die Struktur und Funktion menschlicher Gewebe nachbilden. Insbesondere Gewebe- oder Organe-auf-Chips, die Mikrofluidik-Technologie nutzen, ermöglichen die Nachbildung der mechanischen und biochemischen Umgebung in vivo und gleichzeitig die Echtzeitüberwachung des zellulären Wachstums und der Entwicklung. Solche Systeme können besonders nützlich für Studien im Weltraumflug sein, da sie beispielsweise zur Internationalen Raumstation (ISS) befördert werden können, um die Auswirkungen des Weltraumflugs auf den menschlichen Körper zu untersuchen. Ein wesentliches Hindernis für den Erfolg von mikrophysiologischen Systemen (MPS) ist die Bildung von Blasen, die in der Schwerelosigkeit besonders ausgeprägt sein kann. In dieser Arbeit wird die Konstruktion, Montage und Bedienung eines mikrophysiologischen Zellkultursystems beschrieben, das unter simulierter Schwerelosigkeit eingesetzt werden kann (z. B. am Random Positioning Machine oder am Klinostaten). Der Einbau einer lageunabhängigen Blasenfalle in den fluidischen Kreislauf hat sich als äußerst wirksam bei der Entfernung von Luftblasen in Schwerelosigkeit und zur Unterstützung einer langfristigen Endothelzellkultur erwiesen. Dieses geschlossene, lageunabhängige mikrofluidische System kann für den blasenfreien Betrieb von Gewebechips oder Organen-auf-Chips zur Simulation der kombinierten Effekte von Mikrogravitation und Strömung oder für den Einsatz in Weltraummissionen verwendet werden.
Einleitung
Es ist mittlerweile gut belegt, dass mechanische Kräfte – durch Mechanismen, die derzeit untersucht werden – eine entscheidende Rolle bei der zellulären Funktion sowie beim fein abgestimmten Gleichgewicht zwischen Gesundheit und Krankheit spielen1. Unter allen Umweltbelastungen ist die Schwerkraft einzigartig und wird zu Recht in der überwiegenden Mehrheit der biomedizinischen Wissenschaft als konstanter, unveränderlicher Vektor angenommen. Der Weltraumflug hingegen bietet eine einzigartige Mikrogravitationsumgebung, in der sich das Verhalten von Organismen von dem auf der Erde unterscheiden kann. Weltraumexperimente mit Tieren und menschlichen Probanden zeigen signifikante physiologische Veränderungen und unterstreichen damit die Rolle der Schwerkraft bei der zellulären und organismischen Homöostase2.
In jüngster Zeit haben NASA und andere private Organisationen erhebliches Interesse daran gezeigt, Gewebechips (oder Organ-auf-Chips) für den Einsatz auf Weltraummissionen zu entwickeln.3. Die Gewebechips sind so konzipiert, dass sie die in vivo Architektur, die es ermöglicht, mit hoher Genauigkeit die physiologischen und mechanistischen Auswirkungen von Mikroschwerkraft und Weltraumstrahlung zu modellieren4Durch die Nutzung von Spenderzellen können Gewebenchips auch verwendet werden, um die Empfindlichkeit von Astronauten gegenüber Mikrogravitation und Weltraumstrahlung zu untersuchen und präventive Gegenmaßnahmen zu entwickeln.5In den letzten fünf Jahren wurden mehrere Organsysteme, darunter Gehirn, Leber, Darm, Blutgefäße, Herz, Niere und Lunge, mithilfe von Gewebeschips modelliert und an Bord der ISS gestartet.6. in vivo, Organe werden in unterschiedlichem Maße durch das vaskuläre System durchblutet, was ihre Physiologie bestimmt – beispielsweise ist die Leber stark vaskularisiert, während Knorpel dagegen deutlich weniger durchblutet ist. Daher ist bei der Entwicklung von Organ-auf-einem-Chip-Systemen die Einbindung von Flüssigkeitsdurchfluss durch Gewebe und Zellen eine wichtige Überlegung, um die Organfunktion in vitro genau nachzubilden.
Mikrofluidik wurde verwendet, um Zellen und Gewebe in Organ-auf-einem-Chip-Systemen zu perfundieren7,8. Angemessene Strömungsgeschwindigkeiten des Fluids unterstützen nicht nur den Nährstofftransport in das System hinein und den Abtransport von Abfallprodukten aus dem System heraus, sondern erhalten auch den physiologischen Scherstress aufrecht, dem die Zellen ausgesetzt sind. Allerdings stellen Blasen bei kleinen Abmessungen an Phasengrenzen eine anhaltende Herausforderung dar, die zu ungenauen Messungen, Schäden und Verstopfungen führen kann9. Zur Minderung dieses Problems wurden Blasenfallen mit aktiven (z. B. Vakuumentgasung oder äußeren Feldern wie akustischen oder thermischen) und passiven (z. B. einer semipermeablen Membran, die von Oberflächeneigenschaften abhängt) Konstruktionen eingesetzt10,11. Solche mikrofluidischen Entlüfterkonstruktionen erhöhen jedoch die Komplexität der Geräteherstellung, beeinträchtigen die Probenechtheit und führen zu Verstopfungen sowie Beschädigungen der Barriere. Die Probleme verschärfen sich im Weltraum, wo Keimbildung und Blasenbildung deutlich ausgeprägter sind und die auf der Erde wirksamen Strategien zur Blasenminderung weitgehend ineffektiv werden12. Bodengestützte Mikroschwerkraft-Analoga können mit Geräten wie einem rotierenden Wandbehälter (RWV) oder einer zufälligen Positioniermaschine (RPM) erzeugt werden13,14. Insbesondere bei der RPM wird der Schwerkraftvektor kontinuierlich neu ausgerichtet, wodurch der zeitlich gemittelte Netto-Schwerereiz auf die Probe nahezu aufgehoben wird. Kürzlich berichteten wir über die Konstruktion, Herstellung und Anwendung einer orientationsunabhängigen Blasenfalle für die Perfusionskultur von Endothelzellen unter simulierter Mikroschwerkraft mithilfe einer RPM15. In diesem Artikel beschreiben wir die schrittweise Montage und den Betrieb eines geschlossenen Perfusionsystems unter Verwendung der orientationsunabhängigen Blasenfalle und demonstrieren deren Anwendbarkeit für die Kultur humaner Nabelvenen-Endothelzellen als Modell für eine kontinuierliche Zellkultur unter simulierter Mikroschwerkraft.
Das geschlossene System besteht aus einem Mikrocontroller mit einem Motorregler für die frequenz- und spannungsgesteuerte Betätigung einer Mikropumpe, einem Flüssigkeitsdurchflusssensor, einer Blasenfalle15 und einem mikrofluidischen Kanal mit anhaftenden endothelialen Zellen. Spezifische Komponenten sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt. Die untenstehenden Protokolle beschreiben den Aufbau der elektronischen Systemkomponenten (Schritt 1), den Aufbau der Fluidik (Schritt 2), die Sterilisation und Befüllung (Schritte 3 und 4), die Integration der mikrofluidischen Zellkultur (Schritt 4), den Aufbau der Mikropumpen und der Steuerung (Schritt 5) sowie die Montage des gesamten Systems in einem Gehäuse (Schritt 6). Das geschlossene Durchflusssystem wurde auf dem RPM montiert, um Mikrogravitation unter Verwendung eines speziell angefertigten Gehäuses zu simulieren (Schritt 7).
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Systemelektronik
- Schließen Sie den Pumpentreiber an den Mikrocontroller an den dafür vorgesehenen Buchsen, die mit „mp-Highdriver4“ gekennzeichnet sind, an.
- Schließen Sie ein Pumpenkabel an der dafür vorgesehenen Stelle an die Seite des Pumpentreibers an, die mit „CH1 CH2“ gekennzeichnet ist.
- Schließen Sie eine Mikropumpe an einen der Pumpenkabelanschlüsse an. Achten Sie darauf, dass der weiße Anschluss vorsichtig von den farbigen Drähten weggezogen wird, um die Mikropumpe vollständig einzuführen. Sobald die Mikropumpe vollständig in den Anschluss eingeführt ist, schieben Sie den weißen Anschluss vorsichtig wieder in Richtung der farbigen Drähte, um die Mikropumpe zu verriegeln.
- Verwenden Sie ein Kabel mit einem USB-Macro- auf einen USB-Mini-Anschluss, um die Nano-Platine mit einem Computer zu verbinden, auf dem die Anwendung für den Mikrocontroller installiert ist.
- Befestigen Sie zwei Gewinde- und Hutmutter-Adapter an den Enden eines Flüssigkeitsdurchflusssensors. Verwenden Sie den Flüssigkeitsdurchflusssensor, um die Durchflussgeschwindigkeit der Flüssigkeit zu überwachen und die Daten aufzuzeichnen. Das zusammengesetzte System ist in Abbildung 1 dargestellt.
HINWEIS: Alle Komponenten in Abschnitt 1 müssen nur bei Bedarf ersetzt werden, beispielsweise wenn sie beschädigt sind oder wenn die Leistung nachlässt.
2. Fluidikverbindungen des Systems
- Füllen Sie während des Spülens den Hohlraum der orientationsunabhängigen Blasenfalle zu etwa 80 % der maximalen Kapazität mit der experimentellen Arbeitsflüssigkeit.
ANMERKUNG: Dieser Füllstand ermöglicht höhere Raten der Blaseneinlagerung, während die Ein- und Auslassöffnungen weiterhin unter der Arbeitsflüssigkeit eingetaucht bleiben. Die orientationsunabhängige Blasenfalle verfügt über zwei Seitenanschlüsse in der Nähe ihres Schwerpunkts, die als direkte Verbindungen zum geschlossenen Durchflusssystem dienen, sowie über einen Luer-kompatiblen oberen Anschluss, der bei geöffnetem Zustand eine weitere Befüllung des Hohlraums ermöglicht. Vor Beginn des Experiments ist es entscheidend, dass der obere Anschluss der orientationsunabhängigen Blasenfalle vollständig mit einer Kombination aus Teflonband und einem Luer-Stopfen verschlossen wird, um ein vollständig geschlossenes System sicherzustellen. - Schneiden Sie vier 10 cm lange Stücke aus PVC-Schlauch (1,59 mm Innendurchmesser × 3,18 mm Außendurchmesser) zu, um alle Komponenten der Durchflussanlage miteinander zu verbinden.
- Verbinden Sie ein Stück PVC-Schlauch mit dem Auslass des Mikropumpen (Pfeilmarkierung zeigt die Strömungsrichtung vom Einlass zum Auslass an). Verwenden Sie einen 3 mm schwarzen runden Nylonabstandshalter (3,2 mm Innendurchmesser) um den PVC-Schlauch, um diesen fest an der Mikropumpe zu befestigen. Verbinden Sie das andere Ende des Schlauchs mit einem der Seitenanschlüsse der orientationsunabhängigen Blasenfalle.
- Verwenden Sie das zweite Stück PVC-Schlauch, um den anderen Seitenanschluss der orientationsunabhängigen Blasenfalle mit dem Eingangsstutzen des Flüssigkeitsdurchflusssensors zu verbinden (Pfeilmarkierung zeigt die Strömungsrichtung vom Einlass zum Auslass an).
- Verwenden Sie das dritte Stück PVC-Schlauch, um den Ausgangsstutzen des Flüssigkeitsdurchflusssensors (d. h. die Seite, auf die der Pfeil zeigt) mit einem gewinkelten Luer-Verbinder zu verbinden.
- Verbinden Sie das letzte Stück PVC-Schlauch mit dem Einlass derselben Mikropumpe (Pfeilmarkierung zeigt die Strömungsrichtung vom Einlass zum Auslass an). Verwenden Sie einen 3 mm schwarzen runden Nylonabstandshalter (3,2 mm Innendurchmesser) um den PVC-Schlauch, um diesen fest an der Mikropumpe zu befestigen. Verbinden Sie das andere Ende des Schlauchs mit einem gewinkelten Luer-Verbinder.
ANMERKUNG: Alle Schläuche sollten zwischen jedem Experiment ausgetauscht werden.
3. Experimentelle Vorbereitung und Systemsterilisation
- Bereiten Sie einen Sicherheitswerkbank für den Sterilisationsprozess vor, um vollständige Sterilität und Sicherheit für die Zellkultur zu gewährleisten.
- Bereiten Sie ein 50-mL-Selbststehendes Zentrifugenröhrchen mit 70 % Ethanol und ein weiteres 50-mL-Selbststehendes Zentrifugenröhrchen mit steriler Zellkulturwasser vor.
- Platzieren Sie den Mikrocontroller in eine kleine Plastiktüte, lassen Sie jedoch das Pumpenkabel und die Mikropumpe aus der Tüte herausragen. Verschließen Sie die Plastiktüte mit einem Kabelbinder, um die elektronischen Bauteile zu schützen.
- Sterilisieren Sie die Außenseiten aller Komponenten des Flusskreislaufs und aller sonstigen Versuchsmaterialien mit einer Sprühflasche mit 70 %igem Ethanol und Papiertüchern. SPRÜHEN SIE 70 %igen Ethanol NICHT auf elektrische Anschlüsse. Stellen Sie jede Komponente und jedes Material unmittelbar nach dem Abwischen mit 70 %igem Ethanol in die Sicherheitswerkbank.
- Verbinden Sie eine mobile Computerstation über ein USB-Kabel (Mann- zu Mini-USB) mit dem Mikrocontroller und öffnen Sie die Computeranwendung des Mikrocontrollers, um die Frequenz und Spannung der beiden Mikropumpen auf 100 Hz bzw. 240 V einzustellen. Halten Sie die Mikropumpe ausgeschaltet.
- Tauchen Sie den mit der Mikropumpe verbundenen Ellenbogen-Luer-Stecker direkt in ein 50-mL-Selbststehendes Zentrifugenröhrchen mit 70 %igem Ethanol. Verbinden Sie eine 12-mL-Spritze mit einem weiblich-zu-weiblich-Luer-Verbinder mit dem anderen Ellenbogen-Luer-Stecker im gleichen Flusskreislauf.
- Drücken Sie manuell den PVC-Schlauchabschnitt zwischen Mikropumpe und Ellenbogen-Luer-Stecker ab und vergewissern Sie sich, dass die obere Öffnung des lageunabhängigen Blasenfängers mit Teflonband und einem Luer-Stopfen verschlossen ist. Ziehen Sie mit der anderen Hand die 12-mL-Spritze um etwa 5 mL zurück, um im gesamten System ein ausreichendes Vakuum zu erzeugen.
- Schalten Sie die Mikropumpe ein und lösen Sie die Abklemmung aus dem vorherigen Schritt. Lassen Sie 5 mL 70 %igen Ethanol durch das System in die Spritze fließen, um eine gründliche Sterilisation des Systems sicherzustellen.
- Öffnen Sie die obere Öffnung des lageunabhängigen Blasenfängers, damit diese sich mit 70 %igem Ethanol füllen kann. Sobald der lageunabhängige Blasenfänger zu etwa 80 % mit 70 %igem Ethanol gefüllt ist, schalten Sie die Pumpe aus und verschließen Sie die obere Öffnung vollständig mit Teflonband und einem Luer-Stopfen. Schütteln Sie den lageunabhängigen Blasenfänger vorsichtig, um sicherzustellen, dass das Innere vollständig sterilisiert ist.
- Nehmen Sie den Ellenbogen-Luer-Stecker aus dem Zentrifugenröhrchen mit 70 %igem Ethanol heraus und schalten Sie die Mikropumpe ein, um das System zu entleeren. Sobald der gesamte 70 %ige Ethanol in die 12-mL-Spritze gezogen wurde, trennen Sie den lageunabhängigen Blasenfänger vom System, entfernen Sie den Luer-Stopfen und leeren Sie den lageunabhängigen Blasenfänger direkt in einen Abfallbehälter, um den 70 %igen Ethanol zu entsorgen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.6–3.10, wobei Sie anstelle von 70 %igem Ethanol das 50-mL-Selbststehende Zentrifugenröhrchen mit steriler Zellkulturwasser verwenden, und lassen Sie jeweils 15 mL sterile Zellkulturwasser durch jeden Flusskreislauf fließen.
4. Systemanpassung und Integration des mikrofluidischen Zellkanals
- Nach Abschluss der Sterilisation das System zur Vakuumprimierung mit der Arbeitsflüssigkeit im Sicherheitswerkbank belassen.
- Den mit der Mikropumpe verbundenen Ellenbogen-Luer-Stecker direkt in einen Kunststoffbehälter (ungefähre Abmessungen 80 mm × 50 mm × 25 mm) eintauchen, der mit 30 mL Zellkulturmedium gefüllt ist. Die 12-mL-Spritze mit dem anderen Ellenbogen-Luer-Stecker desselben Durchflusskreislaufs unter Verwendung eines weiblich-zu-weiblich-Luer-Verbinders anschließen.
- Mit dem linken Zeigefinger und Daumen die PVC-Tygon-Schlauchstrecke zwischen Mikropumpe und Ellenbogen-Luer-Stecker abklemmen und mit der rechten Hand die 12-mL-Spritze etwa um 5 mL ziehen, um im gesamten System ein ausreichendes Vakuum zu erzeugen. Stellen Sie sicher, dass der obere Anschluss des lageunabhängigen Blasenfängers mit Teflonband und einem Luer-Stopfen verschlossen ist.
- Schalten Sie die Mikropumpe ein und lösen Sie die Abklemmung aus dem vorherigen Schritt. Lassen Sie 5 mL Zellkulturmedium durch den Kreislauf in die Spritze fließen, um eine vollständige Primierung des Systems sicherzustellen.
- Öffnen Sie den oberen Anschluss des lageunabhängigen Blasenfängers, um ihn mit Zellkulturmedium zu füllen. Sobald der lageunabhängige Blasenfänger etwa 80 % seiner Kapazität mit Zellkulturmedium erreicht hat, schalten Sie die Pumpe aus und verschließen den oberen Anschluss vollständig mit Teflonband und einem Luer-Stopfen.
- Platzieren Sie den mikrofluidischen Kanal mit kultivierten Zellen direkt in den Kunststoffbehälter mit den Abmessungen 80 mm × 50 mm × 25 mm und legen Sie den magnetischen Rührstab in die Mitte des mikrofluidischen Kanals mit den kultivierten Zellen, um ein Aufschwimmen zu verhindern. Füllen Sie den Kunststoffbehälter mit zusätzlichem Zellkulturmedium, bis die gesamte Objektträgerfläche vollständig untergetaucht ist.
HINWEIS: Die endothelialen Zellen wurden vor der Integration in den Durchflusskreislauf gemäß Standardprotokollen in einem ibidi µ-Slide VI0.4 bis zu 80 % Konfluenz kultiviert16. - Während die Ellenbogen-Luer-Stecker eines Durchflusskreislaufs weiterhin im Zellkulturmedium untergetaucht bleiben, schalten Sie die Mikropumpe für diesen Durchflusskreislauf ein. Verbinden Sie die Ellenbogen-Luer-Stecker vorsichtig mit einem der Mikrokanäle und achten Sie darauf, dass an den Verbindungsstellen keine Luftblasen entstehen. Schalten Sie die Mikropumpe danach aus.
5. Gehäuse für Mikrocontroller und Mikropumpen (optional)
- Verwenden Sie zwei M3 × 8 Edelstahlschrauben, zwei M3 Edelstahlmuttern und zwei M3 Edelstahlscheiben, um die selbstgefertigte Quertraverse an der selbstgefertigten unteren Montageplatte zu befestigen.
- Verwenden Sie vier M3 × 12 Edelstahlschrauben, vier M3 Edelstahlmuttern und vier M3 Edelstahlscheiben, um die Unterseite des Polycarbonat-Gehäuses an der selbstgefertigten unteren Montageplatte zu befestigen. Verwenden Sie acht M3 Nylon-Scheiben (zwei an jeder M3 × 12 Schraube), um einen kleinen Abstand zwischen der Gehäuseunterseite und der unteren Montageplatte zu gewährleisten.
- Verwenden Sie vier M3-Schrauben, vier M3-Edelstahlmuttern und vier M3-Kunststoff-Abstandshülsen (mit männlichem und weiblichem Gewinde), um den Mikrocontroller an der selbstgefertigten Acryl-Innenmontageplatte zu befestigen. Platzieren Sie die Kunststoff-Abstandshülsen zwischen der Unterseite des Mikrocontrollers und der Acryl-Montageplatte.
- Verwenden Sie zwei M3 × 8 Edelstahlschrauben, zwei M3 Edelstahlmuttern und zwei M3 Edelstahlscheiben, um den selbstgefertigten Mikropumpenhalter an der Oberseite der Acryl-Innenmontageplatte zu befestigen.
- Setzen Sie die Mikropumpen in den selbstgefertigten Mikropumpenhalter ein, sodass der Pfeil auf den Mikropumpen in Richtung Pumpentreiber zeigt.
- Verwenden Sie vier M3 × 8 Edelstahl-Senkkopfschrauben und vier M3 Edelstahlscheiben, um die Acryl-Innenmontageplatte von innen an das Polycarbonat-Gehäuse zu befestigen.
- Setzen Sie vier Gummikabeldurchführungen in eine Seite des Polycarbonat-Gehäuses ein, die vier aufeinanderfolgende Löcher aufweist. Wiederholen Sie dies auf der gegenüberliegenden Seite mit den vier aufeinanderfolgenden Löchern.
- Nummerieren Sie die Kabeldurchführungen mithilfe eines Etikettendruckers von links nach rechts mit 1 bis 4 auf beiden Seiten des Polycarbonat-Gehäuses.
- Befestigen Sie zwei O-Ringe am Gewindeteil des männlich-weiblichen Mini-USB-Kabels. Danach führen Sie das weibliche Ende des männlich-weiblichen Mini-USB-Kabels durch die Öffnung im Polycarbonat-Gehäuse auf der Seite mit den Mikropumpenpfeilen ein. Sichern Sie die weibliche Seite des männlich-weiblichen Mini-USB-Kabels, indem Sie einen weiteren O-Ring am Gewindeteil auf der Außenseite des Polycarbonat-Gehäuses befestigen.
- Versiegeln Sie das verbleibende Loch an der Seite des Polycarbonat-Gehäuses mit Allzweckklebeband. Das zusammengesetzte System ist in Abbildung 2 dargestellt.
6. Montageplatte für oberen Abschnitt (optional)
- Verwenden Sie vier M2 × 8 Edelstahlschrauben und vier M2 Edelstahlmuttern, um zwei Halterungen für den Durchflusssensor an der kundenspezifisch gefertigten Acryl-Oberteil-Montageplatte zu befestigen.
- Verwenden Sie vier M3 × 12 Edelstahlschrauben und vier M3 Edelstahlmuttern, um zwei kundenspezifische, ausrichtungsunabhängige Halterungen für Blasenfallen an der kundenspezifisch gefertigten Acryl-Oberteil-Montageplatte zu befestigen.
- Verwenden Sie eine Zange, um einen M4-Stahlgewindestab in vier Stücke von etwa 110 mm Länge zu schneiden. Verwenden Sie diese vier Stücke als senkrechte Stützen, um die Oberteil-Montageplatte über dem Polycarbonat-Gehäuse zu befestigen.
- Verwenden Sie eine Schere, um vier 40 mm lange Stücke Polyurethan-Schlauch (6,35 mm Außendurchmesser) zu schneiden. Führen Sie die M4-Stahlgewindestücke durch diese Schlauchabschnitte, um einen ausreichenden Abstand zwischen der Oberteil-Montageplatte und dem Deckel des Polycarbonat-Gehäuses sicherzustellen.
- Mit den kundenspezifischen, ausrichtungsunabhängigen Blasenfallenhaltern und den Montageklammern nach oben gerichtet, führen Sie jeweils eines der vier M4-Gewindestücke zur Hälfte durch jede Ecke der kundenspezifisch gefertigten Acryl-Oberteil-Montageplatte. Befestigen Sie an der Oberseite jedes Gewindestücks eine M4-Flügelmutter, eine M4-Mutter und eine Unterlegscheibe.
- Führen Sie jedes M4-Gewindestück durch einen 6 mm schwarzen runden Nylonabstandshalter (3,2 mm Innendurchmesser) und ein 40 mm langes Stück Polyurethan-Schlauch. Befestigen Sie abschließend an der Unterseite jedes M4-Gewindestücks eine M4-Flügelmutter. Ordnen Sie die Komponenten in der folgenden Reihenfolge an: M4-Stahl-Flügelmutter, M4-Edelstahlmutter, M4-Edelstahl-Unterlegscheibe, Oberteil-Montageplatte, schwarzer runder Nylonabstandshalter, Polyurethan-Schlauch und eine weitere M4-Stahl-Flügelmutter.
- Verwenden Sie Allzweckklebeband, um zwei 75 mm lange × 25 mm breite Acrylrohlinge flächig gegenüberliegend miteinander zu verbinden, sodass die Längen der Acrylplatten parallel zueinander liegen.
- Verwenden Sie eine Schere, um ein 75 mm langes Stück doppelseitiges Schaumklebeband (25 mm breit × 1,6 mm dick) zu schneiden. Kleben Sie eine Seite des 75 mm langen doppelseitigen Schaumklebebands auf den 75 mm langen × 25 mm breiten Acrylrohling, sodass die Länge des Schaumklebebands parallel zur Länge des Acrylrohlings verläuft.
- Verwenden Sie diesen mit Schaumklebeband versehenen Acrylrohling als Polster, das auf den Ellenbogen-Luer-Anschlüssen des Mikroobjektträgers aufliegt, um zu verhindern, dass diese während simulierter Mikrogravitationsexperimente sich lösen. Halten Sie das gepolsterte Acrylrohling-Polster und den Mikroobjektträger mit einem kundenspezifisch gefertigten Mikroobjektträgerhalter zusammen.
7. Montage auf der zufälligen Positioniervorrichtung (RPM)
- Verwenden Sie doppelseitiges Schaumstoffklebeband, um alle Komponenten des Flusssystems auf der Befestigungsplatte des RPM zu befestigen. Vermeiden Sie es, direkt unterhalb der mikrofluidischen Kanäle für die Zellkultur zu verkleben, um während des Experiments einen Gasaustausch der Zellen zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass die Mikroplatte mittig auf der Befestigungsplatte befestigt wird, damit sie während des Experiments auf der Drehachse des RPM bleibt.
- Schieben Sie die Befestigungsplatte in den obersten Schlitz des U-förmigen Rahmens des RPM und befestigen Sie sie dort mit der beiliegenden Schraube und Unterlegscheibe am U-Rahmen des RPM.
- Verwenden Sie einen vorab korrekt verdrahteten DB15-Abgriffanschluss, um die Computerstation direkt mit dem RPM zu verbinden, der anschließend über einen zweiten, vorab verdrahteten DB15-Abgriffanschluss mit dem Mikrocontroller und den Flüssigkeitsdurchflusssensoren verbunden wird.
HINWEIS: Der Drehdurchführungsring (Slip Ring) des RPM verbindet die beiden DB15-Anschlüsse und verknüpft so effektiv die Computerstation mit dem Mikrocontroller und dem Durchflusssensor. - Verbinden Sie die Stromkabel für den Mikrocontroller und den Durchflusssensor und sichern Sie lose Kabelabschnitte mit Kabelbindern. Die Kabel sollten straff befestigt sein, jedoch darf keine mechanische Spannung an den elektrischen Anschlüssen entstehen. Das zusammengesetzte System ist in Abbildung 3 dargestellt.
8. Erfassung der Durchflussdaten
- Öffnen Sie die Strömungssensorsoftware an der Computerstation, um die Durchflussrate zu überwachen.
- Verwenden Sie die Computeranwendung des Mikrocontrollers, um die Pumpenspannung so lange anzupassen, bis der Strömungssensor die gewünschte Durchflussrate anzeigt.
- Wenn die Durchflussrate eingestellt ist, beginnen Sie mit der Aufzeichnung der Durchflussdaten für 24 h.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Bevor wie unten beschrieben Ergebnisse zur Fluidik oder Zellkultur gesammelt werden, sollte die Systemintegrität an jedem wichtigen Prüfpunkt des Protokolls während der Montage- und Anfüllvorgänge überprüft werden. Elektronische Verbindungen können einfach geprüft werden, indem die Mikrosteuerung und der Flüssigkeitsdurchflusssensor mit einem Computer verbunden und über die jeweilige Anwendungssoftware mit den einzelnen Komponenten kommuniziert wird. Schlauchverbindungen an konischen Verbindern gelten als ausreichend, so...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Ein geschlossenes, lagernunabhängiges Mikrofluidiksystem, das in der Lage ist, ohne Schwerkraft zu arbeiten, wurde entwickelt und als tauglich für die Kultivierung von Endothelzellen unter physiologischen Flussbedingungen gezeigt. Die wichtigsten Bestandteile des Systems sind ein Mikrocontroller, eine Mikropumpe, ein Flüssigkeitsdurchflusssensor, eine Zellkultur-Mikrokammer und eine speziell angefertigte, dreidimensional gedruckte, lagernunabhängige Entlüftungsfalle.
Die in dieser Arbeit verwe...
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die omnidirektionale Blasenfalle ist durch die Patentanmeldung US 18634723 geschützt. Es bestehen keine weiteren konkurrierenden Interessen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch den NASA Space Biology-Zuschuss # 80NSSC21K0272 unterstützt.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 100 % Ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Wird zur Herstellung einer 70 %igen Ethanol-Lösung für die Systemsterilisation verwendet (mindestens 35 mL erforderlich) |
| 6 mm schwarzer Rundabstandshalter aus Nylon, 7 mm Außendurchmesser, 3,2 mm Innendurchmesser | Exqutoo | ZH-0050 | Befestigt die obere Halterung am Gehäuse (mindestens 4 erforderlich) |
| Acrylplatte, 75 mm lang × 25 mm breit | Polymersan | ACRCS | Sichert Luer-Adapter mit 90°-Winkel am Mikrokanal-Objektträger (mindestens 1 benötigt) |
| A-Mann zu Mini-B-Kabel USB 2.0 Kabel | Ugreen Group Limited | 10355 | Zum Verbinden des Computers mit dem Mikrocontroller (mindestens 1 erforderlich) |
| Blasenfalle | (Gebräuchlich) | Zur Vermeidung von Blasenübergang zum Miklideschlitten (Minimum benötigt 1) | |
| Halterung für Blasenfalle | Benutzerdefiniert | 3D-gedruckter Halter zur Befestigung der Blasenfalle (mindestens 2 benötigt) | |
| Wasser für die Zellkultur | Fisher Scientific | MT25055CI | Wird verwendet, um alle Rückstände von Ethanol nach der Sterilisation zu entfernen (mindestens 30 mL erforderlich) |
| Regler, Pumpe und Gehäusehalterung (Innenaufbau) | Benutzerdefiniert | Montageplatte im Gehäuse (mindestens 1 benötigt) | |
| Querholmhalterung | Benutzerdefiniert | Montagequerschienen-Befestigungsplatte für Gehäuse (mindestens 1 benötigt) | |
| DB15-Breakout-Stecker + Buchse | ANMBEST | ANMBEST_MDDB15 | Zum Anschließen des Computers an die Maschine für zufällige Positionierung und anschließend an den Mikrocontroller (mindestens benötigt: 1) |
| Ellbogen-Luer-auf-Barb-Verbinder | ibidi | 10802 | Verbindet das Mikroobjektträger mit der Flussanlage (mindestens 2 benötigt) |
| Doppelseitiges Schaumstoffband | 3M | 4026 | Zur Kompression von Luer-Adaptern am Ellenbogen für Mikrokanal-Objektträger (mindestens 1 benötigt) |
| Gehäuse (60 mm x 140 mm x 140 mm) | Hammond | 1554Q2GYCL | Beherbergt den Mikrocontroller und die Mikropumpen (mindestens benötigt: 1) |
| Gehäusemontage (Unterseite) | Benutzerdefiniert | Montageplatte unterhalb des Gehäuses (mindestens benötigt: 1) | |
| Weiblich-weibliche Luer-Verbindung | Boao | Boao-Spritzen-WAD2354 | Zur Verbindung der Spritze mit dem Luer-Verbinder (Ellbogenstück) zum Befüllen mit Zellkulturmedium (mindestens 1 benötigt) |
| Gibco RPMI 1640 Zellkulturmedium | Thermo Fisher | 11875093 | Zur Kultivierung der Endothelzellen verwendet (mindestens 50 mL benötigt) |
| Hülsen, 9/16" Lochdurchmesser und 1/8" Dicke, 1/8" ID | McMaster-Carr | 9307K863 | Zum Durchführen von Schläuchen in und aus dem Gehäuse (mindestens 8 erforderlich) |
| IDEX P-646 Adapterstück, 1/16" Bajonettverschluss auf 1/4-28 | IDEX | P-646 | Schließt den Durchflusssensor an die Durchflussanlage an (mindestens 2 erforderlich) |
| Flüssigkeitsdurchflusssensor | Sensirion | SLF3-1300F | Für die Sammlung von Durchflussdaten (minimale Anforderung 1) |
| Montageklemme für Durchflusssensor | Sensirion | SLF3x Montageklemme | SLF3x-Halterung (mindestens 2 erforderlich) |
| Luer-Lock-Spritze (12 mL) | McKesson | 414624 | Für die Vakuumbefüllung (mindestens 1 benötigt) |
| Luer-Verschlussstopfen | Cole-Parmer | UX-50110-33 | Zum Versiegeln der ausrichtungsunabhängigen Blasenfallen (Mindestbedarf 1) |
| M2 Edelstahlmutter | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Befestigt Flüssigkeitsdurchflusssensoren an der oberen Halterung (mindestens 4 erforderlich) |
| M2×8 Edelstahlschrauben | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Befestigt Flüssigkeitsdurchflusssensoren an der oberen Halterung (mindestens 4 erforderlich) |
| M3 Nylon-Abstandshalter mit Gewinde, männlich-weiblich, sechseckig | Meijubol | B0GC6GN9S7 | Befestigt das mp-Multiboard an der Innenseite der Halterung (mindestens 4 erforderlich) |
| M3-Nylonscheibe | Sutemribor | 7,81573E+11 | Sichert die Gehäusebefestigung an der Unterseite (mindestens 16 erforderlich) |
| M3 Edelstahlmutter | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Befestigt Gehäuse an der unteren Halterung, Quertraverse an der unteren Halterung, Pumpenhalter an der inneren Halterung (mindestens 16 erforderlich) |
| M3 Edelstahl-Scheibe | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Befestigt Quertraverse an der unteren Halterung, Gehäuse an der unteren und inneren Halterung, innere Halterung an der Pumpenhalterung (mindestens 12 erforderlich) |
| M3×12 Edelstahl-Schrauben mit Senkkopf | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Befestigt die Abschirmung am unteren Montagepunkt (mindestens 4 erforderlich) |
| M3×12 Schrauben mit Innensechskant aus rostfreiem Stahl | Fgruh | FG001-3 | Befestigt den Blasenfängerhalter am oberen Deckmontageplatz (mindestens 2 erforderlich) |
| M3×6 Phillips-Schrauben mit Senkkopf | Meijubol | B0GC6GN9S7 | Befestigt das mp-Multiboard an der Innenseite der Halterung (mindestens 4 erforderlich) |
| M3×8 Edelstahlschrauben | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Befestigt Querstange am unteren Halter, Gehäuse am Innentalter, Pumpenhalter am Innentalter (mindestens 8 erforderlich) |
| M4 Edelstahlmutter | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Befestigt die obere Halterung am Gehäuse (mindestens 4 erforderlich) |
| M4 Edelstahl-Scheibe | VIGRUE | B07PJQC7T6 | Sichert die obere Befestigung am Gehäuse (mindestens 4 erforderlich) |
| M4-0,7 Gewindestange aus Stahl | Arwnnklo | AR01 | Auf etwa 15 cm Länge zuschneiden (mindestens 4 benötigt) |
| Mini-USB-Kabel, männlich auf weiblich | Plinkwirekb | PCM-0725-L | Zum Verbinden des Computers mit dem Mikrocontroller (Minimum benötigt: 1) |
| Männlicher auf weiblicher Mini-USB-Stecker mit rechtem Winkel | UCEC | 4326453558 | Zum Anschließen des Computers an den Mikrocontroller (optional) (mindestens 1 erforderlich) |
| Mikrokanalhalter | Benutzerdefiniert | 3D-gedruckter Halter zur Zentrierung des Mikrokanals (mindestens 1 benötigt) | |
| Microkanalplatte, µ-Objektträger VI 0,4 | ibidi | 80606 | Für Zelltests unter Flussbedingungen (Mindestbedarf 1) |
| Mikropumpe | Bartels | MP6-HYB | Zur Erzeugung des Durchflusses (minimale Anforderung 1) |
| Mikropumpenhalter | Benutzerdefiniert | Montagevorrichtung zum Halten der Mikropumpe (mindestens 1 benötigt) | |
| mp-Multiboard mit mp-Highdriver4 | Bartels | BM-E-0005 | Zur Steuerung der Frequenz- und Spannungseinstellungen der Mikropumpen (Mindestens benötigt 1) |
| mp-pump Kabel | Bartels | BM-A-0055 | Wird verwendet, um den mp-Multiboard elektrisch mit den Mikropumpen zu verbinden (mindestens 1 benötigt) |
| Nylonscheibe, rund, 7 mm Außendurchmesser, 3,2 mm Innendurchmesser | Harfington | 2037015 | Zum Befestigen von Schläuchen an der Mikropumpe (mindestens 2 benötigt) |
| O-Ring | ZDBB | 7,17327E+11 | Sichert das männliche auf weibliche Mini-USB-Kabel am Gehäuse (optional) (Mindestens 3 erforderlich) |
| Plastikbehälter | Herdusa | HDS10 KUNSTSTOFFBOX | Als offene Reservoir für das Zellkulturmedium verwendet (Minimum benötigt 1) |
| Polyurethan-Schlauch, 1/8" I.D., 1/4" O.D. | PARKER | 95U-4-062-BLU-0100 | Befestigt die obere Halterung am Gehäuse (mindestens 1,6 cm erforderlich) |
| Random-Positionierungs-Maschine | AIRBUS | Random-Positionierungs-Maschine 2.0 (mindestens 1 erforderlich) | |
| SCC1-USB-Kabel | Sensirion | SCC1-USB 2M | Verbindet Flüssigkeitsdurchflusssensoren mit dem Computer (mindestens 1 erforderlich) |
| Selbststehendes Zentrifugenröhrchen | PEKYBIO | B0C13GZVD6 | Zur Aufbewahrung von Zellkulturwasser/70 % Ethanol (mindestens 2 benötigt) |
| Abstandshülse, 8 mm Außendurchmesser, 20 mm lange Aluminiumhülse | McMaster-Carr | 94669A062 | Mindestens benötigt 4 |
| Tygon PVC 1/16" ID x 1/8" OD | Saint-Gobain | B-44-3 | Verbindet alle Komponenten der Durchflussanlage (mindestens 40 cm erforderlich) |
| Oberes Deckmontage | Benutzerdefiniert | Montageplatte, verbunden mit Flüssigkeitsdurchflusssensoren und Blasenfalle (mindestens 1 erforderlich) | |
| Flügelmutter, M4 x 0,7 mm, Stahl verzinkt | Siptenk | S-TH-DLM-002 | Befestigt die obere Halterung am Gehäuse (mindestens 4 erforderlich) |
| Kabelbinder | HABE MICH TD | 7,32073E+11 | Sichert Kabel beim Montieren des Systems an der RPM (mindestens 4 benötigt) |
Referenzen
- Di X, et al. Cellular mechanotransduction in health and diseases: from molecular mechanism to therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:282.
- Krittanawong C, et al. Human health during space travel: state-of-the-art review. Cells. 2023;12(1):40.
- Parafati M, et al. Human skeletal muscle tissue chip autonomous payload reveals changes in fiber type and metabolic gene expression due to spaceflight. NPJ Microgravity. 2023;9:77.
- Mair DB, Tsui JH, Higashi T, Kim D. Spaceflight-induced contractile and mitochondrial dysfunction in an automated heart-on-a-chip platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(40):e2404644121.
- Kim S, et al. Skeletal muscle-on-a-chip in microgravity as a platform for regeneration modeling and drug screening. Stem Cell Rep. 2024;19(8):1061-1073.
- Mu X, et al. Small tissue chips with big opportunities for space medicine. Life Sci Space Res (Amst). 2022;35:150-157.
- Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23:467-491.
- Kong JS, Kim J, Jang J, Cho D. Advances and applications of organ-on-a-chip technology. Cell Rep Methods. 2026;6(3):101361.
- He X, et al. How to prevent bubbles in microfluidic channels. Langmuir. 2021;37(6):2187-2194.
- Gao Y, Wu M, Lin Y, Xu J. Trapping and control of bubbles in various microfluidic applications. Lab Chip. 2020;20(24):4512-4527.
- Yang M, et al. Emergence of debubblers in microfluidics: A critical review. Biomicrofluidics. 2022;16(3):031503.
- Zhang Q, et al. Bubble nucleation and growth on microstructured surfaces under microgravity. NPJ Microgravity. 2024;10:13.
- Radtke AL, Herbst-Kralovetz MM. Culturing and applications of rotating wall vessel bioreactor derived 3D epithelial cell models. J Vis Exp. 2012;(62):e3868.
- Wadhwa A, Bruun L, Petersen JCG, Petersen LG. Guidelines for use of the random positioning machine as a reduced-gravity analog. Sci Rep. 2026;16:10012.
- Vegunta B, et al. Orientation-independent bubble trap with internal partition for robust operation of microfluidic systems. Lab Chip. 2025;25(14):3423-3429.
- Evani SJ, et al. Monocytes mediate metastatic breast tumor cell adhesion to endothelium under flow. FASEB J. 2013;27(8):3017-3029.
- Musgrove HB, Catterton MA, Pompano RR. Applied tutorial for the design and fabrication of biomicrofluidic devices by resin 3D printing. Anal Chim Acta. 2022;1209:339742.
- Nam N, Hwangbo N, Jin G, Shim J, Kim J. Effects of heat-treatment methods on cytocompatibility and mechanical properties of dental products 3D-printed using photopolymerized resin. J Prosthodont Res. 2023;67(1):121-131.
- Shelhamer M, et al. Selected discoveries from human research in space that are relevant to human health on Earth. NPJ Microgravity. 2020;6:5.
- Fisher AB, Chien S, Barakat AI, Nerem RM. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2001;281(3):L529-L533.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
